Summary
Deze studie beschrijft een hoog debiet, imaging gebaseerde micro-neutralisatie test om te bepalen van de titer van neutraliserende antilichamen specifiek voor respiratoir syncytieel virus (RSV). Deze bepaling-indeling is getest op verschillende monster typen.
Abstract
Respiratoir syncytieel virus-specifieke neutraliserende antilichamen (RSV NAbs) zijn een belangrijke markering van bescherming tegen RSV. Een aantal verschillende assay formaten zijn momenteel in gebruik wereldwijd dus er is een behoefte aan een nauwkeurige en high-throughput methode voor het meten van RSV NAbs. Hier beschrijven we een imaging gebaseerde micro-neutralisatie bepaling die is getest op RSV deelgroep A en kan ook worden aangepast voor RSV deelgroep B en verschillende monster typen. Deze methode is zeer reproduceerbaar is, met inter assay variaties voor de referentie-antiserum wordt minder dan 10%. Wij geloven dat deze bepaling kan worden gemakkelijk vast te stellen in veel laboratoria wereldwijd tegen relatief lage kosten. Ontwikkeling van een verbeterde, hoge-doorvoer bepaling dat maatregelen van RSV NAbs vormt een belangrijke stap voorwaarts voor de normalisatie van deze methode internationaal evenals kritisch voor de beoordeling van nieuwe RSV vaccin kandidaten in de toekomst.
Introduction
Respiratoir syncytieel virus (RSV) is de belangrijkste oorzaak van infecties van de lagere luchtwegen in de pediatrische bevolking wereldwijd1. Ondanks haar hoge last is er nog geen vaccin of behandeling beschikbaar. Sinds 2013, heeft de World Health Organization (WHO) verklaard RSV vaccinontwikkeling prioritair grote onderzoeksprogramma, met jaarlijkse WHO overleg vergaderingen2,3. De WHO is overeengekomen over het gebruik van RSV neutraliserende antilichamen (NAb) meting volgen vaccin immunogeniciteit, zoals dit is erkend als belangrijke serologische markering van bescherming4. SurePress Touchscreen nAbs is aangetoond dat ze beschermen tegen ernstige RSV-infectie in een aantal studies alsook de klinische proeven van de anti-RSV monoklonaal antilichaam palivizumab, momenteel de alleen preventieve strategie beschikbaar4.
Er zijn meerdere NAb assay formaten gebruikt door laboratoria wereldwijd, met inbegrip van cel- en moleculaire gebaseerde testen, die hebben ingespannen normalisatie uitdagende5,6,7,8. De conventionele plaque-reductie neutralisatie (PRN) bepaling die meet het aantal verminderde plaque vorming van eenheden (PFU) door de aanwezigheid van een RSV-specifieke antilichaam blijft echter nog steeds de gouden standaard9. Wij rapporteren hier, een betere, vereenvoudigde en high-throughput PRN-protocol dat worden op talrijke cellijnen, voor verschillende RSV stammen en met verhoogde assay debiet gebruikt kan. Dit protocol is getest met behulp van klinische monsters uit verschillende instellingen alsmede op monsters uit dierlijk model experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een BSL2 kap, tenzij anders vermeld. Virale titratie is vereist voorafgaand aan een PRN-test om te bepalen van de optimale RSV-concentratie in de PRN-bepaling gebruikt. Het is aanbevolen om aliquot de virusvoorraden in een klein volume die zal worden eenmaal ontdooid en gebruikt voor elke NAb assay. Gebruik van de dezelfde virale voorraad voor alle NAb tests uitgevoerd voor alle monsters uit een studie is ook aanbevolen. Zorg ervoor dat cultuurmedia en -fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 37 ° C is opgewarmd voordat u toevoegt aan cel platen.
1. RSV virale titratie
Opmerking: Afhankelijk van het aantal virusvoorraden en het aantal duplicaten, kan worden ingesteld in de plaat assay volgens Figuur 1. Elke virus voorraad moet worden getitreerd in drievoud naar beneden de assay plaat, beginnend bij de hoogste virale concentratie (dat wil zeggen, 1:10). Seriële titraties kunnen meestal 1:10. De cultuur van de cel van de A549 en onderhoud, alsmede RSV cultuur procedure zijn gedaan met behulp van standaardprocedures en zijn niet opgenomen in dit protocol.
