Summary
Denne undersøgelse beskriver en høj produktivitet, imaging-baseret mikro-neutralisering assay til at bestemme titer af neutraliserende antistoffer specifikke for respiratorisk syncytialvirus (RSV). Dette assay format er blevet testet på forskellige prøve typer.
Abstract
Respiratorisk syncytial virus-specifikke neutraliserende antistoffer (RSV NAbs) er en vigtig markør for beskyttelse mod RSV. En række forskellige assay formater er i øjeblikket i brug over hele verden, så der er behov for en nøjagtig og høj overførselshastighed metode til måling af RSV Nimb. Vi beskriver her en imaging-baseret mikro-neutralisering assay, der er blevet testet på RSV undergruppe A og kan også tilpasses til RSV undergruppe B og forskellige prøve typer. Denne metode er meget reproducerbar, med Inter assay variationer for reference antiserum mindre end 10%. Vi mener, at denne analyse umiddelbart kan fastslås i mange laboratorier verden over til en relativt lav pris. Udvikling af en forbedret, høj overførselshastighed assay, der måler RSV NAbs repræsenterer et stort skridt fremad for standardisering af denne metode internationalt samt at være kritisk til evaluering af roman RSV vaccine kandidater i fremtiden.
Introduction
Respiratorisk syncytialvirus (RSV) er den hyppigste årsag til nedre luftvejsinfektioner i den pædiatriske befolkning på verdensplan1. Trods sin høje byrde findes der stadig ingen vaccine eller behandling. Siden 2013, har World Health Organization (WHO) erklæret RSV vaccine udvikling prioriteres større forskning med årlige WHO høring møder2,3. WHO har godkendt ved hjælp af RSV neutraliserende antistof (NAb) måling til at overvåge vaccine immunogenicitet, da dette er anerkendt som den store serologisk markør for beskyttelse4. Nimb har vist sig at beskytte mod alvorlige RSV infektion i en række undersøgelser samt kliniske forsøg med anti-RSV monoklonalt antistof palivizumab, i øjeblikket den kun forebyggende strategi tilgængelige4.
Der er flere NAb assay formater, der bruges af laboratorier verden over, herunder celle- og molekylært-baserede assays, der har gjort standardisering bestræbelser udfordrende5,6,7,8. Konventionelle plaque-reduktion neutralisering (PRN) analysen, der måler antallet af reducerede plak danner enheder (PFU) af en RSV-specifikke antistof er imidlertid stadig guldstandarden9. Her rapporterer vi en forbedret, forenklet og høj overførselshastighed PRN-protokol, der kan bruges på mange cellelinjer, for forskellige RSV stammer og med øget assay overførselshastighed. Denne protokol er blevet testet ved hjælp af kliniske prøver fra forskellige indstillinger samt på prøver fra dyremodel eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Alle trin skal udføres på et BSL2 hood st├Ñr forskelligt. Viral titrering er nødvendig før en PRN analysen til at fastslå den optimale RSV koncentration til PRN assay. Det anbefales at prøve viruslagrene i en lille mængde, der vil blive optøet når og anvendes til hver NAb assay. Ved hjælp af den samme viral bestand for alle NAb assays udføres for alle prøver fra én undersøgelse anbefales også. Sørg for dyrkningsmedier og fosfatbufferet saltopløsning (PBS) er opvarmet ved 37 ° C før du tilføjer til cellen plader.
1. RSV Viral titrering
Bemærk: Afhængigt af antallet af virus bestande og antallet af dubletter, kan analysen pladen sættes op i henhold til figur 1. Hver virus bestand bør titreres i tre eksemplarer ned assay plade, begyndende med den højeste viral koncentration (dvs. 1:10). Seriel titreringer kan være typisk 1:10. A549 cellekultur og vedligeholdelse samt RSV kultur procedure er gjort ved hjælp af standard procedurer og indgår ikke i denne protokol.
- Såning plader (dag 1)
- Resuspend A549 celler i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) + 10% føtalt kalveserum (FCS) + 1000 IE penicillin/streptomycin (pen/strep) på 4 x 105/mL. Frø 96-godt flad bund sterile plader med 100 μL/brønd 4 x 104 A459 celler.
- Inkuber plader natten over ved 37 ° C, 5% CO2 (celler bliver i log-fase vækst).
