Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تحليل الجزئي-تحييد فيروس المخلوي تنفسي (RSV) إنتاجية المحسنة وارتفاع

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/59025
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 3, 1,2,4, 1,2
1Murdoch Children's Research Institute, 2Department of Paediatrics, University of Melbourne, 3School of Chemistry and Molecular Bioscience, University of Queensland, 4London School of Hygiene and Tropical Medicine

Summary

تصف هذه الدراسة إنتاجية عالية، المستندة إلى تصوير المقايسة الأبطال الجزئي لتحديد عيار تحييد الأجسام المضادة المحددة للفيروس المخلوي التنفسي (RSV). تم اختبار هذا الشكل مقايسة على أنواع مختلفة من عينة.

Abstract

الجهاز التنفسي المخلوي الخاصة بالفيروس تحييد الأجسام المضادة (RSV رعايتها) علامة هامة للحماية ضد RSV. عدد من تنسيقات مختلفة بالانزيم قيد الاستخدام حاليا في جميع أنحاء العالم حتى لا يكون هناك حاجة لطريقة دقيقة والفائق لقياس رعايتها RSV. يصف لنا هنا مقايسة الأبطال الجزئي على أساس التصوير التي قد تم اختباره على RSV الفريق الفرعي A ويمكن تكييفها أيضا للفريق الفرعي RSV ب وأنواع مختلفة من عينة. هذا الأسلوب الغاية استنساخه، مع اختلافات المقايسة بين الوكالات ل antiserum مرجع حاليا أقل من 10 في المائة. ونحن نعتقد أن هذا التحليل يمكن أن ينشأ سهولة في العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم بتكلفة منخفضة نسبيا. تطوير مقايسة محسنة، والفائق الذي يقيس رعايتها RSV يمثل خطوة هامة إلى الأمام لتوحيد هذا الأسلوب دوليا، فضلا عن انتقاده لتقييم المرشحين لقاح RSV الرواية في المستقبل.

Introduction

الفيروس المخلوي التنفسي (RSV) هو السبب الرئيسي لالتهابات الجهاز التنفسي السفلي في طب الأطفال من السكان في جميع أنحاء العالم1. على الرغم من أن عبء عالية، لا تتوفر لا يزال أي لقاح أو علاج. وقد أعلنت منظمة الصحة العالمية (WHO) منذ عام 2013، تطوير اللقاحات RSV كأولوية رئيسية لبحث، مع اجتماعات التشاور منظمة الصحة العالمية السنوي2،3. ووافقت منظمة الصحة العالمية على استخدام RSV تحييد قياس الأجسام المضادة (NAb) لرصد اللقاحات الاستمناع، هذا هو المعترف بها كعلامة المصلية الرئيسية لحماية4. يعتقل أظهرت لحماية ضد العدوى RSV شديدة في عدد من الدراسات، فضلا عن التجارب السريرية من باليفيزوماب المضادة-RSV [مونوكلونل] جسم، حاليا استراتيجية وقائية فقط المتاحة4.

وهناك عدة صيغ المقايسة قبض تستخدمها المختبرات في جميع أنحاء العالم، بما في ذلك فحوصات يستند إلى الخلية والجزيئية، التي جعلت جهود توحيد تحدي5،6،،من78. غير أنه ما زال المقايسة الأبطال (PRN) التقليدية للحد من اللوحة أن التدابير عدد البلاك انخفاض تشكيل وحدات (بفو) بوجود جسم RSV-خاصة بمعيار الذهب9. هنا، نحن تقرير بروتوكول PRN المحسنة والمبسطة والفائق التي يمكن استخدامها في العديد من خطوط الخلايا، لسلالات RSV مختلفة ومع المقايسة زيادة الإنتاجية. تم اختبار هذا البروتوكول باستخدام عينات سريرية من إعدادات مختلفة وكذلك على عينات من تجارب حيوانية نموذجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: وقد جميع الخطوات المراد تنفيذها في غطاء BSL2 إلا إذا ذكر بشكل مختلف. مطلوب معايرة الفيروسية قبل مقايسة PRN لتحديد تركيز RSV المثلى المستخدمة في التحليل PRN. من المستحسن أن قاسمة مخزونات الفيروس في وحدة صغيرة والتي سيتم إذابة مرة واحدة وتستخدم لكل مقايسة قبض. ويوصي أيضا باستخدام نفس الرصيد الفيروسية لفحوصات قبض كل إجراء لجميع العينات المأخوذة من دراسة واحدة. تأكد من أن وسائل الإعلام الثقافة والفوسفات مخزنة المالحة (PBS) هو درجة حرارة عند 37 درجة مئوية قبل إضافة إلى ألواح الخلية.

