Summary
本研究描述了一种高吞吐量 、基于图像的微中和方法, 以确定呼吸合胞病毒 (rsv) 特异性中和抗体的滴度。这种检测格式已在不同的样品类型上进行了测试。
Abstract
呼吸道合胞病毒特异性中和抗体 (rsv nabs) 是预防 rsv 的重要标志。目前全球有许多不同的检测格式在使用, 因此需要一种精确、高吞吐量的方法来测量 rsv nabs。我们在这里描述了一种基于图像的微中和试验, 该方法已在 rsv a 亚群上进行了测试, 也可适用于 rsv b 亚群和不同的样本类型。该方法具有高度重现性, 参考抗血清的测定变化小于10%。我们相信, 这种检测方法可以很容易地在全球许多实验室以相对较低的成本建立。开发一种测量 rsv nabs 的改进的高通量检测方法, 是在国际上实现 rsv nabs 标准化的一个重要步骤, 也是今后评价新型 rsv 疫苗候选疫苗的关键。
Introduction
呼吸道合胞病毒 (rsv) 是全世界儿科人群下呼吸道感染的主要原因1。尽管负担很重, 但仍然没有疫苗或治疗方法。自2013年以来, 世界卫生组织 (世卫组织) 已宣布 rsv 疫苗的开发为主要研究优先事项, 世卫组织年度协商会议为 2、3.世卫组织已同意使用 rsv 中和抗体 (nab) 测量来监测疫苗的免疫原性, 因为这被认为是保护的主要血清学标志4。nab 已被证明可以防止严重的 rsv 感染在一些研究以及临床试验的抗 rsv 单克隆抗体 palizumab, 目前唯一的预防策略可用4。
世界各地的实验室使用多种 nab 检测格式, 包括基于细胞和分子的检测, 这使得标准化工作对 5、6、7、8具有挑战性。然而, 传统的减少斑块中和 (prn) 方法仍然是金标准 9, 该方法通过存在 rsv 特异性抗体来测量减少的斑块形成单元 (pfu)的数量。在这里, 我们报告了一个改进、简化和高通量的 prn 协议, 该协议可用于多种细胞系, 适用于不同的 rsv 菌株, 并提高了检测吞吐量。该方案已使用来自不同环境的临床样本以及动物模型实验的样本进行了测试。
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Protocol
请注意:所有步骤都必须在 bsl2 引擎盖中执行, 除非另有说明。病毒滴定是需要在 prn 检测之前, 以确定在 prn 检测中使用的最佳 rsv 浓度。建议将病毒库存小批量, 将解冻一次, 并用于每次 nab 检测。还建议对一项研究中的所有样本进行的所有 nab 检测使用相同的病毒库存。在添加细胞板之前, 请确保培养基和磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 在37°c 加热。
1. rsv 病毒滴定
请注意:根据病毒库存的数量和重复的数量, 可以根据图 1设置检测板。每个病毒库存应滴定一式三份下的检测板, 从最高的病毒浓度 (即 1:10) 开始。串行滴定通常为1:10。a549 细胞培养和维护以及 rsv 培养程序是使用标准程序完成的, 不包括在本协议中。
- 播种板 (第1天)
- 在 dulbecco 的改良鹰培养基 (dmem) + 10% 的胎儿小牛血清 (fcs) + 1000 iu penicillin/streptomycin (pen/链球菌) 中的 a549 细胞, 在 4 x105/mll。种子96孔平底无菌板, 含有 100μl/井含有 4 x10 4 a459 细胞。
- 在37°c、5% co2 (细胞将处于逻辑阶段生长) 的情况下隔夜培育板材。
请注意:在23个通道后使用新的 a549 细胞小瓶。建议不要在新的细胞小瓶还在前三个通道时开始实验。
- 病毒感染 (第2天)
- 病毒序列稀释的制备
- 在37°c 的水浴中快速解冻一个冷冻小瓶 rsv, 直到几乎完全解冻, 立即放在冰上。为每个要检测的 rsv 病毒库存准备3个副本, 使用初始病毒库存稀释为 1:10, 稀释病毒井为 100μl, 并保留至少一列进行负控制。
