Summary
Denna studie beskriver en hög genomströmning, imaging-baserade micro-neutralization assay att bestämma titern av neutraliserande antikroppar specifika för respiratory syncytial virus (RSV). Denna assay format har testats på olika provtyper.
Abstract
Respiratory syncytial virus-specifika neutraliserande antikroppar (RSV NAbs) är en viktig markör för skydd mot RSV. Ett antal olika assay format är för närvarande används över hela världen så det finns ett behov av en noggrann och hög genomströmning metod för att mäta RSV NAbs. Här beskriver vi ett imaging-baserade micro-neutralisering test som har testats på RSV undergruppen A och kan även anpassas för RSV undergruppen B och olika provtyper. Denna metod är mycket reproducerbara, med mellan analyser variationer för referens antiserumet är mindre än 10%. Vi anser att denna analys lätt kan fastställas i många laboratorier över hela världen till relativt låg kostnad. Utveckling av ett förbättrat, högt dataflöde test som mäter RSV NAbs utgör ett betydande steg framåt för standardiseringen av denna metod internationellt som är kritiska för utvärdering av romanen RSV vaccinkandidater i framtiden.
Introduction
Respiratory syncytial virus (RSV) är den ledande orsaken av nedre luftvägsinfektioner i den pediatriska population i världen1. Trots dess höga börda finns det fortfarande inget vaccin eller behandling. Sedan 2013 har den Världshälsoorganisationen (WHO) förklarat RSV vaccinutveckling prioriteras större forskning, med årliga WHO samråd möten2,3. WHO har kommit överens om med RSV neutraliserande antikroppar (NAb) mätning för att övervaka vaccin immunogenicitet, som detta är erkänd som den stora serologisk markören för skydd4. NAbs har visat sig skydda mot allvarliga RSV-infektion i ett antal studier samt kliniska prövningar av den anti-RSV monoklonal antikropp palivizumab, för närvarande endast profylaktisk strategi tillgängliga4.
I området i närheten finns det flera NAb assay format används av laboratorier över hela världen, inklusive cell- och molekylär-baserade analyser, som har gjort standardisering ansträngningar utmanande5,6,7,8. Dock fortfarande konventionella plack-minskning neutralisering (PRN) analysen som mäter antalet reducerade plackbildande enheter (PFU) av närvaron av en RSV-specifika antikroppar den gyllene standard9. Vi rapporterar här, en förbättrad, förenklade och hög genomströmning PRN-protokoll som kan användas på många cellinjer, för olika RSV stammar och med ökad assay genomströmning. Detta protokoll har testats med hjälp av kliniska prover från olika miljöer och på prover från djurmodell experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Alla åtgärder måste utföras i en BSL2 huva såvida inget annat anges. Viral titrering krävs i förväg om en PRN-analysen att bestämma den optimala RSV-koncentration som används i PRN-analysen. Det rekommenderas att alikvot virus bestånden i en liten volym som ska Tinas en gång och används för varje NAb assay. Det rekommenderas också att använda samma viral bestånd för alla NAb analyser utförs för alla prover från en studie. Kontrollera att kultur media och fosfatbuffrad saltlösning (PBS) är värmas vid 37 ° C innan du lägger till cell plattor.
1. RSV Viral titrering
Obs: Beroende på antalet virus bestånd och antalet dubbletter, kan haltbestämning plattan inrättas enligt figur 1. Varje virus bestånd bör titreras i tre exemplar ner assay plattan, med den högsta viral koncentrationen (dvs. 1:10). Seriell titreringar kan vara typiskt 1:10. A549 cellkultur och underhåll samt RSV kultur förfarandet görs med hjälp av standardprocedurer och ingår inte i detta protokoll.
- Seedning plattor (dag 1)
- Återsuspendera A549 celler i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) + 10% fetalt kalvserum (FCS) + 1000 IE penicillin/streptomycin (penna/strep) på 4 x 105/ml. Utsäde 96 brunnar platt-sterila bottenplåtar med 100 μL/brunn innehållande 4 x 104 A459 celler.
- Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C, 5% CO2 (celler blir i log-fas tillväxt).
Obs: Använd nya A549 cell injektionsflaskan efter 23 passager. Det är rekommenderat att inte starta experimenten när en ny cell injektionsflaska är fortfarande på första tre passager.