- Zaaien van platen (dag 1)
- Resuspendeer de cellen van de A549 in de Dulbecco bewerkt Eagles medium (DMEM) + 10% foetaal kalfsserum (FCS) + 1000 IU penicilline/streptomycine (pen/strep) op de 4 x 105/mL. Zaad 96-Wells flat-onder steriele platen met 100 μl per putje met 4 x 104 A459 cellen.
- Incubeer de platen 's nachts bij 37 ° C, 5% CO2 (cellen zal zijn in de groei van de log-fase).
Opmerking: Gebruik nieuwe A549 cel injectieflacon na 23 passages. Het is aanbevolen om niet start de experimenten, wanneer een nieuwe cel flacon bevindt zich nog in de eerste drie passages.
- Virusinfectie (dag 2)
- Voorbereiding van virus seriële verdunning
- Snel ontdooien een enkele bevroren Injectieflacon van RSV in een waterbad 37 ° C tot bijna volledig ontdooid en onmiddellijk van kracht worden op het ijs. Bereiden 3 wordt gerepliceerd op elke RSV virus voorraad worden bepaald, gebruik van een eerste virus voorraad verdunning 1:10 met 100 μl van verdunde virus per putje en reserveren van ten minste één kolom voor de negatieve controle.
Opmerking: Figuur 1 toont negatieve controle in triplicates. - Voeg 100 μl van elke verdunde virus op 1:10 in drievoud van rij A van een 96-Wells U-onder steriele plaat. 90 μl per putje van DMEM + 1000 IU pen/strep zonder FCS toevoegen aan rijen B aan H.
- Uitvoeren van seriële 1:10 verdunningen beneden de plaat door de overdracht van 10 μL van rij A rij B. Mix oplossing door pipetting inhoud op en neer 5 keer en blijven het tienvoudige verdunningen tot rij H. Discard de laatste 10 μL zodat het eindvolume in elk goed 90 μL.
Opmerking: Het is belangrijk om het gebruik van nieuwe tips voor elke verdunning.
- Snel ontdooien een enkele bevroren Injectieflacon van RSV in een waterbad 37 ° C tot bijna volledig ontdooid en onmiddellijk van kracht worden op het ijs. Bereiden 3 wordt gerepliceerd op elke RSV virus voorraad worden bepaald, gebruik van een eerste virus voorraad verdunning 1:10 met 100 μl van verdunde virus per putje en reserveren van ten minste één kolom voor de negatieve controle.
-
Virus inoculatie naar A549 cellen
- A549 cell plate(s) voorbereid op de vorige dag ophalen. Zorg ervoor dat A549 cel monolayers in de 96-wells-platen ~ 80% heuvels. Media verwijderen door zachtjes plaat omkeren en licht bevlekken op steriel absorberend papier handdoek.
- Was alle putjes met 100 μl van PBS tweemaal, ontdoen van overtollige PBS door voorzichtig omkeren plaat en licht bevlekken op steriel absorberend papier handdoek na elke wasbeurt. Laat geen platen om te drogen.
- De verdunningen van het virus van de virale titratie plaat (Figuur 1) overbrengen aan overeenkomstige putjes op de plaat van de cel A549. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2. Na een incubatieperiode van 1 h, decanteren supernatant met behulp van een precisiepipet (kruis om verontreiniging te voorkomen). Nemen 90 μl per putje.
- Voeg 100 μl van 1 x medium 199 (M199, zie tabel van materialen) + natriumzout van 1,5% carboxymethylcellulose (CMC) lage viscositeit + 2% FCS met pen/strep aan elk putje.
Opmerking: 2 x M199 + 4% FCS + pen/strep 2% en 3% CMC oplossingen moeten worden voorbereid en opgeslagen bij 4 ° C voor toekomstig gebruik. Zorg ervoor dat de oplossing voordat u toevoegt aan de platen bij 37 ° C is opgewarmd.- Bereiden van 2 x M199 oplossing: 1 zakje/500 mL gedistilleerd water + 20 mL FCS + 10 mL pen/strep (om 2 x MI99). Filtreer de oplossing met behulp van een 0,22 μm filter eenheid.