请注意:图 1显示了三元组中的负控件。 - 在96井 u 型底板的 a 排 1:10 上, 加入100μl 的每株稀释病毒。在 b ~ h 行中加入 90μl/井, 在没有 fcs 的情况下添加 dmem + 1000 iu pen\ 链球菌。
- 通过将10μl 从 a 排转移到 b 行, 将溶液向上和向下移移 5次, 然后继续十折稀释, 直到 h 行, 将最后的10μl 丢弃, 使每口井的最终体积为 90μl, 从而使板材的最终体积为90μl。
请注意:每次稀释都要使用新的提示是很重要的。
- 在37°c 的水浴中快速解冻一个冷冻小瓶 rsv, 直到几乎完全解冻, 立即放在冰上。为每个要检测的 rsv 病毒库存准备3个副本, 使用初始病毒库存稀释为 1:10, 稀释病毒井为 100μl, 并保留至少一列进行负控制。
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对 a549 细胞的病毒接种
- 检索前一天准备的 a549 细胞板。确保96孔板中 a549 细胞单层约80% 融合。通过轻轻倒置板和轻轻涂抹在无菌吸水纸巾上的介质。
- 用100μl 的 pbs 清洗所有井两次, 每次清洗后, 通过轻轻倒置板和在无菌吸收性纸巾上轻轻涂抹, 丢弃多余的 pbs。不要让盘子干燥。
- 将病毒稀释从病毒滴定板 (图 1) 转移到 a549 细胞板上的相应井。在37°c 下将板材培育 1小时, 5% co2。孵育1小时后, 使用移液器 (以避免交叉污染) 的上清液。取出 90μl/井。
- 加入100μl的 1x 介质 199 ( m199 , 见材料表 ) + 1 . 5% 羧甲基纤维素钠盐 ( cmc ) 低粘度 + 2% fcs , 每口井含有链球菌。
注:需要预先准备 2x m199 + 4% fcs + 2% 的 pump/链球菌和 3% cmc 溶液, 并将其存储在4°c 下, 以供将来使用。在添加到板材中之前, 请确保溶液在37°c 下加热。- 制备 2x mL 溶液: 1 sachet/500 ml 蒸馏水 + 20 ml fcs + 10 ml pen 链丝 (以构成 2x mi99)。使用0.22μm 过滤单元对溶液进行过滤。
- 为制备3% 的 cmc, 将15克 cmc 慢慢加入500毫升的蒸馏水中。在50°c 时使用金属搅拌器加热器将 cmc 溶解在水中, 约需1小时的制备时间。混合好, 使3% 的 cmc 和高压灭菌的溶液。
请注意:必须在水中添加 cmc 固体才能溶解;在干燥的固体中加水会产生一个很难溶解的固体 "团块"。 - 通过将步骤1.2.2.4.2 制备的 2x m199 和 3% cmc 混合, 制备 1x m199 + 1.5% cmc 低粘度 + 2% fcs, 其中包含笔状链球道。
- 在 37°c, 5% co2下孵化板3天。
- 病毒序列稀释的制备
- 开发分析板和分析 (第5天)
- 固定和开发检测板
- 通过轻轻倒置板, 丢弃含有笔状链球道的 m199 + cmc + 2% fcs。慢慢加入 (以避免干扰细胞层) 200μl 的固定缓冲液 (80% 丙酮, 20% pbs, 储存在-20°c) 固定细胞。在-20°c 下孵化20分钟。
- 丢弃固定缓冲液, 轻轻涂抹在吸水纸巾上。让盘子面朝下干燥10分钟。
请注意:从这一步开始, 可以在 bsl2 引擎盖外进行检测。 - 在含有0.05% 聚山梨酸酯20的过滤 pbs 中制备5% 的牛奶稀释剂阻滞溶液 (pbs-聚山梨酸酯, 见材料表)。对于一个板材, 根据 200/井和110井计算堵塞所需的体积: 200/井 x 110 井 = 22 毫升 (20.9 毫升过滤的 pbs-聚山梨酸盐中的 1.1 ml 浓缩牛奶稀释剂)。在这一阶段, 也为原代和二级抗体提供了足够的阻滞溶液。对于一个板, 根据 50/井和110井计算每个抗体溶液所需的体积:50/井 x 110 井 = 5.5 ml。因此, 单片检测所需的牛奶稀释剂阻滞溶液总量为33毫升。
- 加入 200/井的阻塞溶液。在室温 (rt) 下将板材孵化 30分钟, 轻轻倒置板, 并将其涂抹在吸水性纸巾上, 将溶液丢弃。
- 制备 1: 500 山羊 x rsv 抗体 (mab-初级抗体) 在阻断溶液中稀释。加入 50%/井的 ma b 溶液, 在37°c 孵育 1小时. 用过滤后的 pbs 聚山梨酸盐清洗板3次。
