Summary
Este protocolo describe un método para el análisis cuantitativo de la formación de complejos de proteínas mitophagy específicamente en células beta a partir de muestras de islet humanos primarios. Esta técnica permite así el análisis de la mitopagia a partir de material biológico limitado, que son cruciales en las muestras preciosas de células beta pancreáticas humanas.
Abstract
La mitopagia es una vía de control de calidad mitocondrial esencial, que es crucial para la bioenergética de células beta de islotes pancreáticos para alimentar la liberación de insulina estimulada por la glucosa. La evaluación de la mitopagia es un reto y a menudo requiere reporteros genéticos o múltiples técnicas complementarias que no se utilizan fácilmente en muestras de tejido, como islotes pancreáticos humanos primarios. Aquí demostramos un enfoque robusto para visualizar y cuantificar la formación de complejos de mitopagia endógenos clave en islotes pancreáticos humanos primarios. Utilizando la técnica de ensayo de ligadura de proximidad sensible para detectar la interacción de los reguladores de mitopagia NRDP1 y USP8, somos capaces de cuantificar específicamente la formación de complejos de mitopagia esenciales in situ. Al acoplar este enfoque a la contramancha para el factor de transcripción PDX1, podemos cuantificar los complejos de mitopagia, y los factores que pueden afectar la mitopagia, específicamente dentro de las células beta. La metodología que describimos supera la necesidad de grandes cantidades de extractos celulares necesarios para otros estudios de interacción proteína-proteína, como la inmunoprecipitación (IP) o la espectrometría de masas, y es ideal para muestras de islotes humanos preciosos generalmente no disponibles en cantidades suficientes para estos enfoques. Además, esta metodología evita la necesidad de técnicas de clasificación de flujo para purificar las células beta de una población de isletes heterogéneos para aplicaciones de proteínas aguas abajo. Por lo tanto, describimos un protocolo valioso para la visualización de la mitopagia altamente compatible para su uso en poblaciones celulares heterogéneas y limitadas.
Introduction
Las células beta pancreáticas producen la insulina necesaria para mantener la homeostasis normal de glucosa, y su fracaso resulta en el desarrollo de todas las formas de diabetes. Las células beta conservan una robusta capacidad mitocondrial para generar la energía necesaria para acoplar el metabolismo de la glucosa con la liberación de insulina. Recientemente, se ha hecho evidente que el mantenimiento de la masa mitocondrial funcional es de importancia fundamental para la función óptima de la célula beta1,2,3. Con el fin de mantener la masa mitocondrial funcional, las células beta dependen de mecanismos de control de calidad para eliminar las mitocondrias disfuncionales, dañadas o envejecidas4. Nosotros y otros hemos demostrado previamente que las células beta se basan en una forma especializada de rotación mitocondrial, llamada autofagia mitocondrial (o mitopagy), para mantener el control de calidad mitocondrial tanto en roedores como en islas humanas1, 2,5. Desafortunadamente, sin embargo, no había un método simple para detectar la mitopagia, o los componentes de mitopagia expresados endógenamente, en células beta pancreáticas humanas.
Recientemente hemos demostrado que la regulación ascendente de la mitopagia en células beta se basa en la formación de un complejo proteico que comprende las ligases E3 CLEC16A y NRDP1 y la desubiquitinasa USP81. NRDP1 y USP8 han demostrado de forma independiente afectar la mitopagia a través de la acción en el iniciador clave de mitopagy PARKIN6,7. NRDP1 se dirige a PARKIN para la ubiquitinación y degradación para desactivar la mitopagia6,y USP8 desubiquitiniza específicamente PARKIN vinculado a K6 para promover su translocación a las mitocondrias7. La tecnología de ensayo de ligadura de proximidad (PLA) hasido un avance reciente en el campo de la biología de la interacción proteica 8, permitiendo la visualización de interacciones proteicas endógenas in situ en células individuales, y no está limitada por el escaso material de la muestra. Esta metodología es particularmente tentadora para la biología de células de islotes/beta humanas, debido a la escasa de la disponibilidad de la muestra, junto a la necesidad de comprender los complejos proteicos fisiológicamente relevantes dentro de los tipos de células heterogéneas.
