Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח כמותי של היווצרות חלבון mitophagy במיוחד בתאי ביתא מדגימות איון האנושי העיקרי. טכניקה זו ובכך מאפשרת ניתוח של mitophagy מתוך חומר ביולוגי מוגבל, אשר חיוניים בדגימות יקרות של תא הלבלב האנושי.
Abstract
Mitophagy הוא מסלול חיוני בקרת איכות מיטוכונדריאלי, אשר חיוני עבור התא ביתא איון הלבלב ביואנרגיה כדי דלק מגורה ממריצים אינסולין שחרור. הערכה של mitophagy הוא מאתגר ולעתים קרובות דורש כתבים גנטיים או טכניקות משלימים מרובים לא מנוצל בקלות בדגימות רקמות, כגון איואי הלבלב האנושי העיקרי. כאן אנו להפגין גישה חזקה כדי להמחיש ומכמת היווצרות של מתחמי מפתח אנדוגניים מרכזיים באיים הלבלב האנושי העיקרי. ניצול הקירבה רגישות לסדר שיטת החיבור כדי לזהות אינטראקציה של הרגולטורים mitophagy NRDP1 ו USP8, אנחנו מסוגלים במיוחד לכמת היווצרות מתחמי mitophagy חיוניים באתרו. על-ידי צימוד גישה זו כדי להכתים את גורם התמלול PDX1, אנחנו יכולים לכמת את מתחמי mitophagy, ואת הגורמים שיכולים לפגוע mitophagy, במיוחד בתוך תאי בטא. המתודולוגיה שאנו מתארים מתגבר על הצורך בכמויות גדולות של תמציות הסלולר הנדרשות למחקרים של חלבון-חלבון אחרים, כגון immunoprecipitation (IP) או ספקטרומטר מסה, והוא אידיאלי לדגימות של איון אנושי יקרות בדרך כלל לא זמינים בכמויות מספיקות עבור גישות אלה. יתרה מזאת, מתודולוגיה זו בדקה את הצורך בטכניקות מיון זרימה כדי לטהר את תאי הבטא מאוכלוסיית איון הטרוגנית עבור יישומי החלבון במורד הזרם. לפיכך, אנו מתארים פרוטוקול רב ערך עבור ויזואליזציה של mitophagy תואם מאוד לשימוש באוכלוסיות תאים הטרוגנית ומוגבלת.
Introduction
תאים ביתא הלבלב לייצר את האינסולין הנדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס הגלוקוז נורמלי, וכישלון שלהם תוצאות בפיתוח של כל צורות הסוכרת. תאי בטא שומרים על קיבולת מיטוכונדריאלי חזקה כדי ליצור את האנרגיה הדרושה לחילוף החומרים של גלוקוז עם שחרור אינסולין. לאחרונה, זה התברר כי התחזוקה של מסה מיטוכונדריאלי פונקציונלי היא בעלת חשיבות מרכזית עבור הפונקציה האופטימלית של תא ביתא1,2,3. על מנת לקיים מסה מיטוכונדריאלי פונקציונלי, תאי בטא להסתמך על מנגנוני בקרת איכות כדי להסיר תפקוד, פגום, או הזדקנות המיטוa4. אנחנו ואחרים הוכיחו בעבר כי תאים ביתא להסתמך על צורה מיוחדת של מחזור מיטוכונדריאלי, הנקרא הוראות מיטוכונדריאלי (או mitophagy), כדי לשמור על איכות מיטוכונדריאלי בקרת מכרסמים והאדם האנושי1, 2,5. למרבה הצער, עם זאת, לא היתה שיטה פשוטה כדי לזהות mitophagy, או באופן מידי הביע רכיבים mitophagy, בתאי בטא הלבלב האנושי.
