Summary
Bu protokol, özellikle primer insan Islet örneklerinden Beta hücrelerinde mitofagoy protein kompleksi oluşumunun nicel analizi için bir yöntem özetliyor. Bu teknik, değerli insan pankreatik beta hücre örneklerinde önemli olan sınırlı biyolojik materyalden mitophaginin analizini sağlar.
Abstract
Mitofajit, glukoz stimüle edilen insülin salınımı için pankreas Islet Beta hücresi Biyoenerji için önemli olan temel bir mitokondriyal kalite kontrol yoludur. Mitophagy değerlendirilmesi zordur ve genellikle genetik gazetecilere veya primer insan pankreatik izletleri gibi doku örneklerinde kolayca kullanılabilen çoklu tamamlayıcı teknikler gerektirir. Burada, primer insan pankreatik izletlerinde anahtar endojen mitophagy kompleksleri görselleştirilmesi ve ölçülmesine yönelik güçlü bir yaklaşım gösteriyoruz. Hassas yakınlık ligasyon assay tekniği kullanarak mitophagy regülatörleri NRDP1 ve USP8 etkileşimi algılamak için, özellikle situ içinde temel mitofajit kompleksleri oluşumunu ölçmek edebiliyoruz. PDX1 transkripsiyon faktörü için bu yaklaşımı kullanarak, biz mitophagy kompleksleri ve özellikle Beta hücreleri içinde mitophagy zarar verebilir faktörleri ölçmek olabilir. Tarif ettiğimiz metodoloji, immünopresipitasyon (IP) veya kütle spektrometresi gibi diğer protein-protein etkileşimi çalışmaları için gerekli olan büyük miktarlarda hücresel ekstraktlara ihtiyacı üstesinden gelir ve genellikle değerli insan Islet örnekleri için idealdir Bu yaklaşımlar için yeterli miktarlarda kullanılabilir. Ayrıca, Bu metodoloji akış ayıklama teknikleri, aşağı protein uygulamaları için heterojen bir Islet nüfusu beta hücrelerini arındırmak için ihtiyaç ortadan kaldırır. Böylece, heterojen ve sınırlı hücre nüfuslarında kullanmak için son derece uyumlu mitofajit görselleştirme için değerli bir protokol açıklanmaktadır.
Introduction
Pankreas Beta hücreleri normal glikoz homeostaz korumak için gerekli insülin üretmek, ve diyabet her türlü gelişiminde onların başarısızlık sonuçları. Beta hücreleri insülin salınımı ile çift glikoz metabolizması için gerekli enerjiyi üretmek için sağlam bir mitokondriyal kapasiteyi korur. Son zamanlarda, fonksiyonel mitokondriyal kütle Bakımı optimum beta hücre fonksiyonu1,2,3için önemli öneme sahip olduğu belirgin hale gelmiştir. Fonksiyonel mitokondriyal kütlesini sürdürmek için, Beta hücreleri disfonksiyonel, hasarlı veya yaşlanma mitokondri4kaldırmak için kalite kontrol mekanizmaları güveniyor. Biz ve diğerleri daha önce beta hücrelerinin mitokondriyal cirosunun özel bir formu, mitokondriyal otophagy (veya mitophagy) denilen, hem kemirgen ve insan adacıklar1 mitokondriyal kalite kontrolünü korumak için güvenmektedir göstermiştir 2,5. Ne yazık ki, ancak, mitophagy tespit etmek için basit bir yöntem yoktu, ya da Endogenously mitophagy bileşenleri ifade, insan pankreas Beta hücrelerinde.