Utilizando el enfoque PLA, somos capaces de observar los complejos de mitopagia endógenos clave en las células beta pancreáticas primarias y las líneas celulares neuronales, y demostrar los efectos de un ambiente diabetogénico en la vía mitophagia1. En resumen, el objetivo general de este protocolo es analizar complejos específicos de proteína mitopagia en tejidos que carecen de material abundante, o donde los estudios convencionales de interacción proteica no son posibles.
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Protocol
El uso de islotes pancreáticos humanos de donantes no identificados se realiza a través de una exención de la Junta de Revisión Institucional (IRB) y en cumplimiento de la política de irB de la Universidad de Michigan. Los islotes pancreáticos humanos fueron proporcionados por el Programa Integrado de Distribución de Islotes (IIDP, por sus siglas en que se patrocinó por NIH/NIDDK).
1. Preparación de muestras de islet humano
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Disociación de una sola célula
- Muestras de islotes humanos de cultivo (4000–6000 equivalentes de islotes/10 ml medios) durante al menos 1 día a 37 oC en medios de islotes pancreáticos (PIM(S)) complementados con 1 mM de glutamina (PIM(G)), 100 unidades/ml antibiótico-antibiótico, piruvato sódico de 1 mM y 10 % de bovino fetal suero aB humano o suero aB humano.
- Utilice un microscopio de luz de disección con un aumento de 3x para contar los islotes humanos individuales del cultivo. Escoja 40 islotes por tratamiento/condición de interés (como glucolipotoxicidad) en tubos de 1,5 ml en medios de islotes.
- Islas centrífugas a 400 x g durante 1 min a 10oC a sedimentos.
- Las muestras de lavado, mediante una breve inversión de tubos a temperatura ambiente, dos veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato de 1 ml (PBS) que contiene 50 m PR619 (un inhibidor de la deubiquitinasa; para preservar las interacciones proteicas dependientes de la ubiquitina), con centrifugación entre cada lavado a 400 x g durante 1 min a 10oC.
- Disociar islotes en células individuales con 125 ml de trippsina al 0,25% que contienen 50 oM PR619 mediante la incubación de tripsina precalentada (37 oC) durante 3 minutos con pellets de islotes. Disperse suavemente los islotes durante este tiempo con un pipeteo suave periódico utilizando una pipeta de 200 ml.
- Quench la trippsina con 1 mL calentado (37 oC) de medios PIM(S) que contengan 50 m PR619, luego células sedimentarias centrifugando a 400 x g durante 1 min.
- Lavar las células por centrifugación a 400 x g durante 1 min, dos veces, con PBS + 50 m PR619.
- Por último, resuspenda las células en PBS de 150 ml que contengan 50 oM PR619.
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Adherencia y fijación de una sola célula
- Después de la resuspensión, gire la solución celular sobre diapositivas de microscopio esmeriladas, cargadas, usando una citocentrífuga a 28 x g durante 10 min.
- Después de la citocentrifugación, delinee el área celular con una pluma hidrófoba (ver la Tabla de Materiales)para minimizar los volúmenes de solución de anticuerpos/PLA necesarios. Fijar células con 4% de paraformaldehído en PBS durante 15 min a temperatura ambiente.
ADVERTENCIA: La PFA es peligrosa y debe manipularse con cuidado. - Para obtener los mejores resultados, realice la tinción/PLA inmediatamente, o dentro de las 24 h. Si es necesario, conservar las muestras en PBS a 4oC hasta la tinción durante no más de 48 h.
2. Inmunohistoquímica
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Bloqueo
- Lave las células dos veces con 1pbS durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Bloquear la solución celular, para eliminar la tinción de fondo, con 10% de suero de burro en PBS que contiene 0,3% detergente (ver la Tabla de Materiales)durante 1 h a temperatura ambiente.
-
Tinción
- Incubar células con anticuerpos primarios de ratón o conejo contra USP8 (1:250) y NRDP1 (1:250) respectivamente (ver la Tabla de Materiales)diluidas en solución salina tamponada de fosfato con detergente (PBT, ver Tabla de Materiales),a 4oC durante la noche, a detectar la señalización compleja mitophagy a través de PLA.