- 准备1:5000 亚历克莎-福陆驴抗山羊 igg (二级抗体) 稀释在阻断溶液中。加入 50/井的二级抗体溶液, 在37°c 孵育 1小时. 用过滤后的 pbs 聚山梨酸盐清洗板5次。
- 使用荧光素异硫氰酸酯 (fitc) 通道和计数设置读取自动点读取器上的板, 如图 2所示。将钢板包裹在铝箔中, 存放在4°c。使用未使用的96孔培养板校准仪器, 并在检测前输入计数设置。
请注意:如果需要, 可以在几天内重新扫描。如果检测使用相同类型的板用于校准, 则可以保存校准和计数设置并用于将来的扫描。 - 检查井的图像中是否有人工斑块或中断的单元格单层 (图 3)。排除细胞单层破坏的井。
请注意:根据人工制品斑块的大小, 可能需要对这些井进行人工计数, 或者可能需要从数据分析中丢弃这些井。有效结果的标准包括在多个复制井中检测到的未被破坏的细胞单层或人工斑块, 在负井 (没有添加病毒的井) 中没有检测到 pfu。
-
测定病毒浓度
- 选择最后两种稀释剂, 其中斑点可以清楚地计数。计算在相同稀释情况下复制井的平均点数。使用以下公式计算库存样本的病毒滴度 (pfu/ml):
pusu\ ml = 平均产量/(稀释因子 x 稀释病毒添加到井中的体积)
注: 为每个 rsv 库存确定的病毒浓度现在可以在 prn 检测中使用 (步骤 2)。
- 选择最后两种稀释剂, 其中斑点可以清楚地计数。计算在相同稀释情况下复制井的平均点数。使用以下公式计算库存样本的病毒滴度 (pfu/ml):
- 固定和开发检测板
2. rsv 中和检测
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播种板 (第1天)
- 在 4x10/ml 的 dmem + 10% fcs + 1000 iu pen 链球菌中重新复制 a549 细胞.种子96孔平底无菌板, 含有 100μl/井, 含有 4 x10 4 a459 细胞, 并在37°c、5% co 2 (细胞将处于逻辑阶段生长) 处隔夜孵育板。
请注意:在23个通道后使用新的 a549 细胞小瓶。不建议在3号通道之前使用 a549 细胞。
- 在 4x10/ml 的 dmem + 10% fcs + 1000 iu pen 链球菌中重新复制 a549 细胞.种子96孔平底无菌板, 含有 100μl/井, 含有 4 x10 4 a459 细胞, 并在37°c、5% co 2 (细胞将处于逻辑阶段生长) 处隔夜孵育板。
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病毒和血清制剂 (第2天)
请注意:根据样品类型的不同, 在 nab 检测之前, 需要采取产前处理步骤。建议使用 rsv 国际标准血清, 该血清现可根据国家生物标准和控制研究所 (nibsc) 的要求提供。-
血清稀释的制备
- 在使用前 30分钟, 在 rt 中解冻人 rsv 参考抗血清 (参考血清、ref) 和血清检测样本, 在56°c 的水浴中提取热失活血清样本和参考抗血清。根据板模板准备稀释液 (图 4)。
- 准备 1: 100 稀释 ref. 准备至少110μl 的 ref, 在 dmem + pen/链带中稀释, 每个检测板没有 fcs (例如,在15μl 的总体积范围内的 ref 为 1.5μl)。在96孔 u 型底板的 a12 井中加入110μl 的1:100 稀释 ref。
- 在第12栏中加入55μl 的 dmem + pen/链球菌, 使 b12 至 h12。通过将55μl 从 a 排转移到 b 排, 将溶液向上和向下移移 5次, 并一直持续到 h 行, 从而使每口井的最终体积为 55μl, 从而使板材的最终体积达到 55μl, 从而使板材的最终体积降低。使用新的提示, 每次稀释。
- 准备 1: 100 稀释血清测试样品。由于所有血清样本均检测为三份, 因此为每个血清测试样本准备至少 110μl/well x3 = 330 μl。
- 在每个稀释的血清测试样品中加入 110μl (1:100;s1 = 血清1、s2 = 血清2等)根据图 4, 96 孔无菌板的相应井 a1 至 a9 和 e1 到 e9。