Geçenlerde Beta hücrelerinde mitophagy upstream yönetmelik E3 Ligas CLEC16A ve NRDP1 ve deubiquitinase USP81oluşan bir protein kompleksi oluşumuna dayanır göstermiştir. NRDP1 ve USP8 bağımsız olarak mitophagy anahtar mitophagy Başlatıcı Parkin üzerinde eylem yoluyla etkilemek için gösterildi6,7. NRDP1 mitophagy kapalı kapatmak için mayası ve bozulma için Parkin hedefler6, ve USP8 özellikle mitokondri7için translokasyon tanıtmak için K6 bağlantılı Parkin deubiquitinates. Proximity ligasyon Assay (PLA) teknolojisi, protein etkileşimi biyoloji8alanında yeni bir avans olmuştur, tek hücrelerde situ içinde endojen protein etkileşimleri görselleştirme izin, ve az örnek malzeme ile sınırlı değildir. Bu metodoloji özellikle insan islet/Beta hücresi biyolojisi için, örnek mevcudiyeti, heterojen hücre türleri içinde fizyolojik olarak ilgili protein kompleksler anlamak için ihtiyaç ile birleştiğinde için cazip.
PLA yaklaşımı kullanarak, birincil insan pankreatik Beta hücrelerinde ve nöronal hücre hatlarında anahtar endojen mitophagy kompleksleri gözlemlemek edebiliyoruz, ve mitophagy yolu üzerinde bir diyabet hastalığı etkilerini göstermek1. Özetle, bu protokolün kapsamlı hedefi, bol miktarda malzeme bulunmayan dokulardaki belirli mitophagy protein kompleksini analiz etmektir veya konvansiyonel protein etkileşimi çalışmalarının mümkün olmadığı bir yerdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bir kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) muafiyet ve Michigan Üniversitesi IRB politikası ile uyumlu olarak tanımlanabilen donör insan pankreatik adacıklar kullanımı ile. İnsan pankreatik adacıklar NIH/niddk destekli entegre Islet dağıtım programı (IIDP) tarafından sağlandı.
1. insan Islet numune hazırlama
-
Tek hücreli ayrışma
- Kültür insan Islet örnekleri (4000 – 6000 Islet eşdeğerleri/10 ml medya) pankreas Islet medya (PIM (S)) medya 1 mm glutamin (PIM (G)) ile tamamlayıcı 37 °c en az 1 gün için, 100 birimler/ml Antimikotik-antibiyotik, 1 mm sodyum piruvat ve 10% fetal sığır Serum (FBS) veya insan AB serumu.
- Kültürden bireysel insan izletlerini saymak için 3x büyütmede diseksiyon ışık mikroskobu kullanın. Çekme 40 adacıklar tedavi başına/durum (örneğin glucolipotoxicity) içine 1,5 ml tüpler içine Islet medya.
- 400 x g , 10 °c ' de 1 dak için tortu ile Santrifüjü izlet.
- Yıkama örnekleri, oda sıcaklığında tüpler kısa inversiyon tarafından, iki kez 1 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) içeren 50 μM PR619 (bir deubiquitinase inhibitörü; Ubiquitin bağımlı protein etkileşimlerini korumak için), her yıkama arasında santrifüjleme 400 10 °C ' de 1 dakika için x g .
- 125 μL (50 μM PR619) içeren tek hücrelere 0,25, prewarmed tripsin (37 °c) ile 3 dakika boyunca Islet PELLETLER ile birlikte dissociate adacıklar. 200 μL pipet kullanılarak periyodik nazik pipetleme ile bu süre zarfında yavaşça dağılın.
- 50 μM PR619 içeren 1 ml ısıtılmış (37 °c) PIM (S) medyasını, ardından 1 dakika boyunca 400 x g 'de santrifükleme yaparak tortu hücrelerini yavaşlatın.
- 400 x g 'de 1 dakika boyunca santrifüjleme ile hücreleri iki kez, PBS + 50 μM PR619 ile yıkayın.
- Son olarak, 50 μM PR619 içeren 150 μL PBS hücrelerinde pelletini hücreleri.
-
Tek hücreli yapışması ve sabitleme
- Resuspension sonra, 10 dakika için 28 x g bir sitosenterge kullanarak buzlu, şarj, mikroskop slaytlar üzerine hücre çözümünü döndürün.
- Cytocent, sonra bir hidrofobik kalem ile hücresel alan anahat (bkz: malzeme tablosu) Antibody/PLA çözüm hacimlerini en aza indirmek için gerekli. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS 'de% 4 civarında formaldehite ile hücreleri düzeltin.
