Summary
Este estudio describe un alto rendimiento, basado en la proyección de imagen de neutralización micro ensayo para determinar el título de anticuerpos neutralizantes específicos para virus sincicial respiratorio (VSR). Este formato de ensayo ha sido probado en tipos diferentes de la muestra.
Abstract
Respiratorios sincicial virus específicos anticuerpos neutralizantes (NAbs de RSV) son un marcador importante de protección contra el VRS. Un número de formatos de ensayo diferentes está en uso en todo el mundo así que hay una necesidad de un método preciso y de alto rendimiento para medir RSV NAbs. Aquí describimos un análisis micro-neutralización basado en proyección de imagen que ha sido probado en el subgrupo de RSV A y también puede ser adaptado para RSV subgrupos B y tipos de muestras diferentes. Este método es altamente reproducible, con variaciones inter-ensayos para el antisuero de referencia siendo menos del 10%. Creemos que este análisis pueden establecerse fácilmente en muchos laboratorios en todo el mundo a un costo relativamente bajo. Desarrollo de un ensayo mejorado, de alto rendimiento que mide RSV NAbs representa un importante paso adelante para la estandarización de este método internacionalmente como críticos para la evaluación de nuevos candidatos vacunales de RSV en el futuro.
Introduction
Virus sincitial respiratorio (VSR) es la principal causa de infecciones del tracto respiratorio inferiores en la población pediátrica en todo el mundo1. A pesar de su alta carga, no existe todavía ninguna vacuna o tratamiento. Desde 2013, la Organización Mundial de la salud (OMS) ha declarado el desarrollo de una vacuna RSV como una prioridad de investigación, con reuniones consulta anual WHO2,,3. La OMS ha acordado con RSV neutralizando la medición de anticuerpos (NAb) para supervisar la inmunogenicidad de la vacuna, esto se reconoce como el marcador serológico más importante de protección4. Atrapó se han demostrado para proteger contra la infección de RSV grave en un número de estudios y ensayos clínicos del palivizumab anticuerpo monoclonal de anti-RSV, actualmente la estrategia profiláctico disponible4.
Existen múltiples formatos de ensayo NAb utilizados por laboratorios de todo el mundo, incluyendo análisis celular y molecular, que han hecho esfuerzos de estandarización difícil5,6,7,8. Sin embargo, el ensayo de neutralización (PRN) de reducción de placa convencional que mide el número de placa reducida formando unidades (PFU) por la presencia de un anticuerpo específico de RSV sigue siendo el estándar de oro9. Aquí, Divulgamos un protocolo PRN mejor, simplificado y de alto rendimiento que puede utilizarse en numerosas líneas celulares de diferentes cepas de RSV y con capacidad de análisis mayor. Este protocolo ha sido probada utilizando muestras clínicas de diferentes contextos, así como muestras de experimentos de modelo animal.
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Protocol
Nota: Todas las medidas deben realizarse en una campana de BSL2 indique diferentemente. Titulación viral se requiere antes de un ensayo PRN para determinar la concentración óptima de RSV utilizada en el ensayo PRN. Se recomienda a alícuota a las poblaciones de virus en un pequeño volumen que serán descongelados una vez y para cada ensayo de NAb. También se recomienda usar el mismo stock viral para todos los ensayos de NAb realizados para todas las muestras de un estudio. Asegúrese de que los medios de cultivo y solución salina tamponada con fosfato (PBS) se calienta a 37 ° C antes de agregar placas de células.
1. titulación Viral VRS
Nota: Dependiendo del número de poblaciones de virus y el número de duplicados, la placa de ensayo puede configurarse según figura 1. Cada stock de virus debe titularse por triplicado hacia abajo la placa de ensayo, a partir de la mayor concentración viral (es decir, 1:10). Titulaciones seriales pueden ser típicamente 1:10. Cultivo de células A549 y mantenimiento, así como procedimiento de cultura de RSV se realiza empleando los procedimientos estándar y no se incluyen en este protocolo.
- Placas de siembra (día 1)
- Resuspender las células A549 de Dulbecco modificado águilas mediana (DMEM) + 10% de suero fetal de ternero (FCS) + 1000 UI penicilina/estreptomicina (pen/strep) en 4 x 105/ml. Semilla de 96 pozos fondo plano placas estériles con 100 μL/pocillo que contiene 4 x 104 A459 células.