1-RSV الفيروسية المعايرة

ملاحظة: اعتماداً على العدد مخزون فيروس وعدد التكرارات، يمكن إعداد لوحة المقايسة وفقا الرقم 1. وينبغي أن تيتراتيد كل مخزون الفيروس في ثلاث نسخ إلى أسفل لوحة المقايسة، بدءاً من أعلى تركيز الفيروسية (أي، 01:10). معايرات المسلسل يمكن عادة 01:10. A549 خلية ثقافة والصيانة، فضلا عن RSV الثقافة الداخلي يتم استخدام إجراءات موحدة وغير مدرجة في هذا البروتوكول.

  1. لوحات البذر (1 يوم)
    1. ريسوسبيند خلايا A549 في دولبيكو "تعديل النسور" المتوسطة (دميم) + 10% مصل العجل الجنين (FCS) + 1000 وحدة دولية البنسلين/ستربتوميسين (القلم/بكتيريا) في 4 × 105/mL. 96 البذور جيدا مسطحة-أسفل لوحات العقيمة مع 100 ميكروليتر/البئر الذي يحتوي على خلايا 4 × 104 A459.
    2. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5% CO2 (الخلايا ستكون في سجل--مرحلة النمو).
      ملاحظة: استخدام قنينة خلايا A549 جديدة بعد 23 الممرات. ينصح بعدم بدء التجارب عند قنينة خلية جديدة لا تزال في الممرات الثلاثة الأولى.
  2. الإصابة بالفيروسات (2 يوم)
    1. إعداد الفيروس تمييع المسلسل
      1. سرعة ذوبان الجليد قنينة مجمدة واحدة من RSV في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى مذاب تماما تقريبا ووضع فورا على الجليد. إعداد 3 replicates لكل RSV مخزون الفيروس تكون جزيئي واستخدام فيروسات أولى إضعاف أسهم 01:10 مع 100 ميكروليتر من الفيروس المخفف/جيدا ونحتفظ بعمود واحد على الأقل للمراقبة السلبية.
        ملاحظة: ويبين الشكل 1 التحكم السلبي في تريبليكاتيس.
      2. إضافة 100 ميكروليتر من كل الفيروس المخفف الساعة 01:10 في ثلاث نسخ صف أ ش 96-جيدا-قاع لوحة العقيمة. إضافة ميكروليتر 90/بئر دميم + 1000 وحدة دولية/بكتيريا القلم دون FCS إلى صفوف ب إلى ه.
      3. أداء تسلسلي 01:10 تخفيف أسفل اللوحة بنقل 10 ميكروليتر من الصف صف الحل ب مزيج من المحتوى بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 مرات ومواصلة تخفيف عشرة إضعاف حتى الصف H. تجاهل ميكروليتر 10 النهائي حيث يكون الحجم النهائي في كل ميكروليتر 90 جيدا إلى.
        ملاحظة: من المهم استخدام نصائح جديدة لتمييع كل.
    2. تلقيح الفيروس إلى خلايا A549
      1. استرداد cell plate(s) A549 أعدت في اليوم السابق. التأكد من وجود مونولاييرس خلايا A549 في لوحات 96-جيدا روافد ~ 80%. تجاهل وسائل الإعلام بعكس لوحة بلطف وخفة النشاف على منشفة ورقية ماصة معقمة.
      2. تغسل جميع الآبار مع 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني مرتين، وتجاهل برنامج تلفزيوني الزائدة بعكس لوحة بلطف وخفة النشاف على منشفة ورقية ماصة معقمة بعد كل غسل. عدم السماح بلوحات لتجف.
      3. نقل تخفيف الفيروس من لوحة المعايرة الفيروسية (الشكل 1) للآبار المقابلة على لوحة خلايا A549. احتضان لوحة ح 1 في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2. وبعد تفريخ ح 1، صب supernatants استخدام ماصة (لتجنب التلوث المتبادل). تأخذ بها 90 ميكروليتر/جيدا.
      4. إضافة 100 ميكروليتر من متوسطة 1 x 199 (M199، انظر الجدول للمواد) + 1.5% كاربوكسيميثيلسيلولوسي الصوديوم الملح (CMC) منخفضة اللزوجة + FCS 2% يحتوي على القلم/بكتيريا لكل بئر.
        X M199 ملاحظة: 2 + FCS 4% + 2% القلم/بكتيريا وحلول CMC 3% بحاجة إلى أن تكون معدّة مسبقاً والمخزنة في 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل. تأكد من أن الحل هو استعد في 37 درجة مئوية قبل إضافة إلى لوحات.
        1. إعداد حل x M199 2: 1 الكيس/500 مل المقطر المياه + 20 مل FCS + 10 مل القلم/بكتيريا (جعل حتى 2 x MI99). تصفية الحل باستخدام وحدة تصفية 0.22 ميكرومتر.
        2. لإعداد 3% CMC، إضافة 15 غم من اللجنة العسكرية المركزية ببطء إلى 500 مل ماء المقطر. حل اللجنة العسكرية المركزية في المياه باستخدام سخان محرض المعدني في 50 درجة مئوية، ويستغرق حوالي 1 ساعة إعداد. مزيج جيد لجعل 3% CMC والاوتوكلاف الحل.