DIKKAT: PFA tehlikelidir ve dikkatle ele alınmalıdır. - En iyi sonuçları elde etmek için, hemen veya 24 saat içinde boyama/PLA gerçekleştirin. Gerekirse, 4 °C ' de PBS 'de numuneleri 48 h 'den fazla olmayan şekilde boyayın.
2. immünhistokimya
-
Engelleme
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1x PBS ile hücreleri iki kez yıkayın.
- Blok hücre çözümü, arka plan boyama ortadan kaldırmak için,% 10 eşek serumu ile PBS% 0,3 deterjan içeren ( malzeme tablosunabakın) Oda sıcaklığında 1 saat.
-
Boy -ama
- USP8 (1:250) ve NRDP1 (1:250) ' e karşı primer fare veya tavşan antikorları olan hücreleri sırasıyla ( malzeme tablosunabakın) deterjan ile fosfat tamponlu tuz ile seyreltilmiş (PBT, malzeme tablosunabakın), gece 4 °c ' de, PLA üzerinden mitophagy kompleks sinyalizasyon tespit.
- Bu yüzden PLA sinyaline müdahale değil fare veya tavşan yükseltilmiş değildi beta hücre tanımlaması için özel bir marker ile hücreleri kokulat. Bu durumda PBT Anti-keçi PDX1 (1:500) ile hücreleri inkübe. Evaporasyonu önlemek için çözümün üstünde plastik film kullanarak, 4 °C ' de bir gecede tüm primer antikorları kuluçat.
3. yakınlık ligasyon tahlil
- PLA prob ve karşı leke
- PLA prob çözümünü üreticinin talimatlarına göre hazırlayın, örneğin, PBT 'de hem Anti-fare hem de tavşan karşıtı prob çözeltisi 1:5 son konsantrasyonunu hazırlayarak örnek başına 20 μL prob çözeltisi yapın ve odada 20 dakika boyunca kulkayın Sıcaklık.
- Gece inkübasyon sonra, bir rocker üzerinde 5 dakika her biri için 1x PBS ile iki kez hücreleri yıkayın.
- Prob çözeltisi ile kuluçba hemen önce, 1:600 son konsantrasyonunda Anti-keçi Cy5 ikincil ekleyin (endojen PDX1 tespiti için) prob çözeltisine. Her hücre koşullarına 20 μL prob çözeltisi ekleyin, plastik film ile yavaşça kapın ve 37 °C ' de 1 saat boyunca inküye yapın.
- Ligasyon
- Hücreleri iki kez yıkayın, oda sıcaklığında, buffer A ile (tarifi için malzeme tablosuna bakın) 5 dk her, bir rocker üzerinde.
- Üreticinin talimatlarına göre ligasyon çözümünü hazırlayın (algılama reaktiflerinin bir parçası, malzeme tablosunugörün). Bunun için dietil pyrocarbonate (DEPC)-tedavi edilen suda seyreltilen ligasyon stokları (5x) 1:5. İnkübasyon hemen önce 0,025 U/mL ligaz ekleyin. Hücrelere 20 μL ligasyon çözümü ekleyin. Plastik film ile kapak ve 37 °C ' de 30 dakika boyunca inkübe.
- Amplifikasyon
- 2 dakika her biri için buffer A ile Oda sıcaklığında iki kez yıkama hücreleri.
- Üreticinin talimatlarına göre amplifikasyon çözümü (algılama reaktiflerinin bir parçası, malzeme tablosunu görmek) olun. DEPC-işlenmiş suda seyreltmeli amplifikasyon tamponu (5x) 1:5 ve kullanıma kadar karanlıkta tutun. Ekleme bir 1:80 polimeraz seyreltme (algılama reaktiflerinin bir parçası, bkz: malzeme tablosu) çözüme hemen önce hücrelere çözüm ekleme.
- Hücrelere 20 μL amplifikasyon çözümü ekleyin. Maksimum sinyal için 1 saat 40 dk ila 2 saat arasında 37 °C ' de karanlık plastik film ve yer ile kapak.
- Görüntüleme hazırlığı
- Tampon B ile iki kez yıkama hücreleri (tarifi için malzeme tablosuna bakın) Oda sıcaklığında 10 dakika için, bir rocker üzerinde.