- Incubar las placas durante la noche a 37 ° C, 5% CO2 (células será en el crecimiento de la fase logarítmica).
Nota: Utilice el nuevo vial de células A549 después 23 pasajes. Se recomienda no empezar los experimentos cuando un vial nuevo de celular todavía está en los primeros tres pasos.
- Infección por el virus (día 2)
- Preparación de la dilución serial virus
- Rápidamente descongelar un vial congelado individual de RSV en un baño de agua de 37 ° C hasta casi completamente descongelada y colocar inmediatamente en hielo. Preparar 3 repeticiones para cada RSV stock virus ensayarse, utilizar una dilución de virus inicial stock de 1:10 con 100 μL de virus diluido/bien y reservar al menos una columna para el control negativo.
Nota: La figura 1 muestra control negativo en triplicado. - Añada 100 μL de cada virus diluido en 1:10 por triplicado de la columna A de un fondo de U 96 pocillos placa estéril. Agregar 90 μL/pocillo de DMEM + 1000 UI pluma/estreptococos sin FCS a filas B a H.
- Realizar la serie 1:10 diluciones hacia abajo la placa al transferir 10 μL de fila A fila solución B. Mezclar por pipeteo contenido arriba y abajo 5 veces y continuar con las diluciones diez veces hasta fila H. descartar el final 10 μL para que el volumen final en cada bien es 90 μL.
Nota: Es importante utilizar puntas nuevas para cada dilución.
- Rápidamente descongelar un vial congelado individual de RSV en un baño de agua de 37 ° C hasta casi completamente descongelada y colocar inmediatamente en hielo. Preparar 3 repeticiones para cada RSV stock virus ensayarse, utilizar una dilución de virus inicial stock de 1:10 con 100 μL de virus diluido/bien y reservar al menos una columna para el control negativo.
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Inoculación del virus a las células A549
- Recuperar cell plate(s) A549 preparado el día anterior. Que sean monocapas de células A549 en placas de 96 pocillos confluentes de ~ 80%. Desechar el medio por inversión suavemente de la placa y borrar suavemente sobre una toalla de papel absorbente estéril.
- Lavar todos los pocillos con 100 μL de PBS dos veces, deseche el exceso PBS por inversión suavemente de la placa y borrar suavemente sobre una toalla de papel absorbente estéril después de cada lavado. No permita que las placas se sequen.
- Transferencia de las diluciones de virus de la placa de titulación viral (figura 1) en los pocillos correspondientes en la placa de células A549. Incubar la placa por 1 h a 37 ° C, 5% CO2. Después de 1 h de incubación, decantar el sobrenadante con una pipeta (para evitar contaminación cruzada). Saque 90 μL/pozo.
- Añada 100 μL de medio de 1 x 199 (M199, véase tabla de materiales) + 1,5% sal de sodio carboximetilcelulosa (CMC) de baja viscosidad + 2% FCS con pluma/strep a cada pocillo.
Nota: 2 x M199 + 4% FCS + pluma/estreptococos a 2% y 3% CMC soluciones necesitan ser preparados de antemano y almacenados a 4 ° C para su uso futuro. Asegúrese de que la solución se calienta a 37 ° C antes de agregar a las placas.- Preparar la solución x M199 2: 1 sachet/500 mL agua destilada 20 mL FCS, agua + 10 mL pluma/strep (para 2 x MI99). Filtrar la solución utilizando una unidad de filtro de 0,22 μm.
- Para la preparación de 3% CMC, añadir 15 g de CMC lentamente en 500 mL de agua destilada. Disolver el CMC en agua usando calentador agitador metálico a 50 ° C, que toma cerca de 1 hora de preparación. Mezclar bien para hacer 3% CMC y autoclave la solución.
Nota: El CMC sólido debe agregarse al agua para disolverse; Añadir agua al sólido seco produce un "bosquecillo" del sólido que es muy difícil de disolver. - Preparar 1 x M199 + viscosidad baja de CMC 1,5% + 2% FCS con pluma/strep por mezcla 1:1 2 x M199 y 3% CMC preparado en el paso 1.2.2.4.2.
- Incubar la placa por 3 días a 37 ° C, 5% CO2.