- Coincubar celdas con un marcador específico para la identificación de células beta que no se elevó en el ratón o conejo para no interferir con la señal PLA. En este caso incubar células con PDX1 anticabra (1:500) en PBT. Incubar todos los anticuerpos primarios durante la noche a 4oC, utilizando película de plástico encima de la solución para evitar la evaporación.
3. Ensayo de ligadura de proximidad
- Sonda pLA y contramancha
- Preparar la solución de sonda PLA de acuerdo con las instrucciones del fabricante, es decir, hacer 20 ml de solución de sonda por muestra preparando una concentración final de 1:5 solución de solución de sonda anti-ratón y anticonejo en PBT, e incubando durante 20 minutos en la habitación Temperatura.
- Después de la incubación durante la noche, lavar las células dos veces con 1x PBS durante 5 minutos cada una, en un balancín.
- Justo antes de la incubación con solución de sonda, añada Cy5 secundario anti-cabra a una concentración final de 1:600 a la solución de sonda (para la detección de PDX1 endógeno). Añadir la solución de la sonda de 20 l a cada condición celular, cubrir suavemente con película de plástico e incubar a 37 oC durante 1 h.
- Ligadura
- Lave las células dos veces, a temperatura ambiente, con el Tampón A (ver la Tabla de Materiales para la receta) durante 5 minutos cada una, en un balancín.
- Preparar la solución de ligadura (parte de los reactivos de detección, ver Tabla de materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para ello, diluir la culata (5x) 1:5 en agua tratada con piricarbonato dietílico (DEPC). Inmediatamente antes de la incubación añadir 0.025 U/ml de ligasa. Añadir solución de ligadura de 20 l a las células. Cubrir con película de plástico e incubar a 37oC durante 30 min.
- Amplificación
- Lave las células dos veces a temperatura ambiente con Tampón A durante 2 minutos cada una.
- Realice una solución de amplificación (parte de los reactivos de detección, consulte Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Diluir el tampón de amplificación (5x) 1:5 en agua tratada con DEPC y mantener en la oscuridad hasta su uso. Agregue una dilución 1:80 de la polimerasa (parte de los reactivos de detección, ver Tabla de materiales) a la solución inmediatamente antes de agregar la solución a las células.
- Añadir 20 sl de solución de amplificación a las células. Cubrir con película de plástico y colocar en la oscuridad a 37 oC durante entre 1 h 40 min a 2 h para la señal máxima.
- Preparación para la toma de imágenes
- Lave las células dos veces con El tampón B (ver la Tabla de Materiales para la receta) durante 10 minutos a temperatura ambiente, en un balancín.
- Finalmente, lave las células una vez en 0.01x Buffer B, durante 2 minutos a temperatura ambiente en un balancín.
- Montar muestras añadiendo una gota de medios de montaje que contengan 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) y colocando cuidadosamente un cubreobjetos sobre las muestras utilizando una cuchilla de bisturí para expulsar las burbujas formadas. Selle los cubreobjetos usando esmalte de uñas transparente alrededor de los bordes.
- Muestras de imágenes en un microscopio capaz de capturar múltiples planos focales, como un microscopio confocal de escaneo láser, o un microscopio de fluorescencia invertido con capacidades de desconvolución, tomando al menos 9 imágenes de plano focal diferentes.
- Capture imágenes con un aumento de 100x, con una altura de pila z de aproximadamente 0,45 mm. Capturar PLA a 550 nm excitación, 570 nm de emisión; contramanchas a 650 nm excitación, 670 nm de emisión; y DAPI a 405 nm excitación, 450 nm de emisión.
- Para garantizar que las señales de fondo de la imagen de fluorescencia y la luz perdida se minimicen para el análisis posterior de eventos PLA (especialmente en microscopios de campo ancho), las imágenes de proceso que utilizan un algoritmo de desconvolución bidimensional (vecino más cercano) a través de un algoritmo de desconvolución bidimensional (vecino más cercano) a través de un algoritmo de desconvolución bidimensional (vecino más cercano) a través de un algoritmo de desconvolución bidimensional (vecino más cercano) a través de un algoritmo de desconvolución bidimensional (vecino más cercano) a través de un algoritmo de desconvolución bidimensional (vecino más software de procesamiento de imágenes estándar de su elección.
