Summary
Denne protokollen skisserer en metode for kvantitativ analyse av mitophagy protein kompleks formasjon spesielt i beta celler fra primære menneskelige Holme prøver. Denne teknikken gir dermed analyse av mitophagy fra begrenset biologisk materiale, som er avgjørende i dyrebare menneskelige bukspyttkjertelen beta celleprøver.
Abstract
Mitophagy er en viktig mitokondrie kvalitetskontroll sti, som er avgjørende for bukspyttkjertel beta celle bioenergi til drivstoff glukose-stimulert insulin utgivelse. Vurdering av mitophagy er utfordrende og krever ofte genetiske journalister eller flere komplementære teknikker som ikke er lett å anvende i vevsprøver, slik som primære, menneskelige bukspyttkjertelen. Her viser vi en robust tilnærming for å visualisere og kvantifisere dannelsen av sentrale endogene mitophagy komplekser i primære menneskelige bukspyttkjertelen holmer. Utnytte den følsomme nærhet ligation analysen teknikk for å oppdage samspillet av mitophagy regulatorer NRDP1 og USP8, er vi i stand til å spesifikt kvantifisere dannelsen av essensielle mitophagy komplekser in situ. Ved sammenkobling denne tilnærmingen til counterstaining for transkripsjon faktor PDX1, kan vi kvantifisere mitophagy komplekser, og faktorer som kan svekke mitophagy, spesielt i beta-celler. Metodikken vi beskriver overvinner behovet for store mengder av cellulære ekstrakter som kreves for andre protein-protein interaksjonsstudier, slik som immunutfelling (IP) eller masse massespektrometri, og er ideell for dyrebare menneskelige Holmen prøver generelt ikke tilgjengelig i tilstrekkelige mengder for disse tilnærmingene. Videre, denne metodikken obviates behovet for flyt sortering teknikker for å rense beta celler fra en heterogen Holme befolkning for nedstrøms protein applikasjoner. Derfor beskriver vi en verdifull protokoll for visualisering av mitophagy som er svært kompatibel for bruk i heterogene og begrensede celle populasjoner.
Introduction
Bukspyttkjertelen beta celler produserer insulin som kreves for å opprettholde normal glukose homeostase, og deres svikt resulterer i utviklingen av alle former for diabetes. Beta celler beholde en robust mitokondrie kapasitet til å generere energien som kreves for å par glukose metabolisme med insulin utgivelse. Nylig har det blitt klart at vedlikehold av funksjonell mitokondrie massen er av avgjørende betydning for optimal beta celle funksjon1,2,3. For å opprettholde funksjonell mitokondrie masse, beta celler stole på kvalitetskontroll mekanismer for å fjerne dysfunksjonelle, skadet eller aldrende mitokondrier4. Vi og andre har tidligere vist at beta celler stole på en spesialisert form for mitokondrie omsetning, kalt mitokondrie autofagi (eller mitophagy), for å opprettholde mitokondrie kvalitetskontroll i både gnager og menneskelige holmer1, 2,5. Beklageligvis, imidlertid, der var nei enkel metoden å merker mitophagy, eller endogenously uttrykt mitophagy komponentene, inne human bukspyttkjertelen beta celler.
Vi har nylig vist at oppstrøms regulering av mitophagy i beta celler er avhengig av dannelsen av et protein kompleks bestående av E3 ligases CLEC16A og NRDP1 og deubiquitinase USP81. NRDP1 og USP8 har blitt vist uavhengig å påvirke mitophagy gjennom handling på nøkkelen mitophagy initiator PARKIN6,7. NRDP1 mål PARKIN for ubiqitinering og degradering å skru av mitophagy6, og USP8 spesielt deubiquitinates K6-sammenkoblet PARKIN å fremme dens translokasjon å mitokondrier7. Nærhet ligation analysen (PLA) teknologi har vært en fersk forhånd innen protein interaksjon biologi8, slik visualisering av endogene protein interaksjoner in situ i enkeltceller, og er ikke begrenset av knappe sample materiale. Denne metodikken er spesielt fristende for menneskelig Holme/beta cellebiologi, på grunn av sparsity av prøven tilgjengelighet, koplet til behovet for å forstå fysiologisk relevante protein komplekser innenfor heterogene celletyper.