- Voorbereiding van 3% CMC, voeg 15 g CMC langzaam in 500 mL gedestilleerd water. Los de CMC in water met behulp van metallisch roerder kachel bij 50 ° C, waarin ongeveer 1 h van voorbereiding. Mix goed op 3% CMC en autoclaaf de oplossing.
Opmerking: De CMC solide moet worden toegevoegd aan het water om te worden ontbonden; water toe te voegen aan de droge vaste stof produceert een "klomp" van het lichaam dat is heel moeilijk te ontbinden. - 1 x M199 + 1,5% CMC lage viscositeit bereiden + 2% FCS pen/strep door het mengen van 1:1 met de 2 x M199 en 3% CMC bereid in stap 1.2.2.4.2.
- Incubeer de plaat gedurende 3 dagen bij 37 ° C, 5% CO2.
- Voorbereiding van virus seriële verdunning
- Ontwikkeling van assay plaat en analyse (dag 5)
- Fixatie en ontwikkelende assay plaat
- Gooi CMC, M199 + 2% FCS met pen/strep door zachtjes het omkeren van de plaat. Voeg langzaam (om te voorkomen dat de cellaag verstoren) 200 μL van fixatie buffer (80% aceton, 20% PBS, opgeslagen bij-20 ° C) cellen vast te stellen. Incubeer bij-20 ° C gedurende 20 minuten.
- Negeren van de fixatie buffer en zachtjes vlek op absorberend papier handdoek. Laat de plaat gezicht neer aan droge gedurende 10 minuten.
Opmerking: Vanaf deze stap, kan test worden uitgevoerd buiten de BSL2 kap. - Bereiden van 5% melk verdunningsmiddel blokkerende oplossing in gefilterde PBS met 0,05% Polysorbaat 20 (PBS-polysorbaat, Zie Tabel van materialen). Voor één plaat, het berekenen van het volume die nodig is voor blokkeren op basis van 200/110 en wells: 200/goed x 110 wells = 22 mL (1.1 mL geconcentreerde melk in 20.9 mL verdunningsmiddel gefilterd PBS-polysorbaat). In dit stadium ook voldoende blokkerende oplossing voor primaire en secundaire antilichamen make-up. Voor één plaat, het berekenen van het volume die nodig zijn voor elke antilichaam-oplossing op basis van 50/goed en 110 wells: 50/goed x 110 wells = 5,5 mL. Daarom is de totale hoeveelheid melk verdunningsmiddel blokkeren oplossing nodig voor een enkele plaat assay 33 mL.
- Voeg toe 200 berichten van blokkerende oplossing. Incubeer plaat bij kamertemperatuur (RT) gedurende 30 min. negeren de oplossing door zachtjes de plaat omkeren en vlek op absorberend papier handdoek.
- Voorbereiden 1:500 geit X RSV antilichaam (mAb-primair antilichaam) verdund in het blokkeren van de oplossing. Voeg 50 berichten van de mAb-oplossing toe en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 h. Wash plaat 3 keer met gefilterde PBS-polysorbaat.
- Voorbereiden 1:5,000 Alexa-Fluor ezel anti-geit IgG (secundair antilichaam) verdund in het blokkeren van de oplossing. Voeg 50 berichten voor de oplossing van secundair antilichaam en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 h. Wash plaat 5 keer met gefilterde PBS-polysorbaat.
- Plaat op een lezer van de geautomatiseerde vlekken met behulp van het fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-kanaal lezen en tellen van instellingen zoals afgebeeld in Figuur 2. Plaat in folie wikkelen en bewaren bij 4 ° C. Kalibreren van het instrument met behulp van een cultuur van ongebruikte 96-wells-plaat en invoeren van graaf instellingen vóór assay.
Opmerking: Opnieuw scannen binnen een paar dagen is mogelijk indien nodig. De kalibratie en de graaf instelling kunnen worden opgeslagen en gebruikt voor het toekomstige scannen als de bepaling maakt gebruik van hetzelfde type plaat gebruikt voor de kalibratie. - Controleer de beelden van putten voor artefact plaques of verstoord cel monolayers (Figuur 3). Putjes met verstoorde cel monolayers uitsluiten.