- Preparación de la dilución serial virus
- Desarrollo de la placa de ensayo y análisis (día 5)
- Fijación y desarrollo de ensayo de placa
- Deseche el M199 + CMC + 2% FCS con pluma/strep invirtiendo suavemente la placa. Añadir poco a poco (para evitar perturbar la capa de células) 200 μL de tampón de fijación (acetona al 80%, 20% PBS, almacenado a-20 ° C) para fijar las células. Incubar a-20 ° C por 20 min.
- Desechar el tampón de fijación y luego suavemente sobre una toalla de papel absorbente. Deja la cara de la placa hasta seco durante 10 minutos.
Nota: De este paso se puede realizar análisis fuera de la campana BSL2. - Preparar 5% leche diluyente bloqueo solución filtrada PBS que contenga 0.05% polisorbato 20 (PBS-polisorbato, véase Tabla de materiales). Para una placa, calcular el volumen necesario para bloqueo basado en 200 y bien 110 pozos: pozos de 200/bien x 110 = 22 mL (1.1 mL concentrado leche diluyente en 20,9 mL filtrada PBS-polisorbato). En esta etapa, también forman parte suficiente de solución de bloqueo por anticuerpos primarios y secundarios. Para una placa, calcular el volumen necesario para cada solución de anticuerpo, basado en 50 y bien 110 pozos: 110 pozos 50/bien x = 5,5 mL. Por lo tanto, el volumen total de diluyente leche bloqueando la solución necesaria para un análisis de la placa solo es de 33 mL.
- Añadir 200 /well de solución de bloqueo. Incubar la placa a temperatura ambiente (RT) durante 30 minutos, desechar la solución invirtiendo suavemente la placa y secar sobre una toalla de papel absorbente.
- Preparación de anticuerpos de cabra X VRS 1: 500 (mAb – anticuerpo primario) diluido en solución de bloqueo. Añadir 50 /well de la solución de mAb e incubar a 37 ° C por 1 h. placa de lavado 3 veces con PBS-polisorbato filtrada.
- Preparar 1:5,000 burro de Alexa Fluor anti-cabra IgG (anticuerpo secundario) diluido en solución de bloqueo. Añadir 50 /well de la solución de anticuerpo secundario e incubar a 37 ° C por 1 h. placa de lavado 5 veces con PBS-polisorbato filtrada.
- Leer la placa en un lector automatizado puntos utilizando el canal de fluoresceína isotiocianato (FITC) y contar la configuración como se muestra en la figura 2. Envuelva la placa en papel y almacenar a 4 ° C. Calibrar el instrumento usando una placa de cultivo de 96 pocillos no utilizados y la introducción de ajustes de cuenta antes del ensayo.
Nota: Volver a exploración en pocos días es posible si es necesario. La calibración y ajuste de cuenta se pueden guardar y utilizar para la exploración futura, si el ensayo utiliza el mismo tipo de placa utilizada para la calibración. - Revise las imágenes de pozos de las placas de artefacto o monocapas de células perturbada (figura 3). Excluye pozos con monocapas de células interrumpida.
Nota: Dependiendo del tamaño de las placas de artefacto, manual de cuentas deba realizarse para los pozos o los pozos deba descartarse del análisis de los datos. Los criterios para un resultado válido incluyen no perturbada célula monocapa o artefacto placas detectadas en más de una repetición bien y no PFU detectada en pozos negativos (pozos sin virus agregado).
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Determinar las concentraciones virales
- Elija las dos últimas diluciones donde pueden contarse claramente puntos. Calcular el número promedio de puntos de replicación pozos en la misma dilución. Calcular la concentración viral (PFU / mL) de la muestra común utilizando la siguiente fórmula:
PFU/mL = promedio del número de placas / (factor de dilución × volumen de virus diluido añadido al pozo)
Nota: La concentración del virus determinada para cada acción de RSV puede utilizarse ahora en el análisis PRN (paso 2).
- Elija las dos últimas diluciones donde pueden contarse claramente puntos. Calcular el número promedio de puntos de replicación pozos en la misma dilución. Calcular la concentración viral (PFU / mL) de la muestra común utilizando la siguiente fórmula:
- Fijación y desarrollo de ensayo de placa
2. ensayo de neutralización VRS
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Placas de siembra (día 1)
- Resuspender las células A549 en DMEM + 10% FCS + 1000 UI pluma/strep en 4 x 105/ml. Placas estériles de semilla 96 pozos de fondo plano con 100 μL/pocillo que contiene 4 x 104 A459 células e incubar las placas durante la noche a 37 ° C, 5% CO2 (células será en el crecimiento de la fase logarítmica).