          ملاحظة: اللجنة العسكرية المركزية الصلبة يجب أن يضاف إلى الماء من أجل حلها؛ وتنتج "أجمة" الصلبة التي من الصعب جداً حل إضافة المياه إلى الصلبة الجافة.
        3. إعداد 1 × M199 + 1.5% CMC منخفضة اللزوجة + FCS 2% يحتوي على القلم/بكتيريا بخلط 1:1 2 x M199 و 3% CMC إعدادها في الخطوة 1.2.2.4.2.
      5. احتضان لوحة لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
  3. وضع لوحة الفحص والتحليل (5 يوم)
    1. التثبيت والنامية المقايسة لوحة
      1. تجاهل اللجنة العسكرية المركزية + M199 + 2% FCS المحتوية على القلم/بكتيريا بعكس اللوحة بلطف. أضف ببطء (تجنبا للإزعاج في طبقة الخلايا) 200 ميكروليتر من التثبيت المخزن المؤقت (الأسيتون 80%، 20% برنامج تلفزيوني، المخزنة في-20 درجة مئوية) لإصلاح الخلايا. احتضان في-20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
      2. تجاهل المخزن المؤقت التثبيت ولطخة بلطف في منشفة ورقية ماصة. اترك لوحة الوجه وصولاً إلى الجاف لمدة 10 دقائق.
        ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا، يمكن إجراء الفحص خارج هود BSL2.
      3. إعداد 5% لبن حل حظر مادة في برنامج تلفزيوني المصفاة التي تحتوي على 0.05% بوليسوربيت 20 (برنامج تلفزيوني-بوليسوربيت، انظر الجدول للمواد). للوحة واحدة، وحساب حجم اللازمة لعرقلة استناداً إلى الآبار 200/جيدا و 110: الآبار 200/بئر x 110 = مل 22 (1.1 مل تركيز الحليب مادة في مل 20.9 تصفية برنامج تلفزيوني-بوليسوربيت). في هذه المرحلة، كما تشكل الحل حجب كافية للأجسام المضادة الأولية والثانوية. للوحة واحدة، وحساب حجم اللازمة لكل جسم حل يستند إلى الآبار 50/جيدا و 110: الآبار 110 x 50/جيدا = 5.5 مل. ولذلك، الحجم الإجمالي للحليب مخفف عرقلة الحل المطلوب مقايسة لوحة واحدة 33 مل.
      4. إضافة/well 200 من عرقلة الحل. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة (RT) عن 30 دقيقة تجاهل الحل بعكس اللوحة بلطف ولطخة على منشفة ورقية ماصة.
      5. إعداد 1: 500 الماعز X RSV جسم (ماب – جسم الابتدائي) المخفف في عرقلة الحل. إضافة 50/well الحل ماب واحتضان في 37 درجة مئوية حاء 1 لوح الغسيل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني-بوليسوربيت التي تمت تصفيتها.
      6. إعداد حمار أليكسا-فلور 1:5,000 مفتش الماعز المضادة (الأجسام المضادة الثانوية) المخفف في عرقلة الحل. إضافة 50/well الحل جسم الثانوية واحتضان في 37 درجة مئوية حاء 1 لوح الغسيل 5 مرات مع برنامج تلفزيوني-بوليسوربيت التي تمت تصفيتها.
      7. قراءة اللوحة على قارئ الآلي بقع استخدام قناة fluorescein isothiocyanate (فيتك) وتعتمد الإعدادات كما هو مبين في الشكل 2. التفاف لوحة في إحباط وتخزينها في 4 درجات مئوية. معايرة هذا الصك باستخدام صفيحة غير مستخدمة 96-بئر ثقافة وإدخال الإعدادات العد قبل الفحص.
        ملاحظة: إعادة تفحص في غضون أيام قليلة من الممكن إذا لزم الأمر. يمكن حفظها واستخدامها لفحص المستقبل إذا كان الإنزيم يستخدم نفس النوع من اللوحة المستخدمة للمعايرة معايرة وإعداد عدد.
      8. تحقق من صور الآبار للحرفية لويحات أو تعطل الخلايا مونولاييرس (الشكل 3). استبعاد الآبار مع مونولاييرس خلية معطلة.
        ملاحظة: اعتماداً على حجم لويحات الحرفية، التهم اليدوي قد تحتاج إلى إجراء لهذه الآبار أو قد تحتاج تلك الآبار التخلص من تحليل البيانات. وتشمل معايير للحصول على نتيجة صحيحة لا خلية تعطلت أحادي الطبقة أو الحرفية لويحات المكتشفة في تكرار واحد أو أكثر وبفو لا اكتشاف في الآبار السلبية (الآبار دون الفيروسات المضافة).
    2. تحديد تركيزات الفيروسية
      1. اختر تخفيف الأخيرين حيث يمكن أن تحسب النقاط واضح. حساب متوسط عدد البقع من آبار نسخ متماثل في إضعاف نفسه. حساب عيار الفيروسية (بفو كل مل) من عينة المخزون باستخدام الصيغة التالية:
        بفو/مل = متوسط عدد من اللوحات (× معامل تخفيف حجم الفيروس المخفف يضاف إلى البئر)
        ملاحظة: تركيز الفيروس مصممة لكل سهم RSV يمكن الآن استخدامها في التحليل PRN (الخطوة 2).