NOTA: Para el uso de CellSens de Olympus, Nikon utiliza NIS-Elements, Leica utiliza LAS X, Zeiss – ZEN, Metamorph, MATLAB, Huygens Software, así como varios plugins disponibles a través de Image-J. Para el análisis, el número total de interacciones en todas las pilas z debe analizarse utilizando el software Image-J, asegurando que solo se analicen las celdas positivas Pdx-1 (sección 3.5).
- Cuantificación de las interacciones de PLA
- Abra la aplicación gratuita de software Image-J y abra la imagen PLA. Comience desde la primera imagen PLA enfoco.
- Haga clic en la pestaña de la imagen y seleccione ajustary, a continuación, umbral (figura1A). Ajuste el umbral para eliminar toda la señal PLA no específica, tome nota del ajuste del umbral y trate de mantenerlo consistente durante todo el análisis.
- Haga clic en la pestaña Process y seleccione binaryy, a continuación, haga binario (Figura1B). Utilice la imagen binaria para medir partículas, haciendo clic en la pestaña "analizar" y presionando analizar partículas (Figura 1C).
- Para el análisis, asegúrese de que la configuración es la siguiente: Tamaño - 0–Infinito, Circularidad - 0–1.0, Mostrar - Esquemas, casillas de verificación para Mostrar resultadosy Borrar resultados (Figura 1D). Haga clic en Aceptar. Tome nota del número de partículas analizadas en una hoja de cálculo que denota la muestra y la posición de la pila z.
- Repita los pasos 3.5.2–3.5.4 hasta que se hayan analizado todas las pilas z enfocadas de la muestra. Sume el número total de partículas de la muestra en la hoja de cálculo para cuantificar el número total de interacciones.
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Representative Results
Realizamos experimentos iniciales en la línea de células beta pancreática sin páncreas MIN6 y la línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y SH-SY5Y, para optimizar y confirmar tanto la especificidad de los anticuerpos como las interacciones proteicas visualizadas. Las células MIN6 se nivelaron en los labios de las cubiertas a 30.000 células/ml y se dejaron adheridas durante 48 h, las células SH-SY5Y se enchaparon en los labios de las cubiertas a 15.000 células/ml y se dejaron adheridas durante 24 horas. El protocolo PLA fue seguido como arriba, comenzando en el paso 1.2.3. Para garantizar la especificidad de las señales PLA, primero realizamos este enfoque en presencia de (i) ningún anticuerpo primario (Figura2A, Figura 3A), ii) anticuerpo NRDP1 solo (Figura2B, Figura 3B), (iii) anticuerpo USP8 solo ( Figura 2C, Figura 3C) y (iv) anticuerpos NRDP1 y USP8 (Figura2D, Figura 3D). Para facilitar la configuración de la muestra, la Tabla 1 indica cómo diseñar correctamente los controles experimentales. En particular, no observamos señal PLA punctada en un solo anticuerpo primario o en condiciones de control de anticuerpos primarios, lo que confirma que las interacciones in situ se observan específicamente entre NRDP1 y USP8 en presencia de ambos anticuerpos primarios, tanto en MIN6 como en Células SH-SY5Y.