- Son olarak, bir rocker üzerinde oda sıcaklığında 2 dakika için 0.01 x tampon B, bir kez hücreleri yıkayın.
- Mount örnekleri 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (dapi) içeren montaj ortamı bir damla ekleyerek ve dikkatle örnekleri üzerinde bir neşter bıçak kullanarak herhangi bir kabarcıklar oluşan dışarı basın için bir lamel magazini yerleştirerek. Kenarları şeffaf tırnak cilası kullanarak mühür kapak.
- Lazer tarama Konfokal mikroskop veya ters çevrilmiş Floresan Mikroskobu gibi birden fazla odak düzlemini yakalama yeteneğine sahip bir mikroskop üzerinde görüntü örnekleri, en az 9 farklı odak düzlem görüntüleri alarak, deconvolution yetenekleri ile.
- Yaklaşık 0,45 mm z yığını yüksekliğiyle 100x büyütme oranındaki görüntüleri yakalayın. 550 nm uyarma, 570 nm Emisyon at yakala PLA; 650 nm uyarma, 670 nm Emisyon at karşı-leke; ve DAPı 405 nm uyarma, 450 nm Emisyon.
- Floresan görüntü arka plan sinyalleri ve sokak ışık sağlamak için aşağı aşağı Analizi PLA olayların (özellikle Widefield microscopes), işlem görüntüleri kullanarak iki boyutlu deconvolution (en yakın komşu) algoritması kullanılarak bir Standart görüntü işleme yazılımı tercih.
Not: Olympus CellSens kullanmak Için, Nikon NIS-Elements kullanın, Leica kullanarak LAS X, Zeiss – ZEN, MetaMorph, MATLAB, Huygens yazılım, yanı sıra birkaç eklentileri Image-J aracılığıyla kullanılabilir. Analiz için, tüm z-yığınları üzerindeki etkileşimlerin toplam sayısı Image-J yazılımı kullanılarak analiz edilmelidir, yalnızca PDX-1 pozitif hücrelerin analiz edilmesini sağlar (Bölüm 3,5).
- PLA etkileşimlerini ölçmek
- Ücretsiz Image-J yazılım uygulamasını açın ve PLA görüntüsünü açın. İlk keskin odaklama PLA görüntüsünden başlayın.
- Resim sekmesini tıklatın ve Ayarla'yı, ardından eşik 'yi (Şekil 1a) seçin. Tüm spesifik olmayan PLA sinyalini kaldırmak için eşik ayarlayın, eşik ayarı not edin ve analiz boyunca tutarlı tutmaya çalışın.
- İşlem sekmesini tıklatın ve ikili'i seçin, sonra ikili olun (Şekil 1B). Parçacıkları ölçmek için ikili görüntüyü kullanın, "analizet" sekmesine tıklayıp parçacıkları analiz edin (Şekil 1C).
- Çözümleme için ayarların aşağıdaki gibi olduğundan emin olun: Boyut = 0 – Infinity, circularity = 0 – 1.0, göster = anahatlar, görüntüleme sonuçlarıIçin onay kutuları ve sonuçları temizle (Şekil 1D). Tamam'ı tıklatın. Örnek ve z-yığını konumu gösteren bir elektronik tabloda analiz edilen parçacıkların sayısını not alın.