Bemærk: Brug nye A549 celle hætteglas efter 23 passager. Det anbefales at ikke start eksperimenterne når en ny celle hætteglas er stadig på de første tre passager.
- Virusinfektion (dag 2)
- Forberedelse af virus seriel fortynding
- Hurtigt optø en enkelt frosne hætteglas af RSV i et 37 ° C vandbad indtil næsten helt optøet og læg straks på is. Forbered 3 flergangsbestemmelser for hver RSV virus materiel, der skal analyseres, bruge en indledende virus stock fortynding på 1:10 med 100 μL fortyndet virus/brønd og reservere mindst én kolonne for negativ kontrol.
Bemærk: Figur 1 viser negativ kontrol i tre. - Tilsæt 100 μL af hver fortyndet virus på 1:10 i tre eksemplarer i række A af en 96-brønd U-bund sterile plade. Tilføje 90 μL/brønd af DMEM + 1000 IE pen/strep uden FCS til række B til H.
- Udføre serie 1:10 fortyndinger ned på pladen ved at overføre 10 μL fra række A række B. Mix løsning af pipettering indhold op og ned 5 gange og fortsætte billeddetaljerne Fortyndingerne indtil række H. kassere den endelige 10 μL, således at den endelige mængden i hver godt er 90 μL.
Bemærk: Det er vigtigt at bruge nye tips for hver fortynding.
- Hurtigt optø en enkelt frosne hætteglas af RSV i et 37 ° C vandbad indtil næsten helt optøet og læg straks på is. Forbered 3 flergangsbestemmelser for hver RSV virus materiel, der skal analyseres, bruge en indledende virus stock fortynding på 1:10 med 100 μL fortyndet virus/brønd og reservere mindst én kolonne for negativ kontrol.
-
Virus podning til A549 celler
- Hente A549 cell plate(s) forberedt den foregående dag. Sikre, at A549 celle encellelag i 96-brønd plader ~ 80% sammenflydende. Kassér medier af forsigtigt invertere plade og let blotting på sterile absorberende papir håndklæde.
- Vask alle brønde med 100 μL af PBS to gange, slette overskydende PBS ved forsigtigt invertere plade og let blotting på sterile absorberende papir håndklæde efter hver vask. Tillad ikke plader til tørre.
- Overføre virus fortyndinger fra viral titrering plade (figur 1) til tilsvarende brønde på A549 celle plade. Inkuber plade i 1 timer ved 37 ° C, 5% CO2. Efter 1 time inkubationen dekanteres analysere ved hjælp af en pipette (for at undgå krydskontaminering). Tage ud 90 μL/brønd.
- Tilsæt 100 μL af 1 x medium 199 (M199, se tabel af materialer) + 1,5% carboxymethylcellulose natriumsalt (CMC) lav viskositet + 2% FCS indeholdende pen/strep til hver brønd.
Bemærk: 2 x M199 + 4% FCS + 2% pen/strep og 3% CMC løsninger skal være forberedt på forhånd og opbevares ved 4 ° C til fremtidig brug. Kontroller, at løsningen er opvarmet ved 37 ° C før du tilføjer til plader.- Forberede 2 x M199 løsning: 1 pose/500 mL destilleret vand + 20 mL FCS + 10 mL pen/strep (at gøre op 2 x MI99). Filtrer løsning ved hjælp af et 0,22 μm filterenhed.
- Til forberedelse af 3% CMC, tilsættes 15 g CMC langsomt ind i 500 mL destilleret vand. Opløse CMC i vand ved hjælp af metallisk omrører varmer ved 50 ° C, hvilket tager omkring 1 time af forberedelse. Bland godt at gøre 3% CMC og autoklave løsningen.
Bemærk: CMC solid skal føjes til vandet for at opløses; tilsætning af vand til den tørre faste producerer en "klump" af solid, det er meget vanskeligt at opløse. - Forberede 1 x M199 + 1,5% CMC lav viskositet + 2% FCS indeholdende pen/strep ved at blande 1:1 2 x M199 og 3% CMC forberedt taktfast 1.2.2.4.2.
- Inkuber plade i 3 dage ved 37 ° C, 5% CO2.