2-RSV تحييد الإنزيم

  1. لوحات البذر (1 يوم)
    1. ريسوسبيند خلايا A549 في القلم 1000 وحدة دولية/بكتيريا في/mL 4 × 105+ دميم + FCS 10%. 96 البذور جيدا مسطحة-أسفل لوحات العقيمة مع 100 ميكروليتر/البئر التي تحتوي على A459 4 × 104 خلايا، واحتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5% CO2 (الخلايا ستكون في سجل--مرحلة النمو).
      ملاحظة: استخدام قنينة خلايا A549 جديدة بعد 23 الممرات. لا ينصح باستخدام خلايا A549 قبل مرور عدد 3.
  2. إعداد الفيروس والمصل (2 يوم)
    ملاحظة: اعتماداً على نوع العينة، هناك خطوات مطلوبة لعينات ما قبل المعالجة قبل الفحص قبض. من المستحسن استخدام الأمصال RSV القياسية الدولية التي أصبحت الآن متاحة بناء على طلب من المعهد الوطني "المعايير البيولوجية" والرقابة (NIBSC).
    1. إعداد مصل تمييع
      1. ذوبان الجليد antiserum مرجع RSV البشرية (المرجع المصل، المرجع) واختبار العينات في إلغاء تنشيط الحرارة الرايت عينات مصلية ومرجع أنتيسيروم في حمام مائي في 56 درجة مئوية و 30 دقيقة قبل استخدام المصل. إعداد تخفيف حسب قالب لوحة (الشكل 4).
      2. إعداد تمييع 1: 100 لتحضير الرقم الحد أدنى من 110 ميكروليتر من REF المخفف في دميم + القلم/بكتيريا دون FCS كل لوح المقايسة (مثل، ميكروليتر 1.5 من المرجع في إجمالي حجم 150 ميكروليتر). إضافة 110 ميكروليتر من 1: 100 المخفف REF في A12 جيدا 96-جيدا U-قاع لوحة العقيمة.
      3. إضافة 55 ميكروليتر دميم + القلم/بكتيريا دون FCS إلى الآبار B12 إلى H12 في العمود 12. إجراء تخفيف 1:2 أسفل اللوحة المسلسل بنقل 55 ميكروليتر من صف بصف ب وخلط الحل بمحتوى بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 مرات والمستمرة حتى الصف تجاهل H. ميكروليتر 55 النهائي لوسائل الإعلام حيث يكون الحجم النهائي في كل ميكروليتر 55 جيدا. استخدام تلميحات جديدة لتمييع كل.
      4. إعداد تمييع 1: 100 من المصل عينات الاختبار. كما يتم جزيئي جميع عينات مصل الدم في ثلاث نسخ، إعداد حجم الحد أدنى ميكروليتر/البئر 110 × 3 = 330 ميكروليتر كل عينة اختبار المصل.
      5. إضافة 110 ميكروليتر من كل عينة اختبار المصل المخفف (1: 100؛ S1 = S2 من المصل 1، = مصل 2، إلخ.) إلى الآبار المقابلة A1 إلى A9 و E1 إلى E9 بليت العقيمة 96-جيدا وفقا الرقم 4أيضا.
      6. إضافة 55 ميكروليتر من دميم + القلم/بكتيريا دون FCS لجميع الآبار المسمى عاشرا تنفيذ المسلسل تخفيف 1:2 حسب الخطوة 2.2.1.3 حتى صف د (بالنسبة للعينات 1 و 2 و 3). تجاهل ميكروليتر 55 النهائي لوسائل الإعلام حيث يكون الحجم النهائي في كل بئر 55 ميكروليتر. وبالمثل، أداء المسلسل تخفيف 1:2 لعينات 4 و 5 و 6 لصفوف ه إلى ه.
        ملاحظة: من المهم استخدام نصائح جديدة لتمييع كل.
      7. إضافة 55 ميكروليتر دميم + القلم/بكتيريا دون FCS إلى الآبار في الأعمدة 10 و 11.
    2. إعداد الفيروسات
      1. سرعة ذوبان الجليد قنينة مجمدة واحدة من RSV في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى مذاب تماما تقريبا ووضع فورا على الجليد.