Nota: Utilice el nuevo vial de células A549 después 23 pasajes. No se recomienda utilizar las células A549 antes del número de paso 3.
- Resuspender las células A549 en DMEM + 10% FCS + 1000 UI pluma/strep en 4 x 105/ml. Placas estériles de semilla 96 pozos de fondo plano con 100 μL/pocillo que contiene 4 x 104 A459 células e incubar las placas durante la noche a 37 ° C, 5% CO2 (células será en el crecimiento de la fase logarítmica).
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Preparación de suero y virus (día 2)
Nota: Dependiendo del tipo de muestra, hay pasos requeridos para preprocesamiento muestras antes del ensayo de NAb. Se recomienda usar el suero estándar internacional de RSV que ahora está disponible a petición del Instituto Nacional para estándares biológicos y control (NIBSC).-
Preparación de la dilución de suero
- Descongelar el antisuero de referencia RSV humano (suero de referencia, REF) y suero prueba las muestras de excelencia-Inactive por calor las muestras de suero y antisuero en un baño de agua a 56 ° C durante 30 minutos antes de usarlo de referencia. Preparar diluciones según la plantilla de la placa (figura 4).
- Preparar la dilución 1: 100 de la preparación Ref. un mínimo de 110 μL Ref diluido en DMEM + pluma/estreptococos sin FCS por placa de ensayo (por ejemplo,, 1,5 μL de REF en un volumen total de 150 μL). Agregar 110 μL de 1: 100 diluido REF en A12 bien de un fondo de U 96 pocillos placa estéril.
- Añadir 55 μL de DMEM + pluma/estreptococos sin FCS a pozos B12 H12 en la columna 12. Llevar a cabo serie diluciones 1:2 abajo de la placa de transferencia 55 μL de columna A fila B, solución de mezcla por pipeteo contenido arriba y abajo 5 veces y continuando hasta fila H. descartar el final 55 μL de medios de comunicación para que el volumen final en cada bien es 55 μL. Utilizar puntas nuevas para cada dilución.
- Preparar la dilución 1: 100 del suero prueba de las muestras. Como todos los sueros se analizaron por triplicado, preparar un volumen mínimo de 110 μL/pozo x 3 = 330 μL por muestra de suero.
- Agregar 110 μL de cada muestra de suero diluido (1: 100; S1 = suero 1, S2 = suero 2, etcetera.) correspondientes pocillos A1 a A9 y también E1 a E9 de la placa de 96 pocillos estéril según figura 4.
- Añadir 55 μL de DMEM + pluma/estreptococos sin FCS en todos los pocillos etiquetados X. Realice serie diluciones 1:2 según paso 2.2.1.3 hasta fila D (muestras 1, 2 y 3). Deseche el final 55 μL de medios de comunicación para que el volumen final en cada pozo es 55 μL. Del mismo modo, realizar la serie diluciones 1:2 para las muestras 4, 5 y 6 para las filas E a H.
Nota: Es importante utilizar puntas nuevas para cada dilución. - Añadir 55 μL de DMEM + pluma/estreptococos sin FCS a pozos en columnas 10 y 11.
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Preparación de virus
- Rápidamente descongelar un vial congelado individual de RSV en un baño de agua de 37 ° C hasta casi completamente descongelada y colocar inmediatamente en hielo.
- Diluir el virus en DMEM + pluma/estreptococos sin FCS basado en la concentración de la alícuota de RSV determinada en el paso 1.3.2. Aplicar una dilución que da aproximadamente 200 PFU/bien. Preparar un volumen total de 5,5 mL (100 pozos).
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Preparación de mezcla de suero virus
- Añadir 55 del virus diluido a todos los pocillos de las columnas 1-9 y pozos de registros E-H de las columnas 10 y 11 (control positivo) según la plantilla de la placa (figura 4).
- Añadir 55 de DMEM + pluma/estreptococos sin FCS a todos los pozos de las filas A-d de columnas 10 y 11 (control negativo). Incubar la placa por 1 h a 37 ° C, 5% CO2.