- Forberedelse af virus seriel fortynding
- Udvikle assay plade og analyse (dag 5)
- Fiksering og udvikle assay plade
- Kassere M199 + CMC + 2% FCS indeholdende pen/strep af forsigtigt invertering af pladen. Tilsæt langsomt (for at undgå at forstyrre cellelag) 200 μl af fiksering buffer (80% acetone, 20% PBS, opbevares ved-20 ° C) at fastsætte celler. Der inkuberes ved-20 ° C i 20 min.
- Kassér fiksering buffer og forsigtigt duppes på absorberende papir håndklæde. Forlade plade ansigt ned til tørre i 10 min.
Bemærk: Fra dette trin og fremefter, kan analysen udføres udenfor BSL2 hætte. - Forberede 5% mælk fortyndingsmiddel blokerende løsning i filtreret PBS indeholdende 0,05% Polysorbat 20 (PBS-Polysorbat, se Tabel af materialer). For én plade, beregne mængden nødvendig for blokering baseret på 200/godt og 110 wells: 200/brønd x 110 wells = 22 mL (1,1 mL koncentreret mælk fortyndingsmiddel i 20,9 mL filtreret PBS-Polysorbat). På dette stadium, også udgør tilstrækkelig blokerende løsning til primære og sekundære antistoffer. For én plade, beregne mængden nødvendig for hver antistof løsning baseret på 50/godt og 110 wells: 50/godt x 110 wells = 5,5 mL. Derfor er den samlede mængde mælk fortyndingsvæske blokering løsning kræves til en enkelt plade assay 33 mL.
- Tilføje 200 /well af blokerende løsning. Inkuber plade ved stuetemperatur (RT) for 30 min. udsmid løsningen af forsigtigt invertere pladen og duppes på absorberende papir håndklæde.
- Forberede 1: 500 ged X RSV antistof (mAb-primære antistof) fortyndet i blokerende løsning. Tilsæt 50 /well mAb-opløsning og inkuberes ved 37 ° C i 1 h. vask plade 3 gange med filtreret PBS-Polysorbat.
- Forberede 1:5,000 Alexa-Fluor æsel anti-ged IgG (sekundær antistof) fortyndet i blokerende løsning. Tilsæt 50 /well sekundær antistof-opløsning og inkuberes ved 37 ° C i 1 h. vask plade 5 gange med filtreret PBS-Polysorbat.
- Læs plade på en automatiseret steder læser ved hjælp af fluorescein isothiocyanat (FITC) kanal og tælle indstillinger som vist i figur 2. Wrap plade i folie og opbevares ved 4 ° C. Kalibrere instrument bruger en ubrugt 96-og kultur plade og indrykke count indstillinger før assay.
Bemærk: Re scanning inden for et par dage er muligt, hvis det kræves. Kalibrering og tælle indstilling kan gemmes og anvendes for den fremtidige scanning, hvis analysen bruger den samme type af plade anvendes til kalibrering. - Check billederne af brønde for artefakt plaques eller forstyrret celle encellelag (figur 3). Udelukke brønde med forstyrret celle monolag.
Bemærk: Afhængigt af størrelsen af artefakt plaques, manuel tæller muligvis skal udføres for disse brønde eller disse brønde kan være nødvendigt at blive kasseret fra dataanalyse. Kriterier for et gyldigt resultat omfatter ikke forstyrret celle éncellelag eller artefakt plaques opdages i mere end én replikat godt og ingen PFU opdaget i negative brønde (brønde uden tilsat virus).
-
Bestemme viral koncentrationer
- Vælg de sidste to fortyndinger hvor steder kan tælles klart. Beregne det gennemsnitlige antal steder fra Repliker brønde på den samme fortynding. Beregne den virale titer (PFU pr. mL) af stock prøven ved hjælp af nedenstående formel:
PFU/mL = gennemsnitligt antal plaques / (fortynding faktor × volumen af fortyndet virus tilføjet til brønden)
Bemærk: Virus fusionen bestemmes for hver RSV bestand kan nu bruges i PRN assay (trin 2).
- Vælg de sidste to fortyndinger hvor steder kan tælles klart. Beregne det gennemsnitlige antal steder fra Repliker brønde på den samme fortynding. Beregne den virale titer (PFU pr. mL) af stock prøven ved hjælp af nedenstående formel:
- Fiksering og udvikle assay plade
2. RSV neutralisering Assay
-
Såning plader (dag 1)
- Resuspend A549 celler i DMEM + 10% FCS + 1000 IE pen/strep på 4 x 105/mL. Frø 96-godt flad bund sterile plader med 100 μL/brønd indeholdende 4 x 104 A459 celler og inkuberes plader natten over ved 37 ° C, 5% CO2 (celler bliver i log-fase vækst).