- Örnek için tüm odak z-yığınları analiz edilinceye kadar 3.5.2 – 3.5.4 arasındaki adımları yineleyin. Toplam etkileşim sayısını ölçmek için elektronik tablodaki numunenin toplam parçacıklarının sayısını topla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz MIN6 pankreas beta hücre hattı ve SH-SY5Y Nöroblastom hücre hattı SH-SY5Y, optimize etmek ve hem de antikorların özgüllüğü ve görselleştirilmiş protein etkileşimlerini onaylamak için ilk deneyler gerçekleştirdi. MIN6 hücreler/mL ve 48 h için sığmasını sol, SH-SY5Y hücreleri 30.000 ' de Cover, üzerinde kaplama vardı/mL ve 24 h için sığmasını sol 15.000 Cover, üzerine kaplama edildi. PLA Protokolü sonra yukarıdaki gibi, adım 1.2.3 başlayarak izledi. PLA sinyallerinin özgüllüğünü sağlamak için, bu yaklaşımı (i) primer antikor (Şekil 2a, Şekil 3A), (II) tek başına NRDP1 antikor (Şekil 2B, ŞEKIL 3B), (iii) USP8 antikor varlığı ( Şekil 2C, Şekil 3c) ve (IV) hem NRDP1 hem de USP8 antikorları (Şekil 2D, şekil 3D). Örnek ayarlama kolaylığı için Tablo 1 deneysel denetimler düzgün mizanpajı nasıl gösterir. Özellikle, biz tek primer antikor ya da hiçbir birincil antikor kontrol koşullarında hiçbir deliner PLA sinyali gözlemlemek, böylece situ etkileşimleri özellikle NRDP1 ve USP8 arasında hem primer antikorların varlığında gözlenen teyit, hem MIN6 ve SH-SY5Y hücreleri.
Daha sonra bu yaklaşımı, özellikle primer insan Beta hücrelerinde bulunan mitophagy kompleks etkileşimleri analiz etmek için insan izletleriyle kullanmak üzere adapte ettik. İnsan izletler Alfa, Beta, Delta ve PP hücreleri9gibi işlevsel olarak farklı hücrelerin heterojen bir nüfusundan oluşur. Beta hücrelerinin ~ 80% Islet kütlesine ait olduğu fare izletinin aksine, Beta hücreleri insan adasları içinde (28-75%)10,11,12arasında orantılı olarak daha küçük bir Aralık oluşturur. Böylece, bize özellikle Beta hücreleri içinde NRDP1-USP8 mitophagy kompleksleri varlığını gözlemlemek ve biz diğer Islet hücre tiplerinden (hangi meydana gelebilir şok gözlemleri dikkate vermedi emin olmak için pla teknolojisini kullanmak için çalıştı Islet Lysates Co-immunoprecipitation çalışmaları). Böylece, tek hücrelerin kolayca ayrımcılık ve daha da analiz edilebilir böyle bir seviyeye yeterli ve Tekdüzen Islet dağılım sağlamak önemlidir. Şekil 4' te görüldüğü gibi, dağılım Protokolü (Bölüm 1), aşağı akış analizi için mikroskop görüş alanında tek hücrelerin sağlanması açısından son derece etkilidir. Beta hücrelerini tanımlamak için, PLA sürecinde PDX1 spesifik Anti-sera ile ortak boyama gerçekleştirdik. PDX1, temelde çekirdek13içinde olgun insülin üreten beta hücrelerinde bulunan hayati bir beta hücresi spesifik transkripsiyon faktörüdür. PDX1 boyama, birincil insan izletinde NRDP1: USP8 PLA aşağıdaki tutulmuştur (Şekil 4). Önemlisi, biz (tavşan Anti-NRDP1 ve fare Anti-USP8, sırasıyla) PLA için kullanılan primer antikorlar ile çapraz reaktivite önlemek için keçi PDX1 Anti-sera kullanılır. Böylece, PDX1 counterstaining ilavesi primer insan Beta hücreleri içinde endojen mitofajy kompleksleri belirli değerlendirilmesi için izin verir.
Bu yaklaşımlardan yararlanarak, NRDP1: USP8 mitophagy kompleksi, Beta hücrelerinde mitophagy yolunun yetkinliğini elde etmek için bir anlık görüntüsünü derleyebilirsiniz. Bu tür 2 diyabet14taklit çevresel koşullar içinde kullanım için bu yaklaşımı genişletmek için, biz glucolipotoxicity ikna etmek için palmitat ve yüksek glikoz ile beta hücre hatları ve birincil insan adacıklar tedavi. Nitekim, biz NRDP1 ve USP8 etkileşimi, hem beta hücre hatları yanı sıra primer insan beta hücrelerinin PLA (Şekil 5 ve referans1) tarafından palmitat ve yüksek glikoz bir 48 h pozlama aşağıdaki azaldı bulundu. Bu sonuç, diyabetojenik uyaranlara aşağıdaki anahtar endojen mitophagy faktörleri değerlendirmek için bu testin fizibilitesi vurgular.