לאחרונה הראינו כי במעלה הזרם של mitophagy בתאי ביתא מסתמך על היווצרות של מתחם חלבון הכולל את E3 ליגסים CLEC16A ו NRDP1 והוא USP81. NRDP1 ו USP8 הוכחו באופן עצמאי להשפיע mitophagy באמצעות פעולה על מפתח מיאופלגיה מיזם parkin6,7. NRDP1 מטרות PARKIN עבור אוביקווינציה והשפלה כדי לכבות את mitophagy6, ו USP8 במיוחד באופן בלתי מקושר K6-parkin לקדם את הטרנסלוקציה שלה כדי המיטומטר7. שיטת החיבור הצמוד (PLA) הטכנולוגיה היתה מקדמה לאחרונה בתחום של אינטראקציה חלבון ביולוגיה8, המאפשר ויזואליזציה של אינטראקציות חלבונים אנדוגניים באתרו תאים בודדים, והוא אינו מוגבל על ידי חומר לדוגמה נדירים. מתודולוגיה זו מפתה במיוחד לביולוגיה של האדם/תא ביתא, בשל הספניות של זמינות המדגם, ביחד לצורך הבנת מתחמי חלבון רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית בתוך סוגי תאים הטרוגנית.
ניצול הגישה PLA, אנחנו מסוגלים להתבונן מרכזי מפתח אנדוגניים מתחמי בתאי בטא הלבלב האנושי העיקרי וקווי התאים עצביים, ולהדגים את ההשפעות של סביבה diabetogenic על מסלול מיטואופג'י1. לסיכום, מטרת היסוד של פרוטוקול זה היא לנתח מתחמי חלבון mitophagy ספציפיים ברקמות חסר חומר שופע, או כאשר מחקרים קונבנציונאלי-חלבון האינטראקציה אינם אפשריים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
השימוש של האדם תורם דה מזוהה הלבלב האנושי הוא באמצעות הלוח סקירה מוסדית (IRB) פטור ובהתאם למדיניות האוניברסיטה של מישיגן IRB. איונים הלבלב האנושי סופקו על ידי התוכנית הפצה משולבת של איון/NIDDK של משולב הפצת האיים (IIDP).
1. הכנה לדוגמא של האדם איון
-
דיסוציאציה של תא בודד
- התרבות בדגימות איון האנושי (4000 – 6000 איון שווי/10 mL מדיה) עבור לפחות 1 יום ב 37 ° c ב הלבלב איון מדיה (PIM (S)) מדיה בתוספת גלוטמין 1 מ"מ (PIM (G)), 100 יחידות/mL antimycotic-אנטיביוטי, 1 מ"מ נתרן פירובט ו 10% העובר עוברי סרום (FBS) או סרום AB אנושי.
- השתמש במיקרוסקופ אור לנתיחה בהגדלה של 3x כדי לספור איונים אנושיים בודדים מהתרבות. לאסוף 40 איונים לכל טיפול/מצב של עניין (כגון רעילות msm ליפו, לתוך 1.5 מ ל צינורות במדיה איון.
- האיים צנטריפוגה ב 400 x g עבור 1 דקות ב 10 ° c כדי משקעים.
- לשטוף דגימות, על ידי היפוך קצר של צינורות בטמפרטורת החדר, פעמיים עם 1 mL פוספט באגירה מלוחים (PBS) המכיל 50 μM PR619 (מעכב דאויקוויאיאז; כדי לשמר אוביקוויטים התלויים אינטראקציות חלבון), עם צנטריפוגה בין כל לשטוף ב 400 x g עבור 1 דקות ב-10 ° c.
- הנתק איים לתוך תאים בודדים עם 125 μL של 0.25% טריפסין המכיל 50 μM PR619 על ידי הדגירה הקדם-שחומם (37 ° c) עבור 3 דקות עם כדורי איון. בעדינות לפזר איונים במהלך הזמן הזה עם ליטוף עדין תקופתי באמצעות 200 μL פיפטה.
- כיבוי טריפסין עם 1 mL מחומם (37 ° צ') PIM (S) מדיה המכילה 50 μM PR619, ואז תאים משקעים על ידי תפרידו ב 400 x g עבור 1 דקות.
- לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 400 x g עבור 1 דקות, פעמיים, עם PBS + 50 ΜM PR619.
- בסופו של דבר, השעיית תאים מחדש ב-150 μL PBS המכיל 50 μM PR619.
-
הדבקות וקיבוע תאים בודדים
- לאחר השעיה מחדש, לסובב את הפתרון התא על מזוגג, טעונה, שקופיות מיקרוסקופ באמצעות ציטוצנטריפוגה ב 28 x g עבור 10 דקות.
