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Medicine

मानव अग्नाशय बीटा कोशिकाओं में Situ में अंतर्जात Mitophagy परिसरों का दृश्य निकटता लिगेशन परख का उपयोग

Published: May 2, 2019 doi: 10.3791/59398
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, 2VA Ann Arbor Healthcare System

Summary

इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से प्राथमिक मानव गिलेट के नमूनों से बीटा कोशिकाओं में mitophagy प्रोटीन जटिल गठन के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक विधि की रूपरेखा. इस तकनीक इस प्रकार सीमित जैविक सामग्री है, जो कीमती मानव अग्नाशय बीटा सेल के नमूनों में महत्वपूर्ण हैं से mitophagy के विश्लेषण की अनुमति देता है.

Abstract

Mitophagy एक आवश्यक mitochondrial गुणवत्ता नियंत्रण मार्ग है, जो अग्नाशय ी islet बीटा सेल bioenergetics के लिए ग्लूकोज उत्तेजित इंसुलिन रिलीज ईंधन के लिए महत्वपूर्ण है. mitophagy का आकलन चुनौतीपूर्ण है और अक्सर आनुवंशिक पत्रकारों या कई पूरक तकनीकों की आवश्यकता है आसानी से ऊतक के नमूने में उपयोग नहीं, इस तरह के प्राथमिक मानव अग्नाशय islets के रूप में. यहाँ हम कल्पना और प्राथमिक मानव अग्नाशय islets में कुंजी अंतर्जात mitophagy परिसरों के गठन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मजबूत दृष्टिकोण का प्रदर्शन. संवेदनशील निकटता ligation परख तकनीक का उपयोग करने के लिए mitophagy नियामकों NRDP1 और USP8 के संपर्क का पता लगाने के लिए, हम विशेष रूप से situ में आवश्यक mitophagy परिसरों के गठन की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम हैं. प्रतिलेखन कारक PDX1 के लिए counterstaining करने के लिए इस दृष्टिकोण युग्मन करके, हम mitophagy परिसरों की मात्रा निर्धारित कर सकते हैं, और कारक है कि mitophagy ख़राब कर सकते हैं, विशेष रूप से बीटा कोशिकाओं के भीतर. पद्धति हम वर्णन सेलुलर अन्य प्रोटीन बातचीत अध्ययन के लिए आवश्यक निष्कर्षों की बड़ी मात्रा के लिए की आवश्यकता पर काबू पाने, ऐसे इम्यूनोप्रीसिप्शन (आईपी) या बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के रूप में, और कीमती मानव आइलेट नमूने के लिए आदर्श है आम तौर पर नहीं इन दृष्टिकोणों के लिए पर्याप्त मात्रा में उपलब्ध है. इसके अलावा, इस पद्धति प्रवाह छँटाई तकनीक के लिए की जरूरत obviates बहाव प्रोटीन अनुप्रयोगों के लिए एक विषम islet आबादी से बीटा कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए. इस प्रकार, हम विषम और सीमित सेल आबादी में उपयोग के लिए mitophagy अत्यधिक संगत के दृश्य के लिए एक मूल्यवान प्रोटोकॉल का वर्णन.

Introduction

अग्नाशय बीटा कोशिकाओं सामान्य ग्लूकोज homeostasis बनाए रखने के लिए आवश्यक इंसुलिन का उत्पादन, और मधुमेह के सभी रूपों के विकास में उनकी विफलता परिणाम. बीटा कोशिकाओं इंसुलिन रिलीज के साथ जोड़े ग्लूकोज चयापचय के लिए आवश्यक ऊर्जा उत्पन्न करने के लिए एक मजबूत mitochondrial क्षमता बनाए रखने. हाल ही में, यह स्पष्ट हो गया है कि कार्यात्मक माइटोकोंड्रियाल द्रव्यमान का रखरखाव इष्टतम बीटा सेल फलन1,2,3के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है। कार्यात्मक mitochondrial द्रव्यमान को बनाए रखने के लिए, बीटा कोशिकाओं बेकार, क्षतिग्रस्त, या उम्र बढ़ने mitochondria4को दूर करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र पर भरोसा करते हैं। हम और दूसरों को पहले से पता चला है कि बीटा कोशिकाओं mitochondrial कारोबार के एक विशेष रूप पर भरोसा करते हैं, mitochondrial autophagy कहा जाता है (या mitophagy), दोनों कृंतक और मानव islets में mitochondrial गुणवत्ता नियंत्रण बनाए रखने के लिए1, 2,5. दुर्भाग्य से, तथापि, वहाँ mitophagy का पता लगाने के लिए कोई सरल तरीका था, या अंतर्जात रूप से व्यक्त mitophagy घटकों, मानव अग्नाशय बीटा कोशिकाओं में.