Şekil 1: PLA etkileşimlerini ölçmek Için görüntü J analizinin Iş akışı. Analiz önemli adımlar burada vurgulanır. (A) belirli PLA sinyal analizini sağlamak için görüntü eşiğinin ayarlanması. (B) kolay quantification izin vermek için ikili veri görüntü dönüştürme. (C-D) Nasıl ımagej yazılım tarafından tanınan parçacıkları analiz ederek Analizi sonuçlandırmak için. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: NRDP1 ve USP8 özellikle pankreas Beta hücrelerinde etkileşime. Yüksek büyütme (100x) fare pankreatik hücre hattı görüntüleri, MIN6, gösterilir. (A-D) NRDP1 için PLA sinyali: USP8 etkileşimi kırmızı olarak gösterilir ve çekirdekler mavi DAPı tarafından belirlendi. (A-C) NRDP1 için özel bir deliner sinyal yok: USP8 etkileşimi her iki (A) ya da bir (B, C) PRIMER protein antikorlarının PLA sürecinde atlanırsa görülür. Her iki antikorların dahil ancak, pankreas Beta hücrelerinde (D) her iki proteinlerin etkileşimi PLA tarafından görülebilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: NRDP1 ve USP8 özellikle nöroblastom hücrelerinde etkileşim. İnsan Nöroblastom hücre hattının yüksek büyütme (100x) görüntüleri, SH-SY5Y, gösterilir. (A-D) NRDP1 için PLA sinyali: USP8 etkileşimi kırmızı olarak gösterilir ve çekirdekler mavi DAPı tarafından belirlendi. (A-C) NRDP1 için özel bir deliner sinyal yok: USP8 etkileşimi her iki (A) ya da bir (B, C) PRIMER protein antikorlarının PLA sürecinde atlanırsa görülür. Ancak her iki antikor da dahil olmak üzere her iki proteinin de etkileşimi PLA (D) tarafından görülebilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: beta hücre mitophagy kompleksleri PLA tarafından situ içinde Primer insan pankreatik adacıklar tespit edilebilir. Dağınık insan izletlerinin yüksek büyütme (100x) görüntüleri gösterilir. Tek hücreler DAPI (mavi) ile nükleer boyama ile tarif, Beta hücreleri PDX1 boyama (macenta) ile gözlenen ve mitophagy kompleksleri hem Beta hücreleri ve non-beta hücrelerinde görülebilir (kırmızı). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: NRDP1: USP8 mitophagy kompleksi, Beta hücrelerinde glucolipotoxicity tarafından istikrarsızlaştırılmış.
MIN6 hücrelerin yüksek büyütme (100x) görüntüleri (25 mM glikoz + 0,82% BSA) veya yüksek glikoz + palmitat (25 mm glikoz + 0,4 mM palmitat/0.82% BSA) ile 48 h için tedavi gösterilir. (A-B) PLA (NRDP1: USP8) her iki tedavi grubunda sinyal görülmektedir. PLA sinyali, MIN6 Beta hücrelerinde glukolipotoksisite (B) sonra kontrolleri (A) ile karşılaştırıldığında azalır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Örnek | ANTIBODY 1 (fare Anti-NRDP1) | ANTIBODY 2 (tavşan Anti-USP8) | Antibody 3 (keçi Anti-PDX1) (Opsiyonel counterstain) |
| KONTROL 1: primer antikor (40 islets) yok | - | - | + |
| KONTROL 2: NRDP1 tek başına (40 islets) | + | - | + |
| KONTROL 3: USP8 tek başına (40 islets) | - | + | + |
| Deneysel 1-x: tüm deneysel koşullar (40 adacıklar her) | + | + | + |
Tablo 1: örnek deneysel tasarım kurulumu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada kullanmak için basit ve verimli bir yaklaşım açıklamak NRDP1: USP8 PLA dokularda/ilgi hücreleri upstream mitophagy kompleksleri oluşumunu ölçmek için. Daha önce çeşitli metodolojiler tarafından pankreas Beta hücrelerinde CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy kompleksi oluşumunu teyit, Co-immünoprecipitation deneyler de dahil olmak üzere, hücre-serbest etkileşim çalışmaları, ve in vitro yanı sıra hücre tabanlı mayası, ve nasıl bu kompleks sürücüler mitophagic Flux düzenlendiği gösterilmiştir1,15. Burada rapor ettiğimiz ve tarif ettiğimiz PLA çalışmaları, birincil insan beta hücrelerine son derece uyarlanabilir olan mitophagy yolunun hızlı, nicel ve hücreye özgü görünümüne izin verir. Buna ek olarak, NRDP1: USP8 PLA 'ın SH-SY5Y nöroblastom hücrelerinde beta hücresi biyolojisinin dışında kullanılmak üzere adapte edilebilir, bu tekniğin potansiyel fizibilitesini vurgulayarak da nöronal sistemlerde mitophagy kompleksler izlemek için.