- Virusinfektion (dag 2)
- Beredning av virus följetong utspädning
- Snabbt Tina en fryst injektionsflaska av RSV i 37 ° C vattenbad tills nästan helt tinade och placera omedelbart på is. Förbered 3 replikat för varje RSV virus lager analyseras, använda en inledande virus lager utspädning av 1:10 med 100 μL av utspädda virus per brunn och reservera minst en kolumn för negativ kontroll.
Obs: Figur 1 visar negativ kontroll i exemplar. - Tillsätt 100 μL av varje utspätt virus på 1:10 i tre exemplar av rad A i en 96-väl U-botten steril platta. Lägga till 90 μl per brunn DMEM + 1000 IE penna/strep utan FCS i raderna B-H.
- Utföra seriell 1:10 utspädningar ner plattan genom att överföra 10 μL från rad A att ro B. Mix lösning genom pipettering innehåll upp och ner 5 gånger och fortsätta tiofaldig spädningarna tills raden H. kasta de sista 10 μL så att den avslutande volymen i varje är väl 90 μl.
Obs: Det är viktigt att använda nya tips för varje spädning.
- Snabbt Tina en fryst injektionsflaska av RSV i 37 ° C vattenbad tills nästan helt tinade och placera omedelbart på is. Förbered 3 replikat för varje RSV virus lager analyseras, använda en inledande virus lager utspädning av 1:10 med 100 μL av utspädda virus per brunn och reservera minst en kolumn för negativ kontroll.
-
Virus inympning till A549 celler
- Hämta A549 cell plate(s) beredd på föregående dag. Se till att A549 cell enskiktslager i 96 brunnar tallrikar ~ 80% konfluenta. Kassera media genom att försiktigt vända plattan och lätt blotting på sterila absorberande hushållspapper.
- Tvätta alla brunnar med 100 μL av PBS två gånger, kassera överskott PBS genom att försiktigt vända plattan och lätt blotting på sterila absorberande pappershandduk efter varje tvätt. Tillåt inte plattorna torka.
- Överför virus spädningarna från viral titrering plattan (figur 1) till motsvarande brunnar på A549 cell plattan. Inkubera plattan för 1 h vid 37 ° C, 5% CO2. Efter 1 h inkubation, Dekantera supernatanterna med pipett (för att undvika korskontaminering). Ta ut 90 μl per brunn.
- Tillsätt 100 μL 1 x medium 199 (M199, se tabell för material) + 1,5% karboximetylcellulosa natriumsalt (CMC) låg viskositet + 2% FCS som innehåller penna/strep till varje brunn.
Obs: 2 x M199 + 4% FCS + 2% penna/strep och 3% CMC lösningar behöver förberedas i förväg och lagras vid 4 ° C för framtida bruk. Kontrollera lösningen värms vid 37 ° C innan du lägger till plattor.- Förbered 2 x M199 lösning: 1 dospåse/500 mL destillerat vatten + 20 mL FCS + 10 mL penna/strep (göra upp 2 x MI99). Filtrera lösningen med en 0,22 μm filterenhet.
- För beredning av 3% CMC, tillsätt 15 g CMC långsamt till 500 mL destillerat vatten. Lös upp CMC i vatten med hjälp av metalliskt omrörare värmare vid 50 ° C, som tar ca 1 h av preparatet. Blanda väl att göra 3% CMC och autoklavera lösningen.
Obs: CMC solid måste läggas till vattnet för att upplösas; tillsats av vatten till de torra fasta producerar en ”klump” i fast form som är mycket svårt att lösa upp. - Förbereda 1 x M199 + 1,5% CMC låg viskositet + 2% FCS som innehåller penna/strep genom att blanda 1:1 2 x M199 och 3% CMC bereddes i steg 1.2.2.4.2.
- Inkubera plattan i 3 dagar vid 37 ° C, 5% CO2.
- Beredning av virus följetong utspädning
- Utveckla assay plattan och analys (dag 5)
- Fixering och utveckla analysen plattan
- Kassera M199 + CMC + 2% FCS innehållande penna/strep genom att försiktigt vända plattan. Tillsätt långsamt (för att undvika att störa det cell-lagret) 200 μL av fixering buffert (80% aceton, 20% PBS, lagras vid-20 ° C) fixar celler. Inkubera vid-20 ° C i 20 min.