- לאחר cytocentrifugation, לתאר את האזור התאי עם עט הידרופובי (לראות את הטבלה של חומרים) כדי למזער את אמצעי האחסון נוגדן/משחק לפתרון הדרוש. תקן תאים עם 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
התראה: המטה מסוכן ויש לטפל בו בזהירות. - לקבלת התוצאות הטובות ביותר, בצע כתמים/מפלה מיד, או בתוך 24 h. במקרה הצורך, יש לאחסן דגימות ב-PBS ב-4 ° צ' עד לצביעת לא יותר מ-48 h.
2. אימונוהיסטוכימיה
-
חסימת
- שטוף את התאים פעמיים ב-1x PBS עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- תא לחסום פתרון, כדי למנוע כתמים ברקע, עם 10% החמור סרום ב-PBS המכיל 0.3% ניקוי (לראות את הטבלה של חומרים) עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
-
צביעת
- מודלת תאים עם העכבר הראשי או נוגדנים הארנב נגד USP8 (1:250) ו NRDP1 (1:250) בהתאמה (לראות את הטבלה של חומרים) מדולל מלוחים באגירה פוספט עם אבקת (pbt, ראה לוח חומרים), ב 4 ° c לילה, כדי ל זיהוי מתחם מיטלהגיה איתות באמצעות PLA.
- שיתוף בתאי התאים עם סמן ספציפי עבור זיהוי תא ביתא שלא הועלה בעכבר או ארנב כדי לא להפריע לאות PLA. במקרה זה התאים האלה לדגירה עם PDX1 נגד עז (1:500) ב PBT. מודטה את כל הנוגדנים העיקריים לילה ב 4 ° c, באמצעות הסרט פלסטיק על גבי הפתרון כדי למנוע אידוי.
3. שיטת היטל קירבה
- בדיקה וכתמים של משחק הנגד
- להכין את הפתרון בדיקה PLA על פי הוראות היצרן, כלומר, לעשות 20 μL של פתרון בדיקה לכל מדגם על ידי הכנת ריכוז סופי של 1:5 פתרון של שניהם נגד העכבר ואנטי ארנב פתרון בדיקה PBT, ו דגירה עבור 20 דקות בחדר טמפרטורה.
- לאחר הדגירה לילה, לשטוף את התאים פעמיים עם 1x PBS עבור 5 דקות כל אחד, על הנדנדה.
- ממש לפני דגירה עם פתרון בדיקה, להוסיף אנטי עז Cy5 משני בריכוז הסופי של 1:600 לפתרון בדיקה (לזיהוי של אנדוגניים PDX1). הוסף 20 μL פתרון בדיקה לכל תנאי תא, לכסות בעדינות עם הסרט פלסטיק ו דגירה ב 37 ° c עבור 1 h.
- צדו
- לשטוף את התאים פעמיים, בטמפרטורת החדר, עם מאגר A (לראות את הטבלה של חומרים עבור המתכון) עבור 5 דקות כל אחד, על הנדנדה.
- הכינו פתרון לחלקים (חלק מריאגנטים האיתור, ראו טבלת חומרים) לפי הוראות היצרן. בשביל זה, לדלל את המניה (5x) 1:5 ב דיאתיל פירוקרבונט (depc)-מים מטופלים. מיד לפני הדגירה להוסיף 0.025 U/mL ligase. הוסף 20 פתרון הנוגע לתאי μL לתאים. כיסוי עם הסרט פלסטיק ו-דגירה ב 37 ° c עבור 30 דקות.
- גברה
- שטוף את התאים פעמיים בטמפרטורת החדר עם מאגר A עבור 2 דקות כל אחד.
- להפוך פתרון הגברה (חלק של ריאגנטים לזיהוי, ראה טבלת חומרים) על פי הוראות היצרן. לדלל מאגר הגברה (5x) 1:5 ב DEPC מטופלים מים ולשמור בחושך עד השימוש. הוסף דילול 1:80 של פולימראז (חלק מהריאגנטים לזיהוי, ראה טבלת חומרים) לפתרון מיד לפני הוספת הפתרון לתאים.
- הוסף 20 μL של פתרון הגברה לתאים. כיסוי עם סרט פלסטיק ומקום בחושך ב 37 ° c עבור בין 1 h 40 דקות עד 2 h עבור אות מקסימלית.