Opmerking: Afhankelijk van de grootte van de plaques artefact, handmatige graven moet worden uitgevoerd voor deze putten of die putten wellicht moeten worden afgevoerd van data-analyse. Criteria voor een geldig resultaat omvatten geen verstoord cel enkelgelaagde of artefact plaques gedetecteerd in meer dan één repliceren goed en geen PFU gedetecteerd in negatieve wells (wells zonder toegevoegde virus).
-
Virale concentraties bepalen
- Kies de laatste twee verdunningen waar vlekken duidelijk kunnen worden geteld. Bereken het gemiddelde aantal plekken uit repliceren putten bij de dezelfde verdunning. Bereken de virale titer (PFU per mL) van de voorraad monster met behulp van de onderstaande formule:
PFU/mL = gemiddelde aantal plaques / (verdunning factor × Volume van de verdunde virus toegevoegd aan het putje)
Opmerking: De concentratie van de virus bepaald voor elk aandeel RSV kan nu worden gebruikt in de PRN-test (stap 2).
- Kies de laatste twee verdunningen waar vlekken duidelijk kunnen worden geteld. Bereken het gemiddelde aantal plekken uit repliceren putten bij de dezelfde verdunning. Bereken de virale titer (PFU per mL) van de voorraad monster met behulp van de onderstaande formule:
- Fixatie en ontwikkelende assay plaat
2. RSV neutralisatie Assay
-
Zaaien van platen (dag 1)
- Resuspendeer de cellen van de A549 in DMEM + 10% FCS + 1000 IU pen/strep op 4 x 10,5/mL. Zaad 96-Wells flat-onder steriele platen met 100 μl per putje met 4 x 104 A459 cellen en incubeer platen 's nachts bij 37 ° C, 5% CO2 (cellen zal zijn in de groei van de log-fase).
Opmerking: Gebruik nieuwe A549 cel injectieflacon na 23 passages. Het is niet aanbevolen om het gebruik van A549 cellen voor passage nummer 3.
- Resuspendeer de cellen van de A549 in DMEM + 10% FCS + 1000 IU pen/strep op 4 x 10,5/mL. Zaad 96-Wells flat-onder steriele platen met 100 μl per putje met 4 x 104 A459 cellen en incubeer platen 's nachts bij 37 ° C, 5% CO2 (cellen zal zijn in de groei van de log-fase).
-
Virus en serum voorbereiding (dag 2)
Opmerking: Afhankelijk van het type van de steekproef zijn er stappen die zijn vereist voor voorbewerkend monsters vóór de bepaling van de NAb. Het is aanbevolen om gebruik van de RSV internationale standaard sera die nu beschikbaar is op verzoek van het Nationaal Instituut voor biologische normen en controles (NIBSC).-
Voorbereiding van de serumverdunning
- Ontdooi de menselijke RSV referentie-antiserum (referentieserum, REF) en serum testopnames in serummonsters RT. warmte-inactivering en verwijst naar antiserum in een waterbad bij 56 ° C gedurende 30 minuten vóór gebruik. Maak verdunningen volgens de plaat sjabloon (Figuur 4).
- Maak 1:100 verdunning van de REF. voorbereiden een minimum van 110 μL van REF verdund in DMEM + pen/strep zonder FCS per assay plaat (b.v., 1,5 μL van REF in een totaal volume van 150 μl). Voeg 110 μL van 1:100 verdund REF in goed A12 van een 96-Wells U-onder steriele plaat.
- Voeg 55 l DMEM + pen/strep zonder FCS putjes B12 aan H12 in kolom 12. Uitvoeren serie 1:2 verdunnen naar beneden de plaat door overdracht van 55 μL van rij A naar rij B, oplossing mengen door pipetting inhoud op en neer 5 keer en verder tot rij H. Discard de definitieve 55 μL van media zodat het eindvolume in elk goed 55 μL. Het gebruik van nieuwe tips voor elke verdunning.
- Maak 1:100 verdunning van het serum monsters. Zoals alle serummonsters worden vehiculumcontrolegroep in drievoud, bereiden een minimumhoeveelheid 110 μl per putje x 3 = 330 μL per test serummonster.