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Inoculación del virus a las células A549
- Antes de la terminación del período de incubación, recuperar A549 cell plate(s) preparado en el paso 2.1.1. Que sean monocapas de células A549 en placas de 96 pocillos confluentes de ~ 80%.
- Desechar el medio por inversión suavemente de la placa y borrar suavemente sobre una toalla de papel absorbente estéril. Lavar todos los pocillos con 100 μL de PBS dos veces, deseche el exceso PBS por inversión suavemente de la placa y borrar suavemente sobre una toalla de papel absorbente estéril después de cada lavado. No permita que las placas se sequen.
- Transferencia de 100 /well de la mezcla de virus suero a los pocillos correspondientes de la placa de células A549 siguiendo la plantilla de placa incubar la placa por 1 h a 37 ° C, 5% CO2.
- Después de 1 h, utilizando una pipeta, sacar 90/bien y añadir 100 de había precalentado 1 x M199 + 1,5% CMC 2% FCS + pluma/strep. Incubar la placa por 3 días a 37 ° C, 5% CO2.
Nota: Asegúrese de que la solución se calienta a 37 ° C antes de agregar a las placas.
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Preparación de la dilución de suero
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Desarrollo de la placa de ensayo y análisis (día 5)
- Desarrollar la placa de fijación y ensayo siguiendo los pasos 1.3.1.1 a 1.3.1.8.
- Determinar el título de neutralización de 50%
- Determinar que el título de neutralización del 50% mediante el cálculo de la distancia proporcional entre las diluciones de suero recíproco por encima y por debajo del 50% del control 'no suero' pozos (control positivo virus - columna 10, filas E-H).
- Contar el número de UFP (es decir, placas) derivados de infecciones virales individuales en suero y no pozos de control de suero. Calcular el número medio de PFU del no hay pozos de control de suero y determinar el valor de 50%.
- Identificar las diluciones de suero con cuentas que están inmediatamente por encima y por debajo del valor de 50% de los no pozos de control de suero. Utilizando una plantilla de hoja de cálculo o gráfico semilogarítmico, parcela número de PFU en el eje x (escala lineal) y la dilución de suero recíproco en el eje y (escala logarítmica de10 ). Dibujar una línea entre los dos puntos y leer los títulos de neutralización del 50% de la prueba de las muestras de suero de esta línea.
Nota: La hoja de cálculo del ensayo de RSV PRN (Hoja suplementaria) se utiliza para determinar el título de neutralización de 50%.
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Representative Results
La valoración de una acción de virus se realizó a partir de 1:10 a 1:108 dilución para determinar la concentración del virus stock antes del ensayo PRN (resultados representativos se muestra en la figura 5). De la figura 5se puede contar PFU confiablemente en diluciones de 1:104 y 1:105. Se calculó el número promedio de PFU de pozos por triplicado en la misma dilución. Desde el número promedio de puntos en 1:10 dilución5 era 14, el título viral de esta acción viral fue determinado como sigue:
14 (número promedio de puntos) / [10-5 (dilución) x 0,1 mL (volumen de inóculo)] = 1.4 x 107 PFU/mL
Usando lo anterior describía el método, hemos medido NAbs para ambos RSV-A y B en muestras humanas. Figura 6 se muestra la interpretación de imágenes bien de tres sueros representativos con diversos títulos de NAb contra RSV-A. Figura 6A muestra también imágenes de titulación de la muestra se replica para cada suero representante (la placa de ensayo real tuvo tres repeticiones técnicas). Diluciones de suero indicado son diferentes para cada muestra. Pozos de control de virus con un solo virus y no suero tuvieron su promedio PFU calculado y utilizado para determinar el corte de la neutralización del 50%, que en este ejemplo fue 52. Figura 6B ilustra cómo la valoración de los tres sueros fue determinada utilizando este atajo. El recíproco de2 log de la dilución de suero se traza en el eje x y el número de UFP como un porcentaje de control en el eje y. Símbolo y error de las barras representan la media de los triplicados ± desviación estándar. Cincuenta por ciento de los puntos promedio en los pozos de control de virus (indicados por la línea punteada horizontal) fue utilizado como un punto de corte para determinar el 50%, neutralizando el título de anticuerpos de una muestra de suero. El título del anticuerpo de neutralización se define como el recíproco de la dilución que se traduciría en 50% de inhibición de la actividad del virus.