- Kassera fixering bufferten och försiktigt blot på absorberande pappershandduk. Lämna plattan ansikte ner till torr i 10 min.
Obs: Från detta steg framåt, kan analysen utföras utanför BSL2 huven. - Förbereda 5% mjölk spädningsvätska blockerande lösning i filtrerade PBS som innehåller 0,05% polysorbat 20 (PBS-polysorbat, se Tabell för material). För en plåt, beräkna den volym som krävs för blockering bygger på 200/110 och brunnar: 200 per brunn x 110 brunnar = 22 mL (1,1 mL koncentrerad mjölk spädningsvätska i 20,9 mL filtrerat PBS-polysorbat). I detta skede, också göra upp tillräcklig blockerande lösning för primära och sekundära antikroppar. För en plåt, beräkna den volym som krävs för varje antikropp lösning baserad på 50/väl och 110 brunnar: 50/väl x 110 brunnar = 5,5 mL. Därför är den totala mängden mjölk spädningsvätska blockerar lösningen som behövs för en enda skylt analys 33 mL.
- Lägga till 200 /well blockerande lösning. Inkubera plattan vid rumstemperatur (RT) i 30 min. Kassera lösningen genom att försiktigt vända plattan och blot på absorberande pappershandduk.
- Laga 1: 500 get X RSV antikroppar (mAb – primär antikropp) utspätt i blockering lösning. Tillsätt 50 /well mAb lösning och inkubera vid 37 ° C under 1 h. Tvätta plattan 3 gånger med filtrerade PBS-polysorbat.
- Tillaga 1:5,000 Alexa-Fluor åsna anti get IgG (sekundär antikropp) utspätt i blockering lösning. Tillsätt 50 /well av sekundär antikropp lösningen och inkubera vid 37 ° C under 1 h. Tvätta plattan 5 gånger med filtrerade PBS-polysorbat.
- Läs plattan på en automatiserad ställen läsare med fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) kanal och räkna inställningar som visas i figur 2. Linda in plattan i folie och förvara vid 4 ° C. Kalibrera instrumentet med hjälp av en oanvänd 96 brunnar kultur plattan och inmatning av greve inställningar innan analys.
Obs: Avsökning inom några dagar är möjligt om det behövs. Den kalibrering och räkna inställningen kan sparas och användas för den framtida genomsökning om analysen använder samma typ av plåt som används för kalibrering. - Kolla bilderna av brunnar för artefakt plack eller störd cell enskiktslager (figur 3). Utesluta brunnar med störd cell enskiktslager.
Obs: Beroende på storleken på artefact plack, manuella räkningar kan behöva utföras för dessa brunnar eller dessa brunnar kan behöva kasseras från dataanalys. Kriterier för ett giltigt resultat inkluderar inga störd cell enskiktslager eller artefakt plack upptäcktes i mer än en replikera väl och inga PFU upptäckts i negativa wells (brunnar utan extra virus).
-
Fastställa viral koncentrationer
- Välja de senast två utspädningar där ställen kan räknas tydligt. Beräkna det genomsnittliga antalet ställen från replikera brunnar med samma utspädning. Beräkna viral titern (PFU / mL) av lager provet med hjälp av formeln nedan:
PFU/mL = Genomsnittligt antal plaketter / (utspädning faktor × volym av utspädda virus lagt till brunnen)
Obs: Virus koncentrationen bestäms för varje RSV bestånd kan nu användas i PRN-analysen (steg 2).
- Välja de senast två utspädningar där ställen kan räknas tydligt. Beräkna det genomsnittliga antalet ställen från replikera brunnar med samma utspädning. Beräkna viral titern (PFU / mL) av lager provet med hjälp av formeln nedan:
- Fixering och utveckla analysen plattan
2. RSV Neutralization Assay
-
Seedning plattor (dag 1)
- Återsuspendera A549 celler DMEM + 10% FCS + 1000 IE penna/strep på 4 x 105/ml. Utsäde 96 brunnar platt-sterila bottenplåtar med 100 μL/brunn innehållande 4 x 104 A459 celler och inkubera plattorna över natten vid 37 ° C, 5% CO2 (celler blir i log-fas tillväxt).