Utnytte PLA tilnærming, er vi i stand til å observere sentrale endogene mitophagy komplekser i primære menneskelige bukspyttkjertelen beta celler og neuronal cellelinjer, og demonstrere virkningene av et diabetogenic miljø på mitophagy Pathway1. Oppsummert er det overordnede målet med denne protokollen å analysere spesifikke mitophagy protein komplekser i vev som mangler rikelig materiale, eller hvor konvensjonelle protein-interaksjon studier er ikke mulig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruk av de-identifiserte donor menneskelige bukspyttkjertelen holmer er via en institusjonell gjennomgang Board (IRB) fritak og i samsvar med University of Michigan IRB politikk. Human bukspyttkjertelen holmer ble gitt av NIH/NIDDK-sponset Integrated Islet Distribution program (IIDP).
1. Human Holme prøveforberedelse
-
Dissosiasjon med én celle
- Kultur Human Holmen prøver (4000 – 6000 Holme ekvivalenter/10 mL Media) i minst 1 dag ved 37 ° c i bukspyttkjertelen Holme Media (PIM (S)) Media supplert med 1 mM glutamin (PIM (G)), 100 enheter/mL antimykotisk-antibiotika, 1 mM natrium pyruvat og 10% fosterets storfe serum (FBS) eller humant AB serum.
- Bruk et disseksjon lys mikroskop ved 3x forstørrelse for å telle individuelle menneske holmer fra kultur. Plukk 40 holmer per behandling/tilstand av interesse (for eksempel glucolipotoxicity) til 1,5 mL rør i Holme Media.
- Sentrifuge holmer ved 400 x g for 1 min ved 10 ° c til sediment.
- Vask prøver, ved kort inversjon av rør ved romtemperatur, to ganger med 1 mL fosfat bufret saltvann (PBS) som inneholder 50 μM PR619 (en deubiquitinase inhibitor, for å bevare ubiquitin avhengige protein interaksjoner), med sentrifugering mellom hver vask ved 400 x g for 1 min ved 10 ° c.
- Distansere holmer i enkeltceller med 125 μL av 0,25% Trypsin inneholdende 50 μM PR619 av incubating prewarmed Trypsin (37 ° c) i 3 minutter med Holme pellets. Forsiktig spre holmer i løpet av denne tiden med periodisk milde pipettering ved hjelp av en 200 μL pipette.
- Slukke Trypsin med 1 mL varmet (37 ° c) PIM (S) medier som inneholder 50 μM PR619, deretter sediment celler ved sentrifugering ved 400 x g i 1 min.
- Vask celler ved sentrifugering ved 400 x g i 1 min, to ganger, med PBS + 50 μM PR619.
- Til slutt, resuspend celler i 150 μL PBS inneholder 50 μM PR619.
-
Tilslutning og fiksering av enkeltceller
- Etter blanding, snurr celle løsningen på frostet, ladet, mikroskop lysbilder ved hjelp av en cytocentrifuge på 28 x g i 10 min.
- Etter cytocentrifugation, skissere mobil området med en hydrofobe penn (se tabell over materialer) for å minimere ANTISTOFF/PLA løsnings volumer nødvendig. Fix celler med 4% paraformaldehyde i PBS i 15 min ved romtemperatur.
FORSIKTIG: PFA er farlig og må håndteres med forsiktighet. - For best resultat, Utfør farging/PLA umiddelbart, eller innen 24 timer. Om nødvendig, Oppbevar prøver i PBS ved 4 ° c til farging for ikke lenger enn 48 h.
2. immunhistokjemi
-
Blokkerer
- Vask celler to ganger med 1x PBS i 5 minutter ved romtemperatur.
- Blokk celle løsning, for å eliminere bakgrunns farging, med 10% esel serum i PBS som inneholder 0,3% vaskemiddel (se tabell over materialer) for 1 t ved romtemperatur.
-
Flekker
- Ruge celler med primær mus eller kanin antistoffer mot USP8 (1:250) og NRDP1 (1:250) henholdsvis (se tabell over materialer) fortynnet i fosfat bufret saltvann med VASKEMIDDEL (PBT, se tabell over materialer), ved 4 ° c over natten, for å oppdage mitophagy kompleks signalering via PLA.