हमने हाल ही में दिखाया है कि बीटा कोशिकाओं में मिटोफैगी का अपस्ट्रीम विनियमन एक प्रोटीन परिसर के गठन पर निर्भर करता है जिसमें E3 ligas CLEC16A और NRDP1 और डेयूबिक्विटिनेस यूएसपी 81शामिल हैं . एनआरडीपी1 और यूएसपी 8 को प्रमुख मिटोफैगी प्रारम्भिक पार्किन6,7पर कार्रवाई के माध्यम से मिटोफैगी को प्रभावित करने के लिए स्वतंत्र रूप से दिखाया गया है . NRDP1 सर्वव्यापकता और गिरावट के लिए PARKIN लक्ष्य mitophagy6बंद करने के लिए , और USP8 विशेष रूप से deubiquitinates K6 से जुड़े PARKIN mitochondria7के लिए अपने स्थानांतरण को बढ़ावा देने के लिए . निकटता लिगेशन परख (पीएलए) प्रौद्योगिकी प्रोटीन बातचीत जीव विज्ञान8के क्षेत्र में हाल ही में एक अग्रिम किया गया है, एकल कोशिकाओं में situ में अंतर्जात प्रोटीन बातचीत के दृश्य की अनुमति है, और दुर्लभ नमूना सामग्री द्वारा सीमित नहीं है. यह पद्धति विशेष रूप से मानव आइलेट/बीटा सेल जीव विज्ञान के लिए मोहक है, नमूना उपलब्धता की कमी के कारण, विषम कोशिका प्रकारों के भीतर शारीरिक रूप से प्रासंगिक प्रोटीन परिसरों को समझने की आवश्यकता के साथ।।

पीएलए दृष्टिकोण का उपयोग, हम प्राथमिक मानव अग्नाशय बीटा कोशिकाओं और न्यूरॉन सेल लाइनों में प्रमुख अंतर्जात mitophagy परिसरों का निरीक्षण करने में सक्षम हैं, और mitophagy मार्ग पर एक diabetogenic पर्यावरण के प्रभाव का प्रदर्शन1. संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल के व्यापक लक्ष्य के लिए प्रचुर मात्रा में सामग्री की कमी ऊतकों में विशिष्ट mitophagy प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण है, या जहां पारंपरिक प्रोटीन-इंटरैक्शन अध्ययन संभव नहीं हैं.

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Protocol

de-पहचान दाता मानव अग्नाशय islets का उपयोग एक संस्थागत समीक्षा बोर्ड (IRB) छूट के माध्यम से और मिशिगन आईआरबी नीति विश्वविद्यालय के अनुपालन में है. मानव अग्नाशय islets NIH/NIDK द्वारा प्रायोजित एकीकृत आइलेट वितरण कार्यक्रम (IIDP) द्वारा प्रदान की गई.

1. मानव islet नमूना तैयारी

  1. एकल सेल वियोजन
    1. संस्कृति मानव islet नमूने (4000-6000 islet समकक्ष/10 एमएल मीडिया) कम से कम 1 दिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस में अग्नाशयी islet मीडिया (PIM(एस)) मीडिया 1 एमएम glutamine (PIM (पीआईएम (जी) के साथ पूरक, 100 इकाइयों / सीरम (FBS) या मानव एबी सीरम.
    2. संस्कृति से अलग-अलग मानव आइलेट्स की गणना करने के लिए 3x आवर्धन पर एक विच्छेदन प्रकाश माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें। आइलेट मीडिया में 1.5 एमएल ट्यूबों में ब्याज (जैसे ग्लूकोलियोटॉक्सिसिटी) के प्रति 40 आइलेट्स चुनें।
    3. सेन्चुरी 10 डिग्री सेल्सियस से तलछट पर 1 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर आइलेट्स है।
    4. कमरे के तापमान पर ट्यूबों के संक्षिप्त व्युत्क्रम द्वारा, दो बार 1 एमएल फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (पीबीएस) जिसमें 50 डिग्री पीआर619 (एक डेउबिक्विटिनेस अवरोधक; सर्वव्यापक निर्भर प्रोटीन बातचीत को संरक्षित करने के लिए), 400 पर प्रत्येक धोने के बीच सेंट्रीफ्यूगेशन के साथ 10 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए x g।
    5. आइलेट छर्रों के साथ 3 मिनट के लिए prewarmed trypsin (37 डिग्री सेल्सियस) को इनक्यूबेट करके 50 डिग्री सेल्सियस PR619 युक्त 0.25% ट्रिप्सिन के साथ एकल कोशिकाओं में आइसोसेट्स को अलग करें। धीरे से फैलाने islets इस समय के दौरान आवधिक कोमल pipeting के साथ एक 200 $L pipette का उपयोग कर.
    6. 1 एमएल गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पीआईएम (एस) मीडिया के साथ trypsin को कंचें जिसमें 50 डिग्री सेल्सियस PR619 होता है, फिर तलछट कोशिकाओं को 1 मिनट के लिए 400 x g पर अपकेंद्रण द्वारा।
    7. 1 मिनट, दो बार, पीबीएस + 50 डिग्री एम PR619 के साथ 400 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को धोएं।
    8. अंत में, 150 डिग्री सेल्सियस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित 50 डिग्री एम PR619 युक्त.
  2. एकल सेल पालन और निर्धारण
    1. पुनः निलंबन के बाद, ठंढा, आरोप लगाया, माइक्रोस्कोप स्लाइड पर सेल समाधान स्पिन 10 मिनट के लिए 28 x ग्राम पर एक साइटोसेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर।
    2. साइटोसेंट्रीफ्यूगेशन के बाद, एक हाइड्रोफोबिक पेन के साथ सेलुलर क्षेत्र की रूपरेखा (सामग्री की तालिकादेखें) एंटीबॉडी /पीएलए समाधान मात्रा की आवश्यकता को कम करने के लिए। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
      चेतावनी: पीएफए खतरनाक है और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए।
    3. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, दाग/पीएलए को तुरंत, या 24 घंटे के भीतर ले जाएं। यदि आवश्यक हो, तो PBS में 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें जब तक कि 48 h से अधिक समय तक धुंधला न हो जाए।

2. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. अवरुद्ध
    1. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 1x PBS के साथ दो बार कोशिकाओं को धो एंट्स।
    2. ब्लॉक सेल समाधान, पृष्ठभूमि धुंधला को खत्म करने के लिए, पीबीएस में 10% गधा सीरम के साथ 0.3% डिटर्जेंट युक्त (सामग्री की तालिकादेखें) कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए।
  2. धुंधला
    1. यूएसपी 8 (1:250) और एनआरडीपी1 (1:250) के खिलाफ प्राथमिक माउस या खरगोश एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं क्रमशः (सामग्री की तालिकादेखें ) डिटर्जेंट के साथ फॉस्फेट बफर नमकीन में पतला (पीबीटी, सामग्री की तालिकादेखें), रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर, करने के लिए पीएलए के माध्यम से mitophagy जटिल संकेतन का पता लगाने।
    2. बीटा सेल पहचान के लिए विशिष्ट मार्कर के साथ सह-इनक्यूबेट कोशिकाओं को माउस या खरगोश में नहीं उठाया गया था ताकि पीएलए सिग्नल के साथ हस्तक्षेप न किया जा सके। इस मामले में पीबीटी में एंटी-गोट PDX1 (1:500) के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। वाष्पीकरण को रोकने के लिए समाधान के शीर्ष पर प्लास्टिक की फिल्म का उपयोग करते हुए, रात भर में सभी प्राथमिक एंटीबॉडी को 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

3. निकटता लिगेशन परख

  1. पीएलए जांच और काउंटरस्टेन
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीएलए जांच समाधान तैयार करें, यानी, पीबीटी में एंटी-माउस और एंटी-रैबिट जांच समाधान दोनों के अंतिम एकाग्रता को तैयार करके प्रति नमूने की जांच समाधान का 20 डिग्री सेल्सियस बनाएं, और कमरे में 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट िंग करें। तापमान.
    2. रात भर ऊष्मायन के बाद, एक रॉकर पर 5 मिनट प्रत्येक के लिए 1x पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं।
    3. बस जांच समाधान के साथ ऊष्मायन से पहले, जांच समाधान के लिए 1:600 की अंतिम एकाग्रता में एंटी-गोट Cy5 माध्यमिक जोड़ें (अंतर्जात PDX1 का पता लगाने के लिए)। प्रत्येक कोशिका स्थिति में 20 डिग्री सेल्सियस जांच समाधान जोड़ें, प्लास्टिक की फिल्म के साथ धीरे से कवर करें और 1 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. लिगेशन
    1. दो बार कोशिकाओं को धो, कमरे के तापमान पर, बफर ए के साथ (विधि के लिए सामग्री की तालिका देखें) 5 मिनट प्रत्येक के लिए, एक रॉकर पर.
    2. लिगेशन समाधान तैयार करें (डिटेक्शन अभिकर्मकों का हिस्सा, सामग्री की तालिकादेखें) निर्माता के निर्देशों के अनुसार। इसके लिए, डाइएथिल पाइरोकार्बोनेट (डीईपीसी) में पानी का उपचार किया गया है। ऊष्मायन से ठीक पहले 0.025 यू/ कोशिकाओं के लिए 20 डिग्री एल लिगेशन समाधान जोड़ें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लास्टिक की फिल्म और इनक्यूबेट के साथ कवर करें।
  3. प्रवर्धन
    1. 2 मिनट प्रत्येक के लिए बफर ए के साथ कमरे के तापमान पर दो बार कोशिकाओं को धोएं।
    2. उदाहरण के लिए समाधान करें (डिटेक्शन अभिकर्मकों का हिस्सा, सामग्री की तालिका देखें) निर्माता के निर्देशों के अनुसार. डिल्यूट प्रवर्धन बफर (5x) 1:5 DEPC में पानी का इलाज किया और उपयोग जब तक अंधेरे में रहते हैं. एक 1:80 polymerase के कमजोर पड़ने जोड़ें (खोज अभिकर्मकों का हिस्सा, सामग्री की तालिका देखें) तुरंत कोशिकाओं के लिए समाधान जोड़ने से पहले समाधान के लिए.
    3. कोशिकाओं में प्रवर्धन समाधान का 20 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। प्लास्टिक की फिल्म के साथ कवर और अधिकतम संकेत के लिए 1 एच 40 मिनट से 2 एच के बीच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में जगह है।
  4. इमेजिंग के लिए तैयारी
    1. बफर बी के साथ दो बार कोशिकाओं को धो (रेसिप के लिए सामग्री की तालिका देखें) कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए, एक रॉकर पर.
    2. अंत में, एक रॉकर पर कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 0.01x बफर बी में एक बार कोशिकाओं को धोने।
    3. माउंट बढ़ते मीडिया की एक बूंद जोड़ने के द्वारा 4 ",6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) और ध्यान से किसी भी बुलबुले का गठन बाहर प्रेस करने के लिए एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर नमूनों पर एक coverlip रखकर. किनारों के चारों ओर स्पष्ट नेल पॉलिश का उपयोग करके सील कवरलिप।
    4. इस तरह के एक लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप, या deconvolution क्षमताओं के साथ एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के रूप में कई फोकल विमानों पर कब्जा करने में सक्षम एक माइक्रोस्कोप पर छवि के नमूने, कम से कम 9 अलग फोकल विमान छवियों ले रही है।
      1. 100x आवर्धन पर छवियों पर कब्जा, लगभग 0.45 मिमी z-स्टैक ऊंचाई के साथ. 550 एनएम उत्तेजना, 570 एनएम उत्सर्जन पर पीएलए पर कब्जा; 650 एनएम उत्तेजना, 670 एनएम उत्सर्जन पर काउंटर दाग; और 405 एनएम उत्तेजना पर डीएपीआई, 450 एनएम उत्सर्जन।
    5. फ्लोरोसेंट छवि पृष्ठभूमि संकेतों और आवारा प्रकाश पीएलए घटनाओं (विशेष रूप से व्यापक माइक्रोस्कोप पर) के बहाव विश्लेषण के लिए कम से कम कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए, एक के माध्यम से एक दो आयामी deconvolution (सबसे पास पड़ोसी) एल्गोरिथ्म का उपयोग प्रक्रिया छवियों पसंद के मानक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर.
      नोट: ओलिंप उपयोग CellSens के लिए, Nikon उपयोग एनआईएस-Elements, Leica का उपयोग एलएएस एक्स, ज़ीस - ज़ेन, Metamorph, MATLAB, Huygens सॉफ्टवेयर, साथ ही कई छवि जे के माध्यम से उपलब्ध Plugins. विश्लेषण के लिए, सभी z-स्टैक पर बातचीत की कुल संख्या छवि-जे सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया जाना चाहिए, यह सुनिश्चित करने केवल Pdx-1 सकारात्मक कोशिकाओं का विश्लेषण कर रहे हैं (अनुभाग 3.5).
  5. पीएलए बातचीत की मात्रा
    1. मुक्त छवि-जे सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग खोलें, और PLA छवि खोलें। पहले तेजी से इन-फोकस पीएलए छवि से शुरू करें।
    2. छवि टैब पर क्लिक करें, और समायोजित करेंका चयन करें, फिर थ्रेशोल्ड (चित्र 1A). सभी गैर-विशिष्ट पीएलए सिग्नल को निकालने के लिए थ्रेशोल्ड समायोजित करें, थ्रेशोल्ड समायोजन का एक नोट करें और पूरे विश्लेषण में इसे संगत रखने का प्रयास करें।
    3. प्रक्रिया टैब पर क्लिक करें, और बाइनरीका चयन करें, फिर बाइनरी बनाएं (चित्र 1B). कणों को मापने के लिए बाइनरी छवि का उपयोग करें, " पर क्लिक करके " टैब काविश्लेषणकरें और विश्लेषण कणों को दबाकर ( चित्र1C)।
    4. विश्लेषण के लिए सुनिश्चित करें कि सेटिंग्स निम्नानुसार हैं: आकार ] 0-इन्फिनिटी, परिपत्र ] 0-1.0, दिखाएँ ] बाह्यरेखाएँ, प्रदर्शनपरिणामों के लिए चेक बॉक्स, और स्पष्ट परिणाम (चित्र 1D)। ठीकक्लिक करें. नमूना, और z-स्टैक स्थिति को दर्शाते स्प्रेडशीट में विश्लेषण कणों की संख्या का ध्यान रखें।
    5. 3.5.2-3.5.4 कदम दोहराएँ जब तक सभी में फोकस z-स्टैक नमूने के लिए विश्लेषण किया गया है. स्प्रेडशीट में नमूने के लिए कणों की कुल संख्या राशि बातचीत की कुल संख्या मात्रा निर्धारित करने के लिए.