A continuación adaptamos este enfoque para su uso con islotes humanos para analizar interacciones complejas mitophagia específicamente dentro de las células beta humanas primarias. Los islotes humanos se componen de una población heterogénea de célulasfuncionalmente distintas, incluyendo alfa, beta, delta y células PP 9. A diferencia de los islotes de ratón en los que las células beta representan el 80% de la masa de los islotes, las células beta comprenden un rango proporcionalmente menor dentro de los islotes humanos (entre 28-75%)10,11,12. Por lo tanto, buscamos utilizar la tecnología PLA para permitirnos observar la presencia de complejos de mitopagia NRDP1-USP8 específicamente dentro de células beta y asegurarnos de que no observamos observaciones de confunción de otros tipos de células de islotes (que podrían ocurrir a partir de estudios de coinmunoprecipitación de los islotes lisados). Por lo tanto, es importante garantizar una dispersión adecuada y uniforme de los islos a un nivel tal que las células individuales puedan ser fácilmente discriminadas y analizadas más a fondo. Como se ve en la Figura4, el protocolo de dispersión (sección 1) es altamente eficiente para asegurar células individuales en el campo de visión del microscopio para el análisis aguas abajo. Para identificar las células beta, realizamos la co-tinción con antisueros específicos PDX1 durante el proceso de PLA. PDX1 es un factor de transcripción específico de células beta vital, que se encuentra en las células beta maduras productoras de insulina principalmente dentro del núcleo13. La tinción PDX1 se retuvo siguiendo NRDP1:USP8 PLA en los islotes humanos primarios (Figura 4). Es importante destacar que utilizamos la cabra PDX1 anti-sueros para evitar la reactividad cruzada con anticuerpos primarios utilizados para PLA (conejo anti-NRDP1 y ratón anti-USP8, respectivamente). Por lo tanto, la adición de contramanchación PDX1 permite la evaluación específica de los complejos de mitopagia endógenas dentro de las células beta humanas primarias.
Utilizando estos enfoques, podemos compilar una instantánea de la retención del complejo de mitopagia NRDP1:USP8 para inferir la competencia de la vía mitophagy dentro de las células beta. Para ampliar este enfoque para su uso dentro de las condiciones ambientales emulando las de la diabetes tipo 214,tratamos líneas beta celulares e islotes humanos primarios con palmitato y glucosa alta para inducir glucolipotoxicidad. De hecho, encontramos que la interacción de NRDP1 y USP8 se redujo después de una exposición de 48 h al palmitato y a la glucosa alta tanto en las líneas beta de las células beta como en las células beta humanas primarias por PLA (Figura5 y referencia1). Este resultado pone de relieve la viabilidad de este ensayo para evaluar los factores clave de la mitopagia endógena después de los estímulos diabetogénicos.
Figura 1: Flujo de trabajo del análisis de la imagen J para la cuantificación de las interacciones de PLA. Los pasos importantes del análisis se resaltan aquí. (A) Ajuste del umbral de imagen para asegurar un análisis específico de la señal PLA. (B) Conversión de la imagen a datos binarios para permitir una fácil cuantificación. (C-D) Cómo finalizar el análisis mediante el análisis de las partículas reconocidas por el software ImageJ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: NRDP1 y USP8 interactúan específicamente en células beta pancreáticas. Se muestran imágenes de alto aumento (100x) de la línea celular pancreática del ratón, MIN6. (A-D) La señal PLA para la interacción NRDP1:USP8 se muestra en rojo, y los núcleos son delineados por DAPI en azul. (A-C) No se ve ninguna señal específica de punctato para la interacción NRDP1:USP8 si se omiten (A) o cualquiera (B,C) de los anticuerpos proteicos primarios durante el proceso de PLA. Sin embargo, la interacción de ambas proteínases visible por PLA en las células beta pancreáticas (D ) cuando se incluyen ambos anticuerpos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: NRDP1 y USP8 interactúan específicamente en células de neuroblastoma. Se muestran imágenes de alto aumento (100x) de la línea celular del neuroblastoma humano, SH-SY5Y. (A-D) La señal PLA para la interacción NRDP1:USP8 se muestra en rojo, y los núcleos son delineados por DAPI en azul. (A-C) No se ve ninguna señal específica de punctato para la interacción NRDP1:USP8 si se omiten (A) o cualquiera (B,C) de los anticuerpos proteicos primarios durante el proceso de PLA. Sin embargo, la interacción deambas proteínas es visible por PLA (D ) cuando se incluyen ambos anticuerpos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Los complejos de mitopagia de células beta se pueden identificar en islotes pancreáticos humanos primarios in situ por PLA. Se muestran imágenes de alto aumento (100x) de islotes humanos dispersos. Las células individuales se delinean por la tinción nuclear con DAPI (azul), las células beta se observan con tinción PDX1 (magenta), y los complejos de mitopagia se pueden ver tanto en células beta como en células no beta (rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: El complejo de mitopagia NRDP1:USP8 se desestabiliza en las células beta por glucolipotoxicidad.