- Co-ruge celler med en markør spesifikk for beta celle identifisering som ikke var reist i mus eller kanin, slik som å ikke forstyrre PLA signal. I dette tilfellet ruge celler med anti-geit PDX1 (1:500) i PBT. Ruge alle primære antistoffer over natten ved 4 ° c, ved hjelp av plastfilm på toppen av løsningen for å hindre fordampning.
3. nærhet ligation analysen
- PLA-sonde og counterstain
- Klargjør PLA-sonde-løsningen i henhold til produsentens anvisninger, det vil si at 20 μL av sonde-oppløsning per prøve ved å utarbeide en endelig konsentrasjon av 1:5 løsning av både anti-mus-og anti-Rabbit-sonde i PBT-og incubating i 20 min ved rom Temperatur.
- Etter over natten inkubasjons, vask celler to ganger med 1x PBS for 5 min hver, på en rocker.
- Like før inkubasjons med sonde løsning, tilsett anti-geit Cy5 sekundære ved en endelig konsentrasjon av 1:600 til sonden løsning (for påvisning av endogene PDX1). Tilsett 20 μL sonde løsning på hver celle tilstand, dekk forsiktig med plastfilm og ruge ved 37 ° c for 1 time.
- Ligation
- Vask celler to ganger, ved romtemperatur, med buffer A (se tabell over materialer for oppskriften) for 5 min hver, på en rocker.
- Klargjør ligation løsning (en del av deteksjons reagensene, se tabell over materialer) i henhold til produsentens anvisninger. For dette, fortynne ligation lager (5x) 1:5 i dietyl pyrocarbonate (DEPC)-behandlet vann. Umiddelbart før inkubasjons tilsett 0,025 U/mL ligase. Tilsett 20 μL ligation-løsning på cellene. Dekk med plastfilm og ruge ved 37 ° c i 30 min.
- Forsterkning
- Vask celler to ganger ved romtemperatur med buffer A i 2 minutter hver.
- Lag forsterknings løsning (del av deteksjons reagensene, se tabell over materialer) i henhold til produsentens anvisninger. Fortynne forsterkning buffer (5x) 1:5 i DEPC-behandlet vann og holde i mørket til bruk. Tilsett en 1:80 fortynning av polymerase (del av deteksjons reagensene, se tabell over materialer) til løsningen umiddelbart før du legger løsningen til cellene.
- Tilsett 20 μL forsterknings løsning i cellene. Dekk med plastfilm og plasser i mørket ved 37 ° c for mellom 1 t 40 min. til 2 h for maksimal signal.
- Klargjøring for bildebehandling
- Vask celler to ganger med buffer B (se tabell over materialer for oppskriften) for 10 min ved romtemperatur, på en rocker.
- Til slutt, vask celler en gang i 0,01 x buffer B, for 2 min ved romtemperatur på en rocker.
- Montere prøver ved å legge en dråpe montering medier som inneholder 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og nøye plassere en dekkglass over prøvene ved hjelp av en skalpell blad til å trykke ut eventuelle bobler dannet. Seal coverslips bruker klar neglelakk rundt kantene.
- Bilde prøver på et mikroskop som kan fange flere fokal fly, for eksempel en laserskanning konfokalmikroskopi mikroskop, eller et invertert fluorescens mikroskop med deconvolution evner, tar minst 9 forskjellige fokalplanet bilder.
- Ta bilder med 100-forstørrelse, med omtrent 0,45 mm z-stabelhøyde. Capture PLA ved 550 NM eksitasjon, 570 NM utslipp; Counter-stain på 650 NM eksitasjon, 670 NM utslipp; og DAPI ved 405 NM eksitasjon, 450 nm utslipp.
- For å sikre fluorescens bilde bakgrunns signaler og spredt lys minimeres for nedstrøms analyse av PLA hendelser (spesielt på widefield mikroskop), Prosessbilder utnytte en todimensjonal deconvolution (nærmeste nabo) algoritme gjennom en standard bildebehandling programvare av valget.