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Representative Results

हम MIN6 अग्नाशय बीटा सेल लाइन और SH-SY5Y neuroblastoma सेल लाइन SH-SY5Y में प्रारंभिक प्रयोगों का आयोजन किया, अनुकूलन और एंटीबॉडी और कल्पना प्रोटीन बातचीत के दोनों विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए. MIN6 कोशिकाओं को 30,000 कोशिकाओं/एमएल पर कवरलिपपर चढ़ाया गया था और 48 एच, एसएच-एसवाई5वाई कोशिकाओं को 15,000 कोशिकाओं/एमएल पर कवरलिप्स पर चढ़ाया गया था और 24 एच के लिए पालन करने के लिए छोड़ दिया गया था। पीएलए प्रोटोकॉल तो ऊपर के रूप में पीछा किया गया था, चरण 1.2.3 पर शुरू. पीएलए संकेतों की विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए, हमने सबसे पहले इस प्रकिया को (i) कोई प्राथमिक एंटीबॉडी (चित्र 2क, चित्र 3क ) की उपस्थिति में किया ( चित्र 2क , चित्र 3क), (पप) एनआरडीपी1 एंटीबॉडी अकेले (चित्र 2ख, चित्र 3ख), (पप) यूएसपी8 एंटीबॉडी अकेले ( चित्र 2ं, चित्र 3ं, और (पअ) एनआरडीपी1 और यूएसपी8 एंटीबॉडी दोनों (चित्र 2D, चित्र 3D) . नमूना सेट-अप में आसानी के लिए, तालिका 1 प्रयोगात्मक नियंत्रणों को ठीक से लेआउट करने का तरीका निर्दिष्ट करती है. विशेष रूप से, हम एकल प्राथमिक एंटीबॉडी या कोई प्राथमिक एंटीबॉडी नियंत्रण की स्थिति में कोई punctate पीएलए संकेत निरीक्षण, इस प्रकार की पुष्टि है कि situ बातचीत में विशेष रूप से दोनों प्राथमिक एंटीबॉडी की उपस्थिति में NRDP1 और USP8 के बीच मनाया जाता है, दोनों MIN6 में और SH-SY5Y कोशिकाओं.