      2. يضعف الفيروس في دميم + القلم/بكتيريا دون FCS استناداً إلى تركيز قاسمة RSV تحديد في الخطوة 1-3-2. تطبيق إضعاف الذي يعطي حوالي 200 بئر/بفو. إعداد وحدة تخزين إجمالي 5.5 مل (للآبار 100).
    3. إعداد الخليط مصل فيروس
      1. إضافة 55 الفيروس المخفف لجميع الآبار من أعمدة 1-9 وحفر الآبار من صفوف ه-ح من الأعمدة 10 و 11 (مراقبة إيجابية) وفقا للقالب لوحة (الشكل 4).
      2. إضافة 55 دميم + القلم/بكتيريا دون FCS إلى الآبار جميع الصفوف أ-د من الأعمدة 10 و 11 (مراقبة سلبية). احتضان لوحة ح 1 في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
    4. تلقيح الفيروس إلى خلايا A549
      1. قبل انتهاء فترة الحضانة، استرداد cell plate(s) A549 إعدادها في الخطوة 2.1.1. التأكد من وجود مونولاييرس خلايا A549 في لوحات 96-جيدا روافد ~ 80%.
      2. تجاهل وسائل الإعلام بعكس لوحة بلطف وخفة النشاف على منشفة ورقية ماصة معقمة. تغسل جميع الآبار مع 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني مرتين، وتجاهل برنامج تلفزيوني الزائدة بعكس لوحة بلطف وخفة النشاف على منشفة ورقية ماصة معقمة بعد كل غسل. عدم السماح بلوحات لتجف.
      3. نقل/well 100 من خليط مصل فيروس إلى الآبار المقابلة على لوحة خلايا A549 عقب قالب لوحة إينكوباتي لوحة ح 1 في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
      4. بعد ح 1، استخدام ماصة، وإخراج 90/جيدا وإضافة 100 من بريوارميد 1 × M199 + 1.5% CMC FCS 2% + + القلم/بكتيريا. احتضان لوحة لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
        ملاحظة: تأكد من أن الحل هو استعد في 37 درجة مئوية قبل إضافة إلى لوحات.
  3. وضع لوحة الفحص والتحليل (5 يوم)
    1. وضع لوحة التثبيت والمقايسة اتباع الخطوات 1.3.1.1 إلى 1.3.1.8.
    2. تحديد عيار تحييد 50%
      1. تحديد عيار تحييد 50% عن طريق حساب المسافة النسبية بين تخفيف المصل المتبادلة المذكورة أعلاه وأدناه 50% من عنصر التحكم 'لا مصل' الآبار (مراقبة الفيروسات إيجابية-العمود 10، صفوف ه-ح).
      2. حساب عدد بفو (أي، لويحات) الناجمة عن العدوى الفيروسية الفردية في الآبار المصل ولا آبار مراقبة المصل. حساب متوسط عدد بفو المصل لا مراقبة الآبار وتحديد القيمة 50%.
      3. تحديد تخفيف المصل مع التهم التي يتم فورا فوق وتحت القيمة 50% من آبار مراقبة المصل لا. استخدام الرسم البياني شبه سجل أو قالب جدول البيانات، ارسم عدد بفو على المحور السيني (المقياس الخطي) وتمييع المصل متبادلة على المحور الصادي (سجل الجدول10 ). رسم خط بين النقطتين وقراءة التتر تحييد 50% للاختبار عينات مصلية من هذا الخط.
        ملاحظة: يتم استخدام مقايسة RSV PRN ورقة العمل (ورقة العمل التكميلية) لتحديد عيار تحييد 50%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم إجراء المعايرة من مخزون فيروس من 01:10 إلى 01:108 إضعاف لتحديد تركيز الفيروس الأسهم قبل الفحص PRN (الممثل النتائج هو موضح في الشكل 5). من الرقم 5، بفو يمكن أن تحسب موثوق في تخفيف من 01:10 01:10 و4 5. تم حساب متوسط عدد بفو من ثلاث آبار في إضعاف نفسه. نظراً لأن عدد متوسط من بقع في 01:10 إضعاف5 كان 14، كان تحديد عيار الفيروسية من هذا المخزون الفيروسية كما يلي:

14 (متوسط عدد النقاط)/[10-5 (تمييع) × 0.1 مل (حجم العدوى)] = 1.4 × 107 بفو/mL

استخدام ما ورد أعلاه وصف الأسلوب، وقد قمنا بقياس رعايتها لكلا RSV-A و B في العينات البشرية. الشكل 6 يوضح تفسير الصور جيدا لثلاث عينات المصل الممثل مع اختلاف التتر قبض ضد RSV-ألف. ويبين الشكل 6A جيدا الصور لمعايرة العينة وإنشاء نسخ متماثلة لكل مصل الممثل (لوحة الفحص الفعلي كان replicates التقنية الثلاثة). تخفيف المصل كما ذكرت مختلفة بالنسبة لكل عينة. آبار مراقبة الفيروسات التي تحتوي على الفيروسات ولا مصل فقط كان متوسطها بفو محسوبة والمستخدمة لتحديد وقف تحييد 50 في المائة، وفي هذا المثال هو 52. يوضح الشكل 6B كيف تمت معايرة سيرا ثلاثة تحدد باستخدام هذا الوقف. المتبادلة2 سجل لتمييع المصل المرسومة على المحور س، وعدد بفو كنسبة مئوية من السيطرة على المحور ص. أشرطة الخطأ ورمز يمثل متوسط تريبليكاتيس ± الانحراف المعياري. خمسين في المئة المواقع متوسط في الآبار لمكافحة الفيروسات (المشار إليها بواسطة خط متقطع أفقي) كوقف لتحديد 50% تحييد عيار الأجسام المضادة من عينة المصل. ويعرف عيار الأجسام المضادة تحييد المتبادلة لتمييع يؤدي تثبيط 50% من نشاط الفيروس.

كما يتضمن كل تجربة antiserum مرجع RSV وآبار مراقبة الفيروس إيجابية، توفر مراقبة تقلب المقايسة بين مراقبة الجودة بين التجارب. يبين الشكل 7 نتائج الفحص PRN رسفا في فئات الراشدين مختلفة اثنين من الفوج غامبيا (ن = 21)10 والمتطوعين صحية في ملبورن (N = 36). وكان التتر من قبض RSV متغير داخل كل السكان، مع الكبار الغامبي وجود عيار قبض يعني أقل مقارنة بالكبار ملبورن. ويرد أيضا antiserum مرجع RSV (N = 52 replicates)، مما يدل على تقلب منخفض جداً مع معامل الاختلاف (CV) 6.82%.

Figure 1
رقم 1: تخطيط لوحة المعايرة الفيروسية كوانتيتاتيون أرصدة RSV. الخامس = مخزون فيروس RSV (v1، الأسهم الفيروسية دفعة 1 v2، الأسهم الفيروسية دفعة 2؛ v3، الأسهم الفيروسية دفعة 3)، N = مراقبة سلبية جيدا، س = الوسائط المضافة. الترميز باللون فقط لمساعدة التصور لتخطيط لوحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: مثال عد الإعدادات المستخدمة للقارئ البقع. لقطة شاشة البارامترات المستخدمة عادة لعد لويحات الفيروس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
رقم 3: أمثلة من الحرفية وتعطلت الخلية مونولاييرس. المصنوعات اليدوية (A). (ب) ديسروبتيد خلية مونولاييرس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: قالب لوحة للمقايسة RSV PRN. V = آبار مراقبة إيجابية الفيروسية، N = آبار المراقبة السلبية، X = الوسائط المضافة، S = antiserum مرجع مع تخفيف جميع (من 1: 100 إلى 01:12، 800) في عمود 12. الترميز باللون فقط لمساعدة التصور لتخطيط لوحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5: مثال على نتيجة معايرة الفيروسية RSV. وترد الآبار الممثل من فحص القيام بها في ثلاث نسخ. الأرقام في كل بئر تشير إلى العدد لويحات عد استخدام قارئ البقع. TMC = عدد كبير جداً من العد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: ينتج عن مقايسة RSV PRN ممثل. (أ) حساب عدد بفو لثلاث عينات المصل الفردية وفقا لتمييع مختلف النطاقات. تشير الأرقام في كل صورة جيدا لعدد اللوحات التي تم عدها. (ب) احصل على تفسير عيار من الصور جيدا في الفريق A لثلاث عينات تمثيلية مصل الدم البشري. البيانات يحسب على أساس وقف 50% من آبار مراقبة الفيروس. أشرطة أفقية تمثل يعني ± التنمية المستدامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: RSV تحييد الأجسام المضادة التتر في ملبورن (ن = 21) وغامبيا (N = 36) الكبار. كما يظهر المصل RSV البشرية على مرجع للمقارنة (N = 52 replicates). تمثل الرموز التتر الفردية وأشرطة أفقية تمثل الوسط الهندسي عيار ± 95% CI. N = 52 نتائج تستند إلى ثلاثة فنيين خلال فترة شهرين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure S1
التكميلية رقم 1: "مقارنة احصلي على" التتر ل RSV-ألف. (اليسار) احصل على التتر محسوبة باستخدام نماذج الانحدار الخطي وغير الخطي (N = فحوصات 152). (اليمين) الارتباط بين التتر "رسفا احصلي على" استخدام كلا خطي ونماذج الانحدار غير الخطي. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لقد وضعت والأمثل البساطة والكفاءة RSV إبطال الجزئي مقايسة التي يمكن تكييفها مع سهولة في معظم المختبرات. هذا الفحص غير قادرة على قياس قدرة العدوى الفيروسية، فضلا عن قياس تثبيط العدوى الفيروسية بقبض على المستوى الخلوي باستخدام المسح صورة محوسبة. استخدام منصة المستندة إلى تصوير ونظم محددة تستند إلى جسم زادت خصوصية وحساسية للكشف الموضعي مقارنة باللوحة التقليدية أساليب الكشف عن6،7. وهذا يسمح لتوصيف RSV سلالات مع العدوى المنخفضة، وينص أيضا القياس الكمي دقيقة التركيز RSV قبل استخدامها في التحليل PRN.