Merk: for Olympus bruk CellSens, Nikon bruker NIS-elementer, Leica bruke LAS X, Zeiss-ZEN, programmet, MATLAB, Huygens Software, samt flere plugins tilgjengelig via image-J. For analyse bør det totale antallet interaksjoner over alle z-stakker analyseres ved hjelp av image-J-programvare, slik at bare PDX-1-positive celler analyseres (avsnitt 3,5).
- Kvantifisering av PLA interaksjoner
- Åpne Gratis image-J programmet, og åpne PLA bildet. Start fra den første skarpt i fokus PLA bilde.
- Klikk kategorien bilde , og velg Juster, deretter terskel (figur 1a). Juster terskelen for å fjerne alle ikke-spesifikke PLA-signal, noter terskel justeringen og prøv å holde den konsekvent gjennom hele analysen.
- Klikk kategorien prosess , og velg binær, og gjør deretter binær (figur 1B). Bruk det binære bildet til å måle partikler, ved å klikke på "analyser"-fanen og trykke analyser partikler (figur 1C).
- For analyse må du kontrollere at innstillingene er som følger: size = 0 – Infinity, sirkularitet = 0 – 1.0, Vis = disposisjoner, avmerkingsbokser for visningsresultaterog klare resultater (figur 1d). Klikk på OK. Legg merke til hvor mange partikler som er analysert i et regneark som viser prøve, og z-stack-posisjon.
- Gjenta trinn 3.5.2 – 3.5.4 til alle in-Focus z-stabler for prøven har blitt analysert. Sum totalt antall partikler for prøven i regnearket for å kvantifisere det totale antallet interaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi gjennomførte innledende eksperimenter i MIN6 bukspyttkjertelen beta cellelinje og SH-SY5Y neuroblastom cellelinje SH-SY5Y, for å optimalisere og bekrefte både spesifisitet av antistoffer og visualisere protein interaksjoner. MIN6 celler ble belagt på coverslips på 30 000 celler/mL og venstre for å overholde 48 h, SH-SY5Y celler ble belagt på coverslips på 15 000 celler/mL og venstre for å overholde 24 h. PLA-protokollen ble deretter fulgt som ovenfor, og begynte ved Step 1.2.3. For å sikre spesifisitet av PLA-signaler, utførte vi først denne tilnærmingen i nærvær av (i) ikke noe primært antistoff (figur 2a, figur 3a), (II) NRDP1 antistoff alene (figur 2b, figur 3b), (III) USP8 antistoff alene ( Figur 2C, figur 3c) og (IV) både NRDP1-og USP8-antistoffer (figur 2D, figur 3D). For å forenkle prøve oppsettet angir tabell 1 hvordan eksperimentelle kontroller skal settes opp på riktig måte. Spesielt observerer vi ingen punktat PLA-signal i enkelt primær antistoff eller ingen primære antistoff kontroll forhold, og dermed bekrefter at in situ interaksjoner er spesielt observert mellom NRDP1 og USP8 i nærvær av både primære antistoffer, i både MIN6 og SH-SY5Y celler.
Vi neste tilpasset denne tilnærmingen for bruk med menneskelige holmer til å analysere mitophagy komplekse interaksjoner spesielt innenfor primære menneskelige beta celler. Menneskelige holmer består av en heterogene populasjon av funksjonelt distinkte celler, inkludert Alpha, beta, delta, og PP-Cells9. I motsetning til mus holmer hvor beta celler utgjør ~ 80% av Holmen massen, utgjør beta celler et proporsjonalt mindre område innenfor menneskelige holmer (mellom 28-75%)10,11,12. Derfor forsøkte vi å bruke PLA teknologi for å tillate oss å observere tilstedeværelsen av NRDP1-USP8 mitophagy komplekser spesielt innenfor beta celler og sikre at vi ikke observerer forvirrende observasjoner fra andre Holme celletyper (som kan oppstå fra co-immunutfelling studier av Holmen lysater). Dermed er det viktig å sikre tilstrekkelig og ensartet Holme dispersjon til et slikt nivå at enkeltceller kan lett diskriminert og videre analysert. Som sett i Figur 4er sprednings protokollen (del 1) svært effektiv for å sikre enkeltceller i mikroskop synsfeltet for nedstrøms analyse. For å identifisere beta celler, utførte vi co-farging med PDX1 spesifikke anti-Sera under PLA prosessen. PDX1 er en viktig beta celle spesifikke transkripsjon faktor, som finnes i modne insulin-produserende beta celler primært innenfor kjernen13. PDX1 farging ble beholdt etter NRDP1: USP8 PLA i primær menneskelige holmer (Figur 4). Viktigere, brukte vi geit PDX1 anti-Sera å unngå kryss-reaktivitet med primære antistoffer som brukes for PLA (kanin anti-NRDP1 og mus anti-USP8, henholdsvis). Således, tillegg av PDX1 counterstaining gir den spesifikke vurderingen av endogene mitophagy komplekser innenfor primære menneskelige beta celler.