Como cada experimento incluye el antisuero de referencia RSV y pocillos de control positivo del virus, la variabilidad inter-ensayo proporciona control de calidad entre experimentos. La figura 7 muestra los resultados del ensayo RSV-A PRN en dos diferentes cohortes de adultos de la cohorte de Gambia (N = 21)10 y voluntarios sanos en Melbourne (N = 36). Títulos de RSV NAb fueron variables dentro de cada población, con los adultos gambianos tiene un título de NAb media inferior en comparación con los adultos de Melbourne. El antisuero de referencia RSV también se muestra (N = 52 repeticiones), demostrando muy poca variabilidad con un coeficiente de variación (CV) del 6,82%.
Figura 1: diseño de placa de titulación Viral para la cuantificación de las existencias de RSV. v = stock del virus RSV (v1, la acción viral lote 1 v2, stock de lotes virales 2; v3, stock de viral lote 3), N = control negativo, X = media añadido. Codificación de color es sólo para facilitar la visualización de diseño de la placa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: configuración de la cuenta de ejemplo utilizada para el lector puntos. Captura de pantalla de los parámetros normalmente utilizados para contar las placas de virus. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: ejemplos de artefacto y monocapas de células problemas. (A) artefactos. (B) interrumpió de células monocapas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: plantilla de placa de ensayo VSR PRN. V = control positivo viral pozos, N = pozos de control negativo, X = media añadido, S = antisuero de referencia con todas las diluciones (de 1: 100 a 1:12, 800) en la columna 12. Codificación de color es sólo para facilitar la visualización de diseño de la placa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: ejemplo de un resultado de la valoración vírica RSV. Aparecen pozos de representante de un ensayo que se realizó por triplicado. Los números en cada pozo se refieren al número de placas contadas mediante el lector de puntos. TMC = demasiadas para contar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: resultados de un análisis representativo de RSV PRN. (A) el número de UFP cuenta para tres muestras de suero individuales según rangos de dilución diferentes. Los números en cada imagen bien se refieren al número de placas contadas. (B) interpretación del título de las imágenes bien en panel A para las tres muestras de suero humano representativo de NAb. Los datos se calculan sobre la base del corte de 50% de los pozos de control de virus. Barras horizontales representan la media ± SD. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: RSV neutralizando los títulos de anticuerpos en Melbourne (N = 21) y Gambia (N = 36) adultos. El suero humano de referencia RSV también se muestra para la comparación (N = 52 repeticiones). Símbolos representan títulos individuales y barras horizontales media geométrica título ± IC del 95%. N = 52 resultados se basan en tres técnicos durante un período de dos meses. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementario Figura 1: comparación de NAb títulos para RSV-A. (Izquierda) NAb títulos calculados usando los modelos de regresión lineal y no lineal (N = 152 ensayos). (Derecho) Correlación entre títulos RSV-A NAb utilizando tanto lineal y modelos de regresión no lineal. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Hemos desarrollado y optimizado un ensayo micro-neutralización de RSV simple y eficiente que puede ser adaptado fácilmente en la mayoría de los laboratorios. Este ensayo es capaz de medir la capacidad de infección viral así como la inhibición de la infección viral por NAb a nivel celular mediante análisis de imagen automatizado de medición. El uso de una plataforma basada en la proyección de imagen y sistemas basados en anticuerpos específicos ha aumentado la especificidad y la sensibilidad de detección punto comparada con placa tradicional detección métodos6,7. Esto permite la caracterización de RSV cepas con baja infectividad y también proporciona una cuantificación precisa de concentración RSV antes de utilizar en el ensayo PRN.
Se recomienda que el mismo lote de material viral se utiliza para cada estudio con el fin de reducir al mínimo las variaciones de lote a lote entre las poblaciones de RSV. Otros aspectos importantes del análisis incluyen la consistencia de la concentración de entrada de virus, la integridad de la monocapa de células A549 y usando la misma configuración de la cuenta para ensayo de consistencia y precisión. La cantidad de virus que se ha añadido a la placa puede ser verificada otra vez en una titulación viral de placa independiente. Sin embargo, monitoreo de los pozos de control positivo del ensayo PRN también proporciona una indicación del título viral real y también vale la pena monitorear a través de ensayos. Además, el suero de referencia en cada placa es otra medida de control de calidad para asegurar que los ensayos son reproducibles. Nuestros experimentos no usó el antisuero estándar internacional recientemente validado del RSV de NIBSC, como no estaba disponible en el momento de nuestro estudio11. Usando este antisuero estándar internacional de RSV se recomienda para futuros estudios medición RSV NAb para que pueden comparar resultados a través de laboratorios con confianza.