Bemærk: Brug nye A549 celle hætteglas efter 23 passager. Det anbefales ikke at bruge A549 celler før passage nummer 3.
- Resuspend A549 celler i DMEM + 10% FCS + 1000 IE pen/strep på 4 x 105/mL. Frø 96-godt flad bund sterile plader med 100 μL/brønd indeholdende 4 x 104 A459 celler og inkuberes plader natten over ved 37 ° C, 5% CO2 (celler bliver i log-fase vækst).
-
Virus og serum forberedelse (dag 2)
Bemærk: Afhængigt af hvilken prøve er der nødvendige skridt til forbehandling af prøver før NAb assay. Det anbefales at bruge de RSV internationale standard sera, der er nu tilgængelige på anmodning fra det nationale Institut for biologiske standarder og kontrol (NIBSC).-
Forberedelse af serumfortynding
- Optø den menneskelige RSV reference antiserum (referenceserum, REF) og serum teste prøver på RT. varme-inaktivere serumprøver og reference antiserum i vandbad på 56 ° C i 30 min før brug. Tilberedes fortyndinger pr plade skabelon (figur 4).
- Laves 1: 100 fortynding af REF. Forbered mindst 110 μL af REF fortyndet i DMEM + pen/strep uden FCS pr. assay plade (f.eks., 1,5 μL af REF i en samlet maengde paa 150 μl). Tilføje 110 μL af 1: 100 fortyndet REF i godt A12 af en 96-brønd U-bund sterile plade.
- Tilføje 55 μL af DMEM + pen/strep uden FCS brønde B12 til H12 i kolonne 12. Udføre serie 1:2 fortyndinger ned pladen ved at overføre 55 μL fra række A til række B, blandingsopløsning af pipettering indhold op og ned 5 gange og fortsatte indtil række H. kassere den endelige 55 μL af media således at det endelige rumfang i hver godt er 55 μL. Brug nye tip for hver fortynding.
- Laves 1: 100 fortynding af serum analyseprøverne. Som alle serumprøver er analyseres i tre eksemplarer, forberede en mindstemængde af 110 μL/brønd x 3 = 330 μl pr. serum analyseprøve.
- Tilføje 110 μL af hver fortyndede serum prøve (1: 100; S1 = serum 1, S2 = serum 2, osv.) tilsvarende brønde A1 til A9 og også E1 til E9 af 96-brønd sterile plade efter figur 4.
- Tilføj 55 μL af DMEM + pen/strep uden FCS alle brønde mærket X. udføre serie 1:2 fortyndinger pr. trin 2.2.1.3 indtil række D (for prøver 1, 2 og 3). Kassér den endelige 55 μL af medierne, således at den endelige mængden i hver brønd er 55 μL. Ligeledes Udfør serie 1:2 fortyndinger for prøverne 4, 5 og 6 for rækker E til H.
Bemærk: Det er vigtigt at bruge nye tips for hver fortynding. - Tilføje 55 μL af DMEM + pen/strep uden FCS brønde i kolonne 10 og 11.
-
Forberedelse af virus
- Hurtigt optø en enkelt frosne hætteglas af RSV i et 37 ° C vandbad indtil næsten helt optøet og læg straks på is.
- Fortyndet virus i DMEM + pen/strep uden FCS baseret på koncentrationen af RSV alikvot bestemmes i trin 1.3.2. Anvende en fortynding, der giver ca 200 PFU/godt. Forberede en samlede volumen af 5,5 mL (100 brønde).
-
Forberedelse af virus-serum blanding
- Tilføje 55 af fortyndet virus til alle huller i kolonne 1-9 og brønde rækker E-H af kolonner, 10 og 11 (positiv kontrol) Ifølge skabelonen plade (figur 4).
- Tilføje 55 DMEM + pen/strep uden FCS alle brønde rækker A-D i kolonne 10 og 11 (negativ kontrol). Inkuber plade i 1 timer ved 37 ° C, 5% CO2.