Utnytte disse tilnærmingene, kan vi kompilere et øyeblikksbilde av oppbevaring av NRDP1: USP8 mitophagy komplekse å antyde kompetanse på mitophagy veien innen beta-celler. For å utvide denne tilnærmingen for bruk innenfor miljøforhold emulere de av type 2 diabetes14, behandlet vi beta cellelinjer og primære menneskelige holmer med askorbylpalmitat og høy glukose for å indusere glucolipotoxicity. Faktisk fant vi at samspillet mellom NRDP1 og USP8 ble redusert etter en 48 h eksponering for askorbylpalmitat og høy glukose i både beta cellelinjer så vel som primære menneskelige beta celler av PLA (figur 5 og referanse1). Dette resultatet fremhever muligheten for denne analysen å vurdere nøkkelen endogene mitophagy faktorer etter diabetogenic stimuli.
Figur 1: arbeidsflyt for image J-analyse for kvantifisering av PLA-interaksjoner. De viktigste trinnene i analysen er uthevet her. (A) justering av bilde terskelen for å sikre spesifikk PLA signal analyse. (B) konvertering av bilde til binære data for å tillate enkel kvantifisering. (C-D) Hvordan fullføre analysen ved å analysere partiklene gjenkjent av ImageJ programvare. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: NRDP1 og USP8 spesielt samhandle i bukspyttkjertelen beta celler. Høy forstørrelse (100-) bilder av musen bukspyttkjertelen cellelinje, MIN6, vises. (A-D) PLA signal for NRDP1: USP8 interaksjon er vist i rødt, og kjerner er avgrenset av DAPI i blått. (A-C) Ingen spesifikke punktat signal for NRDP1: USP8 interaksjon er sett hvis begge (A) eller enten en (B, C) av de primære PROTEIN antistoffer utelates under PLA prosessen. Samspillet mellom begge proteinene er imidlertid synlig av PLA i beta cellene i bukspyttkjertelen (D) når begge Antistoffene er inkludert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: NRDP1 og USP8 spesielt samhandle i neuroblastom celler. Høy forstørrelse (100-) bilder av den menneskelige neuroblastom cellelinje, SH-SY5Y, vises. (A-D) PLA signal for NRDP1: USP8 interaksjon er vist i rødt, og kjerner er avgrenset av DAPI i blått. (A-C) Ingen spesifikke punktat signal for NRDP1: USP8 interaksjon er sett hvis begge (A) eller enten en (B, C) av de primære PROTEIN antistoffer utelates under PLA prosessen. Samspillet mellom begge proteinene er imidlertid synlig av PLA (D) når begge Antistoffene er inkludert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: beta celle mitophagy komplekser kan identifiseres i primære menneskelige bukspyttkjertelen holmer in situ av PLA. Høy forstørrelse (100-) bilder av spredte menneskelige holmer vises. Enkeltceller er avgrenset av kjernefysisk farging med DAPI (blå), beta celler er observert med PDX1 farging (magenta), og mitophagy komplekser kan sees i både beta-celler og ikke-beta-celler (rød). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: den NRDP1: USP8 mitophagy komplekset er destabilisert i beta celler ved glucolipotoxicity.