- הכנה להדמיה
- לשטוף את התאים פעמיים עם מאגר B (לראות את הטבלה של חומרים למתכון) עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר, על הנדנדה.
- לבסוף, לשטוף את התאים פעם אחת 0.01 x מאגר B, עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר על הנדנדה.
- מעלה דגימות על ידי הוספת טיפה של מדיה הרכבה המכיל 4 ′, 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) ובזהירות הצבת שמיכות מעל דגימות באמצעות להב אזמל ללחוץ על כל בועות שנוצרו. חותם שמיכות באמצעות לק ברור ציפורניים סביב הקצוות.
- דגימות תמונה על מיקרוסקופ מסוגל ללכוד מטוסי מיקוד מרובים, כגון מיקרוסקופ קונפוקלית יקוד לייזר, או מיקרוסקופ הפוכה הפוך עם יכולות פירוק, נטילת לפחות 9 מטוס מוקד שונים תמונות.
- לכידת תמונות בהגדלה של 100x, עם גובה של כ-0.45 מ"מ מחסנית z. לכידת PLA ב 550 הריגוש nm, 570 פליטת nm; נגד כתמים ב 650 הריגוש nm, 670 פליטת nm; ו DAPI ב 405 הריגוש nm, 450 פליטת nm.
- כדי להבטיח אותות הרקע של התמונה הפלואורסצנטית ואת האור התועה הם ממוזערים עבור ניתוח במורד הזרם של אירועי PLA (במיוחד על מיקרוסקופים שטח), עיבוד תמונות באמצעות אלגוריתם דו-מימדי (השכן הקרוב) דרך מ תוכנה סטנדרטית לעיבוד תמונה של בחירה.
הערה: לשימוש האולימפוס CellSens, ניקון להשתמש באלמנטים שקלים, לייקה להשתמש לאס X, Zeiss-זן, התמרה, MATLAB, הויגנס תוכנה, כמו גם תוספים מספר זמין דרך תמונה-J. לצורך ניתוח, יש לנתח את המספר הכולל של אינטראקציות בכל ערימות ה-z באמצעות תוכנת Image-J, ולהבטיח שרק תאים חיוביים של Pdx-1 ינותחו (סעיף 3.5).
- קוונפיקציה של אינטראקציות PLA
- פתח את יישום התוכנה חינם Image-J ופתח את תמונת ה-PLA. התחל מהתמונה החדה הראשונה בפוקוס PLA.
- לחצו על הכרטיסייה ' תמונה ' ובחרו ' התאם ', ולאחר מכן לסף ( איור 1a). כוונן את הסף כדי להסיר את כל אות ה-PLA שאינו ספציפי, רשום את התאמת הסף ונסה לשמור על עקביות במהלך הניתוח.
- לחץ על הכרטיסיה תהליך ובחר בינארי ולאחר מכן הפוך לבינארי ( איור 1b). השתמש בתמונה הבינארית כדי למדוד חלקיקים, על-ידי לחיצה על הכרטיסייה "ניתוח" והקשה על החלקיקים (איור 1c).
- לצורך ניתוח ודא שההגדרות הן כדלקמן: Size = 0 – אינסוף, מעגליות = 0 – 1.0, הצג = קווי מתאר, תיבות סימון עבור תוצאות תצוגה ותוצאות ברורות (איור 1d). לחץ על אישור. רשום לפניך את מספר החלקיקים שנותחו בדוגמה של גיליון אלקטרוני ומיקום מחסנית z.