- Toevoegen van 110 μL van elk monster verdunde serum (1:100; S1 = serum 1, S2 = serum 2, enz.) overeenkomstige putjes A1 A9 en ook E1 naar E9 van de steriele 96-wells-plaat overeenkomstig Figuur 4.
- Voeg 55 l DMEM + pen/strep zonder FCS aan alle putjes geëtiketteerd X. uitvoeren seriële 1:2 verdunnen volgens stap 2.2.1.3 tot rij D (voor monsters 1, 2 en 3). Gooi de definitieve 55 μL van media zodat het eindvolume in elk putje 55 μL is. Ook het uitvoeren van de seriële verdunningen 1:2 voor monsters 4, 5 en 6 voor rijen E aan H.
Opmerking: Het is belangrijk om het gebruik van nieuwe tips voor elke verdunning. - Voeg 55 l DMEM + pen/strep zonder FCS putjes in de kolommen 10 en 11.
-
Voorbereiding van virus
- Snel ontdooien een enkele bevroren Injectieflacon van RSV in een waterbad 37 ° C tot bijna volledig ontdooid en onmiddellijk van kracht worden op het ijs.
- Verdun virus in DMEM + pen/strep zonder FCS op basis van de concentratie van het monster van de RSV in stap 1.3.2 vastgesteld. Toepassing van een verdunning die ongeveer 200 PFU per putje geeft. Voorbereiden op een totaal volume van 5,5 mL (100 wells).
-
Voorbereiding van virus-serum mengsel
- 55 van het verdunde virus toevoegen aan alle putjes van de kolommen 1-9 en putjes van rijen E-H van kolommen 10 en 11 (positieve controle) volgens de plaat sjabloon (Figuur 4).
- 55 van DMEM + pen/strep zonder FCS toevoegen aan alle putjes van rijen A-D van kolommen 10 en 11 (negatieve controle). Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
-
Virus inoculatie naar A549 cellen
- Voorafgaand aan de voltooiing van de incubatietijd, ophalen A549 cell plate(s) bereid in stap 2.1.1. Zorg ervoor dat A549 cel monolayers in de 96-wells-platen ~ 80% heuvels.
- Media verwijderen door zachtjes plaat omkeren en licht bevlekken op steriel absorberend papier handdoek. Was alle putjes met 100 μl van PBS tweemaal, ontdoen van overtollige PBS door voorzichtig omkeren plaat en licht bevlekken op steriel absorberend papier handdoek na elke wasbeurt. Laat geen platen om te drogen.
- 100 berichten van het virus-serum mengsel overbrengen in de overeenkomstige putjes op de A549 cel plaat na de plaat sjabloon Incubate de plaat gedurende 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
- Na 1 uur, met behulp van een precisiepipet, 90/goed nemen en voeg voorverwarmde 100 van 1 x M199 + 1,5% CMC + 2% FCS + pen/strep. Incubeer de plaat gedurende 3 dagen bij 37 ° C, 5% CO2.
Opmerking: Zorg ervoor dat de oplossing voordat u toevoegt aan de platen bij 37 ° C is opgewarmd.
-
Voorbereiding van de serumverdunning
-
Ontwikkeling van assay plaat en analyse (dag 5)
- Fixatie en assay plaat als volgt 1.3.1.1 om 1.3.1.8 te ontwikkelen.
- Bepalen van de titer van de neutralisatie 50%
- Bepaal dat de titer neutralisatie 50% door de berekening van de proportionele afstand tussen de wederzijdse serum verdunningen hierboven en minder dan 50% van de ' geen ' controleserum wells (positieve virus control - kolom 10, rijen E-H).
- Tel het aantal PFU (d.w.z., plaques) die voortvloeien uit individuele virale infecties in serum wells en geen serum-controleputjes. Berekenen van het gemiddelde aantal PFU van de geen serum-controleputjes en bepalen van de waarde van 50%.
- Identificeren van verdunningen van het serum met graven die onmiddellijk boven en onder de 50%-waarde van de geen serum-controleputjes. Met behulp van een semi-logaritmisch grafiek of werkblad sjabloon, plot het aantal PFU op de x-as (lineaire schaal) en de wederzijdse serumverdunning op de y-as (10 logschaal). Een lijn tekenen tussen de twee punten en lees de 50% neutralisatie titers van detest serummonsters van deze lijn.