Høy forstørrelse (100-) bilder av MIN6-celler behandlet for 48 h med enten kontroll (25 mM glukose + 0,82% BSA) eller høy glukose + askorbylpalmitat (25 mM glukose + 0,4 mM askorbylpalmitat/0.82% BSA) vises. (A-B) PLA (NRDP1: USP8) signal er sett i begge behandlingsgruppene. PLA signal nedgang i MIN6 beta celler etter glucolipotoxicity (B) sammenlignet med kontroller (A). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Eksempel | ANTISTOFF 1 (mus anti-NRDP1) | ANTISTOFF 2 (kanin anti-USP8) | Antistoff 3 (geit anti-PDX1) (Valgfri counterstain) |
| KONTROLL 1: ingen primær antistoff (40 holmer) | - | - | + |
| KONTROLL 2: NRDP1 alene (40 holmer) | + | - | + |
| KONTROLL 3: USP8 alene (40 holmer) | - | + | + |
| EKSPERIMENTELL 1-x: alle eksperimentelle forhold (40 holmer) | + | + | + |
Tabell 1: eksempel på eksperimentell design oppsett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en enkel og effektiv tilnærming til bruk NRDP1: USP8 PLA i vev/celler av interesse å kvantifisere dannelsen av oppstrøms mitophagy komplekser. Vi har tidligere bekreftet dannelsen av CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy kompleks i bukspyttkjertelen beta celler av flere metoder, inkludert co-immunutfelling eksperimenter, celle-frie interaksjonsstudier, og in vitro samt celle-baserte ubiqitinering analyser, og demonstrerte hvordan dette komplekse stasjoner regulert mitophagic Flux1,15. Den PLA studier vi rapportere og beskrive her gir en rask, kvantitativ, og celle-spesifikk visning av mitophagy veien som er svært tilpasningsdyktig til primære menneskelige beta celler. I tillegg har vi vist at NRDP1: USP8 PLA kan tilpasses for bruk utenfor beta cellebiologi i SH-SY5Y neuroblastom celler, fremhever den potensielle gjennomførbarhet av denne teknikken til å overvåke mitophagy komplekser i neuronal systemer også.
PLA er en grei tilnærming; enkelte trinn i protokollen er imidlertid av største betydning for å sikre klare og konkrete resultater. Disse inkluderer: (1) å sikre at sprednings prosedyren for menneskelige holmer er mild nok til å forhindre cellelyse/skader for å optimalisere bilder, (2) tilsetning av deubiquitinase inhibitor, PR619, umiddelbart før fiksering og under vask for å bevare ubiqitinering stat (og dermed bindende) for NRDP1-USP8-komplekset for maksimal signal observasjon fra PLA, og (3) den objektive kvantifisering av PLA-hendelser fra ImageJ for å sikre en objektiv vurdering av mitophagy komplekser og også muliggjøre fastsettelse av forhold der endringene på mitophagy kanskje ikke er fullstendig, men likevel statistisk signifikant/biologisk relevant.
En velkjent utfordring innen menneskelig Holme studier er bekymringen for den heterogene befolkningen i både beta-celler og ikke-beta-celler. Vår bruk av PDX1-counterstain muliggjør vurdering av mitophagy kompleks dannelse i beta celler (samt PDX1 negative ikke-beta celler). En potensiell bekymring utnytte PDX1 som counterstain er dens uttrykk i bukspyttkjertelen delta celler16,17,18, om enn til en langt lavere grad enn i beta-celler, som sådan andre markører (dvs. nkx 6.1) kan være ansatt for å målrette beta-cellene mer spesifikt. Ved å spre intakte holmer til enkeltceller umiddelbart før cytocentrifugation og fiksering, er vi også i stand til å utføre enkelt celle mitophagy studier med bare minimale avbrudd av Holmen mikromiljøet i løpet av narkotika behandlinger og/eller glucolipotoxic eksponering. Vi kan imidlertid ikke utelukke muligheten for at Holme dispersjon kan forstyrre mitophagic komplekser i cellene uavhengig av relevante behandlinger.