PLA basit bir yaklaşımdır; Ancak, protokol içinde belirli adımlar net ve spesifik sonuçlar sağlamak için son derece önemlidir. Bunlar şunlardır: (1) insan izletleri için dağılma prosedürün sağlanması yeterli hücre lizis önlemek için hafif/zarar görüntüleri optimize etmek, (2) deubiquitinase inhibitörü eklenmesi, PR619, hemen önce fiktasyon ve yıkanma sırasında korumak için PLA tarafından maksimum sinyal gözlem için NRDP1-USP8 kompleksi mayası devlet (ve böylece bağlayıcı), ve (3) mitophagy kompleksleri tarafsız bir değerlendirme sağlamak ve aynı zamanda belirlenmesi için izin ımagej tarafından PLA olayların objektif ölçümü mitophagy değişiklikleri tam ama hala istatistiksel olarak önemli/biyolojik olarak alakalı olmayabilir koşullar.
İnsan Islet çalışmaları içinde tanınmış bir zorluk hem beta hücrelerinin hem de beta olmayan hücrelerin heterojen nüfusu için endişedir. PDX1 karşıt bizim kullanımı Beta hücreleri içinde mitofajit kompleks oluşumunun değerlendirilmesi için izin verir (yanı sıra PDX1 negatif olmayan Beta hücreleri). Bir karşı leke olarak PDX1 kullanan bir potansiyel endişe pankreas Delta hücrelerinde ifadesidir16,17,18, daha fazla daha düşük bir dereceye kadar Beta hücrelerinde, gibi diğer işaretçileri gibi (yani, nkx 6.1) için istihdam edilebilir daha spesifik olarak hedef Beta hücreleri. Sitosenterasyon ve fiktasyon işleminden hemen önce tek hücrelere bozulmamış ıslets dispersiyon yaparak, Ayrıca ilaç tedavileri ve/veya sırasında Islet mikroçevre sadece en az bozulma ile tek hücreli mitophagy çalışmaları gerçekleştirebiliriz glucolipotoxic pozlama. Ancak, Islet dağılımının, ilgili tedavilerden bağımsız olarak hücrelerdeki mitophagik kompleksleri engellemesi olasılığını dışlayamaz.
Daha geleneksel protein-protein etkileşimi çalışmaları insan pankreatik isletlerde istihdam edilebilir iken, Co-immunoprecipitation ve/veya proteomik yaklaşımlar gibi, bu prosedürler genellikle zor kanıtlayabilirim Islet lysate, büyük miktarda gerektirir insan Islet malzeme kıtlık verilen kullanılabilir. Ayrıca, bu geleneksel teknikler sırasında hücre türü-özgüllük endişe daha belirgin hale gelir veya saf beta hücre nüfus sıralamak için akış sitometri yöntemlerinin ek optimizasyon gerektirir19,20, 21,22. Böylece, PLA yaklaşımımız insan Beta hücrelerinde mitophagy yolunun protein-protein etkileşimi çalışmaları için cazip ve pratik bir alternatif sağlar. Özellikle, binlerce bireysel Beta hücrelerinde mitophagy karmaşık oluşumu ölçmek için deneme başına 40 toplam islets/koşul olarak az kullanımı yeteneği, Islet araştırmacılar diğer değerlendirmeler için onların Islet preparatları korumak için yeteneği sağlar aynı donör.