Opmerking: Het RSV PRN assay werkblad (Aanvullende werkblad) wordt gebruikt voor het bepalen van de titer van de neutralisatie 50%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De titratie van een virus voorraad werd uitgevoerd van 1:10 tot en met 1:10 verdunning van de8 om te bepalen van de concentratie virus voorraad voorafgaand aan de PRN-assay (representatieve resultaten afgebeeld in Figuur 5). Uit Figuur 5, PFU kan worden geteld op betrouwbare wijze in verdunningen van 1:104 en 1:10-5. Het gemiddelde aantal PFU uit drievoudige putten bij de dezelfde verdunning werd berekend. Sinds het gemiddelde aantal spots op 1:10 verdunning van5 14 was, werd de virale titer van deze virale materieel als volgt bepaald:
14 (gemiddelde aantal spots) / [10-5 (verdunning) x 0,1 mL (volume van entmateriaal)] = 1.4 x 107 PFU/mL
Met behulp van de hierboven beschreven methode, wij hebben NAbs gemeten voor beide RSV-A en B in menselijke specimens. Figuur 6 toont de interpretatie van goed beelden van drie representatieve serummonsters met variërende NAb titers tegen RSV-A. Figuur 6A toont ook beelden van monster titratie repliceert voor elke vertegenwoordiger serum (de werkelijke assay plaat had drie technische replicatieonderzoeken). Serum verdunningen zoals aangegeven zijn verschillend voor elk monster. Virus-controleputjes met alleen virus en geen serum had hun gemiddelde PFU berekend en gebruikt om te bepalen van de 50% neutralisatie licht-donkerscheiding, die in dit voorbeeld was 52. Figuur 6B illustreert hoe de titratie van de drie sera werd bepaald met behulp van deze afbakening. De log2 reciproke van de serumverdunning is uitgezet op de x-as en het aantal PFU als een percentage van de controle op de y-as. Symbool en foutbalken vertegenwoordigen de gemiddelde van triplicates ± standaardafwijking. Vijftig procent van de gemiddelde plekjes van de virus-controleputjes (aangegeven door de horizontale stippellijn) werd gebruikt als een licht-donkerscheiding te bepalen van de 50% neutraliserende antilichamen titer van een serummonster. De neutraliserende antilichamen titer wordt gedefinieerd als de reciproque waarde van de verdunning die in 50% inhibitie van virusactiviteit resulteren zou.
Zoals elk experiment de RSV referentie-antiserum en positieve virus-controleputjes omvat, biedt toezicht op de variabiliteit tussen assay kwaliteitscontrole tussen experimenten. Afbeelding 7 toont de resultaten van de RSV-A PRN-assay in twee verschillende volwassen cohorten van de Gambia cohort (N = 21)10 en gezonde vrijwilligers in Melbourne (N = 36). Titers van RSV NAb waren variabele binnen iedere bevolking, met de Gambiaanse volwassenen hebben een lagere gemiddelde NAb titer ten opzichte van de Melbourne volwassenen. Het RSV referentie-antiserum wordt ook weergegeven (N = 52 wordt gerepliceerd), waaruit blijkt zeer lage variabiliteit met een variatiecoëfficiënt (CV) van 6.82%.
Figuur 1: virale titratie plaat lay-out voor de kwantificatie van RSV voorraden. v = voorraad van RSV-virus (v1, voorraad van virale batch 1 v2, voorraad van virale batch 2; v3, voorraad van virale batch 3), N = negatieve controle Nou, X = media toegevoegd. Kleurcodering is alleen op de steun van de visualisatie van de plaat lay-out. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: voorbeeld graaf instellingen gebruikt voor de lezer plekken. Screenshot van de parameters die meestal gebruikt voor het tellen van virus plaques. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: voorbeelden van artefact en verstoorde cel monolayers. (A) de artefacten. (B) Disrupted cell monolayers. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: plaat sjabloon voor RSV PRN assay. V = virale positieve controleputjes, N = negatief-controleputjes, X = media toegevoegd, S = referentie-antiserum met alle verdunningen (van 1:100 tot en met 1:12, 800) in kolom 12. Kleurcodering is alleen op de steun van de visualisatie van de plaat lay-out. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: een voorbeeld van het resultaat van een RSV-virale titratie. Vertegenwoordiger putten uit een test uitgevoerd in drievoud worden weergegeven. De nummers in elk putje verwijzen naar het aantal plaques geteld met behulp van de lezer van de vlekken. TMC = teveel te tellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: resultaten van een representatieve RSV PRN-assay. (A) het aantal PFU geteld voor drie individuele serummonsters volgens verschillende verdunning bereiken. De nummers in elk goed beeld verwijzen naar het aantal plaques geteld. (B) NAb titer interpretatie van de goed beelden in deelvenster A voor de drie monsters van de representatieve menselijk serum. De gegevens wordt berekend op basis van de 50% licht-donkerscheiding van het virus-controleputjes. Gemiddelde ± SD. de horizontale staven Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: RSV neutraliserende antilichamen titers in Melbourne (N = 21) en Gambiaanse (N = 36) volwassenen. De menselijke RSV referentieserum wordt ook weergegeven voor vergelijking (N = 52 wordt gerepliceerd). Symbolen vertegenwoordigen afzonderlijke titers en horizontale staven meetkundig gemiddelde titer ± 95% CI. De N = 52 resultaten zijn gebaseerd op drie technici over een periode van twee maanden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1: vergelijking van de NAb titers voor RSV-A. (Links) NAb titers berekend aan de hand van de lineaire en niet-lineaire regressiemodellen (N = 152 testen). (Rechts) Correlatie tussen RSV-A NAb titers met behulp van zowel lineaire en niet-lineaire regressiemodellen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij hebben ontwikkeld en geoptimaliseerd voor een eenvoudige en efficiënte RSV micro-neutralisatie assay die gemakkelijk kan worden aangepast in de meeste laboratoria. Deze test kan meten van vermogen van virale infectie, evenals het meten van de remming van de virale infectie door NAb op cellulair niveau met behulp van geautomatiseerde afbeelding scannen. Het gebruik van een imaging-gebaseerd platform en specifieke antilichaam gebaseerde systemen is toegenomen de specificiteit en de gevoeligheid voor spot detection in vergelijking met traditionele plaque detectie methoden6,7. Hierdoor karakterisatie van RSV stammen met lage infectiviteit en biedt ook een nauwkeurige kwantificering van RSV concentratie voorafgaand aan gebruik in de PRN-bepaling.
Het is aanbevolen dat dezelfde batch van virale materieel wordt gebruikt voor elk onderzoek om te minimaliseren van eventuele-charges-variaties tussen RSV voorraden. Andere belangrijke aspecten van de bepaling omvatten de consistentie van virus input concentratie, de integriteit van de A549 cel enkelgelaagde, en het gebruik van dezelfde graaf instellingen om assay consistentie en nauwkeurigheid. De hoeveelheid virus toegevoegd aan de plaat kan opnieuw worden geverifieerd in een aparte plaque virale titratie. Echter de positieve controle van de PRN-assay peilbuizen ook geeft een indicatie van de werkelijke virale titer en is ook de moeite waard om te controleren over testen. Bovendien, met inbegrip van het referentieserum in elke plaat is een andere maatregel van de kwaliteitscontrole om ervoor te zorgen dat de tests reproduceerbaar zijn. Onze experimenten gebruikten niet het onlangs gevalideerde RSV internationale standaard antiserum van de NIBSC, als het niet beschikbaar op het moment van onze studie11 was. Met behulp van deze internationale standaard antiserum RSV moet worden aanbevolen voor toekomstige studies meten van RSV NAb zodat resultaten over laboratoria kunnen worden vergeleken met vertrouwen.