Obs: Använd nya A549 cell injektionsflaskan efter 23 passager. Det rekommenderas inte att använda A549 celler innan passage nummer 3.
- Återsuspendera A549 celler DMEM + 10% FCS + 1000 IE penna/strep på 4 x 105/ml. Utsäde 96 brunnar platt-sterila bottenplåtar med 100 μL/brunn innehållande 4 x 104 A459 celler och inkubera plattorna över natten vid 37 ° C, 5% CO2 (celler blir i log-fas tillväxt).
-
Virus och serum förberedelse (dag 2)
Obs: Beroende på Provtyp av finns det steg som krävs för förbehandling prover innan NAb analysen. Det är rekommenderat att använda de RSV internationellt standardserum som nu finns tillgängliga på begäran från det nationella institutet för biologiska standarder och kontroller (NIBSC).-
Beredning av en spädning av serumet
- Tina det mänskliga RSV referens antiserumet (referensserum, REF) och serum prover på RT. värme-inaktivera serumprover och referera antiserum i ett vattenbad vid 56 ° C i 30 min innan användning. Preparera utspädningar enligt mallen plattan (figur 4).
- Bered 1: 100 utspädningen av REF. Förbered minst 110 μL av REF utspätt i DMEM + penna/strep utan FCS per assay platta (t.ex., 1,5 μL av REF i en total volym på 150 μL). Tillsätt 110 μl av 1: 100 utspädd REF i väl A12 av en 96 brunnar U-botten steril platta.
- Tillsätt 55 μL av DMEM + penna/strep utan FCS brunnar B12 till H12 i kolumn 12. Utföra serial 1:2 utspädningar ner plattan genom att överföra 55 μL från rad A till rad B, blandningslösning av pipettering innehåll upp och ner 5 gånger och fortsätter tills raden H. Kassera den slutliga 55 μL av media så att den avslutande volymen i varje är väl 55 μL. Använd nya tips för varje spädning.
- Bered 1: 100 utspädningen av serum prover. Som alla serumprover är analyseras i tre exemplar, förbereda en minsta volym på 110 μL/brunn x 3 = 330 μl per serum analysprov.
- Tillsätt 110 μl av varje utspätt serumprov (1: 100; S1 = serum 1, S2 = serum 2, etc.) till motsvarande brunnar A1 till A9 och även E1 till E9 av 96 brunnar sterila plattan enligt figur 4.
- Lägg till 55 μL av DMEM + penna/strep utan FCS alla brunnar märkt X. utför serial 1:2 spädningar enligt steg 2.2.1.3 tills raden D (för prover 1, 2 och 3). Kassera den slutliga 55 μL av media så att den avslutande volymen i varje brunn är 55 μL. Likaså utför följetongen 1:2 spädningar för prov 4, 5 och 6 för rader E-H.
Obs: Det är viktigt att använda nya tips för varje spädning. - Tillsätt 55 μL av DMEM + penna/strep utan FCS brunnar i kolumner 10 och 11.
-
Beredning av virus
- Snabbt Tina en fryst injektionsflaska av RSV i 37 ° C vattenbad tills nästan helt tinade och placera omedelbart på is.
- Späd ut virus i DMEM + penna/strep utan FCS baserat på koncentrationen av RSV alikvoten bestäms i steg 1.3.2. Applicera en utspädning som ger cirka 200 PFU/brunn. Förbereda en total volym på 5,5 mL (för 100 brunnar).
-
Beredning av blandning av virus-serum
- Lägga till 55 av utspädda viruset till alla brunnar i kolumn 1-9 och brunnar i rader E-H kolumner 10 och 11 (positiv kontroll) enligt mallen plattan (figur 4).
- Lägg till 55 DMEM + penna/strep utan FCS till alla brunnar i rader A-D kolumner 10 och 11 (negativ kontroll). Inkubera plattan för 1 h vid 37 ° C, 5% CO2.
-
Virus inympning till A549 celler
- Innan slutförandet av inkubationstiden, Hämta A549 cell plate(s) bereddes i steg 2.1.1. Se till att A549 cell enskiktslager i 96 brunnar tallrikar ~ 80% konfluenta.