-
Virus podning til A549 celler
- Forud for afslutningen af inkubationstiden, hente A549 cell plate(s) udarbejdet i trin 2.1.1. Sikre, at A549 celle encellelag i 96-brønd plader ~ 80% sammenflydende.
- Kassér medier af forsigtigt invertere plade og let blotting på sterile absorberende papir håndklæde. Vask alle brønde med 100 μL af PBS to gange, slette overskydende PBS ved forsigtigt invertere plade og let blotting på sterile absorberende papir håndklæde efter hver vask. Tillad ikke plader til tørre.
- Overføre 100 /well af virus-serum blandingen til de tilsvarende brønde på A549 celle plade efter plade skabelon Incubate plade i 1 timer ved 37 ° C, 5% CO2.
- Efter 1 h, ved hjælp af en pipette, tegne 90/godt og tilsæt forvarmet 100 af 1 x M199 + 1,5% CMC + 2% FCS + pen/strep. Inkuber plade i 3 dage ved 37 ° C, 5% CO2.
Bemærk: Kontroller, at løsningen er opvarmet ved 37 ° C før du tilføjer til plader.
-
Forberedelse af serumfortynding
-
Udvikle assay plade og analyse (dag 5)
- Udvikle fiksering og assay plade efter trin 1.3.1.1 til 1.3.1.8.
- Bestemme 50% neutralisering titer
- Bestemme 50% neutralisering titer ved at beregne den proportional afstand mellem gensidige serum fortyndinger ovenfor og under 50% af ' ingen ' serumkontrol brønde (positiv virus kontrol - kolonne 10, rækker E-H).
- Tæl antallet af PFU (dvs., plaques) som følge af individuelle virale infektioner i serum brønde og ingen serum-kontrolhullerne. Beregne det gennemsnitlige antal PFU af de ingen serum-kontrolhullerne og bestemme værdien 50%.
- Identificere serum fortyndinger med tæller, der er umiddelbart over og under 50%-værdien af de ikke serum-kontrolhullerne. Ved hjælp af en semi-log graf eller regnearksskabelon, afbilde antallet af PFU på x-aksen (lineær skala) og den gensidige serumfortynding på y-aksen (log10 skala). Trække en linje mellem de to punkter og læse 50% neutralisering titers testens serumprøver fra denne linje.
Bemærk: RSV PRN assay regneark (Supplerende regneark) bruges til at bestemme 50% neutralisering titer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Titrering af en virus bestand blev udført fra 1:10 1:108 fortynding til at bestemme den virus stock koncentration før PRN assay (repræsentative resultater vist i figur 5). Fra figur 5, PFU kan tælles pålideligt på fortyndinger på 1:104 og 1:105. Det gennemsnitlige antal PFU fra tredobbelt brønde på den samme fortynding blev beregnet. Siden det gennemsnitlige antal steder på 1:105 fortynding var 14, blev viral titer af viral bestand fastsat som følger:
14 (gennemsnitlige antal steder) / [10-5 (fortynding) x 0,1 mL (volumen af inokulum)] = 1,4 x 107 PFU/mL
Ved hjælp af den ovenfor beskrevne metode, vi har målt NAbs for begge RSV-A og B i menneskelige prøver. Figur 6 viser fortolkning af godt billeder af tre repræsentative serumprøver med varierende NAb titers mod RSV-A. Figur 6A viser godt billeder af prøven titrering replikater for hvert repræsentativt serum (den faktiske assay plade havde tre tekniske replikater). Serum fortyndinger som anført er forskellige for hver prøve. Virus kontrol brønde, der indeholder kun virus og ingen serum havde deres gennemsnitlige PFU beregnet og anvendes til at bestemme 50% neutralisering cut-off, som i dette eksempel blev 52. Figur 6B illustrerer hvordan titrering af de tre sera blev bestemt ved denne cut-off. Log2 reciprokke af serumfortynding er afbildet på x-aksen og antallet af PFU som en procentdel af kontrollen på y-aksen. Symbol og fejl barer repræsenterer gennemsnittet af tre ± standardafvigelse. Halvtreds procent af de gennemsnitlige steder i virus-kontrolhullerne (anført af den vandrette stiplede linje) blev brugt som en cut-off til at bestemme de 50% neutraliserende antistof titer af en serumprøven. Neutraliserende antistof titer er defineret som reciprokke af den fortynding, der ville resultere i 50% hæmning af virusaktivitet.
