Summary
מחקר זה מתאר של תפוקה גבוהה, assay מיקרו-ניטרול מבוססת הדמיה כדי לקבוע את כייל נוגדנים נטרול ספציפיות עבור הווירוס syncytial הנשימה (RSV). תבנית זו assay נבדקו על סוגי דגימה שונים.
Abstract
הנשימה syncytial וירוס ספציפיים נטרול נוגדנים (RSV NAbs) הם סמן חשוב של הגנה כנגד RSV. מספר תבניות assay שונים הם נמצאים כעת בשימוש ברחבי העולם כך שאין צורך שיטה מדויקת, תפוקה גבוהה עבור מדידת RSV NAbs. נתאר כאן assay מיקרו-ניטרול מבוססת הדמיה אחר נושאים ' נבדק על קבוצת משנה של RSV A, ניתן להתאים גם עבור קבוצת משנה של RSV B סוגי דגימה שונים. שיטה זו היא מאוד לשחזור, עם וריאציות הבין-assay בנסיוב הפניה להיות פחות מ 10%. אנו מאמינים ש-assay הזה ניתן להקים בקלות במעבדות רבות ברחבי העולם במחיר נמוך יחסית. התפתחות assay משופרת, תפוקה גבוהה המודד RSV NAbs מייצג צעד משמעותי קדימה התקינה של שיטה זו ברחבי העולם, כמו גם להיות ביקורתיים להערכת המועמדים חיסון RSV הרומן בעתיד.
Introduction
הווירוס syncytial הנשימה (RSV) הוא הגורם המוביל של זיהומים בדרכי הנשימה התחתונה אוכלוסיית ילדים ברחבי העולם1. למרות משאו גבוהה, יש עדיין אין חיסון או טיפול זמין. משנת 2013, ארגון הבריאות העולמי (WHO) הכריזה על פיתוח חיסון RSV כעדיפות המחקר העיקרי, עם2,פגישות ייעוץ העולמי השנתי3. המי שהסכים באמצעות RSV בנטרול מדידה נוגדנים (NAb) כדי לעקוב אחר חיסון immunogenicity, כפי זה מזוהה כמספר דה מרקר סרולוגית העיקריים של הגנה4. NAbs הוכחו להגן מפני זיהום חמור RSV במספר מחקרים, כמו גם ניסויים קליניים של palivizumab נוגדנים חד שבטיים אנטי-RSV, כיום אסטרטגיה מניעתי בלבד זמינים4.
קיימות מספר תבניות assay NAb בשימוש על ידי מעבדות ברחבי העולם, כולל מבחני מבוססת תא, מבוסס על מולקולרית, אשר עשו מאמצים סטנדרטיזציה מאתגר5,-6,-7,-8. עם זאת, וזמינותו ניטרול (PRN) פלאק קונבנציונלי-הפחתת המודד את מספר מופחת פלאק ויוצרים יחידות (PFU) על ידי הנוכחות של נוגדנים ספציפיים RSV נשאר עדיין תקן זהב9. כאן, אנחנו מדווחים פרוטוקול PRN משופרת מפושטת, תפוקה גבוהה יכול לשמש בשורות תאים רבים, זנים RSV ועם תפוקה מוגברת וזמינותו. פרוטוקול זה נבדקו באמצעות דגימות קליניות של הגדרות שונות, כמו גם על דגימות מן המודל החייתי ניסויים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל השלבים צריך להתבצע בשכונה BSL2 אלא אם צויין אחרת. טיטור ויראלי נדרש מראש וזמינותו PRN כדי לקבוע ריכוז RSV אופטימלית בשימוש PRN וזמינותו. מומלץ aliquot את המניות וירוס באמצעי אחסון קטן להיות הקרת פעם, המשמש עבור כל assay NAb. מומלץ גם באמצעות המניה נגיפי זהה עבור כל מבחני NAb לבצע עבור כל דגימות מחקר אחד. ודא תרבות ומדיה באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) מחומם ב 37 מעלות צלזיוס לפני הוספת תא צלחות.
1. RSV טיטור ויראלי
הערה: בהתאם את מספר המניות וירוס מספר הכפילויות, הצלחת assay ניתן להגדיר על פי איור 1. כל מניה וירוס, צריך להיות טיטרציה שהפקידים למטה הצלחת assay, החל הריכוז הגבוה ביותר ויראלי (קרי, 1:10). Titrations טורי ניתן בדרך כלל 1:10. תרבית תאים A549, תחזוקה, כמו גם RSV תרבות הליך נעשים באמצעות הליכים סטנדרטיים, לא נכללות פרוטוקול זה.
- צלחות זריעה (יום 1)
- Resuspend A549 תאים של Dulbecco הנשרים ששינה בינוני (DMEM) + 10% עגל עוברית סרום (FCS) + 1000 IU פניצילין/סטרפטומיצין (עט/דלקת) ב 4 x 105/mL. זרע 96-ובכן שטוח התחתונה צלחות סטרילי עם 100 μL/טוב המכיל תאים 4 x 104 A459.
- דגירה צלחות בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 (תאים יהיה בבית הגידול שלב יומן).
הערה: שימוש חדש תא A549 המבחנה לאחר 23 מעברים. מומלץ לא להתחיל את הניסויים בקבוקון תא חדש נמצאת עדיין הקטעים הראשונים.
- זיהום בנגיף (יום 2)
- הכנת וירוס דילול טורי
- במהירות להפשיר בקבוקון קפוא יחיד של RSV בתוך אמבט מים 37 ° C עד כמעט לחלוטין הקרת ומניחים מיד על קרח. להכין 3 משכפל RSV כל וירוס מניות ניתן לבדיקה, להשתמש דילול מניות של וירוס הראשונית של 1:10 עם 100 μL של וירוס מדולל/טוב, להזמין לפחות עמודה אחת לשליטה שלילי.
הערה: איור 1 מציג שליטה שלילי triplicates. - להוסיף 100 μL של כל וירוס מדולל ב 1:10 שהפקידים בשורה A של 96-ובכן U-תחתון צלחת סטרילי. להוסיף μL 90/טוב של DMEM + עט 1000 IU/סטרפ ללא FCS שורות B ה
- לבצע 1:10 טורי דילולים למטה את הצלחת על ידי העברת μL 10 משורה A בשורה B. לערבב פתרון על-ידי pipetting תוכן לאורך 5 פעמים ולהמשיך את דילולים ten-fold עד השורה ה להשליך μL 10 הסופי כך שעוצמת הסופי בכל טוב הוא 90 μL.
הערה: חשוב להשתמש עצות חדשות עבור כל אחד דילול.
- במהירות להפשיר בקבוקון קפוא יחיד של RSV בתוך אמבט מים 37 ° C עד כמעט לחלוטין הקרת ומניחים מיד על קרח. להכין 3 משכפל RSV כל וירוס מניות ניתן לבדיקה, להשתמש דילול מניות של וירוס הראשונית של 1:10 עם 100 μL של וירוס מדולל/טוב, להזמין לפחות עמודה אחת לשליטה שלילי.
-
חיסון וירוס לתאים A549
- לאחזר cell plate(s) A549 מוכנים ביום הקודם. ודא A549 monolayers תא לוחית 96-ובכן ~ 80% confluent. למחוק מדיה על ידי בעדינות היפוך צלחת סופג בקלילות על מגבת נייר סופג סטרילי.
- לשטוף את כל בארות עם μL 100 ל- PBS פעמיים, למחוק PBS עודף על ידי בעדינות היפוך צלחת בקלילות סופג על מגבת נייר סופג סטרילי לשטוף אחרי זה. אל תאפשר צלחות להתייבש.
- העברה של דילולים וירוס מהצלחת טיטור ויראלי (איור 1) ולס המתאימות בצלחת תא A549. דגירה את הצלחת. בשביל 1 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. לאחר דגירה 1 h, decant supernatants באמצעות פיפטה (כדי למנוע זיהום לחצות). להוציא 90 μL/טוב.
- להוסיף 100 μL 1 x בינוני 199 (M199, ראה טבלה של חומרים) + 1.5% חומצה גליקולית תאית נתרן מלח (CMC) נמוך צמיגות + 2% FCS המכיל עט/סטרפ כדי מכל קידוח.
הערה: 2 x M199 + 4% FCS + 2% עט/סטרפ ופתרונות CMC 3% צריך להיות מוכן מראש, המאוחסנים ב 4 ° C לשימוש עתידי. ודא כי הפתרון מחומם ב 37 מעלות צלזיוס לפני הוספת צלחות.- להכין פתרון x M199 2: 1 שקית/500 מ"ל מזוקקים מים + 20 מ"ל FCS + אפשרות למצוא עט 10 מ"ל (להמציא 2 x MI99). לסנן את הפתרון באמצעות יחידת מסנן 0.22 μm.
- הכנה של 3% CMC, להוסיף 15 גרם של CMC לאט לתוך 500 מ ל מים מזוקקים. להמיס את CMC במים באמצעות חימום קדירות מתכתי ב 50 מעלות צלזיוס, אשר לוקח בערך 1 h של הכנה. לערבב היטב לעשות 3% CMC ו אוטוקלב הפתרון.
הערה: יש להוסיף את CMC מלא במים כדי להיות מומס; הוספת מים בבית מוצק יבש מייצרת "גוש" של מוצק שקשה מאוד להתמוסס. - להכין 1 x M199 + 1.5% CMC צמיגות נמוכה + 2% FCS המכיל עט/דלקת על ידי ערבוב 1:1 2-M199 ו- 3% CMC מוכן בשלב 1.2.2.4.2.
- תקופת דגירה צלחת של 3 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
- הכנת וירוס דילול טורי
- פיתוח assay צלחת וניתוח (יום 5)
- קיבוע וצלחת assay המתפתח
- להתעלם M199 + CMC + 2% FCS המכיל עט/דלקת על ידי היפוך בעדינות את הצלחת. להוסיף לאט לאט (כדי להימנע להפריע את שכבת תאים) μL 200 קיבוע מאגר (אצטון 80%, 20% ל- PBS, המאוחסנים ב-20 ° C) לתקן תאים. דגירה ב-20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- לבטל את המאגר קיבעון, כתם בעדינות על מגבת נייר סופג. להשאיר צלחת פנים עד יבש למשך 10 דקות.
הערה: משלב זה ואילך, ניתן לבצע assay מחוץ למכסה BSL2. - להכין 5% חלב diluent פתרון חסימה ב- PBS מסוננים המכילה 0.05% polysorbate 20 (PBS-polysorbate, ראה טבלה של חומרים). על לוח אחד, לחשב את אמצעי האחסון הדרושים לצורך חסימת בהתבסס על 200/110 ובקו בארות: 200/טוב x 110 בארות = 22 מ"ל (חלב מרוכז מ ל 1.1 diluent ב 20.9 mL מסונן PBS-polysorbate). בשלב זה, גם להמציא פתרון חסימה מספיק נוגדנים ראשיים ומשניים. על לוח אחד, לחשב את אמצעי האחסון הדרושים עבור כל הפתרונות נוגדן מבוסס על בארות 50/טוב, 110: בארות 110 x 50/טוב = 5.5 mL. לכן, הנפח הכולל של חלב diluent חוסם את הפתרון הנדרש וזמינותו הלוח היחיד הוא 33 מ.
- להוסיף 200 /well של פתרון חסימה. דגירה צלחת בטמפרטורת החדר (RT) במשך 30 דקות להשליך את הפתרון על-ידי היפוך בעדינות את הצלחת, כתם על מגבת נייר סופג.
- להכין נוגדן עז X RSV שבערך (mAb-נוגדן ראשוני) מדולל בחסימה פתרון. הוסף /well 50 של הפתרון mAb, דגירה ב 37 ° C עבור 1 ח' לשטוף צלחת 3 פעמים עם PBS מסונן-polysorbate.
- להכין 1:5,000 אלקסה-עבור חיל הים החמור עז אנטי איג (נוגדנים משניים) מדולל בחסימה פתרון. הוסף /well 50 של הפתרון נוגדנים משניים, דגירה ב 37 ° C עבור 1 ח' לשטוף צלחת 5 פעמים עם PBS מסונן-polysorbate.
- לקרוא את לוחית הזיהוי בקורא נקודות אוטומטית באמצעות תעלת isothiocyanate (FITC) fluorescein ולספור הגדרות כמוצג באיור2. לעטוף את צלחת בנייר ולאחסן ב 4 º C. לכייל את המכשיר באמצעות צלחת שאינם בשימוש תרבות 96-ובכן, הזנת הגדרות לספור לפני וזמינותו.
הערה: סריקה חוזרת תוך מספר ימים אפשרי אם נדרש. כיול והגדרת הרוזן יכול תישמר ולא שימשו את הסריקה בעתיד אם וזמינותו משתמשת מאותו סוג של צלחת המשמש את הכיול. - בדוק את התמונות של בארות הפלאק החפץ או קטועים תא monolayers (איור 3). הכללת וולס עם monolayers תא קטועים.
הערה: בהתאם לגודל של הפלאק החפץ, ספירות ידנית ייתכן שתצטרך לבצע עבור מאותן בארות או מאותן בארות ייתכן שתצטרך להיות מושלך מניתוח נתונים. קריטריונים לקבלת תוצאה חוקית כוללים אין תא שיבשו טפט או החפץ הפלאק זוהה שכפול אחד או יותר טוב, אין PFU זוהה בבארות שלילי (בארות ללא וירוס נוסף).
-
לקבוע ריכוז ויראלי
- לבחור את שתי האחרונות דילולים איפה נקודות ניתן לספור בבירור. לחשב את המספר הממוצע של כתמים מבארות שכפל-דילול אותו. לחשב את נגיפי כייל נוגדנים (PFU לכל מ ל) של המדגם מניות באמצעות הנוסחה שלהלן:
PFU/מ"ל = המספר הממוצע של הפלאק / (דילול גורם × נפח של וירוס מדולל נוספות הבאר)
הערה: ריכוז הוירוס נקבע עבור כל מניה RSV יכול כעת לשמש וזמינותו PRN (שלב 2).
- לבחור את שתי האחרונות דילולים איפה נקודות ניתן לספור בבירור. לחשב את המספר הממוצע של כתמים מבארות שכפל-דילול אותו. לחשב את נגיפי כייל נוגדנים (PFU לכל מ ל) של המדגם מניות באמצעות הנוסחה שלהלן:
- קיבוע וצלחת assay המתפתח
2. RSV ניטרול Assay
-
צלחות זריעה (יום 1)
- Resuspend A549 תאים DMEM + 10% FCS + עט 1000 IU/סטרפ-/mL עונה 4 פרק 105. זרע 96-ובכן שטוח התחתונה צלחות סטרילי עם 100 μL/טוב המכיל 4 x 104 A459 תאים, דגירה צלחות בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 (תאים יהיה בבית הגידול שלב יומן).
הערה: שימוש חדש תא A549 המבחנה לאחר 23 מעברים. לא מומלץ להשתמש A549 תאים לפני המעבר מספר 3.
- Resuspend A549 תאים DMEM + 10% FCS + עט 1000 IU/סטרפ-/mL עונה 4 פרק 105. זרע 96-ובכן שטוח התחתונה צלחות סטרילי עם 100 μL/טוב המכיל 4 x 104 A459 תאים, דגירה צלחות בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 (תאים יהיה בבית הגידול שלב יומן).
-
הכנת וירוס וסרום (יום 2)
הערה: בהתאם לסוג לדוגמה, ישנם צעדים הנדרשים עבור דגימות מראש עיבוד לפני וזמינותו NAb. מומלץ להשתמש את RSV בינלאומי סטנדרטי סרה עכשיו זמינות על פי בקשה מן המכון הלאומי עבור פקדים (לסטנדרטיזציה) ותקני ביולוגי.-
הכנת בסרום
- להפשיר את הנסיוב התייחסות אנושית RSV (הפניה סרום, שופט), סרום לבחון דגימות-בטל-RT. חום הדוגמאות סרום וההתייחסות בנסיוב באמבט מים ב 56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפני השימוש. להכין דילולים לפי התבנית צלחת (איור 4).
- להכין לדילול מטריים להכין הפניה למעורר מינימום של μL 110 של שופט מעורבבת עם DMEM + עט/סטרפ ללא FCS לכל צלחת assay (למשל, μL 1.5 של שופט, הנפח הכולל של 150 μL). להוסיף μL 110 בטחונות מדולל REF ב- A12 טוב של 96-ובכן U-תחתון צלחת סטרילי.
- להוסיף μL 55 DMEM + עט/סטרפ ללא FCS בארות B12 כדי H12 בעמודה 12. לבצע סידורי דילולים 1:2 את הלוח על ידי העברת 55 μL row A בשורה B, ערבוב פתרון על-ידי pipetting תוכן לאורך 5 פעמים, שתמשיך עד השורה ה להשליך את μL 55 הסופי של מדיה, כך שעוצמת הסופי בכל טוב הוא 55 μL. השתמש עצות חדשות עבור כל אחד דילול.
- להכין מטריים דילול של נסיוב הבדיקה דוגמאות. כל הדוגמאות סרום הם לבדיקה שהפקידים, להכין נפח מינימלי של μL/טוב 110 x 3 = 330 μL עבור דגימה בדיקת סרום.
- להוסיף μL 110 של כל מדגם בדיקת סרום מדולל (1: 100; S1 = סרום 1, S2 = סרום 2, וכו '.) כדי המתאימים בארות A1 אל A9 וגם E1 כדי E9 של צלחת סטרילי 96-ובכן לפי איור 4.
- להוסיף μL 55 של DMEM + עט/סטרפ ללא FCS כדי כל בארות מתויג אקס בצע טורי 1:2 דילולים לפי שלב 2.2.1.3 עד שורה D (עבור דגימות 1, 2 ו- 3). למחוק את μL 55 הסופי של מדיה כך שאמצעי האחסון הסופי היטב כל 55 μL. באופן דומה, לבצע הטורי דילולים 1:2 על דגימות 4, 5 ו- 6 עבור שורות E ה
הערה: חשוב להשתמש עצות חדשות עבור כל אחד דילול. - להוסיף μL 55 DMEM + עט/סטרפ ללא FCS בארות בעמודות 10 ו-11.
-
הכנת וירוס
- במהירות להפשיר בקבוקון קפוא יחיד של RSV בתוך אמבט מים 37 ° C עד כמעט לחלוטין הקרת ומניחים מיד על קרח.
- לדלל וירוס DMEM + עט/סטרפ ללא FCS מבוסס על ריכוז aliquot RSV שנקבע בשלב 1.3.2. החל לדילול שנותן כ PFU/טוב 200. היכונו הנפח הכולל של 5.5 mL (בארות 100).
-
הכנת תערובת וירוס-סרום
- להוסיף 55 של הנגיף מדולל בארות כל העמודות 1-9 ווולס שורות E-H של עמודות 10 ו-11 (בקרה חיובית) על פי התבנית צלחת (איור 4).
- להוסיף 55 DMEM + עט/סטרפ ללא FCS בארות כל שורות A-D של עמודות 10 ו-11 (בקרה שלילית). דגירה את הצלחת. בשביל 1 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
-
חיסון וירוס לתאים A549
- לפני סיום תקופת דגירה, לאחזר cell plate(s) A549 מוכנים בשלב 2.1.1. ודא A549 monolayers תא לוחית 96-ובכן ~ 80% confluent.
- למחוק מדיה על ידי בעדינות היפוך צלחת סופג בקלילות על מגבת נייר סופג סטרילי. לשטוף את כל בארות עם μL 100 ל- PBS פעמיים, למחוק PBS עודף על ידי בעדינות היפוך צלחת בקלילות סופג על מגבת נייר סופג סטרילי לשטוף אחרי זה. אל תאפשר צלחות להתייבש.
- העברת /well 100 של תערובת וירוס-סרום הבארות המתאימים בצלחת תא A549 בעקבות התבנית צלחת Incubate הצלחת. בשביל 1 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
- אחרי ה' 1, באמצעות פיפטה של, תוציא 90/היטב ולהוסיף 100 של prewarmed 1 x M199 + 1.5% CMC + 2% FCS + עט/סטרפ. תקופת דגירה צלחת של 3 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
הערה: ודא כי הפתרון מחומם ב 37 מעלות צלזיוס לפני הוספת צלחות.
-
הכנת בסרום
-
פיתוח assay צלחת וניתוח (יום 5)
- לפתח קיבוע ואת וזמינותו הצלחת ביצוע השלבים 1.3.1.1 כדי 1.3.1.8.
- לקבוע את כייל ניטרול של 50%
- לקבוע שכייל ניטרול של 50% על-ידי חישוב המרחק פרופורציונלי בין סרום הדדיים של דילולים מעל ומתחת 50% של הפקד 'אין סרום' בארות (שליטה וירוס חיובי - עמודה 10, שורות E-H).
- לספור את מספר PFU (קרי, שלטי) הנובעות בודדים זיהומים נגיפיים סרום בארות, בארות שליטה ללא סרום. לחשב את מספר PFU אין נסיוב בקרה הבארות רשע וקבע את הערך 50%.
- לזהות דילולים סרום עם ספירות שהינם מיד מעל ומתחת הערך 50% אין נסיוב בקרה הבארות. באמצעות גרף למחצה להיכנס או תבנית גיליון אלקטרוני, להתוות את מספר PFU על ציר ה-x (סולם ליניארית), דילול סרום הדדיים בציר ה-y (יומן10 סולם). למתוח קו בין שתי נקודות וקרא titers 50% ניטרול של הבדיקה הדוגמאות סרום מהקו הזה.
הערה: גליון assay RSV PRN (גליון משלים) משמש כדי לקבוע את כייל ניטרול של 50%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טיטרציה של מלאי וירוס בוצעה מ 1:10 עד 1:108 דילול כדי לקבוע ריכוז מניות וירוס לפני וזמינותו PRN (נציג תוצאות המוצג באיור5). איור 5, PFU ניתן לספור באופן אמין-דילולים של 1:104 ו- 1:105. המספר הממוצע של PFU מבארות triplicate-הדילול באותו מחושב. מאז המספר הממוצע של נקודות ב- 1:105 דילול בת 14, כייל ויראלי של מלאי ויראלי זה נקבע כדלקמן:
14 (המספר הממוצע של כתמים) / [10-5 (דילול) x 0.1 מ"ל (נפח של inoculum)] = 1.4 x 107 PFU/mL
באמצעות לעיל תיאר שיטה, מדדנו NAbs עבור שני RSV-A ו- B בדגימות אנושי. איור 6 מדגים את הפרשנות של תמונות טוב הדוגמאות סרום נציג שלושה והונגריות NAb titers נגד RSV-א איור 6A מראה טוב תמונות של טיטור המדגם משכפל עבור כל סרום נציג (הצלחת assay בפועל היה משכפל טכני שלושה). סרום דילולים כמצוין שונים עבור כל דגימה. וירוס שליטה בארות המכילה רק וירוס, סרום לא היה הממוצע שלהן PFU מחושב ולא להשתמש בו כדי לקבוע שרשם 50% ניטרול, אשר בדוגמה זו היה 52. איור 6B ממחישה איך טיטרציה של sera שלוש היה נחוש באמצעות ניתוק זה. הדדיים2 יומן הרישום של דילול סרום שמותווה על ציר ה-x ואת המספר של PFU כאחוז של שליטה על ציר ה-y. סמל וקווי השגיאה מייצגים הממוצע של triplicates ± סטיית התקן. חמישים אחוז של המקומות הממוצע ב הבארות וירוס-control (מסומן על ידי קו מקווקו אופקי) שימש ניתוק כדי לקבוע את 50% נטרול כייל נוגדנים של דגימת נסיוב. כייל נוגדנים נטרול מוגדר את הדדיים של דילול אשר יוביל 50% עיכוב של פעילות וירוס.
באותו ניסוי כוללת את נסיוב חיסון RSV הפניה ואת וירוס חיובי שליטה בארות, ניטור ההשתנות הבין-assay מספק בקרת איכות בין ניסויים. איור 7 מציגה את התוצאות של RSV-A PRN וזמינותו של שני גדודים למבוגרים שונה מכל קבוצה גמביה (N = 21)10 ומתנדבים בריאים במלבורן (N = 36). Titers של RSV NAb היו משתנה בתוך כל אוכלוסייה, עם המבוגרים הקטלונית שיש כייל נמוך NAb רשע לעומת המבוגרים מלבורן. הנסיוב הפניה RSV מוצג גם (N = משכפל 52), מפגינה השתנות נמוכה מאוד עם מקדם וריאציה (CV) 6.82%.
איור 1: טיטור ויראלי צלחת פריסה עבור כימות של מניות RSV. v = מלאי של וירוס RSV (v1, מלאי של נגיפי אצווה 1; v2, מלאי של נגיפי אצווה 2; v3, מניות של אצווה ויראלי 3), N = שליטה שלילי, X = מדיה נוסף. קודי הצבע הוא רק כדי לסייע ויזואליזציה של פריסת צלחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: דוגמא לספור ההגדרות המשמשות עבור הקורא כתמים. מסך של הפרמטרים משמש בדרך כלל עבור ספירת וירוס הפלאק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: דוגמאות של החפץ שיבשו תא monolayers. (א) חפצים. (B) Disrupted תא monolayers. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: צלחת תבנית עבור assay RSV PRN. V = שליטה חיובית ויראלי וולס, N = שליטה שלילי וולס, X = מדיה נוסף, S = התייחסות בנסיוב עם כל דילולים (מתוך בטחונות כדי 1:12, 800) בעמודה 12. קודי הצבע הוא רק כדי לסייע ויזואליזציה של פריסת צלחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: דוגמה של תוצאה טיטור ויראלי RSV. נציג בארות מ assay ביצע שהפקידים מוצגים. המספרים מכל קידוח מתייחסים למספר של הפלאק נספרים באמצעות קורא כתמים. TMC = מידי מכדי לספור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: נובעת assay RSV PRN נציג. (א) מספר PFU נחשבו שלוש דוגמאות בודדות סרום לפי טווחים שונים דילול. המספרים כל תמונה טוב להפנות מספר שלטי נספרים. (B) NAb כייל את הפירוש תמונות טוב בפאנל A על הדגימות בנסיוב אדם נציג שלוש. הנתונים מחושבת על בסיס שרשם 50% מן הבארות שליטה וירוס. סרגלים אופקיים לייצג זאת אומרת ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: RSV נטרול נוגדן titers במלבורן (N = 21) ו הקטלונית (N = 36) מבוגרים. הסרום התייחסות אנושית RSV מוצג גם להשוואה (N = משכפל 52). סמלים מייצגים titers בודדים ולייצג אופקיות הגיאומטרי כייל נוגדנים ± 95% CI. N = 52 תוצאות מבוססת על שלושה טכנאים בתקופה של חודשיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים איור 1: השוואה של NAb titers עבור RSV-א (שמאל) NAb titers באמצעות המודלים רגרסיה ליניארית ולא לינארי (N = מבחני 152). (מימין) מתאם בין titers RSV-A NAb משתמשים הן ליניארי ומודלים רגרסיה ליניארי. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש שפותחה ואנו ממוטב פשוטה ויעילה RSV מיקרו-ניטרול assay זה ניתן להתאים בקלות במעבדות רוב. זה וזמינותו הוא היכולת למדוד את היכולת זיהום נגיפי, כמו גם מדידת עיכוב של זיהום נגיפי מאת NAb ברמה התאית באמצעות סריקת תמונה ממוחשב. השימוש של פלטפורמה מבוססת הדמיה של מערכות מבוססות נוגדן ספציפי גדל ירידה לפרטים, ורגישות של זיהוי ספוט בהשוואה פלאק מסורתי איתור שיטות6,7. פעולה זו מאפשרת אפיון RSV זנים עם infectivity נמוך ומספק גם של כימות מדויק של RSV ריכוז לפני השימוש ב- PRN וזמינותו.
מומלץ כי מאותה אצווה של מניות ויראלי משמש עבור כל מחקר על מנת למזער את כל הווריאציות אצווה-כדי-אצווה בין מניות RSV. היבטים חשובים אחרים של וזמינותו כוללים את העקביות של ריכוז קלט וירוס, השלמות של טפט תא A549, באמצעות אותן הגדרות count כדי להבטיח עקביות assay ודיוק. אפשרות לאמת את כמות וירוסים. הוסיף לצלחת שוב ב טיטור ויראלי פלאק נפרדים. עם זאת, ניטור הבארות בקרה חיובית של וזמינותו PRN גם מספק אינדיקציה כייל ויראלי בפועל, גם כדאי לעקוב אחר מעבר מבחני. יתר על כן, כולל את הנסיוב הפניית כל צלחת הוא מדד נוסף בקרת איכות כדי להבטיח כי מבחני לשחזור. הניסויים שלנו לא השתמשת לאחרונה המאומת RSV בינלאומי סטנדרטי בנסיוב מ לסטנדרטיזציה, שלא היה זמין בזמנו של המחקר שלנו11. צריך להיות מומלץ להשתמש בנסיוב הזה RSV סטנדרטי בינלאומי עבור מחקרים עתידיים מדידה RSV NAb, כך שניתן יהיה להשוות תוצאות מעבר מעבדות עם ביטחון.
התפתחות assay פשוטה יחסית, תפוקה גבוהה להקל על המאמצים התקינה העולמי לשימוש של RSV NAbs כמו עוד מעבדות ברחבי העולם יהיה מסוגל להשתמש בשיטה זו. דבר זה חשוב במיוחד לנוכח מספר מועמדים חיסון RSV בפיתוח, עם כמה כעת בניסויים שלב 3. זה חיוני כי התוצאות של מחקרים קליניים עתידיים של חיסונים RSV להיות דומות, ולכן assay מתוקננת מייצג היבט מרכזי למטרה זו. בעוד מספר מדינות income נמוך middle לא יכול להיות מסוגלים לתמוך ישירות לצורך רכישת הציוד, קישורים באמצעות שיתופי פעולה בינלאומיים ו/או בניית תוכניות היכולת יהיו קריטיות על המדיום כדי לטווח ארוך.
פרוטוקול assay זה NAb גמיש להיות מסוגל להיות מותאם שורות תאים שונים (A549, Hep2 ו- Vero), ניתן להשתמש עבור זנים RSV. אנחנו לשכיחה בשיטה זו עבור RSV-B בהצלחה. כפי פלטפורמת assay פותחה עבור תבנית צלחת 96-ובכן, זה מספק חלופה חסכונית, תפוקה גבוהה עם רמת דיוק גבוהה כי זה מאפשר משכפל נוסף והכללה של הפניה נסיוב בקרה ושליטה שלילי על כל צלחת. שימוש בפקד סרום באותה התייחסות מומלץ גם כמו זו היא קריטית כדי להבטיח בקרת איכות ואבטחת איכות. בידיים שלנו, הבחנו CVs נמוך מאוד של 6.82% עבור הסרום הפניה אשר הוא נמוך בהרבה מאשר CVs המדווחת עבור מבחני ביולוגיות אחרות בטווח של 30-40%5.
יתר על כן, את נתוני התמונה ואת נתוני הספירה (נתונים גולמיים) שנוצר מתוך פרוטוקול זה ניתן לאחסן ללא הגבלת זמן עתידי ו/או ניתוח. שמירה על רשומות נתונים גולמיים הוא מהדרישות לניסויים קליניים, במיוחד אלו שמערבים חיסונים RSV בעתיד. גליון העבודה שלנו (ראה גליון משלים) הציע ב פרוטוקול זה יכול לעזור כדי להקליט את כל ההיבטים של הניסוי לשם בקרת איכות, אבטחת בקרת. גליון העבודה מספק את החישוב של 50% נטרול כייל נוגדנים באמצעות מודל ליניארי פשוט כמו זה יש את היתרון של לא דורש שום תוכנות מיוחדות. עם זאת, הנתונים הגולמיים של assay NAb שלנו ניתן לנתח באמצעות מודל רגרסיה ליניארי זה שימש גם במחקר חיסון לחישוב titers נטרול 50%, למרות שזה דורש אחרים תוכנה חבילות12,13 . באמצעות נתוני הניסוי שלנו, התוצאות המתקבלות באמצעות שתי השיטות היו דומים, נותן אמון לערכים כייל נוגדנים שהושג באמצעות מודל ליניארי מפושטת (ראה איור 1 משלים). העלות עבור הגדרת assay הזה היא בהישג יד, עבור מעבדות רבות עם אולי הפריט היקר ביותר להיות הקורא כתמים (כ USD $50K). אולם, הקורא כתמים יש את היתרון של היכולת לשמש עבור יישומים אחרים כגון מקושרים-אנזים immunospot (ELISpot) ציטוקינים ו/או מדידה התא מפריש נוגדן, מה שהופך אותו מרכיב חשוב בהערכת המשפט חיסון.
לסיכום, זו assay RSV PRN משופרת, תפוקה גבוהה ניתן ליישם בקלות במעבדות רבות, יתמוך מאמץ בינלאומי משלים של מי עבור מבחני RSV NAb. זה יהיה קריטי עבור הערכת המועמדים הרומן של חיסון RSV בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים תודה לכל המשתתפים מעורבים. אנו להכיר תוכנית תמיכה תשתיות מבצעיות של הממשלה ויקטוריאני. PVL היא נמען מלגת פיתוח הקריירה NHMRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22 μm (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
References
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
- Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
- Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
- Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
- van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
- Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
- Tripp, R. A., Jorquera, P. A. Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , Humana Press. (2016).
- Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
- McDonald, J. U., Rigsby, P., Dougall, T., Engelhardt, O. Report on the WHO collaborative study to establish the 1st International Standard for antiserum to Respiratory Syncytial Virus. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y (2017).
- Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
- Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).