- חזור על שלבים 3.5.2 – ה3.5.4 עד לבדיקה של כל ה-z-מיקוד של המדגם. סכם את מספר החלקיקים הכולל עבור המדגם בגיליון האלקטרוני כדי לכמת מספר כולל של אינטראקציות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ערכנו ניסויים הראשונית קו הלבלב MIN6 ביתא תא ואת SH-SY5Y ונוירובלסטומה חוט התא SH-SY5Y, כדי למטב ולאשר הן ספציפיות של הנוגדנים ואת אינטראקציות החלבון דמיינו. MIN6 תאים היו מצופים שמיכות ב 30,000 תאים/mL ושמאלה כדי לדבוק 48 h, SH-SY5Y תאים היו מצופים שמיכות ב 15,000 תאים/mL ושמאלה כדי לדבוק 24 h. לאחר מכן הפרוטוקול PLA התחיל לעיל, החל משלב 1.2.3. כדי להבטיח את הספציפיות של אותות PLA, אנו הראשון ביצע גישה זו בנוכחות של (אני) אין נוגדן ראשי (איור 2A, איור 3a), (ii) NRDP1 נוגדן לבד (איור 2A, איור 3A), (iii) USP8 נוגדן לבד ( איור 2C, איור 3cו (IV) הן NRDP1 ו USP8 נוגדנים (איור 2C, איור 3c). לקבלת נוחות של הגדרת דוגמה, טבלה 1 מציינת כיצד לפרוס כראוי פקדים ניסיוניים. בעיקר, אנו מתבוננים לא האות PLA מוכן בנוגדן ראשוני יחיד או לא במצב הנוגדן העיקרי השליטה, ובכך מאשרת כי אינטראקציות באתרו נצפו במיוחד בין NRDP1 ו USP8 בנוכחות של שני נוגדנים העיקרי, הן MIN6 ו SH-SY5Y תאים.
אנחנו הבא להתאים את הגישה הזאת לשימוש עם איונים אנושיים לנתח מורכבים אינטראקציות מורכבות במיוחד בתוך תאים ביתא האדם העיקרי. האיים האנושיים מורכבים אוכלוסיית הטרוגניים של תאים ברורים מבחינה פונקציונלית, כולל אלפא, בטא, דלתא, ו-PP-תאים9. בניגוד לאיונים העכבר שבו בתאי ביתא עבור ~ 80% ממסת איון, תאי בטא מהווים טווח קטן יותר באופן פרופורציונלי בתוך איונים אנושיים (בין 28-75%)10,11,12. כך, אנו ביקשו להשתמש בטכנולוגיה PLA כדי לאפשר לנו לצפות את הנוכחות של מתחמי NRDP1-USP8 mitophagy במיוחד בתוך תאים ביתא ולהבטיח שאנחנו לא לצפות תצפיות המייסדים מסוגים אחרים תא איון (אשר יכול להתרחש מ שיתוף immunoprecipitation לימודים של איון lysates). לכן, חשוב להבטיח הולם והפיזור של איון אחיד לרמה כזו כי תאים בודדים יכולים להיות מפלים בקלות ומנותח נוספת. כפי שנראה באיור 4, פרוטוקול הפיזור (סעיף 1) יעיל מאוד בהבטחת תאים בודדים בשדה המיקרוסקופ של המראה לניתוח במורד הזרם. כדי לזהות תאי ביתא, ביצעת כתמים משותפים עם PDX1 anti-סרה ספציפי במהלך התהליך PLA. PDX1 הוא מרכיב ביתא חיוני שעתוק הגורם, אשר נמצא בוגרים מייצר אינסולין בתאי בטא בעיקר בתוך הגרעין13. PDX1 כתמים נשמר בעקבות NRDP1: USP8 PLA באיים האנושיים העיקריים (איור 4). חשוב מכך, השתמשנו עז PDX1 anti-סרה כדי למנוע צולבות פעילות עם נוגדנים העיקרי משמש PLA (ארנב anti-NRDP1 ועכבר anti-USP8, בהתאמה). כך, התוספת של PDX1 נגדיות מאפשר הערכה ספציפית של מכלולי מידוגני מיטוגניים בתוך תאי בטא האנושי העיקרי.
ניצול גישות אלה, אנחנו יכולים לקמפל תמונה של שימור של NRDP1: USP8 mitophagy קומפלקס כדי להסיק את היכולת של המסלול mitophagy בתוך תאי בטא. כדי להרחיב גישה זו לשימוש בתוך התנאים הסביבתיים הדמיית אלה מסוג 2 סוכרת14, התייחסו קווי ביתא האיים האנושיים הראשי עם palmitate וגלוקוז גבוה כדי לגרום הרעלת גלוקולויפוט. אכן, מצאנו כי האינטראקציה של NRDP1 ו USP8 ירד בעקבות חשיפה 48 h palmitate ו גלוקוז גבוה בשני הקווים תא ביתא כמו גם בתאי בטא האנושי העיקרי על ידי PLA (איור 5 והפניה1). תוצאה זו מדגישה את הכדאיות של האפשרות הזאת כדי להעריך את גורמי מידוגני מפתח בעקבות גירויים diabetogenic.
איור 1: זרימת עבודה של תמונה J ניתוח עבור כימות של אינטראקציות PLA. הצעדים החשובים לניתוח מסומנים כאן. (א) התאמה של סף התמונה כדי להבטיח ניתוח מסוים של אותות PLA. (ב) המרה של תמונה לנתונים בינאריים כדי לאפשר כימות קלה. (C-D) כיצד להשלים את הניתוח על-ידי ניתוח החלקיקים המוכרים על-ידי תוכנת ImageJ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: NRDP1 ו USP8 אינטראקציה באופן ספציפי בתאי בטא הלבלב. הגדלה גבוהה (100x) תמונות של קו העכבר לבלב הלבלב, MIN6, מוצגים. (A-D) אות PLA עבור NRDP1: USP8 האינטראקציה מוצג באדום, ו גרעיני הם התחום על ידי DAPI בכחול. (א-ג) אין אות מסוים של NRDP1: אינטראקציה USP8 נראה אם הן (א) או אחד (ב, ג) של נוגדנים החלבון העיקרי מושמט במהלך התהליך PLA. עם זאת, אינטראקציה של שני החלבונים גלוי על ידי PLA בתאי בטא בלבלב (D) כאשר שני נוגדנים נכללים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: NRDP1 ו USP8 אינטראקציה באופן ספציפי בתאים נוירובלסטומה. הגדלה גבוהה (100x) תמונות של קו התא האנושי נוירובלסטומה, SH-SY5Y, מוצגים. (A-D) אות PLA עבור NRDP1: USP8 האינטראקציה מוצג באדום, ו גרעיני הם התחום על ידי DAPI בכחול. (א-ג) אין אות מסוים של NRDP1: אינטראקציה USP8 נראה אם הן (א) או אחד (ב, ג) של נוגדנים החלבון העיקרי מושמט במהלך התהליך PLA. עם זאת, האינטראקציה של שני החלבונים גלויה על-ידי PLA (ד) כאשר שני הנוגדנים נכללים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מכלולי מיטוגיה תא ביתא ניתן לזהות באיי הלבלב האנושיים העיקריים באתרו על ידי PLA. הגדלה גבוהה (100x) תמונות של איים אנושיים מפוזרים מוצגים. תאים בודדים הם כלולים על ידי מכתים גרעיני עם DAPI (כחול), תאים ביתא הם נצפו עם PDX1 כתמים (מגנטה), ואת מכלולי mitophagy ניתן לראות הן בתאי ביתא והן תאים שאינם ביתא (אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מתחם הNRDP1: USP8 mitophagy מורכב מיציבות בתאי ביתא על ידי הרעלת ליפופלקס.
הגדלה גבוהה (100x) תמונות של תאים MIN6 שטופלו עבור 48 h עם כל שליטה (25 מ"מ גלוקוז + 0.82% BSA) או גלוקוז גבוה + palmitate (25 מ"מ גלוקוז + 0.4 mM palmitate/0.82% BSA) מוצגים. (א-ב) האות PLA (NRDP1: USP8) הוא נראה בשתי קבוצות הטיפול. האות PLA פוחתת בתאי ביתא MIN6 לאחר הרעלת ליפול (ב) בהשוואה לפקדים (א). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| דוגמה | נוגדן 1 (העכבר נגד NRDP1) | נוגדן 2 (ארנב נגד USP8) | נוגדן 3 (עז נגד PDX1) (כתם נגדי אופציונלי) |
| שליטה 1: אין נוגדן ראשי (40 איונים) | - | - | + |
| שליטה 2: NRDP1 בלבד (40 איונים) | + | - | + |
| שליטה 3: USP8 בלבד (40 איונים) | - | + | + |
| ניסיוני 1-x: כל התנאים הניסיוניים (40 איונים כל אחד) | + | + | + |
טבלה 1: לדוגמה הגדרת עיצוב ניסיוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים גישה פשוטה ויעילה לשימוש NRDP1: USP8 PLA ברקמות/תאים של עניין היווצרות מכמת של מכלולי mitophagy במעלה. בעבר אישרו את היווצרות של מורכבות CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy בתאי ביתא הלבלב על ידי כמה מתודולוגיות, כולל שיתוף immunoprecipitation ניסויים, תא ללא אינטראקציה לימודי, וחוץ גופית, כמו גם תא מבוסס והפגינו כיצד מורכב זה כוננים מורכבים השטף מיטואני מוסדר1,15. לימודי ה-PLA שאנו מדווחים ומתארים כאן מאפשרים תצוגה מהירה, כמותית, ומיוחדת לתא של מסלול mitophagy הניתנת להתאמה גבוהה לתאי ביתא אנושיים ראשוניים. בנוסף, הצגנו כי NRDP1: USP8 PLA יכול להיות מותאם לשימוש מחוץ לביולוגיה תא ביתא ב-SH-SY5Y בתאי נוירובלסטומה, הדגשת הכדאיות הפוטנציאלית של טכניקה זו כדי לפקח על מתחמי mitophagy במערכות נוירואליות גם.