हम अगले मानव islets के साथ उपयोग के लिए इस दृष्टिकोण अनुकूलित विशेष रूप से प्राथमिक मानव बीटा कोशिकाओं के भीतर mitophagy जटिल बातचीत का विश्लेषण करने के लिए. मानव आइलेट्स अल्फा, बीटा, डेल्टा, और पीपी-कोशिकाओं9सहित कार्यात्मक रूप से अलग कोशिकाओं की विषमजात आबादी से बना है। माउस आइलेट्स के विपरीत जहां बीटा कोशिकाओं का इस्लेट द्रव्यमान का $80% है, बीटा कोशिकाओं में मानव आइलेट्स (28-75% के बीच)10,11,12के भीतर आनुपातिक रूप से छोटी श्रेणी होती है। इस प्रकार, हम पीएलए प्रौद्योगिकी का उपयोग करने के लिए हमें NRDP1-USP8 mitophagy परिसरों की उपस्थिति का निरीक्षण करने के लिए विशेष रूप से बीटा कोशिकाओं के भीतर की अनुमति देने की मांग की और यह सुनिश्चित करें कि हम अन्य islet सेल प्रकार से confounding टिप्पणियों का पालन नहीं किया (जो से हो सकता है आईलेट lysates के सह-प्रतिरक्षा अध्ययन)। इस प्रकार, यह इस स्तर है कि एकल कोशिकाओं को आसानी से भेदभाव किया जा सकता है और आगे विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त और वर्दी आइलेट फैलाव सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। जैसा कि चित्र 4में देखा गया है, फैलाव प्रोटोकॉल (खंड 1) डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए दृश्य के सूक्ष्मदर्शी क्षेत्र में एकल कोशिकाओं को सुनिश्चित करने में अत्यधिक कुशल है। बीटा कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, हमने पीएलए प्रक्रिया के दौरान PDX1 विशिष्ट एंटी-सेरा के साथ सह-स्टेनिंग किया। PDX1 एक महत्वपूर्ण बीटा सेल विशिष्ट प्रतिलेखन कारक है, जो परिपक्व इंसुलिन उत्पादक बीटा कोशिकाओं में मुख्य रूप से नाभिक13के भीतर पाया जाता है. PDX1 धुंधला NRDP1 के बाद बनाए रखा गया था:USP8 पीएलए प्राथमिक मानव islets में (चित्र 4) . महत्वपूर्ण बात, हम बकरी PDX1 विरोधी सेरा का इस्तेमाल किया प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ पार प्रतिक्रिया से बचने के लिए पीएलए के लिए इस्तेमाल किया (रैबिट विरोधी NRDP1 और माउस विरोधी USP8, क्रमशः). इस प्रकार, PDX1 counterstaining के अलावा प्राथमिक मानव बीटा कोशिकाओं के भीतर अंतर्जात mitophagy परिसरों के विशिष्ट आकलन के लिए अनुमति देता है.

इन दृष्टिकोणों का उपयोग, हम बीटा कोशिकाओं के भीतर mitophagy मार्ग की क्षमता का अनुमान लगाने के लिए NRDP1:USP8 mitophagy परिसर की अवधारण का एक स्नैपशॉट संकलन कर सकते हैं. पर्यावरण की स्थिति के भीतर उपयोग के लिए इस दृष्टिकोण का विस्तार करने के लिए प्रकार के उन नकल 2 मधुमेह14, हम बीटा सेल लाइनों और प्राथमिक मानव islets palmitate और उच्च ग्लूकोज के साथ glucolipotoxicity प्रेरित करने के लिए इलाज किया. वास्तव में, हमने पाया कि NRDP1 और USP8 की बातचीत दोनों बीटा सेल लाइनों में palmitate और उच्च ग्लूकोज के लिए एक 48 एच जोखिम के बाद कम हो गया था और साथ ही पीएलए द्वारा प्राथमिक मानव बीटा कोशिकाओं (चित्र 5 और संदर्भ1) . यह परिणाम डायबेटोजेनिक उत्तेजनाओं के बाद प्रमुख अंतर्जात mitophagy कारकों का आकलन करने के लिए इस परख की व्यवहार्यता पर प्रकाश डाला गया.