من المستحسن أن يستخدم نفس الدفعة من الأسهم الفيروسية لكل دراسة من أجل التقليل إلى أدنى حد من أي دفعة لدفعة الاختلافات بين الأرصدة RSV. وتشمل الجوانب الهامة الأخرى للفحص اتساق الفيروس تركيز الإدخال، سلامة أحادي الطبقة خلايا A549، واستخدام نفس حساب إعدادات لضمان اتساق المقايسة ودقتها. يمكن التحقق من كمية الفيروس إضافة إلى اللوحة مرة أخرى في معايرة فيروسية لوحة منفصلة. بيد رصد الآبار السيطرة الإيجابية للمقايسة PRN أيضا مؤشرا من عيار الفيروسية الفعلية وهي أيضا جديرة بالاهتمام لرصد عبر فحوصات. وعلاوة على ذلك، بما في ذلك المصل المرجعية في كل لوحة تدبير آخر مراقبة الجودة لضمان أن فحوصات يتم استنساخه. ولم تستخدم تجاربنا المصادق عليه مؤخرا RSV antiserum القياسية الدولية من كل، كما أنها لم تكن متاحة في وقت لدينا دراسة11. ينبغي أن يوصي استخدام هذا RSV antiserum القياسية الدولية لدراسات المستقبل قياس قبض RSV حتى أنه يمكن مقارنة النتائج عبر المختبرات بالثقة.

تطوير مقايسة بسيطة نسبيا، الفائق سيسهل جهود التوحيد العالمي للاستخدام لرعايتها RSV مزيد من المختبرات في جميع أنحاء العالم سوف تكون قادرة على استخدام هذا الأسلوب. هذا أمر هام نظراً لأن عدد المرشحين لقاح RSV في التنمية، مع بعض حاليا في تجارب المرحلة 3. من الأهمية بمكان أن نتائج الدراسات السريرية مستقبلا من اللقاحات RSV تكون قابلة للمقارنة، وذلك مقايسة موحدة يمثل جانبا رئيسيا لتحقيق هذا الهدف. وفي حين أن عددا من البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل قد لا تكون قادرة على تقديم الدعم المباشر لاقتناء المعدات اللازمة، الروابط من خلال التعاون الدولي و/أو برامج بناء القدرات سوف يكون حاسما على المديين المتوسط والطويل.

هذا البروتوكول المقايسة قبض مرنة في التمكن من تكييف لخطوط الخلايا المختلفة (A549 و Hep2 و فيرو) ويمكن استخدامها لمختلف سلالات RSV. ونحن أيضا تكيف مع هذا الأسلوب ل RSV-ب بنجاح. كما تم وضع منهاج المقايسة لشكل لوحة 96-جيدا، وهذا يوفر بديلاً فعالاً من حيث التكلفة وعالية الإنتاجية بدقة عالية لأنه يسمح replicates أكثر وإدراج مرجع مصل التحكم والمراقبة السلبية في كل لوحة. كما ينصح باستخدام مصل مرجع عنصر التحكم نفسه كهذا أمر بالغ الأهمية لضمان مراقبة الجودة وضمان الجودة. لقد لاحظنا في أيدينا، السير الذاتية منخفضة جداً من 6.82% للمصل المرجع الذي أقل بكثير من المبلغ عنها السير الذاتية لفحوصات بيولوجية أخرى في حدود 30-40%5.