Mens mer tradisjonelle protein-protein interaksjon studier kan være ansatt i menneskelige bukspyttkjertelen holmer, slik som co-immunutfelling og/eller Proteomikk tilnærminger, disse prosedyrene generelt krever en stor mengde Holme lysat, som kan være utfordrende gitt knapphet på menneskelig Holme materiale tilgjengelig. I tillegg blir bekymringen av Cell type-spesifisitet i løpet av disse tradisjonelle teknikkene mer åpenbar eller krever ekstra optimalisering av Flow flowcytometri metoder for å sortere ren beta celle populasjoner19,20, 21,22. Dermed vår PLA tilnærming gir et attraktivt og praktisk alternativ for protein-protein interaksjon studier av mitophagy veien i menneskets beta celler. Spesielt, muligheten til å bruke så få som 40 totalt holmer/condition per eksperiment for å kvantifisere mitophagy kompleks formasjon i tusenvis av individuelle beta-celler tillater Holme forskere muligheten til å bevare sin Holme forberedelser til andre vurderinger fra samme donor.
Som NRDP1 og USP8 er overalt uttrykt, spekulere vi denne teknikken kan ha verdi for vurdering av mitophagy i celletyper utover beta celler. Mulighetene inkluderer andre Holme celletyper (med relevant counterstains for alfa celler eller delta celler) eller celletyper som tungt stole på mitophagy, som neurons. For dette formål, vår observasjon av overførbarhet av denne teknikken til SH-SY5Y neuroblastom celler (figur 2) eller PDX1-negative Holmen celler (Figur 4) kan foreslå nytten av vår teknikk for mitophagy veien i andre celletyper.
Til tross for letthet og enkelhet av NRDP1: USP8 PLA tilnærming, er det utfordringer som kan forvirre resultatene av denne analysen. Mens PLA er i stand til å konstatere protein-protein interaksjoner i umiddelbar nærhet (40 nm), betyr det ikke utelukke muligheten for at visse eksperimentelle forhold kunne opprettholde NRDP1-USP8 nærhet mens forstyrre samspillet, som ville bli savnet av PLA tilnærming. Videre, mens vi har vist at NRDP1: USP8 kompleks formasjon er en gyldig avlesning for den kanoniske CLEC16A/PARKIN-mitophagy veien i bukspyttkjertelen beta celler, nyere studier har observert roller for PARKIN-uavhengige mitophagy i mitokondrie kvalitetskontroll23,24. Vi vet ennå ikke hvordan NRDP1: USP8 kompleks formasjon er modifisert av forstyrrelsen av PARKIN-Independent mitophagy. Således, bruk av en komplementær tilnærming utover de som er beskrevet her for å analysen mitophagy i beta-celler vil være tilrådelig. Til slutt, stabiliteten i dette mitophagy komplekset er avhengig av ubiqitinering av komponenten proteiner, slik at tilsetning av et bredt spekter deubiquitinase inhibitor PR619 er avgjørende for å opprettholde ubiqitinering under prøven forberedelse. Igjen, manipulasjoner av beta celler som kan indirekte forstyrre ubiqitinering av komponenter i NRDP1-USP8 komplekse må vurderes når analysere NRDP1: USP8 som en avlesning for mitophagy kompleks formasjon.
Som rollen til mitokondrie kvalitetskontroll blir stadig mer verdsatt i ikke bare beta celle funksjon, men også andre svært metabolske celletyper, kan den strenge vurderingen av mitophagy vise seg utfordrende og tidkrevende for grupper som ønsker for en raskere vurdering av viktige mitophagy komponenter. Den PLA tilnærmingen vi beskriver er en relativt lav pris, molekylær-nivå visualisering teknikk som kan gi kvantitativ analyse av mitophagy kompleks formasjon med én celle oppløsning i liten mengde menneskelige Holme prøver og kan grovt anvendes til en rekke celletyper, behandlinger, eller sykdomstilstander.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner finansiering støtte fra JDRF (CDA-2016-189 og SRA-2018-539), National Institute of diabetes og fordøyelses-og nyre sykdommer, National Institutes of Health (R01-DK-108921), den Brehm familien, og Anthony familien. JDRF karriere utviklings pris til S.A.S. støttes delvis av det danske diabetes akademiet, som støttes av Novo nordisk Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
References
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. (0), (2015).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y.
- Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
- Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
- Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
- Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).
- Silva Xavier, D. a, G,
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).
- Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
- Poitout, V., et al.
- Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
- Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).