Da hvert forsøg omfatter RSV reference antiserum og positive virus kontrolhullerne, giver overvågning Inter assay variation kvalitetskontrol mellem eksperimenter. Figur 7 viser resultaterne af RSV-A PRN assay i to forskellige voksen kohorter fra Gambia kohorte (N = 21)10 og raske frivillige i Melbourne (N = 36). Titers af RSV NAb var variable inden for hver befolkning, med de gambianske voksne at have en lavere gennemsnitlig NAb titer i forhold til Melbourne voksne. RSV reference antiserum er også vist (N = 52 replikater), viser meget lavt variation med en variationskoefficient (CV) 6.82%.
Figur 1: Viral titrering plade layout til kvantitering af RSV bestande. v = bestand af RSV-virus (v1, lager af viral batch 1 v2, lager af viral batch 2; v3, bestand af viral parti 3), N = negativ kontrol godt, X = medier tilføjet. Farvekodning er kun at støtte visualisering af plade layout. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: eksempel count indstillinger anvendes til steder læser. Screenshot af de parametre, der typisk bruges til optælling virus plaques. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: eksempler på artefakt og forstyrret celle monolag. (A) artefakter. (B) Disrupted cell monolag. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: plade skabelon for RSV PRN assay. V = viral positive kontrolhullerne, N = negativ kontrol wells, X = medier tilføjet, S = reference antiserum med alle fortyndinger (fra 1: 100 til 1:12, 800) i kolonne 12. Farvekodning er kun at støtte visualisering af plade layout. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: et eksempel på en RSV viral titrering resultat. Repræsentant wells fra en analyse udført i tre eksemplarer er vist. Tallene i hver brønd henviser til antallet af plaques tælles ved hjælp af steder læser. TMC = alt for mange til at tælle. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: resultater fra en repræsentativ RSV PRN assay. (A) antallet af PFU tælles for tre individuelle serumprøver ifølge anden fortynding intervaller. Tallene i hver godt billede henviser til antallet af plaques tælles. (B) NAb titer fortolkning fra godt billeder i panelet A de tre repræsentative humant serum prøver. Data er beregnet på grundlag af 50% cut-off fra virus-kontrolhullerne. Vandrette søjler repræsenterer gennemsnit ± SD. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: RSV neutraliserende antistof titers i Melbourne (N = 21) og Gambia (N = 36) voksne. Den menneskelige RSV referenceserum er også vist til sammenligning (N = 52 replikater). Symboler repræsenterer individuelle titers og vandrette søjler repræsenterer geometriske middelværdi titer ± 95% CI. N = 52 resultater er baseret på tre teknikere over en to-måneders periode. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tillægs figur 1: sammenligning af NAb titers for RSV-A. (Venstre) NAb titers beregnes de lineære og ikke-lineær regression modeller (N = 152 assays). (Højre) Korrelation mellem RSV-A Nissen titers ved hjælp af både lineære og ikke-lineær regression modeller. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har udviklet og optimeret en enkel og effektiv RSV mikro-neutralisering assay, der let kan tilpasses de fleste laboratorier. Denne analyse er købedygtig opmåle virusinfektion evne samt måle hæmning af viral infektion af NAb på cellulært niveau ved hjælp af edb billedscanning. Brugen af en imaging-baseret platform og specifikke antistof-baserede systemer har øget specificitet og spot påvisningsfølsomhed sammenlignet med traditionelle plaque påvisning metoder6,7. Dette giver mulighed for karakterisering af RSV stammer med lav smitteevne og også giver en nøjagtig kvantificering af RSV koncentration før anvendelsen i PRN assay.
Det anbefales, at det samme parti af viral stock bruges for hver undersøgelse for at minimere enhver batch til batch variationer mellem RSV bestande. Andre vigtige aspekter af analysen omfatter sammenhængen i virus input koncentration, integriteten af A549 celle éncellelag, og med samme antal indstillinger for at sikre assay ensartethed og nøjagtighed. Mængden af virus tilføjet til pladen kan kontrolleres igen i en separat plaque viral titrering. Men også overvågning positiv kontrol wells af PRN analysen giver en indikation af faktiske viral titer og er også værd at overvåge på tværs af assays. Desuden, herunder referenceserum i hver plade er en anden kvalitetskontrol foranstaltning til at sikre, at assays er reproducerbare. Vores eksperimenter bruge ikke den seneste validerede RSV internationale standard antiserum fra NIBSC, da det ikke var tilgængelige på tidspunktet for vores undersøgelse11. Ved hjælp af denne internationale standard antiserum RSV bør anbefales for fremtidige studier måle RSV NAb, således at resultaterne på tværs af laboratorier kan sammenlignes med tillid.