Se muestran imágenes de alto aumento (100x) de células MIN6 tratadas durante 48 h con control (25 mM de glucosa + 0,82% BSA) o de alta glucosa + palmitato (25 mM de glucosa + 0,4 mM de palmitato/0,82% BSA). (A-B) La señal PLA (NRDP1:USP8) se considera en ambos grupos de tratamiento. La señal PLA disminuye en las células beta MIN6 después de la glucolipotoxicidad (B) en comparación con los controles (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Muestra | ANTICUERPO 1 (ratón anti-NRDP1) | ANTICUERPO 2 (conejo anti-USP8) | ANTICUERPO 3 (cabra anti-PDX1) (Contramancha opcional) |
| CONTROL 1: Sin anticuerpo primario (40 islotes) | - | - | + |
| CONTROL 2: NRDP1 solo (40 islotes) | + | - | + |
| CONTROL 3: USP8 solo (40 islotes) | - | + | + |
| EXPERIMENTAL 1-x: todas las condiciones experimentales (40 islotes cada uno) | + | + | + |
Tabla 1: Ejemplo de configuración de diseño experimental.
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Discussion
Aquí describimos un enfoque simple y eficiente para utilizar NRDP1:USP8 PLA en tejidos/células de interés para cuantificar la formación de complejos mitopagia aguas arriba. Anteriormente confirmamos la formación del complejo de mitopagia CLEC16A-NRDP1-USP8 en células beta pancreáticas por varias metodologías, incluyendo experimentos de co-inmunoprecipitación, estudios de interacción sin células, y in vitro, así como basado en células ubiquitinación, y demostró cómo este complejo impulsa el flujo mitopágico regulado1,15. Los estudios PLA que reportamos y describimos aquí permiten una visión rápida, cuantitativa y específica de la célula de la vía mitophagia que es altamente adaptable a las células beta humanas primarias. Además, hemos demostrado que NRDP1:USP8 PLA se puede adaptar para su uso fuera de la biología de células beta en células de neuroblastoma SH-SY5Y, destacando la viabilidad potencial de esta técnica para monitorear los complejos de mitopagia en sistemas neuronales también.
PLA es un enfoque sencillo; sin embargo, ciertos pasos dentro del protocolo son de suma importancia para garantizar resultados claros y específicos. Estos incluyen: (1) asegurar que el procedimiento de dispersión para los islotes humanos sea lo suficientemente suave como para prevenir la lisis/daño celular para optimizar las imágenes, (2) la adición del inhibidor de la desubiquitinasa, PR619, inmediatamente antes de la fijación y durante los lavados para preservar la ubiquitinación (y por lo tanto vinculante) del complejo NRDP1-USP8 para la observación máxima de la señal por PLA, y (3) la cuantificación objetiva de los eventos PLA por ImageJ para asegurar una evaluación imparcial de los complejos mitopagiay y también permitir la determinación de condiciones por las que los cambios en la mitopagia pueden no ser completos, pero todavía estadísticamente significativos/biológicamente relevantes.
Un desafío bien conocido dentro de los estudios de isla humana es la preocupación por la población heterogénea de células beta y células no beta. Nuestro uso de la contramancha PDX1 permite evaluar la formación compleja de mitopagia dentro de las células beta (así como las células no beta negativas PDX1). Una preocupación potencial que utiliza PDX1 como contramancha es su expresión en células delta pancreáticas16,17,18, aunque en un grado mucho menor que en las células beta, como tales otros marcadores (es decir, NKX6.1) podrían emplearse para células beta objetivo más específicamente. Al dispersar los islotes intactos en células individuales inmediatamente antes de la citocentrifugación y fijación, también podemos realizar estudios de mitopagia de una sola célula con una interrupción mínima del microambiente de los islotes durante el curso de los tratamientos farmacológicos y/o exposición glucolipotóxica. Sin embargo, no podemos excluir la posibilidad de que la dispersión de islotes pueda interferir con los complejos mitopágicos dentro de las células independientemente de los tratamientos pertinentes.