وعلاوة على ذلك، بيانات الصورة وعدد البيانات (البيانات الخام) التي تم إنشاؤها من هذا البروتوكول يمكن تخزينها إلى أجل غير مسمى للرجوع إليها في المستقبل و/أو التحليل. الاحتفاظ بسجلات للبيانات الخام شرط أساسي للتجارب السريرية، ولا سيما تلك التي تنطوي على المستقبل RSV اللقاحات. (انظر ورقة العمل التكميلية) اقترحت ورقة العمل لدينا في هذا البروتوكول يمكن أن تساعد على تسجيل جميع جوانب التجربة غرض مراقبة الجودة وضمان مراقبة. ورقة العمل يوفر حساب 50% تحييد عيار باستخدام نموذج خطي بسيط كهذا له ميزة لا تتطلب أية برمجيات متخصصة. ومع ذلك، يمكن تحليل البيانات الخام من مقايسة قبض لدينا باستخدام نموذج الانحدار غير الخطي التي استخدمت أيضا في أبحاث اللقاح لحساب التتر تحييد 50%، على الرغم من أن هذا يتطلب برامج الحزم الأخرى12،13 . باستخدام البيانات التجريبية، كانت النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هاتين الطريقتين متشابهة، إعطاء الثقة لعيار القيم التي تم الحصول عليها باستخدام النموذج الخطي المبسط (انظر تكميلية الشكل 1). أن تكلفة إعداد هذا التحليل بأسعار معقولة للعديد من المختبرات مع ربما العنصر الأكثر تكلفة يجري القارئ البقع (تقريبا USD 50 ألف دولار). ومع ذلك، قد القارئ البقع ميزة كونها قادرة على استخدامها في تطبيقات أخرى مثل المرتبط بالانزيم إيمونوسبوت (السبت) سيتوكين و/أو قياس الخلية إفراز الأجسام المضادة، مما يجعلها عنصرا قيماً في تقييم اللقاحات للمحاكمة.

وفي الختام، هذه المقايسة RSV PRN محسنة، والفائق يمكن تنفيذها بسهولة في العديد من المختبرات وستدعم جهود التنسيق الدولي لمنظمة الصحة العالمية لفحوصات قبض RSV. وهذا سيكون حاسما لتقييم المرشحين لقاح RSV الرواية في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون جميع المشتركين. نعترف "برنامج دعم البنية التحتية التشغيلية" للحكومة الفيكتوري. PVL مستلم NHMRC زمالة التنمية المهنية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell line
A549 ATCC CCL-185 provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland
Viral strains
RSV A2 ATCC VR-1540 lot number 60430286
Reagents
Acetone Merck 1000142511
Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) Life Technologies A11055
CMC sodium salt powder Sigma-Aldrich C5678-500G
DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) Scientific Services – Tissue Culture MCRI in house supply
Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C) Interpath SFBS-F
Goat X RSV antibody Merck AB1128
human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) BEI Resources NR-4022 Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832)
M199 powder Life Technologies 31100035
Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) Australian Biosearch 50-82-01
Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) Life Technologies 15140122
s.d.H2O from Milli-Q dispenser Merck In-house dispensation
Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C) Scientific Services – Tissue Culture MCRI in house supply
Tween 20 polysorbate Sigma-Aldrich 9005-64-5
General Consumables
Conical Falcon tubes (50 mL) Invitro Technologies FAL352070
Filter unit 0.22 μm (500 mL) Thermo Fisher NAL5660020
Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) Australia PL AM12400
Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) Interpath 655180
Sterile U-bottom plates (96-well with lid) Interpath 650180
5 mL serological pipette Sigma-Aldrich CLS4487-200EA
10 mL serological pipette Interpath 607180
25 mL serological pipette Sigma-Aldrich CLS4251-200EA
Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 Fisher Biotec TF-200-L-R-S
Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 Fisher Biotec TF-20-L-R-S
Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 Fisher Biotec TF-1000-L-R-S
Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 Fisher Biotec TXLF-10-L-R-S
Equipments and softwares
ELISpot reader system AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
AID ELISpot software version 5.0 AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
Microsoft Excel 2007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
  3. Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
  4. Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
  5. Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
  6. Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
  7. van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
  8. Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
  9. Tripp, R. A., Jorquera, P. A. Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , Humana Press. (2016).
  10. Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
  11. McDonald, J. U., Rigsby, P., Dougall, T., Engelhardt, O. Report on the WHO collaborative study to establish the 1st International Standard for antiserum to Respiratory Syncytial Virus. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y (2017).
  12. Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
  13. Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).

Tags

الطب، العدد 143، الفيروس المخلوي التنفسي، تحييد جسم، جسم، الحد من اللوحة، والأمراض المعدية، وتوحيد
تحليل الجزئي-تحييد فيروس المخلوي تنفسي (RSV) إنتاجية المحسنة وارتفاع
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Do, L. A. H., Tse, R., Nathanielsz,… More

Do, L. A. H., Tse, R., Nathanielsz, J., Anderson, J., Ong, D. S., Chappell, K., Mulholland, K., Licciardi, P. V. An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay. J. Vis. Exp. (143), e59025, doi:10.3791/59025 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter