Summary
높은 처리량,이 연구에 설명 합니다 호흡 syncytial 바이러스 (RSV)에 대 한 특정 중화 항 체 titer를 확인 하려면 이미징 기반 마이크로 중화 분석 결과. 이 분석 결과 형식은 다른 샘플 형식에 대해 테스트 되었습니다.
Abstract
호흡 syncytial 바이러스는 특정 중화 항 체 (RSV NAbs)는 RSV에 대 한 보호의 중요 한 표식. 다른 분석 결과 형식의 번호에에서는 현재 전세계 사용 이므로 RSV NAbs 측정 하기 위한 정확 하 고 높은 처리 방법에 대 한 필요. 여기는 영상 기반 마이크로 중화 분석 결과 RSV 하위 그룹 A에서 테스트 되었습니다와 RSV 하위 그룹 B 및 서로 다른 샘플에 대 한 또한 적응 수 있습니다 설명 합니다. 이 방법은 매우 재현성, 참조 원으로 10% 미만 대 한 상호 분석 결과 유사 합니다. 우리는이 분석 결과 많은 실험실에서 상대적으로 저렴 한 비용으로 전세계에 쉽게 설치 될 수 있다 믿습니다. RSV NAbs 측정 개선, 높은 처리량 분석 결과의 개발 뿐만 아니라 소설 RSV 백신 후보자의 평가 미래에 대 한 중요 한 되 고 국제적으로이 방법의 표준화에 대 한 중요 한 단계를 앞으로 나타냅니다.
Introduction
호흡 syncytial 바이러스 (RSV) 소아 인구 세계1에 더 낮은 호흡 기관 감염의 주요 원인입니다. 그것의 높은 부담에도 불구 하 고 아직 아무 백신 이나 치료 가능한 있다. 2013 년 이후 세계 보건 기구 (WHO)는 주요 연구 우선 순위, 연간 WHO 상담 회의2,3로 RSV 백신 개발을 선언 했다. WHO는 RSV 중화 항 체 (NAb) 측정 모니터를 사용 하 백신 immunogenicity로 보호4의 주요 혈 청 학적인 감 적으로 인식 되 고이에 동의 했다. NAbs 안티-RSV 단일 클론 항 체 palivizumab, 현재만 예방 전략 사용 가능한4의 임상 시험 연구의 숫자에 가혹한 RSV 감염 으로부터 보호 하기 위해 표시 되었습니다.
5,6,,78도전 표준화 노력 만든 세포 및 분자 기반 분석을 포함 한 전세계 실험실에 의해 사용 되는 여러 NAb 분석 결과 형식을 확인 하 고 있습니다. 그러나, RSV 특정 항 체의 존재에 의해 감소 된 플 라크 형성 단위 (PFU)의 수를 측정 하는 기존의 플 라크 감소 중화 (PRN) 분석 결과 금9아직도 남아 있다. 여기, 우리는 향상 된, 단순화, 및 높은 처리량 PRN 프로토콜 다른 RSV 긴장 증가 분석 결과 처리량과 수많은 셀 라인에 사용할 수 있는 보고 합니다. 이 프로토콜은 임상 샘플 다른 설정에서 뿐만 아니라 동물 모델 실험에서 샘플을 사용 하 여 테스트 되었습니다.
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Protocol
참고: 모든 단계는 다르게 명시 하지 않는 한 BSL2 후드에서 수행 해야 합니다. 바이러스 성 적정이 PRN 분석 결과에 사용 되는 최적의 RSV 농도 결정 하는 PRN 분석 결과 사전 필요 합니다. 약 수를 한 번 해 동 되 고 각 NAb 분석 결과 대 한 사용 되는 작은 볼륨에서 바이러스 주식 추천 된다. 모든 NAb 분석 한 연구에서 모든 샘플에 대 한 수행에 대 한 같은 바이러스 성 주식을 사용 하 여 또한 것이 좋습니다. 문화 미디어와 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 셀 접시에 추가 하기 전에 37 ° C에서 예 열이 다는 것을 확인 하십시오.
1. RSV 바이러스 성 적정
참고: 바이러스 주식 수와 중복의 수에 따라 분석 결과 접시 그림 1에 따라 설정할 수 있습니다. 각 바이러스 주식 분석 결과 플레이트, 높은 바이러스 농도 (즉, 1:10)부터 아래로 3 중에서 적정 한다. 일반적으로 직렬 titrations 수 1시 10분. RSV 문화 절차 뿐만 아니라 A549 세포 배양 및 유지 보수 할 수 있습니다 표준 절차를 사용 하 고이 프로토콜에 포함 되지 않습니다.
- 시드 플레이트 (1 일)
- Dulbecco의 수정 이글스 매체 (DMEM) + 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) + 1000 IU 페니실린/스 (펜/strep) 4 x 105/mL A549 세포 resuspend 100 μ/잘 4 x 104 A459 셀을 포함 하 시드 96 잘 평면-바닥 살 균 접시.
- 37 ° C, 5% CO2 에서 하룻밤 번호판을 품 어 (셀 로그 단계 성장에 있을 것입니다).
참고: 23 통행 후 새로운 A549 세포 유리병을 사용 합니다. 그것은 권장 하지 시작 실험 때 새로운 셀 유리병은 처음 세 개의 구절에서 여전히.
- 바이러스 감염 (주 2)
- 바이러스 직렬 희석의 준비
- 거의 완전히 해 동 하 고 얼음에 즉시 배치 될 때까지 37 ° C 물 욕조에 RSV의 단일 냉동된 유리병을 녹여 급속 하 게. 3 복제 준비 각 RSV 바이러스 재고 분석 수, 희석 바이러스/잘 100 μ 1시 10분의 초기 바이러스 재고 희석 사용 하 고 부정적인 제어에 대 한 열이 하나 이상 보유 합니다.
참고: 그림 1 triplicates에 부정적인 컨트롤을 보여 줍니다. - 각 희석된 바이러스의 100 μ A 96 잘 U-바닥의 행의 3 중에서 1:10 추가 살 균 판. DMEM + 1000 IU 펜/strep FCS 없이 90 μ/잘 헤 B 행에 추가
- 수행 하는 직렬 1시 10분 희석 아래로 행을 5 번 위아래로 pipetting 콘텐츠 B. 믹스 솔루션 행 행 H. 폐기 최종 10 μ까지 ten-fold 희석 되도록 각 최종 볼륨 잘 90 μ A에서 10 μ를 전송 하 여 접시.
참고: 그것은 각 희석에 대 한 새로운 팁을 사용 해야 합니다.
- 거의 완전히 해 동 하 고 얼음에 즉시 배치 될 때까지 37 ° C 물 욕조에 RSV의 단일 냉동된 유리병을 녹여 급속 하 게. 3 복제 준비 각 RSV 바이러스 재고 분석 수, 희석 바이러스/잘 100 μ 1시 10분의 초기 바이러스 재고 희석 사용 하 고 부정적인 제어에 대 한 열이 하나 이상 보유 합니다.
-
A549 세포에 바이러스 접종
- 전날에 준비 A549 cell plate(s)를 검색 합니다. 96 잘 접시에서 A549 세포 monolayers ~ 80% 합칠 인지 확인 합니다. 부드럽게 접시를 반전 하 고 멸 균 흡수 성 종이 타월에 가볍게 blotting에 의해 미디어를 삭제 합니다.
- PBS의 100 μ와 모든 우물을 두 번 세척, 부드럽게 접시를 반전 하 고 가볍게 각 세척 후 살 균 흡수 성 종이 타월에 blotting에 의해 초과 PBS를 삭제. 접시 건조를 허용 하지 않습니다.
- A549 세포에 바이러스 성 적정 플레이트 (그림 1)에서 해당 우물 바이러스 희석을 전송. 37 ° C, 5% CO2에서 1 시간에 대 한 접시를 품 어. 1 h 부 화 후 supernatants를 (교차 오염 방지) 하는 피 펫을 사용 하 여 가만히 따르다. 90 μ/잘 꺼내 주세요.
- 추가 1 x 매체 199의 100 μ (M199, 재료의 표 참조) + 1.5 %carboxymethylcellulose 나트륨 소금 (CMC) 낮은 점도 + 펜/strep 각 잘을 포함 하는 2 %FCS.
참고: 2 x M199 + 4 %FCS + 펜/strep 2%와 3 %CMC 솔루션 사전에 준비 하 여 나중에 사용할 4 ° C에 저장 해야 합니다. 솔루션은 접시에 추가 하기 전에 37 ° C에서 예 열 다는 것을 확인 하십시오.- 2 x M199 솔루션 준비: 1 향 주머니/500 mL 증류수 10 mL 펜/strep + 물 + 20 mL FCS (2를 만들기 위해 x MI99). 0.22 μ m 필터 단위를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다.
- 3의 준비에 대 한 %CMC, 증류수 500 mL에 천천히 CMC의 15 g 추가. 준비의 약 1 h는 50 ° C에서 금속 활동가 히터를 사용 하 여 물에 CMC를 분해. 믹스 3을 잘 %CMC 및 고압 솔루션.
참고: 단단한 CMC; 해산 하기 위하여 물에 추가 되어야 합니다. 건조 고체 물 추가 분해 하기 매우 어려운 고체의 "덩어리"를 생성 합니다. - 1 x M199 + 1.5 %CMC 낮은 점도 준비 + 펜/strep 혼합 하 여 1: 1를 포함 하는 2% FCS M199 및 3% x 2 CMC 단계 1.2.2.4.2에서에서 준비.
- 37 ° C, 5% CO2에서 3 일 동안 접시를 품 어.
- 바이러스 직렬 희석의 준비
- 분석 결과 플레이트 및 분석 (주 5) 개발
- 고정 및 개발 분석 결과 플레이트
- 부드럽게 접시를 반전 하 여 M199 CMC + 2 %FCS 포함 펜/strep를 삭제 합니다. 천천히 추가 (피하기 위하여 셀 레이어 방해) 고정 버퍼 (80% 아세톤, 20 %PBS,-20 ° C에서 저장 된)의 200 μ 셀을 해결 하기 위해. 20 분 동안-20 ° C에서 품 어.
- 고정 버퍼를 삭제 하 고 부드럽게 흡수 성 종이 타월에 오 점. 플레이트 얼굴을 두고 10 분 동안 드라이까지.
참고: 앞으로이 단계에서 분석 결과 BSL2 후드 밖에 서 수행할 수 있습니다. - 준비 5% 우유 희석제 차단 솔루션 0.05%를 포함 하는 필터링 된 PBS에 폴 20 (PBS-법무부, 재료의 표참조). 한 접시, 200/잘 고 110 우물에 따라 차단에 필요한 볼륨 계산: 200/잘 x 110 웰 스 = 22 mL (1.1 집중 mL 우유 20.9 ml에서 희석제 필터링 PBS-법무부). 이 단계에서 또한 1 차 및 이차 항 체에 대 한 충분 한 차단 솔루션을 확인 합니다. 한 접시에 대 한 계산 50/잘 고 110 우물에 따라 각 항 체 솔루션에 필요한 볼륨: 50/잘 x 110 웰 스 5.5 mL =. 따라서, 단일 플레이트 분석 결과에 필요한 솔루션을 차단 하는 우유 희석 액의 총 볼륨 33 mL 이다.
- 차단 솔루션의 200 /well을 추가 합니다. 품 어 플레이트 실 온 (RT)에서 30 분 삭제에 대 한 솔루션 부드럽게 접시를 반전 하 여 고 흡수 성 종이 타월에 오 점.
- 1: 500 염소 X RSV 항 체 (mAb-1 차적인 항 체) 솔루션을 차단에 희석을 준비 합니다. MAb 솔루션의 50 /well을 추가 하 고 37 ° C 1 h. 세척 접시 3 번 필터링 된 PBS-폴에서 품 어.
- 1:5,000 알 렉 사 Fluor 당나귀 솔루션을 차단에 희석 방지 염소 IgG (이차 항 체)를 준비 합니다. 이차 항 체 솔루션의 50 /well을 추가 하 고 37 ° C 1 h. 세척 접시 5 번 필터링 된 PBS-폴에서 품 어.
- 읽기 fluorescein isothiocyanate (FITC) 채널을 사용 하 여 자동화 된 명소 리더에 접시 및 그림 2와 같이 설정. 접시를 호 일에 포장 및 4 ° c.에 저장 악기는 사용 하지 않는 96 잘 문화 플레이트를 사용 하 여 및 분석 결과 전에 수 설정을 입력 보정.
참고: 몇 일 이내에 다시 검사 하는 것이 필요한 경우 가능 합니다. 교정 및 개수 설정을 저장 하 고 분석 결과 보정에 사용 하는 접시의 동일한 유형을 사용 하는 경우 미래의 검색을 위해 사용할 수 있습니다. - 인 위 플 라크 또는 방해 셀 monolayers (그림 3)에 대 한 웰 스의 이미지를 확인 하십시오. 교란된 셀 monolayers와 웰 스 제외.
참고: 인 위 패의 크기에 따라 수동 카운트 그 우물에 대 한 수행 해야 할 수도 있습니다 또는 그 우물 데이터 분석에서 삭제 할 수 있습니다. 유효한 결과 대 한 기준 이상의 복제에서 잘 발견 아무 방해 셀 단층 또는 인 위 패와 부정적인 우물 (추가 바이러스 없이 우물)에서 검색 된 없음 PFU 포함.
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바이러스 농도 결정
- 마지막 두 희석 명소 명확 하 게 계산 될 수 있는 곳을 선택 합니다. 관광 명소 같은 희석에 복제 우물에서의 평균 수를 계산 합니다. 아래 수식을 사용 하 여 재고 샘플의 바이러스 titer (mL 당 PFU) 계산:
PFU/mL = 플 라크의 평균 수 (희석 비율 × 희석된 바이러스 양의 우물에 추가) /
참고: 각 RSV 주식에 대 한 결정 하는 바이러스 농도 이제 PRN 분석 결과 (2 단계)에서 사용할 수 있습니다.
- 마지막 두 희석 명소 명확 하 게 계산 될 수 있는 곳을 선택 합니다. 관광 명소 같은 희석에 복제 우물에서의 평균 수를 계산 합니다. 아래 수식을 사용 하 여 재고 샘플의 바이러스 titer (mL 당 PFU) 계산:
- 고정 및 개발 분석 결과 플레이트
2. RSV 중화 분석 결과
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시드 플레이트 (1 일)
- DMEM + 10 %FCS + 4 x 105/mL에서 1000 IU 펜/strep A549 세포 resuspend 시드 96 잘 평면-바닥 살 균 판 100 μ/잘 포함 하는 4 x 104 A459 세포 및 37 ° C, 5% CO2 에서 하룻밤 번호판을 품 어 (셀 로그 단계 성장에 있을 것입니다).
참고: 23 통행 후 새로운 A549 세포 유리병을 사용 합니다. 3 번 통과 하기 전에 A549 세포를 사용 하는 권장 하지 않습니다.
- DMEM + 10 %FCS + 4 x 105/mL에서 1000 IU 펜/strep A549 세포 resuspend 시드 96 잘 평면-바닥 살 균 판 100 μ/잘 포함 하는 4 x 104 A459 세포 및 37 ° C, 5% CO2 에서 하룻밤 번호판을 품 어 (셀 로그 단계 성장에 있을 것입니다).
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바이러스 및 혈 청 준비 (주 2)
참고: 샘플 유형에 따라 NAb 분석 결과 전에 미리 처리 샘플에 대 한 필요한 단계 있다. 생물학 표준 및 컨트롤 (NIBSC) 국립 연구소에서 요청 시 사용할 수 있습니다 RSV 국제 표준 세라를 사용 하는 것이 좋습니다.-
혈 청 희석의 준비
- 인간의 RSV 참조 원으로 (참조 혈 청, REF)를 녹여 및 혈 청 혈 청 샘플 실시간 열 비활성화 샘플 테스트 원으로 사용 하기 30 분 전에 56 ° C에서 물 욕조에 참조. 플레이트 템플릿 (그림 4)에 의하여 희석을 준비 합니다.
- 참고 준비의 1: 100 희석 DMEM + 시험 접시 당 FCS 없이 펜/strep 희석 ref 110 μ의 준비 (예:, 150 μ의 전체 볼륨에 REF의 1.5 μ). 1: 100의 110 μ 희석 96 잘 U-바닥의 잘 A12에 REF 추가 살 균 판.
- 웰 스 B12 H12 열 12 DMEM + 펜/strep FCS 없이 55 μ를 추가 합니다. 행 A에서에서 행 B 55 μ를 전송, 5 번 위아래로 pipetting 콘텐츠 솔루션을 혼합 하 고는 각 최종 볼륨 잘 55 μ 미디어의 최종 55 μ 행 H. 삭제 될 때까지 계속 하 여 시리얼 접시 내려 1:2 희석을 수행 합니다. 각 희석에 대 한 새로운 팁을 사용 합니다.
- 1: 100 희석 혈 청의 테스트 샘플을 준비 합니다. 모든 혈 청 샘플은 3 중에서 분석, 준비의 110 μ/3 = 330 x 최소 볼륨 혈 청 테스트 샘플 당 μ.
- 각 희석된 혈 청 테스트 샘플 (1: 100; 110 μ를 추가 S1 = 혈 청 1, S2 = 세럼 2, 등.) A9 하도를 그림 4에 따라 96-잘 살 균 격판덮개의 E9 E1 해당 웰 스 A1.
- DMEM의 55 μ 추가 + 모든 우물 FCS 없이 펜/strep 표시 X. 수행 직렬 1:2 희석 단계 2.2.1.3 당 행 D (예제 1, 2, 및 3)까지. 각 잘에서 최종 볼륨은 55 μ 미디어의 최종 55 μ를 삭제 합니다. 마찬가지로, 4, 5, 및 6 행 E H. 샘플에 대 한 직렬 1:2 희석 수행
참고: 그것은 각 희석에 대 한 새로운 팁을 사용 해야 합니다. - 열 10, 11에에서 웰 스 DMEM + 펜/strep FCS 없이 55 μ를 추가 합니다.
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바이러스의 준비
- 거의 완전히 해 동 하 고 얼음에 즉시 배치 될 때까지 37 ° C 물 욕조에 RSV의 단일 냉동된 유리병을 녹여 급속 하 게.
- 1.3.2 단계에서 결정 된 RSV 약 수의 농도에 따라 FCS 없이 DMEM + 펜/strep 바이러스를 희석. 약 200 PFU/잘 주는 희석을 적용 됩니다. 5.5 mL의 총 볼륨 (100 정)에 대 한 준비.
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바이러스 혈 청 혼합물의 준비
- 열 1-9의 모든 우물과 행 E-H 10 및 11 (긍정적인 통제) 접시 템플릿 (그림 4)에 따라 열의 우물에 희석된 바이러스의 55를 추가 합니다.
- DMEM + 펜/strep FCS 없이 55 행 열 10, 11 (부정적인 제어)의 A-D의 모든 우물을 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 1 시간에 대 한 접시를 품 어.
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A549 세포에 바이러스 접종
- 잠복기의 완료 이전 단계 2.1.1에서에서 준비 A549 cell plate(s)를 검색 합니다. 96 잘 접시에서 A549 세포 monolayers ~ 80% 합칠 인지 확인 합니다.
- 부드럽게 접시를 반전 하 고 멸 균 흡수 성 종이 타월에 가볍게 blotting에 의해 미디어를 삭제 합니다. PBS의 100 μ와 모든 우물을 두 번 세척, 부드럽게 접시를 반전 하 고 가볍게 각 세척 후 살 균 흡수 성 종이 타월에 blotting에 의해 초과 PBS를 삭제. 접시 건조를 허용 하지 않습니다.
- 다음 접시 템플릿 품 37 ° C, 5% CO2에서 1 시간에 대 한 접시 A549 세포에 바이러스 혈 청 혼합물의 100 /well 해당 웰 스 전송.
- 피 펫을 사용 하 여 1 h 90/잘 꺼내 고 추가 후의 100 x M199 + 1.5 %CMC + 2 %FCS + 펜/strep 1 prewarmed. 37 ° C, 5% CO2에서 3 일 동안 접시를 품 어.
참고: 솔루션은 접시에 추가 하기 전에 37 ° C에서 예 열 다는 것을 확인 하십시오.
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혈 청 희석의 준비
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분석 결과 플레이트 및 분석 (주 5) 개발
- 개발 단계 1.3.1.1 1.3.1.8 고정 및 분석 결과 격판덮개.
- 50% 무력화 titer를 결정
- 계산 하 여 50% 무력화 titer 비례 거리 '혈 청' 컨트롤의 50% 아래와 위의 상호 혈 청 희석 사이 우물 (긍정적인 바이러스 컨트롤-열 10, 행 E-H)를 결정 합니다.
- PFU (즉, 플 라크)의 수를 세어 혈 청 우물과 아무 혈 청 제어 우물에서 개별 바이러스 성 감염에서 발생. 없음 혈 청 제어 우물의 PFU의 평균 수를 계산 하 고 50% 값을 결정 합니다.
- 혈 청 희석 카운트는 바로 위와 아래 아무 혈 청 제어 우물의 50% 값을 식별 합니다. Using 세미 로그 그래프 또는 스프레드시트 서식 파일, 플롯 (선형 눈금) x 축 및 y 축 (로그10 규모)에 상호 혈 청 희석 PFU의 수 있습니다. 두 점 사이 선을 인출 하 고이 라인에서 혈 청 샘플 시험의 50% 무력화 titers를 읽고.
참고: RSV PRN 분석 결과 워크시트 (워크시트 보충)는 50% 무력화 titer를 결정 하는 데 사용 됩니다.
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Representative Results
바이러스 주식의 적정 1:10 1시 10분에서 수행한 PRN 분석 결과 (대표 결과 그림5) 전에 바이러스 재고 농도 결정 하기 위해8 희석. 그림 5, PFU 계산 될 수 있는 안정적으로 1:10 희석에4 와 1시 10분5. PFU에서 같은 희석 triplicate 우물에서의 평균 수를 계산 했다. 1 105 희석은 14에 관광 명소의 평균 수, 이후이 바이러스의 바이러스 titer는 다음과 같이 결정 했다.:
14 (반점의 평균 수) / [10-5 (희석) x 0.1 mL (inoculum 볼륨)] = 1.4 x 107 PFU/mL
위의 사용 방법 설명, 우리 두 RSV 대 NAbs 측정-A와 B에서 인간의 샘플. 그림 6 에 NAb titers RSV-.에 대 한 다양 한와 함께 3 개의 대표적인 혈 청 샘플의 이미지를 잘 해석 방법을 보여 줍니다. 그림 6A 샘플 적정의 이미지 (실제 분석 결과 플레이트 3 기술 복제 했다) 각 대표적인 혈 청에 대 한 복제를 잘 보여줍니다. 혈 청 희석 표시는 각 샘플에 대 한 다릅니다. 바이러스 및 아무 혈 청 바이러스 컨트롤 우물 그들의 평균 PFU 계산 하 고이 예제에서 있던 52 50% 무력화 잘라 결정 하는 데 사용 했다. 그림 6B 3 세라의 적정 했다 하는 방법을 보여 줍니다이 커트 오프를 사용 하 여 결정. 혈 청 희석의 로그2 상호 PFU의 수와 x 축에는 y 축에는 컨트롤의 플롯 됩니다. 기호 및 오차 막대 triplicates ± 표준 편차 평균을 나타냅니다. 바이러스 컨트롤 웰 스 (가로 점선으로 표시)에서 평균 명소의 50 %는 중화 항 체 titer 혈 청 샘플의 50%를 결정 하는 마감으로 사용 되었다. 중화 항 체 titer 바이러스 활동의 50% 억제 귀 착될 것입니다 희석의 상호로 정의 됩니다.
각 실험 포함 RSV 참조 원으로 긍정적인 바이러스 컨트롤 우물, 간 분석 결과 다양성 제공 품질 관리 실험 사이 이다. 그림 7 에서는 감비아 일대에서 두 명의 다른 성인 동료 RSV-A PRN 분석 결과의 결과 (N = 21)10 및 멜버른에 건강 한 지원자 (N = 36). RSV NAb의 titers 멜버른 성인에 비해 낮은 평균 NAb titer 데 시리아 성인 각 인구 내의 변수를 했다. RSV 참조 원으로 표시 (N = 52 복제), 6.82%의 편차 (CV)의 계수 매우 낮은 다양성을 보여주는.
그림 1: RSV 주식의 정량에 대 한 바이러스 성 적정 플레이트 레이아웃. v (v 1 이나, 바이러스 성 배치 1의 v 2의, 바이러스 성 배치 2의 주식; v3, 바이러스 성 배치 3의 재고), RSV 바이러스의 재고 = N 부정적인 제어 = 글쎄, X = 미디어 추가. 컬러 코딩 시각화 플레이트 레이아웃의 원조에입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 명소 리더에 사용 된 예 수 설정. 일반적으로 바이러스 플 라크를 계산에 사용 하는 매개 변수의 스크린샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 인 위 및 방해 셀 monolayers 예. (A) 유물입니다. (B) Disrupted monolayers 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: RSV PRN 분석 결과 대 한 서식 파일 판. V 바이러스 긍정적인 제어 웰 스, N = = 부정적인 제어 웰 스, X 미디어 추가, S = = 열 12 (1:12, 800에 1: 100)에서 모든 희석 된 참조 원으로. 컬러 코딩 시각화 플레이트 레이아웃의 원조에입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: RSV 바이러스 적정 결과의 예. 대표 웰 스 3 중에서 분석 결과에서 표시 됩니다. 각 잘에서 숫자 패 명소 리더를 사용 하 여 계산의 수를 참조 하십시오. TMC = 계산에 너무 많은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 대표적인 RSV PRN 분석 결과에서 유래한 다. (A) 다른 희석 범위에 따라 3 개의 개별 혈 청 샘플 PFU의 수 계산. 각 잘 이미지에 숫자 패 계산의 수를 참조 하십시오. (B) 패널 A 3 대표 인간의 혈 청 샘플 잘 이미지에서 titer 해석 잡을. 데이터는 바이러스 컨트롤 우물에서 50% 커트 오프 기준으로 계산 됩니다. 가로 바 대표 평균 ± sd. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: RSV 중화 항 체 titers 멜버른에서 (N = 21)와 시리아 (N = 36) 성인. 인간의 RSV 참조 혈 청 비교에 대 한 표시 됩니다 (N = 52 복제). 기호 개별 titers 나타내고 가로 바 대표은 titer ± 95 %CI. N = 52 결과 기반 3 기술자 2 개월 동안. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1:에 대 한 비교의 잡을 titers RSV. (왼쪽) 선형 및 비선형 회귀 모델을 사용 하 여 계산 titers 잡을 (N = 152 분석 실험). (오른쪽) 둘 다 선형을 사용 하 여 RSV-A 잡을 titers 및 비 선형 회귀 모델의 상관관계 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리가 개발 하 고 최적화는 간단 하 고 효율적인 RSV 마이크로 중화 분석 결과 대부분 실험실에서 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 분석 결과 컴퓨터 이미지 검색을 사용 하 여 세포 수준에서 NAb 바이러스 성 감염의 억제를 측정 뿐만 아니라 바이러스 감염 능력을 측정할 수 있다. 이미징 기반 플랫폼 및 특정 항 체 기반 시스템을 사용 하 여 특이성 및 전통적인 패 감지 방법6,7에 비해 자리 탐지의 감도 증가 했다. 이로써 RSV의 낮은 infectivity와 변종 및 또한 PRN 분석 결과에서 사용 하기 전에 RSV의 정확한 정량화를 제공 합니다.
바이러스 성 주식의 동일한 배치 RSV 주식 사이 어떤 일괄 배치 변화를 최소화 하기 위해 각 연구에 사용 되도록 하는 것이 좋습니다. 분석 결과의 다른 중요 한 측면의 바이러스 입력, 무결성 A549 세포 단층 및 분석 결과 일관성과 정확성을 보장 하기 위해 같은 수 설정을 사용 하 여 일관성 포함 되어 있습니다. 접시에 추가 하는 바이러스의 금액 별도 플 라크 바이러스 적정에서 다시 확인할 수 있습니다. 그러나, PRN 분석 결과의 긍정적인 통제 우물 모니터링 또한 실제 바이러스 titer의 표시 하며 분석 모니터링 보람도 있다. 또한, 참조 혈 청을 포함 하 여 모든 플레이트에 다른 품질 관리 측정 분석 실험을 재현할 수입니다. 그것은 이용할 수 없었다 우리의 연구11의 시간에 우리의 실험 NIBSC에서 최근 검증된 RSV 국제 표준 원으로 사용 하지 않았다. 국제 표준 원으로이 RSV를 사용 하 여 실험실에서 결과 자신 있게 비교할 수 있도록 RSV NAb 측정 하는 미래 연구에 대 한 권장 한다.