- Kassera media genom att försiktigt vända plattan och lätt blotting på sterila absorberande hushållspapper. Tvätta alla brunnar med 100 μL av PBS två gånger, kassera överskott PBS genom att försiktigt vända plattan och lätt blotting på sterila absorberande pappershandduk efter varje tvätt. Tillåt inte plattorna torka.
- Överför 100 /well av virus-serum blandningen till motsvarande brunnarna på A549 cell tallrik efter tallrik mallen Inkubera plattan för 1 h vid 37 ° C, 5% CO2.
- Efter 1 h, med pipett, ta ut 90/väl och Lägg föruppvärmd 100 av 1 x M199 + 1,5% CMC + 2% FCS + penna/strep. Inkubera plattan i 3 dagar vid 37 ° C, 5% CO2.
Obs: Kontrollera lösningen värms vid 37 ° C innan du lägger till plattor.
-
Beredning av en spädning av serumet
-
Utveckla assay plattan och analys (dag 5)
- Utveckla fixering och haltbestämning plattan följande steg 1.3.1.1 till 1.3.1.8.
- Fastställa 50% neutralisation titern
- Fastställa 50% neutralisation titern genom beräkning av proportionella avståndet mellan de ömsesidiga serumspädningarna ovan och under 50% av den ' ingen ' serumkontroll brunnar (positiv virus kontroll - kolumn 10, rader E-H).
- Räkna antalet PFU (dvs, plack) som härrör från enskilda virusinfektioner i serum brunnar och ingen serum kontrollbrunnarna. Beräkna det genomsnittliga antalet PFU av ingen serum kontrollbrunnar och avgöra värdet 50%.
- Identifiera serumspädningar med räknas som är omedelbart ovanför och under 50% värdet av de ingen serum-kontrollbrunnarna. Använda halvlogaritmiskt diagram eller kalkylarksmallen, rita av antalet PFU på x-axeln (linjär skala) och den ömsesidiga serumspädningen på y-axeln (log10 skala). Rita en linje mellan de två punkterna och läsa de 50% neutralisation titrarna av testet serumprover från denna linje.
Obs: RSV PRN assay kalkylbladet (Kompletterande kalkylblad) används för att bestämma 50% neutralisation titern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Titrering av en virus lager utfördes från 1:10 till 1:108 utspädning att bestämma virus lager koncentrationen före PRN analysen (representativa resultat visas i figur 5). Från figur 5, PFU kan räknas på ett tillförlitligt sätt på utspädningar av 1:104 och 1:105. Det genomsnittliga antalet PFU från tre exemplar brunnar med samma utspädning har beräknats. Sedan det genomsnittliga antalet ställen på 1:105 utspädning var 14, var viral antikroppnivåns på detta viral bestånd bestämmas enligt följande:
14 (genomsnittligt antal ställen) / [10-5 (utspädning) x 0,1 mL (volym av inokulatet)] = 1,4 x 107 PFU/mL
Med hjälp av ovanstående beskrivna metoden, vi har mätt NAbs för både RSV-A och B i mänskliga prover. Figur 6 visar tolkningen av väl bilder av tre representativa serumprover med varierande NAb titrarna mot RSV-A. Figur 6A visar väl bilder av provet titrering replikat för varje representativ serum (faktiska assay plattan hade tre tekniska replikat). Serumspädningar som anges är olika för varje prov. Virus kontrollbrunnar som endast innehåller virus och inget serum hade deras genomsnittliga PFU beräknas och används för att bestämma 50% neutralisation cut-off, som i detta exempel var 52. Figur 6B illustrerar hur titrering av tre sera var fastställs med hjälp av denna cut-off. Det log2 reciproka värdet av serumspädningen ritas på x-axeln och antalet PFU som en procentandel av kontroll på y-axeln. Symbol och felstaplar representerar medelvärdet av exemplar ± standardavvikelse. Femtio procent av de genomsnittliga ställena i virus-kontroll brunnarna (indikeras av den vågräta streckade linjen) användes som en cut-off för att avgöra de 50% neutraliserande antikropp titer för ett serumprov. Neutraliserande antikroppar Titern definieras som det reciproka värdet av den utspädning som skulle resultera i 50% hämning av virusaktivitet.
Som varje experiment inkluderar RSV referens antiserum samt positiva virus kontrollbrunnar, ger övervakning mellan analyser variabiliteten kvalitetskontroll mellan experiment. Figur 7 visar resultaten av RSV-A PRN analysen i två olika vuxen kohorter från Gambia kohorten (N = 21)10 och friska i Melbourne (N = 36). Titrar av RSV NAb var variabel inom varje population med gambisk vuxna ha en lägre antikroppnivåns på NAb som jämfört med de Melbourne vuxna. RSV referens antiserumet visas också (N = 52 replikat), visar mycket låg variabilitet med en variationskoefficient (CV) för 6.82%.
Figur 1: Viral titrering plattan layout för kvantitering av RSV bestånd. v = lager av RSV virus (v1, lager av viral batch 1 v2, lager av viral batch 2; v3, lager av viral batch 3), N = negativ kontroll Tja, X = media lagt till. Färgkodningen är endast att stödet visualisering av plattan layout. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exempel räkna inställningar används för ställen läsaren. Skärmdump av de parametrar som vanligtvis används för att räkna virus plack. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: exempel på artefakt och störd cell enskiktslager. (A) artefakter. (B) störd cell enskiktslager. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: plattan mall för RSV PRN assay. V = viral positiva kontrollbrunnar, N = negativa kontrollbrunnar, X = media lagt, S = referens antiserum med alla spädningar (från 1: 100 till 1:12, 800) i kolumn 12. Färgkodningen är endast att stödet visualisering av plattan layout. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: ett exempel på ett resultat för viral titrering av RSV. Företrädaren wells från en analys som utförs i tre exemplar visas. Siffrorna i varje brunn hänvisar till antalet plack räknade med ställen läsaren. TMC = för många att räkna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: resultat från en representativ RSV PRN-assay. (A) antalet PFU räknas för tre enskilda serumprov enligt olika utspädning spänner. Siffrorna i varje väl bild hänvisar till antalet plack som räknas. (B) NAb titer tolkning från väl bilderna i panel A för tre representativa humant serumprover. Data beräknas på grundval av 50% cut-off från virus kontrollbrunnarna. Horisontella staplarna representerar medelvärde ± SD. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 7: RSV neutraliserande antikropp titrar i Melbourne (N = 21) och Gambisk (N = 36) vuxna. Det mänskliga RSV referensserumet visas även för jämförelse (N = 52 replikat). Symboler som representerar enskilda titrar och räck geometrisk genomsnittlig titer ± 95% CI. N = 52 resultat baseras på tre tekniker under en två månaders period. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur1: jämförelse av NAb titrarna för RSV-A. (Vänster) NAb titrar beräknas med hjälp av de linjära och icke-linjära regressionsmodeller (N = 152 analyser). (Höger) Korrelation mellan RSV-A NAb titrar med både linjära och icke-linjära regressionsmodeller. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utvecklat och optimerat en enkel och effektiv RSV mikro-neutralization assay som lätt kan anpassas i de flesta laboratorier. Denna analys är kunna mäta virusinfektion förmåga samt mäta hämning av virusinfektion av NAb på cellnivå med datoriserad bild scanning. Användning av en imaging-baserad plattform och specifika antikroppsbaserade system har ökat den specificitet och känslighet för spot detection jämfört med traditionella plack upptäckt metoder6,7. Detta tillåter karakterisering av RSV stammar med låg smittsamhet och ger också en exakt kvantifiering av RSV koncentration före användning i PRN-analysen.
Det rekommenderas att samma parti av viral materiel används för varje studie för att minimera eventuella sats till sats variationer mellan RSV bestånd. Andra viktiga aspekter av analysen inkludera konsekvens av virus ingående koncentration, integriteten för den A549 cell enskiktslager, och med samma antal inställningar för att säkerställa analysens enhetlighet och exakthet. Mängden virus till plattan kan verifieras igen i en separat plack viral titrering. Dock övervakning de positiva kontrollbrunnarna PRN analysens också ger en indikation av faktiska viral titer och är också värdefullt att övervaka över analyser. Inklusive referensserumet i varje tallrik är dessutom en annan kvalitetskontroll åtgärd så att analyser är reproducerbara. Våra experiment använde inte nyligen validerade RSV internationella standard antiserumet från NIBSC, eftersom det inte var tillgängliga vid tiden för vår studie11. Med hjälp av denna internationella standard RSV-antiserum bör rekommenderas för framtida studier mäta RSV NAb så att resultatet över laboratorier kan jämföras med tillförsikt.