Figure 1
चित्र 1: पीएलए बातचीत के परिमाणीकरण के लिए छवि जम्मू विश्लेषण का कार्यप्रवाह। विश्लेषण के महत्वपूर्ण कदम यहाँ पर प्रकाश डाला जाता है. (ए) विशिष्ट पीएलए संकेत विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए छवि थ्रेशोल्ड का समायोजन। (बी) छवि को बाइनरी डेटा में रूपांतरण करने से आसान परिमाणीकरण की अनुमति दी जा सके। (सी-डी) ImageJ सॉफ्टवेयर द्वारा मान्यता प्राप्त कणों का विश्लेषण करके विश्लेषण को अंतिम रूप देने के लिए कैसे। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: NRDP1 और USP8 विशेष रूप से अग्नाशय बीटा कोशिकाओं में बातचीत. माउस अग्नाशयी सेल लाइन, MIN6 के उच्च आवर्धन (100x) छवियों को दिखाया जाता है। (ए-डी) NRDP1 के लिए पीएलए संकेत:USP8 बातचीत लाल रंग में दिखाया गया है, और नाभिक नीले रंग में DAPI द्वारा वर्णन कर रहे हैं. (ए-सी) NRDP1 के लिए कोई विशिष्ट punctate संकेत नहीं देखा जाता है अगर दोनों (ए) या तो प्राथमिक प्रोटीन एंटीबॉडी के एक (बी , सी) पीएलए प्रक्रिया के दौरान छोड़ दिया जाता है. हालांकि, दोनों प्रोटीन की बातचीत अग्नाशय बीटा कोशिकाओंमें पीएलए द्वारा दिखाई देता है (डी ) जब दोनों एंटीबॉडी शामिल हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: NRDP1 और USP8 विशेष रूप से neuroblastoma कोशिकाओं में बातचीत| मानव neuroblastoma सेल लाइन के उच्च आवर्धन (100x) छवियों, एसएच-SY5Y, दिखाए जाते हैं. (ए-डी) NRDP1 के लिए पीएलए संकेत:USP8 बातचीत लाल रंग में दिखाया गया है, और नाभिक नीले रंग में DAPI द्वारा वर्णन कर रहे हैं. (ए-सी) NRDP1 के लिए कोई विशिष्ट punctate संकेत नहीं देखा जाता है अगर दोनों (ए) या तो प्राथमिक प्रोटीन एंटीबॉडी के एक (बी , सी) पीएलए प्रक्रिया के दौरान छोड़ दिया जाता है. तथापि, दोनों प्रोटीनों की अन्योन्यक्रिया पीएलए(डी) द्वारा तब दिखाई देती है जब दोनों एंटीबॉडी शामिल होते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: बीटा सेल mitophagy परिसरों पीएलए द्वारा situ में प्राथमिक मानव अग्नाशय islets में पहचाना जा सकता है. बिखरे हुए मानव आइलेट्स के उच्च आवर्धन (100x) चित्र दिखाए जाते हैं। एकल कोशिकाओं DAPI (नीले) के साथ परमाणु धुंधला द्वारा वर्णन कर रहे हैं, बीटा कोशिकाओं PDX1 धुंधला (magenta) के साथ मनाया जाता है, और mitophagy परिसरों दोनों बीटा कोशिकाओं और गैर-बीटा कोशिकाओं (लाल) में देखा जा सकता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: NRDP1:USP8 mitophagy जटिल glucolipotoxicity द्वारा बीटा कोशिकाओं में अस्थिर है.
उच्च आवर्धन (100x) या तो नियंत्रण के साथ 48 एच के लिए इलाज किया MIN6 कोशिकाओं की छवियों (25 एमएम ग्लूकोज + 0.82% बीएसए) या उच्च ग्लूकोज + पामिटेट (25 एमएम ग्लूकोज + 0.4 एमएम पामिटेट/ (ए-बी) पीएलए (NRDP1:USP8) संकेत दोनों उपचार समूहों में देखा जाता है। नियंत्रण (क) की तुलना में ग्लूकोलिपोटॉक्सिसिटी (बी) के बाद MIN6 बीटा कोशिकाओं में पीएलए संकेत कम हो जाता है . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नमूना ANTIBODY 1 (माउस विरोधी NRDP1) ANTIBODY 2 (रैबिट विरोधी USP8) ANTIBODY 3 (गोट विरोधी PDX1) (वैकल्पिक काउंटर)
नियंत्रण 1: कोई प्राथमिक एंटीबॉडी (40 islets) - - +
नियंत्रण 2: NRDP1 अकेले (40 islets) + - +
नियंत्रण 3: अकेले USP8 (40 islets) - + +
अनुभव 1-x: सभी प्रयोगात्मक स्थितियों (40 islets प्रत्येक) + + +

तालिका 1: नमूना प्रयोगात्मक डिजाइन सेटअप।

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Discussion

यहाँ हम NRDP1 का उपयोग करने के लिए एक सरल और कुशल दृष्टिकोण का वर्णन:USP8 पीएलए के ऊतकों में / ब्याज की कोशिकाओं को अपस्ट्रीम mitophagy परिसरों के गठन की मात्रा निर्धारित करने के लिए. हम पहले CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy परिसर के गठन की पुष्टि की कई तरीकों से अग्नाशय बीटा कोशिकाओं द्वारा, सह-प्रतिरक्षा प्रयोगों सहित, सेल मुक्त बातचीत अध्ययन, और इन विट्रो के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल आधारित सर्वव्यापकता परख, और प्रदर्शन कैसे इस जटिल ड्राइव विनियमित mitophagic फ्लक्स1,15. पीएलए अध्ययन हम रिपोर्ट और यहाँ का वर्णन एक तेजी से, मात्रात्मक, और सेल के लिए अनुमति देते हैं mitophagy मार्ग है कि अत्यधिक प्राथमिक मानव बीटा कोशिकाओं के लिए अनुकूलनीय है के दृश्य. इसके अतिरिक्त, हमने दिखाया है कि NRDP1:USP8 पीएलए एसएच-SY5Y neuroblastoma कोशिकाओं में बीटा सेल जीव विज्ञान के बाहर उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, इस तकनीक की संभावित व्यवहार्यता पर प्रकाश डाला न्यूरॉन प्रणालियों में mitophagy परिसरों की निगरानी के रूप में अच्छी तरह से.