Udvikling af en forholdsvis enkel, høj overførselshastighed assay ville lette globale standardisering indsats for brug af RSV Nimb, som flere laboratorier på verdensplan ville være i stand til at bruge denne metode. Dette er især vigtigt i betragtning antallet af RSV vaccine kandidater i udvikling, med nogle i øjeblikket i fase 3 forsøg. Det er afgørende, at resultaterne af fremtidige kliniske studier af RSV vacciner være sammenlignelige, og en standardiseret assay udgør derfor et centralt aspekt til dette mål. Mens en række af lav - og mellemindkomstlande ikke muligvis understøtter direkte erhvervelse af udstyr behov, forbindelser gennem internationale samarbejder og/eller kapacitetsopbygning programmer vil være kritisk på mellemlangt til langt sigt.
Denne NAb assay protokol er fleksible for at kunne tilpasses forskellige cellelinjer (A549, Hep2 og Vero) og kan bruges til forskellige RSV stammer. Vi har også tilpasset denne metode for RSV-B med succes. Som assay-platformen er udviklet for en 96-brønd plade format, dette giver en omkostningseffektiv og høj overførselshastighed alternativ med høj præcision, fordi det giver mulighed for flere replikater og inddragelse af reference serumkontrol og negativ kontrol på hver plade. Ved hjælp af kontrolelementet samme reference serum anbefales også, da dette er afgørende for at sikre kvalitetskontrol og kvalitetssikring. I vores hænder observeret vi meget lav CVs 6.82% for referenceserum, som er meget lavere end rapporteret CVs til andre biologiske analyser i rækken af 30-40%5.
Derudover kan billeddata og count data (rå data) genereret fra denne protokol gemmes på ubestemt tid for fremtidig reference og/eller analyse. Opretholde registreringer af raw-data er en forudsætning for kliniske forsøg, navnlig dem, der vedrører fremtidige RSV vacciner. Vores regneark (Se Supplerende regneark) foreslog i denne protokol kan bidrage til at optage alle aspekter af forsøget med henblik på kvalitetsstyring og kvalitetssikring kontrol. Regnearket giver beregningen af 50% neutralisere titer ved hjælp af en simpel lineær model, som dette har fordelen, som ikke kræver specialiseret software. De rå data fra vores NAb assay kan dog analyseres ved hjælp af den ikke-lineære regressionsmodel, der har også været brugt i vaccine forskning ved beregning af 50% neutraliserende titers, selv om det kræver andre software pakker12,13 . Bruger vores forsøgsdata, de resultater, der opnås ved hjælp af disse to metoder var ens, giver tillid til titer værdier opnået ved hjælp af den forenklede lineære model (Se tillægs figur 1). Prisen for at konfigurere dette assay er overkommelig for mange laboratorier med måske den dyreste vare at være steder læser (ca. USD $50K). Steder læser har dog fordelen at kunne anvendes til andre applikationer såsom enzym-forbundet immunospot (ELISpot) for cytokin og/eller antistof-secernerende celle måling, hvilket gør det en værdifuld komponent i vaccine retssag evaluering.
Afslutningsvis, dette forbedrede, høj overførselshastighed RSV PRN assay nemt kan implementeres i mange laboratorier og vil støtte den internationale harmonisering indsats der for RSV NAb assays. Dette vil være afgørende for vurderingen af roman RSV vaccine kandidater i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke alle de involverede deltagere. Vi anerkender den victorianske regering operationelle infrastruktur Support Program. PVL er en NHMRC karriere udvikling Fellowship modtager.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22 μm (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
References
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
- Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
- Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
- Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
- van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
- Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
- Tripp, R. A., Jorquera, P. A. Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , Humana Press. (2016).
- Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
- McDonald, J. U., Rigsby, P., Dougall, T., Engelhardt, O. Report on the WHO collaborative study to establish the 1st International Standard for antiserum to Respiratory Syncytial Virus. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y (2017).
- Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
- Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).