PLA הוא גישה ישירה; עם זאת, צעדים מסוימים בתוך הפרוטוקול הם בעלי חשיבות עליונה להבטחת תוצאות ברורות וספציפיות. אלה כוללים: (1) להבטיח את הליך הפיזור עבור האיים האנושיים הוא קל מספיק כדי למנוע הפירוק תא/נזק כדי למטב את התמונות, (2) תוספת של מעכב דאוביקווינואז, PR619, מיד לפני קיבעון במהלך שוטף לשמר את מדינה אוביקווינציה (ובכך מחייבת) של מתחם NRDP1-USP8 עבור התבוננות איתות מקסימאלי על ידי PLA, ו (3) את הקוונפיקציה האובייקטיבית של אירועי PLA על ידי ImageJ כדי להבטיח הערכה לא משוחדת של מתחמי mitophagy וגם לאפשר נחישות של תנאים שבהם השינויים ב-mitophagy עשויים שלא להיות מושלמים אך עדיין משמעותיים סטטיסטית/רלוונטיים ביולוגית.
אתגר ידוע בתוך מחקרים איון האדם הוא הדאגה האוכלוסייה הטרוגנית הן תאים ביתא והן תאים שאינם ביתא. השימוש שלנו בכתם נגד PDX1 מאפשר הערכה של היווצרות מורכבות mitophagy בתוך תאי בטא (כמו גם PDX1 שלילי תאים ביתא). אחד חשש פוטנציאלי ניצול PDX1 ככתם נגד הוא הביטוי שלה בתאי דלתא של הלבלב16,17,18, אם כי לתואר נמוך בהרבה מאשר בתאי בטא, כמו סמנים אחרים כגון (כלומר, nkx 6.1) יכול להיות מועסק כדי ל מטרה בתאי ביתא באופן ספציפי יותר. על ידי פיזור איונים שלמים לתוך תאים בודדים מיד לפני cytocentrifugation וקיבעון, אנחנו גם מסוגלים לבצע מחקר תא יחיד מיאופלגיה עם הפרעה מינימלית בלבד של המיקרו-סביבה של איון במהלך הטיפול בתרופות ו/או חשיפה ללייפוטוקסיל עם זאת, אנחנו לא יכולים לשלול את האפשרות כי פיזור איון יכול להפריע מתחמי מיאופלגיים בתוך תאים באופן עצמאי של טיפולים רלוונטיים.