पीएलए एक सीधा दृष्टिकोण है; हालांकि, प्रोटोकॉल के भीतर कुछ कदम स्पष्ट और विशिष्ट परिणाम सुनिश्चित करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण हैं। इनमें शामिल हैं: (1) मानव islets के लिए प्रसार प्रक्रिया सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त सेल lysis को रोकने के लिए पर्याप्त है / पीएलए द्वारा अधिकतम संकेत अवलोकन के लिए एनआरडीपी1-यूएसपी 8 परिसर की सर्वव्यापकता स्थिति (और इस प्रकार बाध्यकारी) और (3) ImageJ द्वारा पीएलए घटनाओं का उद्देश्य परिमाणीकरण mitophagy परिसरों का एक निष्पक्ष मूल्यांकन सुनिश्चित करने के लिए और भी के निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं स्थिति जिससे mitophagy पर परिवर्तन पूरा नहीं हो सकता है, लेकिन अभी भी सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण /

मानव islet अध्ययन के भीतर एक प्रसिद्ध चुनौती दोनों बीटा कोशिकाओं और गैर बीटा कोशिकाओं की विषम आबादी के लिए चिंता का विषय है. PDX1 counterstain के हमारे उपयोग बीटा कोशिकाओं के भीतर mitophagy जटिल गठन के आकलन के लिए अनुमति देता है (साथ ही PDX1 नकारात्मक गैर बीटा कोशिकाओं). एक संभावित चिंता एक counterstain के रूप में PDX1 का उपयोग अग्नाशय डेल्टा कोशिकाओं में अपनी अभिव्यक्ति है16,17,18, हालांकि बीटा कोशिकाओं की तुलना में एक बहुत कम डिग्री के लिए, जैसे अन्य मार्करों के रूप में (यानी, NKX6.1) के लिए नियोजित किया जा सकता है लक्ष्य बीटा कोशिकाओं और अधिक विशेष रूप से. बरकरार islets एकल कोशिकाओं में तुरंत cytocentrifugation और निर्धारण से पहले dispersing करके, हम भी दवा उपचार के दौरान आइलेट microenvironment के केवल कम से कम व्यवधान के साथ एकल सेल mitophagy अध्ययन प्रदर्शन करने में सक्षम हैं और / ग्लूकोलिपोटॉक्सिक एक्सपोजर। हालांकि, हम संभावना है कि आइलेट फैलाव प्रासंगिक उपचार से स्वतंत्र रूप से कोशिकाओं के भीतर mitophagic परिसरों के साथ हस्तक्षेप कर सकता है बाहर नहीं कर सकते.

जबकि अधिक पारंपरिक प्रोटीन प्रोटीन बातचीत अध्ययन मानव अग्नाशय islets में नियोजित किया जा सकता है, इस तरह के सह प्रतिरक्षा और / मानव islet सामग्री उपलब्ध की कमी को देखते हुए. इसके अतिरिक्त, इन पारंपरिक तकनीकों के दौरान सेल प्रकार-विशिष्टता की चिंता अधिक स्पष्ट हो जाती है या शुद्ध बीटा सेल आबादी को सॉर्ट करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री विधियों के अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता होती है19,20, 21,22. इस प्रकार, हमारे पीएलए दृष्टिकोण मानव बीटा कोशिकाओं में mitophagy मार्ग के प्रोटीन प्रोटीन बातचीत अध्ययन के लिए एक आकर्षक और व्यावहारिक विकल्प प्रदान करता है. विशेष रूप से, व्यक्तिगत बीटा कोशिकाओं के हजारों में mitophagy जटिल गठन की मात्रा प्रति प्रयोग के रूप में कुछ के रूप में कुछ उपयोग करने की क्षमता 40 कुल islets / शर्त से अन्य आकलन के लिए उनके आइलेट तैयारी के संरक्षण की क्षमता की अनुमति देता है एक ही दाता.

के रूप में NRDP1 और USP8 सर्वव्यापी व्यक्त कर रहे हैं, हम कल्पना इस तकनीक बीटा कोशिकाओं से परे सेल प्रकार में mitophagy के आकलन के लिए मूल्य हो सकता है. संभावनाओं अन्य गिलेट सेल प्रकार शामिल हैं (अल्फा कोशिकाओं या डेल्टा कोशिकाओं के लिए प्रासंगिक counterstains के साथ) या सेल प्रकार जो भारी mitophagy पर भरोसा करते हैं, इस तरह के न्यूरॉन्स के रूप में. इस उद्देश्य के लिए, एसएच-एसवाई5वाई न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं (चित्र 2) या PDX1-ऋणात्मक islet कोशिकाओं (चित्र 4) के लिए इस तकनीक के हस्तांतरणीयता के हमारे अवलोकन अन्य सेल प्रकार में mitophagy मार्ग के लिए हमारी तकनीक की उपयोगिता का सुझाव सकता है.