Desarrollo de un análisis relativamente simple, de alto rendimiento facilitaría esfuerzos de estandarización global para el uso de NAbs RSV como más laboratorios en todo el mundo sería capaces de usar este método. Esto es particularmente importante dado el número de candidatos vacunales de RSV en desarrollo, con algunos actualmente en ensayos de fase 3. Es fundamental que los resultados de futuros estudios clínicos de vacunas de RSV son comparables, y por lo tanto un análisis estandarizado representa un aspecto clave para este objetivo. Mientras que un número de países de ingresos bajos y medios no sean capaces de apoyar directamente a adquisición del equipo necesario, los vínculos a través de colaboraciones internacionales y programas de capacitación será crítica a mediano y largo plazo.
Este protocolo de ensayo de NAb es flexible en su capacidad de ser adaptado para diferentes líneas celulares (A549, Hep2 y Vero) y puede ser utilizado para diferentes cepas de RSV. Hemos también adaptado este método para RSV-B con éxito. Como se ha desarrollado la plataforma de ensayo para un formato de placa de 96 pocillos, esto proporciona una alternativa rentable y de alto rendimiento con alta exactitud ya que permite más repeticiones y la inclusión de la referencia del suero control y control negativo en cada placa. Usando el mismo control de suero de referencia se recomienda ya que es fundamental para asegurar el control de calidad y aseguramiento de la calidad. En nuestras manos, observamos CVs muy baja de 6,82% en el suero de referencia que es mucho menor que el CVs reportados para otros ensayos biológicos en el rango de 30-40%5.
Por otra parte, los datos de imagen y los datos de la cuenta (datos brutos) generados a partir de este protocolo pueden almacenarse indefinidamente para futuras consultas y análisis. Mantener registros de datos sin procesar es un requisito esencial para los ensayos clínicos, particularmente los relacionados con futuras vacunas de RSV. Nuestra hoja de cálculo (ver Hoja de trabajo complementaria) sugerido en este protocolo puede ayudar a registrar todos los aspectos del experimento con el propósito de control de calidad y garantía. La hoja de cálculo proporciona el cálculo del 50% neutralización título usando un modelo lineal simple como esto tiene la ventaja de no requerir ningún software especializado. Sin embargo, los datos de nuestro análisis de NAb se pueden analizar utilizando el modelo de regresión no lineal que se ha utilizado también en la investigación de la vacuna para el cálculo de títulos neutralizantes del 50%, aunque esto requiere de otro software paquetes12,13 . Utilizando los datos experimentales, los resultados obtenidos con estos dos métodos fueron similares, dando confianza a los valores de titulación obtenidos mediante el modelo lineal simplificado (ver figura 1 complementaria). El costo para la creación de este ensayo es asequible para muchos laboratorios con quizás el artículo más caro que el lector puntos (aproximadamente USD $50K). Sin embargo, el lector de puntos tiene la ventaja de poder ser utilizado para otras aplicaciones, como la enzima-ligado immunospot (ELISpot) citocina o medición de células secretoras de anticuerpos, que hace un valioso componente de evaluación ensayo de vacuna.
En conclusión, este ensayo de RSV PRN mejorada, de alto rendimiento puede implementarse fácilmente en muchos laboratorios y apoyará el esfuerzo de armonización internacional de la OMS para los ensayos de RSV NAb. Esto será fundamental para la evaluación de nuevos candidatos vacunales de RSV en el futuro.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a todos los participantes. Reconocemos a programa de apoyo a infraestructura operativa del gobierno de Victorian. PVL es un recipiente de la beca de desarrollo de carrera de NHMRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22 μm (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
References
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
- Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
- Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
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- van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
- Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
- Tripp, R. A., Jorquera, P. A. Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , Humana Press. (2016).
- Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
- McDonald, J. U., Rigsby, P., Dougall, T., Engelhardt, O. Report on the WHO collaborative study to establish the 1st International Standard for antiserum to Respiratory Syncytial Virus. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y (2017).
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- Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).