בעוד מדעי חלבון-חלבון מחקרים יותר יכול להיות מועסק באיונים הלבלב האנושי, כגון co-immunoprecipitation ו/או הגישות פרוטאוממית, הליכים אלה דורשים בדרך כלל כמות גדולה של איון lysate אשר יכול להוכיח מאתגרת בהתחשב במחסור של חומר איון אנושי זמין. בנוסף, הדאגה של סוג תא-ספציפיות במהלך טכניקות אלה מסורתיות הופך להיות ברור יותר או דורש אופטימיזציה נוספת של שיטות הזרמת cy, למיין אוכלוסיות ביתא טהור19,20, 21,22. כך, הגישה שלנו PLA מספק חלופה אטרקטיבית ומעשית עבור חלבון-חלבון לימודי האינטראקציה של מסלול mitophagy בתאי ביתא אדם. בעיקר, את היכולת להשתמש במספר כמו 40 הכולל איונים/תנאי לכל ניסוי כדי לכמת היווצרות mitophagy מורכבים באלפי ביתא בודדים מאפשר לחוקרי איון את היכולת לשמר את ההכנות איון שלהם עבור הערכות אחרות מן ה אותו תורם
כמו NRDP1 ו USP8 ביטא באופן מפורש, אנו משערים כי טכניקה זו עשויה להיות ערך הערכה של mitophagy בסוגי תאים מעבר לתאי בטא. האפשרויות כוללות סוגים אחרים של תא איון (עם כתמי נגד הרלוונטיים עבור תאים אלפא או תאים דלתא) או סוגי תאים אשר סומכים בכבדות על mitophagy, כגון נוירונים. לשם כך, התבוננות שלנו של העברת טכניקה זו כדי SH-SY5Y התאים נוירובלסטומה (איור 2) או PDX1 תאי איון שליליים (איור 4) יכול להציע את השירות של הטכניקה שלנו עבור מסלול mitophagy בסוגי תאים אחרים.
למרות הקלות והפשטות של NRDP1: USP8, יש אתגרים שעלולים לבלבל את תוצאות השיטה. בעוד PLA הוא מסוגל לוודא אינטראקציות חלבון חלבון בסמיכות מאוד (40 nm), זה לא לשלול את האפשרות כי מצבים ניסיוניים מסוימים יכול לשמור על קירבה NRDP1-USP8 תוך שיבוש אינטראקציה, אשר יהיה להחמיץ על ידי ה . גישה מפלה עוד, בעוד הדגמנו כי NRDP1: USP8 היווצרות מורכבים הוא בדיקה בתוקף עבור המסלול CLEC16A קאנוני/PARKIN-mitophagy בתאי ביתא הלבלב, מחקרים שנעשו לאחרונה הבחינו תפקידים עבור PARKIN-עצמאי mitophagy מיטוכונדריאלי בקרת איכות23,24. אנחנו עדיין לא יודעים כיצד NRDP1: USP8 היווצרות מורכבות משתנה על ידי שיבוש של מיטופגיה עצמאית פרקין. לפיכך, שימוש בגישה משלימה מעבר לאלה המתוארים כאן כדי לאשר בתאי ביתא יהיה מומלץ. בסופו של דבר, את היציבות של קומפלקס זה mitophagy תלוי אוביקווינציה של חלבונים רכיב, כגון התוספת של הספקטרום הרחב מעכב הPR619 ביקורת על הצורך לשמור אוביקווינציה במהלך הכנת המדגם. שוב, מניפולציות של תאים ביתא שעלולים לשבש בעקיפין את אוביקווינציה של רכיבים של מורכבות NRDP1-USP8 צריך להיחשב בעת ניתוח NRDP1: USP8 כבדיקה עבור היווצרות מורכבות mitophagy.
כתפקיד של בקרת איכות מיטוכונדריאלי מוערך יותר ויותר לא רק הפונקציה ביתא cell אלא גם סוגים אחרים של תאים מטבולית מאוד, הערכה קפדנית של mitophagy יכול להוכיח מאתגרת זמן רב לקבוצות המבקשים מהירה יותר הערכה של רכיבי מיטוהגיה חיוניים. הגישה ל-PLA שאנו מתארים היא בעלות נמוכה יחסית, ברמה מולקולרית שיטה הדמיה שיכולה לספק ניתוח כמותי של היווצרות מורכבות mitophagy עם רזולוציה תא בודד בכמות קטנה דגימות איון האדם יכול להיות מיושם בהרחבה למגוון סוגי תאים, טיפולים או מחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים מכירים בתמיכת JDRF (CDA-2016-189 וסרה-2018-539), המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות, המכונים הלאומיים לבריאות (R01-DK-108921), משפחת Brehm, ומשפחת אנטוני. פרס לפיתוח קריירה JDRF ל-S.A.S. נתמך בחלקו על ידי האקדמיה לסוכרת דנית, אשר נתמכת על ידי קרן נובו Nordisk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
References
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. (0), (2015).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y.
- Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
- Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
- Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
- Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).
- Silva Xavier, D. a, G,
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).
- Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
- Poitout, V., et al.
- Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
- Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).