Ontwikkeling van een relatief eenvoudig, hoge-doorvoer assay zou meer laboratoria wereldwijd zou kundig voor toepassing van deze methode wereldwijde normalisatie-inspanningen voor het gebruik van RSV NAbs vergemakkelijken. Dit is met name belangrijk gezien het aantal kandidaten van RSV vaccin in ontwikkeling, met een aantal momenteel in fase 3 proeven. Het is van cruciaal belang dat de resultaten van toekomstige klinische studies van RSV vaccins vergelijkbaar zijn, en daarom een gestandaardiseerde test een belangrijk aspect aan dit doel vormt. Terwijl een aantal laag en middelhoge - inkomen landen mei niet zitten kundig voor directe ondersteuning biedt voor overname van de apparatuur nodig, verbanden door internationale samenwerkingen en/of programma's voor capaciteitsopbouw zal kritisch op de middellange tot lange termijn.
Dit NAb assay protocol is flexibel in te kunnen worden aangepast voor verschillende cellijnen (A549, Hep2 en Vero) en kan worden gebruikt voor verschillende stammen van het RSV. Wij hebben deze methode ook succesvol aangepast voor RSV-B. Zoals de assay-platform is ontwikkeld voor de opmaak van een 96-wells-plaat, dit biedt een kosteneffectieve en high-throughput alternatief met een hoge nauwkeurigheid omdat hierdoor meer replicatieonderzoeken en de integratie van de referentie controleserum en de negatieve controle op elke plaat. Met behulp van de dezelfde referentie controleserum wordt ook aanbevolen aangezien dit essentieel is om de kwaliteitsbeheersing en kwaliteitsborging. In onze handen waargenomen we zeer lage CVs van het referentieserum die veel lager is dan de gerapporteerde CVs voor andere biologische testen in de range van 30-40%5%6.82.
Bovendien, de afbeeldingsgegevens en de graaf-gegevens (raw data) gegenereerd op basis van dit protocol kan worden opgeslagen voor onbepaalde tijd voor toekomstig gebruik en/of analyse. Handhaving van de records van raw-gegevens is een essentiële vereiste voor klinische proeven, met name die met betrekking tot toekomstige RSV vaccins. Onze werkblad (Zie Aanvullende werkblad) voorgesteld dit protocol kan helpen om vast te leggen van alle aspecten van het experiment met het oog op kwaliteit en zekerheid controle. Het werkblad bepaalt de berekening van de 50% titer met behulp van een eenvoudige lineaire model als dit het voordeel heeft van niet vereist geen gespecialiseerde software te neutraliseren. Nochtans, de ruwe gegevens van onze NAb assay kan worden geanalyseerd met behulp van de niet-lineaire regressiemodel dat ook in het onderzoek van het vaccin gebruikt is voor de berekening van de 50% neutraliserende titers, hoewel dit andere software pakketten12,13 vereist . Met behulp van onze experimentele gegevens, de resultaten verkregen met behulp van deze twee methoden waren vergelijkbaar, geven vertrouwen aan titer waarden verkregen met behulp van de vereenvoudigde lineair model (Zie aanvullende figuur 1). De kosten voor het opzetten van deze test is betaalbaar voor veel laboratoria met misschien het duurste item wordt de lezer van de vlekken (circa USD $50K). Echter, de vlekken lezer heeft het voordeel dat ze kunnen worden gebruikt voor andere toepassingen zoals de enzym-verbonden immunospot (ELISpot) voor cytokine en/of antilichaam-afscheidende cellen meting, waardoor het een waardevolle component in vaccin proces evaluatie.
Kortom, deze verbeterde, hoge-doorvoer RSV PRN-assay eenvoudig kan worden geïmplementeerd in veel laboratoria en ondersteunt de inspanningen van de internationale harmonisatie van die voor RSV NAb testen. Dit zal van doorslaggevend belang voor de beoordeling van nieuwe RSV vaccin kandidaten in de toekomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken alle betrokken deelnemers. Wij erkennen de Victoriaanse regering operationele infrastructuur Support Program. PVL is een NHMRC carrière ontwikkeling Fellowship-ontvanger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22 μm (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
References
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
- Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
- Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
- Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
- van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
- Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
- Tripp, R. A., Jorquera, P. A. Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , Humana Press. (2016).
- Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
- McDonald, J. U., Rigsby, P., Dougall, T., Engelhardt, O. Report on the WHO collaborative study to establish the 1st International Standard for antiserum to Respiratory Syncytial Virus. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y (2017).
- Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
- Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).