비교적 간단 하 고, 높은 처리량 분석 결과의 개발 더 많은 실험실 전세계이 방법을 사용할 수 있을 것 이라고 RSV NAbs의 사용에 대 한 글로벌 표준화 노력을 촉진 것. 이것은 특히 중요 한 단계 3 예 심에 있는 현재 일부 개발에서 RSV 백신 후보자의 수를 주어진입니다. 그것은 중요 한 RSV 백신의 미래 임상 연구의 결과 비교, 수 및 따라서 표준화 된 분석 결과이 목표에 핵심 요소를 나타냅니다. 낮은 중간 소득 국가 번호를 직접 지원 하지 못할 수 있습니다 수집 장비 필요, 국제 협력을 통해 연계 및 역량 프로그램 매체 장기를 통해 중요 한 것입니다.
이 NAb 분석 실험 프로토콜은 다른 세포 선 (A549, Hep2, Vero)에 대 한 적응 될 수 있는 유연 하며 다른 RSV 변종에 사용할 수 있습니다. 우리는 또한이 방법을 위해 적응 RSV B 성공적으로. 그것에 더 많은 복제 및 참조 혈 청 제어 및 부정적인 컨트롤의 포함을 허용 하기 때문에 높은 정확도와 비용 효율적이 고 높은 처리 대안을 제공 하는 96 잘 접시 형식에 대 한 분석 결과 플랫폼 개발 되었습니다이이 모든 플레이트입니다. 동일한 참조 혈 청 컨트롤을 사용 하 여도 좋습니다이 품질 관리 및 품질 보증을 보장 하기 위해 중요 한. 우리의 손에서 30-405의 범위에서 다른 생물학 분석 실험에 대 한 보고 CVs 보다 훨씬 낮은 참조 혈 청에 대 한 6.82%의 매우 낮은 CVs 관찰 합니다.
또한, 이미지 데이터와이 프로토콜에서 생성 된 수 데이터 (원시 데이터) 저장할 수 있습니다 무기한 나중에 참조할 및 분석. 원시 데이터의 레코드를 유지 특히 그 미래 RSV 백신 관련 임상 시험에 대 한 필수 요구 사항입니다. 우리의 워크시트에 제안 ( 보충 워크시트참조)이이 프로토콜 품질 관리 및 보증 제어 목적으로 실험의 모든 측면을 기록 하는 데 도움이 수 있습니다. 워크시트 중화 titer로이 어떤 특수 소프트웨어를 요구 하지 않기의 이점이 있다 간단한 선형 모델을 사용 하 여 50%의 계산을 제공 합니다. 그러나, 우리의 NAb 분석 결과에서 원시 데이터 분석 될 수 있다 또한 사용 된 백신 연구에 50% 중화 titers을 계산 하지만이 필요한 다른 소프트웨어 패키지12,13 비-선형 회귀 모델을 사용 하 여 . 우리의 실험 데이터를 사용 하 여 이러한 두 가지 방법을 사용 하 여 얻은 결과 비슷, 단순화 된 선형 모델을 사용 하 여 얻은 titer 값에 신뢰를 주는 ( 보충 그림 1참조). 이 분석 결과 설정에 대 한 비용은 많은 실험실에 대 한 저렴 한 관광 명소 리더 (약 USD $50 K) 되는 아마도 가장 비싼 항목입니다. 그러나, 관광 명소 리더는 사이토카인 및 항 체 은닉 세포 측정, 백신 예 심 평가 있는 중요 한 구성 요소를 만드는 효소 연결 된 immunospot (ELISpot) 같은 다른 응용 프로그램에 사용할 수 있는 이점이 있다.
결론적으로,이 개선, 높은 처리량 RSV PRN 분석 결과 많은 실험실에서 쉽게 구현할 수 있다 고 RSV NAb 분석 실험에 대 한 누가의 국제 조화 노력을 지원 합니다. 이 소설 RSV 백신 후보자의 평가 미래에 대 한 중요 한 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 모든 참가자를 참여 감사합니다. 우리는 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램을 인정합니다. PVL은 NHMRC 경력 개발 장학금 받는 사람입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22 μm (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
References
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- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
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