NRDP1:USP8 पीएलए दृष्टिकोण की आसानी और सादगी के बावजूद, वहाँ चुनौतियों है कि इस परख के परिणामों को भ्रमित कर सकते हैं. जबकि पीएलए बहुत करीब निकटता (40 एनएम) में प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का पता लगाने में सक्षम है, यह संभावना से इनकार नहीं करता है कि कुछ प्रयोगात्मक स्थितियों NRDP1-USP8 निकटता बनाए रख सकता है, जबकि बातचीत को बाधित, जो द्वारा याद किया जाएगा पीएलए दृष्टिकोण. इसके अलावा, जबकि हम दिखा दिया है कि NRDP1:USP8 जटिल गठन अग्नाशय बीटा कोशिकाओं में विहित CLEC16A/PARKIN-mitophagy मार्ग के लिए एक वैध readout है, हाल के अध्ययनों से mitochondrial में PARKIN-स्वतंत्र mitophagy के लिए भूमिकाओं को देखा है गुणवत्ता नियंत्रण23,24. हम अभी तक नहीं जानते कि कैसे NRDP1:USP8 जटिल गठन PARKIN-स्वतंत्र mitophagy के विघटन से संशोधित किया जाता है. इस प्रकार, बीटा कोशिकाओं में mitophagy परख के लिए यहाँ वर्णित उन लोगों से परे एक पूरक दृष्टिकोण का उपयोग उचित होगा. अंत में, इस mitophagy परिसर की स्थिरता घटक प्रोटीन की सर्वव्यापकता पर निर्भर है, इस तरह है कि एक व्यापक स्पेक्ट्रम deubicuitinase अवरोध करनेवाला PR619 के अलावा नमूना तैयारी के दौरान सर्वव्यापकता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. फिर, बीटा कोशिकाओं है कि परोक्ष रूप से NRDP1-USP8 जटिल के घटकों की सर्वव्यापकता को बाधित कर सकते हैं के जोड़तोड़ जब NRDP1 का विश्लेषण करने पर विचार करने की जरूरत:USP8 mitophagy जटिल गठन के लिए एक readout के रूप में.

के रूप में mitochondrial गुणवत्ता नियंत्रण की भूमिका तेजी से न केवल बीटा सेल समारोह में सराहना की है, लेकिन यह भी अन्य अत्यधिक चयापचय सेल प्रकार, mitophagy के कठोर मूल्यांकन चुनौतीपूर्ण और समय एक और अधिक तेजी से इच्छुक समूहों के लिए लेने साबित कर सकते हैं महत्वपूर्ण मिटोफैगी घटकों का मूल्यांकन। पीएलए दृष्टिकोण हम वर्णन एक अपेक्षाकृत कम लागत, आणविक स्तर दृश्य तकनीक है कि छोटी मात्रा में मानव islet नमूनों में एकल सेल संकल्प के साथ mitophagy जटिल गठन की मात्रात्मक विश्लेषण प्रदान कर सकते हैं और मोटे तौर पर लागू किया जा सकता है सेल प्रकार, उपचार, या रोग की स्थिति की एक किस्म के लिए।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकJDRF (CDA-2016-189 और SRA-2018-539), राष्ट्रीय मधुमेह और पाचन और गुर्दे की बीमारियों के संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01-DK-108921), ब्रेहम परिवार, और एंथनी परिवार से धन सहायता स्वीकार करते हैं. S.A.S. को JDRF कैरियर विकास पुरस्कार आंशिक रूप से डेनिश मधुमेह अकादमी, जो नोवो Nordisk फाउंडेशन द्वारा समर्थित है द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA 1X Life Technologies 25200-056
Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062
Block solution Homemade Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent.
Buffer A Homemade To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use
Buffer B Homemade To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use
Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat Jackson Labs 705-175-147
Detection Reagents Red Sigma- Aldrich DU092008-100RXN Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase.
DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS Sigma- Aldrich DU092004-100RXN
DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS Sigma- Aldrich DU092002-100RXN
Fetal bovine serum
Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) Santa Cruz SC-14664 RRID: AB_2162373
HEPES (1M) Life Technologies 15630-080
MIN6 pancreatic cell line Gift from D. Stoffers Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays.
Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) Sigma- Aldrich SAB200527
Pap-pen Research Products International 195505
Parafilm Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes.
PBT (phosphate buffered saline with triton) Homemade To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20)
Penicillin-Streptomycin (100X) Life Technologies 15140-122
Phosphate buffered saline, 10X Fisher Scientific BP399-20
PIM(ABS) Human AB serum Prodo Labs PIM-ABS001GMP
PIM(G) (glutamine) Prodo Labs PIM-G001GMP
PIM(S) media Prodo Labs PIM-S001GMP
PR619 Apex Bio A812
Prolong Gold antifade reagent with DAPI Life Technologies (Molecular Probes) P36935
Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) Bethyl Laboratories A300-049A RRID: AB_2181251
SH-SY5Y cells Gift from L. Satin Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays.
Sodium Pyruvate (100X) Life Technologies 11360-070
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Tween-20 Fisher Scientific BP337-100
Water for RNA work (DEPC water) Fisher Scientific BP361-1L

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References

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चिकित्सा अंक 147 अग्नाशय बीटा कोशिकाओं mitophagy निकटता लिगेशन परख मानव islets प्रोटीन-इंटरैक्शन mitochondria
मानव अग्नाशय बीटा कोशिकाओं में Situ में अंतर्जात Mitophagy परिसरों का दृश्य निकटता लिगेशन परख का उपयोग
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Pearson, G., Soleimanpour, S. A. Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (147), e59398, doi:10.3791/59398 (2019).

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