- 在所有贴有 fcs 标签的井中加入55μl 的 dmem + pen/链路, 按步骤进行串行1:2 稀释2.2.1.3 直到 d 行 (样品为1、2和 3)。丢弃最后55μl 介质, 使每口井的最终体积为55μl。同样, 对样本4、5和6行 e 到 h 执行串行1:2 稀释。
请注意:每次稀释都要使用新的提示是很重要的。 - 在第10柱和第11柱的井中加入55μl 的 dmem + pen/链带, 不带 fcs。
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病毒的制备
- 在37°c 的水浴中快速解冻一个冷冻小瓶 rsv, 直到几乎完全解冻, 立即放在冰上。
- 根据步进1.3.2 测定的 rsv 位数浓度, 在没有 fcs 的 dmem + pen\ 链球菌中稀释病毒。应用稀释, 给大约 200 puu/井。准备总体积5.5 毫升 (100 口井)。
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病毒-血清混合物的制备
- 根据板材模板, 将55种稀释后的病毒添加到第1-9 列的所有井和第10列和第11列的 e-h 排井 (正控制) (图 4)。
- 在第10列和第11列 a-d 行的所有井 (负对照) 中添加55无 fcs 的 dmem + pen/链球菌。在37°c 下将板材培育 1小时, 5% co2。
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对 a549 细胞的病毒接种
- 在潜伏期结束之前, 检索2.1.1 步骤制备的 a549 细胞板。确保96孔板中 a549 细胞单层约80% 融合。
- 通过轻轻倒置板和轻轻涂抹在无菌吸水纸巾上的介质。用100μl 的 pbs 清洗所有井两次, 每次清洗后, 通过轻轻倒置板和在无菌吸收性纸巾上轻轻涂抹, 丢弃多余的 pbs。不要让盘子干燥。
- 将病毒血清混合物的 100/井转移到 a549 细胞板上的相应井, 然后在37°c、5% co2下将其培养1小时。
- 1小时后, 使用移液器, 取出 90/井, 加入100预热 1x m199 + 1.5% cmc + 2% fcs + pen/链球菌。在 37°c, 5% co2下孵化板3天。
请注意:在添加到板材中之前, 请确保溶液在37°c 下加热。
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血清稀释的制备
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开发分析板和分析 (第5天)
- 按照 1.3.1.1 1.3.1.8 的步骤开发固定和检测板。
- 确定50% 中和滴度
- 通过计算高于或低于50% 的 "无血清" 控制井 (阳性病毒控制-第10栏, 第 e-h 行) 的对等血清稀释之间的比例距离来确定50% 的中和滴度。
- 数一数血清井和血清控制井中个别病毒感染引起的 pfu (即斑块) 的数量。计算无血清控制井的平均 pfu 数, 并确定50% 的值。
- 识别血清稀释, 计数立即高于或低于无血清控制井50% 的值。使用半日志图或电子表格模板, 绘制 x 轴上的 pfu 数 (线性刻度) 和 y 轴上的对等血清稀释 (日志10刻度)。在这两个点之间画一条线, 并读取这条线中测血清样本的50% 中和滴度。
请注意:rsv prn 检测工作表 (补充工作表) 用于确定50% 的中和滴度。
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Representative Results
病毒库存的滴定从1:10 到 1:10 8 稀释, 以确定 prn 检测前的病毒库存浓度 (图5所示的代表性结果)。从图 5中, 在稀释量为 1:10 4 和 1:10 5时, 可以可靠地计算 pfu。计算了同一稀释情况下三井的 pfu 平均数量。由于 1:10 5 稀释时的平均斑点数为 14, 因此确定了这种病毒库存的病毒滴度如下:
14 (平均 spots)/[10-5 (稀释) x0.1 ml (接种量)] = 1.4 x 10 7 puml
利用上述方法, 我们测量了人体样本中 rsv-a 和 b 的 nab。图 6显示了三个具有代表性的血清样品对 rsv-a 的不同 nab 滴度的井图像的解释。图 6a显示了每个代表性血清的样品滴定复制的良好图像 (实际的检测板有三个技术复制)。所示血清稀释量对于每个样本都是不同的。病毒控制井只含有病毒, 没有血清, 并计算了其平均 pfu, 并用于确定50% 的中和截止, 在本例中为52。图 6b显示了如何使用此截止点确定三个血清的滴定。血清稀释的日志2对等绘制在 x 轴上, pfu 的数量作为控制的百分比在 y 轴上绘制。符号和误差条表示三重标准偏差的平均值。病毒控制井中50% 的平均点 (以水平虚线表示) 被用作截止点, 以确定血清样本50% 的中和抗体滴度。中和抗体滴度被定义为稀释的倒数, 这将导致50% 的病毒活性抑制。
由于每个实验都包括 rsv 参考抗血清和阳性病毒控制井, 因此监测检测间的可变性可提供实验之间的质量控制。图 7显示了来自冈比亚队列 (n = 21) 10 和墨尔本健康志愿者 (n = 36)的两个不同成人群体的 rsv-a prn 检测结果。rsv nab 的滴度在每个人群中是可变的, 与墨尔本成年人相比, 冈比亚成年人的平均 nab 滴度较低。rsv 参考抗血清也显示 (n = 52个重复), 显示出非常低的变异性, 变异系数 (cv) 为6.82。
图 1: 用于定量 rsv 库存的病毒滴定板布局.v = rsv 病毒库存 (v1, 病毒批次1的库存; v1, 病毒批次2的库存; v1, 病毒批次3的库存), n = 负控制好, x = 添加的介质添加。颜色编码只是为了帮助板布局的可视化。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 用于点读取器的计数设置示例.通常用于计算病毒斑块的参数的屏幕截图。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 人工制品和中断的单元格单层的示例.(a) 文物。(b) 已损坏的单元格单层。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: rsv prn 检测的板模板.v = 病毒阳性控制井, n = 负对照井, x = 添加的培养基, s = 所有稀释剂的参考抗血清 (从1:100 到 1:12800) 在第12栏。颜色编码只是为了帮助板布局的可视化。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: rsv 病毒滴定结果的一个示例.显示了一式三份的检测结果所产生的代表性井。每口井中的数字都是指使用点读取器计数的斑块数量。tmc = 太多, 数不清。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 具有代表性的 rsv prn 检测结果.(a) 根据不同的稀释范围, 计算出三个单种血清样本的 pfu 数量。每个井图中的数字指的是计算的斑块数量。(b) 从a 组的井图像中解释三个具有代表性的人血清样本的 nab 滴度。这些数据是根据病毒控制井50% 的截止率计算的。水平条形图代表平均值±sd. 请点击此处查看此图的较大版本.
图7:rsv 中和墨尔本 (n = 21) 和冈比亚 (n = 36) 成虫的抗体滴度.人 rsv 参考血清也显示比较 (n = 52 复制)。符号表示单个滴度, 水平条表示几何均值滴度±95% ci。n = 52 结果是基于三个技术人员在两个月的时间。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 1: rsv-a 的 nab 滴度比较。(左) nab 滴度使用线性和非线性回归模型计算 (n = 152 检测)。(右图)使用线性和非线性回归模型的 rsv-a nab 滴度之间的相关性。请点击此处下载此文件.
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Discussion
我们开发和优化了一种简单高效的 rsv 微中和检测方法, 可在大多数实验室轻松应用。该方法能够测量病毒感染能力, 并通过计算机扫描在细胞层面测量 nab 对病毒感染的抑制。与传统的斑块检测方法 6、7相比, 基于图像的平台和特定抗体系统的使用提高了点检测的特异性和敏感性。这使得 rsv 菌株的特征具有较低的传染性, 并提供了准确的定量 rsv 浓度之前在 prn 检测中使用。
建议每次研究都使用同一批病毒库存, 以尽量减少 rsv 库存之间的任何批次间差异。该检测的其他重要方面包括病毒输入浓度的一致性、a549 细胞单层的完整性, 以及使用相同的计数设置来确保检测的一致性和准确性。添加到盘子中的病毒量可以在单独的斑块病毒滴定法中再次核实。然而, 监测 prn 检测的阳性控制井也提供了实际病毒滴度的迹象, 也是值得监测的整个检测。此外, 在每个板中加入参考血清是另一项质量控制措施, 以确保检测是可重复的。我们的实验没有使用最近验证的来自 nibsc 的 rsv 国际标准抗血清, 因为在我们研究11时还没有这种抗血清。使用这种 rsv 国际标准的抗血清应建议用于未来的研究, 测量 rsv nab, 以便将实验室之间的结果与信心进行比较。
开发一种相对简单、高通量的检测方法将促进使用 rsv nabs 的全球标准化工作, 因为全世界更多的实验室将能够使用这种方法。鉴于 rsv 候选疫苗的数量正在开发中, 这一点尤其重要, 其中一些疫苗目前正在进行第三阶段试验。至关重要的是, rsv 疫苗未来临床研究的结果必须具有可比性, 因此, 标准化的检测是实现这一目标的一个关键方面。虽然一些低收入和中等收入国家可能无法直接支持购置所需设备, 但通过国际合作和能力建设方案建立联系在中长期至关重要。
该 nab 检测方案灵活, 能够适应不同的细胞系 (a549、hep2 和 vero), 并可用于不同的 rsv 菌株。我们也成功地将这种方法应用于 rsv-b。由于该检测平台是为96孔板格式开发的, 因此它提供了一种经济高效且吞吐量高、精度高的替代方案, 因为它允许更多的复制, 并在每个平台上都包含参考血清控制和负控制。板。使用相同的参考血清控制也建议, 因为这是至关重要的, 以确保质量控制和质量保证。在我们手中, 我们观察到参考血清的简历很低, 为 6.82, 远远低于报告的 30-405范围内的其他生物检测的简历。
此外, 该协议生成的图像数据和计数数据 (原始数据) 可以无限期存储, 供将来参考和分析。保存原始数据的记录是临床试验的基本要求, 尤其是那些涉及未来 rsv 疫苗的临床试验。我们在本协议中建议的工作表 (请参阅补充工作表) 可以帮助记录实验的所有方面, 以便进行质量控制和保证控制。工作表使用简单的线性模型提供50% 中和滴度的计算, 因为这样做的优点是不需要任何专门的软件。然而, 我们的 nab 分析中的原始数据可以使用非线性回归模型进行分析, 该模型也用于疫苗研究中计算50% 的中和滴度, 尽管这需要其他软件包12,13.使用我们的实验数据, 使用这两种方法获得的结果是相似的, 为使用简化线性模型获得的滴度值提供了信心 (参见补充图 1)。建立这种检测的成本是负担得起的许多实验室, 也许最昂贵的项目是点读取器 (约50美元)。然而, 点阅读器的优点是能够用于其他应用, 如酶联免疫罐 (elispot) 用于细胞因子和/或抗体分泌细胞测量, 这使得它在疫苗试验评估中的一个有价值的组成部分。
总之, 这种改进的高通量 rsv prn 检测可以很容易地在许多实验室实施, 并将支持世卫组织在 rsv nab 检测方面的国际协调工作。这对于今后评估新型 rsv 候选疫苗至关重要。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢所有相关参与者。我们感谢维多利亚州政府的运营基础设施支持计划。pvl 是 nhmrc 职业发展奖学金获得者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22 μm (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
References
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