Utveckling av en relativt enkla, hög genomströmning analysen skulle underlätta global standardisering ansträngningar för användning av RSV NAbs som fler laboratorier över hela världen skulle kunna använda denna metod. Detta är särskilt viktigt med tanke på antalet RSV vaccinkandidater i utveckling, med några för närvarande i fas 3 studier. Det är viktigt att resultaten av framtida kliniska studier av RSV vacciner vara jämförbara, och en standardiserad analys utgör därför en viktig aspekt till detta mål. Även ett antal låg - och medelinkomstländer inte kanske kunna direkt stödja förvärvet av utrustningen som behövs, kopplingar genom internationella samarbeten och/eller program för kapacitetsuppbyggnad kommer att vara avgörande på medellång till lång sikt.
Detta NAb assay protokoll är flexibel i att kunna anpassas till olika cellinjer (A549, Hep2 och Vero) och kan användas för olika RSV stammar. Vi har också anpassat denna metod för RSV-B framgångsrikt. Som assay plattformen har utvecklats för ett plattan med 96 brunnar-format, detta ger ett kostnadseffektivt och hög genomströmning alternativ med hög noggrannhet eftersom det tillåter fler replikat och införandet av den referens serumkontroll och negativ kontroll på varje plattan. Använda samma referens serumkontroll rekommenderas också eftersom detta är avgörande för att säkerställa kvalitetskontroll och kvalitetssäkring. I våra händer observerade vi mycket låg CVs 6.82% för den referensserum som är mycket lägre än rapporterade CVs för andra biologiska analyser i intervallet 30-40%5.
Dessutom kan bilddata och de räkna data (rådata) som genereras från detta protokoll lagras på obestämd tid för framtida referens eller analys. Dokumentation av raw-data är en förutsättning för kliniska prövningar, särskilt de som rör framtida RSV vacciner. Våra kalkylblad (se Kompletterande kalkylblad) föreslog i detta protokoll kan hjälpa till att registrera alla aspekter av experimentet används för kvalitetskontroll och kvalitetssäkring kontroll. Kalkylbladet ger beräkningen av de 50% neutraliserande titer med en enkel linjär modell som detta har fördelen att inte kräva någon specialiserad mjukvara. Emellertid kan rådata från våra NAb-analysen analyseras med den icke-linjära regressionsmodell som också använts i vaccinforskningen för beräkning av 50% neutraliserande titrar, även om detta kräver andra programvara paket12,13 . Använder våra experimentella data, de resultat som erhålls med hjälp av dessa två metoder var liknande, ger förtroende till titer värden som erhålls med hjälp av förenklade linjära modellen (se kompletterande Figur1). Kostnaden för inrättandet av denna analys är överkomligt för många laboratorier med kanske dyraste objektet vara ställen läsaren (cirka USD $50K). Ställen läsaren har dock fördelen att kunna användas för andra applikationer såsom den enzymkopplad immunospot (ELISpot) för cytokin och/eller antikropp-utsöndrar cell mätning, vilket gör det en värdefull komponent i vaccinet rättegång utvärdering.
Avslutningsvis denna förbättrade, hög genomströmning RSV PRN analys lätt kan genomföras i många laboratorier och kommer att stödja den internationella harmonisering ansträngningen att som för RSV NAb analyser. Detta kommer att vara avgörande för utvärdering av romanen RSV vaccinkandidater i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka alla inblandade deltagare. Vi erkänner den viktorianska regeringens operativa infrastrukturen Support Program. PVL är en NHMRC karriär utveckling-stipendiat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22 μm (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
References
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
- Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
- Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
- Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
- van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
- Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
- Tripp, R. A., Jorquera, P. A. Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , Humana Press. (2016).
- Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
- McDonald, J. U., Rigsby, P., Dougall, T., Engelhardt, O. Report on the WHO collaborative study to establish the 1st International Standard for antiserum to Respiratory Syncytial Virus. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y (2017).
- Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
- Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).