Si bien se pueden emplear estudios más tradicionales de interacción proteína-proteína en islotes pancreáticos humanos, como la coinmunoprecipitación y/o enfoques proteómicos, estos procedimientos generalmente requieren una gran cantidad de lisato de islotes, lo que puede resultar difícil dada la escasez de material de islet humano disponible. Además, la preocupación de la especificidad del tipo de célula durante estas técnicas tradicionales se hace más evidente o requiere una optimización adicional de los métodos de citometría de flujo para clasificar las poblaciones de células beta puras19,20, 21,22. Por lo tanto, nuestro enfoque PLA proporciona una alternativa atractiva y práctica para los estudios de interacción proteína-proteína de la vía mitophagia en las células beta humanas. En particular, la capacidad de utilizar tan solo 40 islotes/condición totales por experimento para cuantificar la formación compleja de mitopagia en miles de células beta individuales permite a los investigadores de islotes la capacidad de conservar sus preparaciones de islotes para otras evaluaciones mismo donante.
Como NRDP1 y USP8 se expresan ubicuamente, especulamos que esta técnica puede tener valor para la evaluación de la mitopagia en tipos de células más allá de las células beta. Las posibilidades incluyen otros tipos de células de isla (con contramanchas relevantes para células alfa o células delta) o tipos de células que dependen en gran medida de la mitopagia, como las neuronas. Con este fin, nuestra observación de la transferibilidad de esta técnica a las células de neuroblastoma SH-SY5Y (Figura 2) o células de islet PDX1-negativas (Figura 4) podría sugerir la utilidad de nuestra técnica para la vía mitophagia en otros tipos de células.
A pesar de la facilidad y simplicidad del enfoque NRDP1:USP8 PLA, hay desafíos que podrían confundir los resultados de este ensayo. Si bien el PLA es capaz de determinar las interacciones proteína-proteína en muy cerca (40 nm), no descarta la posibilidad de que ciertas condiciones experimentales puedan mantener la proximidad NRDP1-USP8 mientras se interrumpe la interacción, que se perdería por el PLA. Además, si bien hemos demostrado que la formación compleja NRDP1:USP8 es una lectura válida para la vía canónica CLEC16A/PARKIN-mitophagy en células beta pancreáticas, estudios recientes han observado roles para la mitopagia independiente de PARKIN en la mitocondrial control de calidad23,24. Todavía no sabemos cómo la formación compleja NRDP1:USP8 es modificada por la interrupción de la mitopagia independiente de PARKIN. Por lo tanto, sería aconsejable el uso de un enfoque complementario más allá de los descritos aquí para analizar la mitopagia en las células beta. Por último, la estabilidad de este complejo de mitopagia depende de la ubiquitinación de las proteínas componentes, de modo que la adición de un inhibidor de la deubiquitinasa de amplio espectro PR619 es fundamental para mantener la ubiquitinación durante la preparación de la muestra. Una vez más, las manipulaciones de células beta que pueden interrumpir indirectamente la ubiquitinación de los componentes del complejo NRDP1-USP8 deben tenerse en cuenta al analizar NRDP1:USP8 como una lectura para la formación compleja de mitopagia.
Como el papel del control de calidad mitocondrial se aprecia cada vez más no sólo en la función de las células beta, sino también en otros tipos de células altamente metabólicas, la evaluación rigurosa de la mitopagia puede resultar difícil y llevar mucho tiempo a los grupos que desean una evaluación de los componentes cruciales de la mitopagia. El enfoque PLA que describimos es una técnica de visualización de nivel molecular de costo relativamente bajo que puede proporcionar un análisis cuantitativo de la formación compleja de mitopagia con resolución de una sola célula en muestras de islas humanas de pequeña cantidad y podría aplicarse ampliamente a una variedad de tipos de células, tratamientos o afecciones de la enfermedad.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen el apoyo de financiamiento de JDRF (CDA-2016-189 y SRA-2018-539), el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales, Institutos Nacionales de Salud (R01-DK-108921), la familia Brehm y la familia Anthony. El Premio JDRF de Desarrollo Profesional a S.A.S. cuenta en parte con el apoyo de la Academia Danesa de la Diabetes, que cuenta con el apoyo de la Fundación Novo Nordisk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
References
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