Gibi NRDP1 ve USP8 her yerde ifade edilir, biz bu tekniğin beta hücrelerinin ötesinde hücre türleri mitofajit değerlendirmesi için değer olabilir spekülasyon. Olasılıklar diğer Islet hücre türleri (Alfa hücreleri veya Delta hücreleri için ilgili karşı lekeleri ile) veya ağır mitofajit, nöronlar gibi güveniyor hücre türleri içerir. Bu amaçla bu tekniğin SH-SY5Y Nöroblastom hücrelerine (Şekil 2) veya PDX1-negatif Islet hücrelerine (Şekil 4) aktarılması bizim gözlemimiz, diğer hücre türlerinde mitophagy yolu için Tekniğimizin yardımcı olduğunu önerebilir.
NRDP1: USP8 PLA yaklaşımı kolaylığı ve basitliğine rağmen, bu testin sonuçlarını konbulabilir zorluklar vardır. PLA, çok yakın (40 Nm) protein-protein etkileşimlerini tespit edebilirken, belirli deneysel koşulların NRDP1-USP8 yakınlık korumak olabilir olasılığını dışarı kural etmez etkileşim kesintiye, hangi tarafından cevapsız olacak PLA yaklaşımı. Daha fazla, biz göstermiştir iken NRDP1: USP8 kompleks oluşumu pankreas Beta hücrelerinde kurallı CLEC16A/PARKIN-mitophagy yolu için geçerli bir okuma olduğunu, son çalışmalar mitokondriyal PARKIN-bağımsız mitophagy için roller gözlemledik kalite kontrol23,24. Henüz nasıl NRDP1: USP8 kompleks oluşumu PARKIN bağımsız mitophagy bozulması tarafından değiştirilir bilmiyorum. Böylece, burada Beta hücrelerinde mitophagy tahlil için açıklanan ötesinde tamamlayıcı bir yaklaşım kullanımı tavsiye edilecektir. Son olarak, bu mitophagy kompleks istikrar bileşen proteinlerinin mayası bağlıdır, geniş spektrumlu deubiquitinase inhibitörü PR619 ilavesi örnek hazırlama sırasında mayası korumak için kritik öneme sahiptir. Yine, dolaylı olarak NRDP1-USP8 kompleksi bileşenlerinin mayası bozabilir beta hücrelerinin manipülasyonları NRDP1 analiz ederken dikkate alınmalıdır: USP8 mitophagy kompleks oluşumu için bir okuma olarak.
Mitokondriyal kalite kontrol rolü giderek sadece beta hücre fonksiyonu değil, aynı zamanda diğer son derece metabolik hücre türleri de takdir edilir, mitophagy titiz değerlendirme zorlu ve daha hızlı için isteyen gruplara zaman alıcı kanıtlayabilirim önemli mitophagy bileşenlerinin değerlendirilmesi. Tarif ettiğimiz PLA yaklaşımı, küçük miktarda insan Islet örneklerinde tek hücreli çözünürlüğe sahip mitofajit kompleks oluşumunun nicel analizini sağlayan ve geniş bir şekilde uygulanabilen, nispeten düşük maliyetli, moleküler düzeydeki bir görselleştirme tekniktir. çeşitli hücre türleri, tedaviler veya hastalık koşulları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar JDRF (CDA-2016-189 ve SRA-2018-539), diyabet ve sindirim ve böbrek hastalıkları Ulusal Enstitüsü, Sağlık Ulusal Enstitüleri (R01-DK-108921), Brehm aile ve Anthony aile finansman desteği kabul eder. S.A.S. yılında JDRF kariyer geliştirme Ödülü, Novo Nordisk Vakfı tarafından desteklenen Danimarka diyabet Akademisi tarafından kısmen desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
References
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. (0), (2015).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y.
- Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
- Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
- Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
- Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).
- Silva Xavier, D. a, G,
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).
- Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
- Poitout, V., et al.
- Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
- Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).
