Summary
このプロトコルは、一次ヒト化物試料からベータ細胞に特異的にミトファジータンパク質複合体形成の定量分析のための方法を概説する。この技術により、貴重なヒト膵臓ベータ細胞サンプルにおいて重要な限られた生物材料からのミトファジーの分析が可能になります。
Abstract
ミトファジーは、膵島のβ細胞バイオエネルギッシュがグルコース刺激インスリン放出を燃料にする上で重要なミトコンドリア品質管理経路である。ミトファジーの評価は困難であり、多くの場合、一次ヒト膵島などの組織サンプルでは容易に利用できない遺伝的レポーターまたは複数の相補的な技術を必要とする。ここでは、一次ヒト膵島における主要な内因性ミトファジー複合体の形成を可視化し、定量化するための堅牢なアプローチを示す。ミトファジーレギュレータNRDP1とUSP8の相互作用を検出する敏感な近接ライゲーションアッセイ技術を利用して、その中で不可欠なミトファジー複合体の形成を具体的に定量することができる。転写因子PDX1のアンチステインに対するこのアプローチを結合することにより、ミトファジー複合体と、特にベータ細胞内でミトファジーを損なう可能性のある因子を定量化することができます。我々が説明する方法論は、免疫沈殿(IP)または質量分析のような他のタンパク質相互作用研究に必要な大量の細胞抽出物の必要性を克服し、一般的に貴重なヒトのイストリーサンプルにとって理想的ではないこれらのアプローチのために十分な量で利用できる。さらに、この方法論は、下流タンパク質アプリケーションのための不均一なイストリール集団からベータ細胞を精製するためのフローソート技術の必要性を妨げる。したがって、異種および限られた細胞集団での使用に対して高い互換性を持つミトファジーの可視化のための貴重なプロトコルを説明する。
Introduction
膵臓ベータ細胞は、正常なグルコース恒常性を維持するために必要なインスリンを産生し、その失敗は糖尿病のすべての形態の発症をもたらす。ベータ細胞は、グルコース代謝とインスリン放出を結合するために必要なエネルギーを生成するために堅牢なミトコンドリア容量を保持します。近年,ミトコンドリア質量の維持が最適なβ細胞機能1,2,3にとって極めて重要であることが明らかになった。機能的なミトコンドリア質量を維持するために、ベータ細胞は、機能不全、損傷、または老化ミトコンドリア4を除去するために品質管理メカニズムに依存しています。私たちや他の人は、ベータ細胞がげっ歯類とヒトの島の両方でミトコンドリア品質管理を維持するために、ミトコンドリアオートファジー(またはミトファジー)と呼ばれるミトコンドリアターンオーバーの特殊な形態に依存していることを以前に実証しました。2,5.しかし、残念ながら、ヒト膵臓ベータ細胞では、ミトファジー、または内因性発現ミトファジー成分を検出する簡単な方法はありませんでした。
我々は最近、ベータ細胞におけるミトファジーの上流調節が、E3リガスCLEC16AおよびNRDP1およびデュビキチナーゼUSP81を含むタンパク質複合体の形成に依存することを示した。NRDP1およびUSP8は、主要なミトファジーイニシエーターPARKIN6,7に対する作用を通じてミトファジーに影響を与えるために独立して示されている。NRDP1は、ミトファジー6をオフに切り替えるためにユビキチン化と劣化のためのPARKINをターゲットとし、USP8は特にミトコンドリア7への転座を促進するためにK6リンクされたPARKINをデュビキチンテートします。近接ライゲーションアッセイ(PLA)技術は、タンパク質相互作用生物学8の分野における最近の進歩であり、単一細胞における内因性タンパク質相互作用の可視化を可能にし、かつ希少なサンプル材料によって制限されない。この方法論は、特にヒトの膵物/β細胞生物学にとって魅力的であり、サンプルの入手可能性が非常に小さいため、異種細胞型内の生理学的に関連するタンパク質複合体を理解する必要性と相まって、
PLAアプローチを用いて、原発性ヒト膵臓ベータ細胞および神経細胞株における主要な内因性ミトファジー複合体を観察し、ミトファジー経路1に対する糖尿病性環境の影響を実証することができる。要約すると、このプロトコルの包括的な目標は、豊富な材料を欠いている組織における特定のミトファジータンパク質複合体を分析すること、または従来のタンパク質相互作用研究が不可能な場合です。
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Protocol
非同定ドナーヒト膵島の使用は、機関審査委員会(IRB)の免除を介して、ミシガン大学IRBポリシーに準拠しています。ヒト膵島は、NIH/NIDDK主催の統合島分布プログラム(IIDP)によって提供された。
1. ヒトのイレットサンプル調製
-
単一細胞解離
- 培養ヒト島試料(4000~6000個相当/10mL培地)膵島培地(PIM(S))で少なくとも1日、1mMグルタミン(PIM(G))、100単位/mL抗mycocoチック系抗生物質、1mMmM膜ピルビン酸、10%のヒトピクルビン酸菌を含む培養物である。血清(FBS)またはヒトAB血清。
- 3倍の倍率で解剖光顕微鏡を使用して、個々のヒトの島を培養から数えます。対象の治療/状態(グルコリポ毒性など)ごとに40の島を、島媒体の1.5 mLチューブに選びます。
- 遠心分離島は400 x gで、10°Cで1分間堆積物にする。
- 洗浄サンプルは、室温でチューブの短い反転によって、50 μM PR619(デュビキチナーゼ阻害剤;ユビキチン依存性タンパク質相互作用を維持するために)を含む1mLリン酸緩衝生理食べ物(PBS)を2回、各洗浄の間の遠心分離を400で行う。10°Cで1分間x g。
- 50 μM PR619を含む125μLの125μLを有する単一細胞に解離し、3分間、予備温めたトリプシン(37°C)をインキュベートして、島ペレットで分けた。この期間中に島を200 μLピペットを使用して定期的に穏やかなピペットで穏やかに分散させます。
- 50 μM PR619を含む1mL(37°C)PIM(S)培温でトリプシンをクエンチし、次いで1分間400xgで遠心分離して堆積細胞を入れ子にする。
- 遠心分離で細胞を1分間、2回、PBS + 50 μM PR619で洗浄します。
- 最後に、50 μM PR619を含む150 μL PBSで細胞を再中断する。
-
単一細胞の付着と固定
- 再懸濁後、細胞溶液をフロスト、帯電、顕微鏡スライドに回し、28 x gのサイトセントリファッジを10分間使用します。
- サイトセントリファゲーションに続いて、必要な抗体/PLA溶液量を最小限に抑えるために、疎水性ペン(材料の表を参照)で細胞領域の概要を説明します。室温で15分間PBSに4%パラホルムアルデヒドを含む細胞を固定します。
注意:PFAは危険であり、注意して取り扱う必要があります。 - 最良の結果を得るには、直ちに、または24時間以内に染色/PLAを行います。必要に応じて、48時間を超える染色までPBSでサンプルを4°Cで保存してください。
2. 免疫組織化学
-
ブロック
- 室温で5分間1x PBSで細胞を2回洗います。
- ブロック細胞溶液は、バックグラウンド染色を排除し、0.3%の洗剤を含むPBS中の10%ロバ血清(材料の表を参照)を室温で1時間使用する。
-
染色
- USP8(1:250)およびNRDP1(1:250)に対する一次マウスまたはウサギ抗体を用いて細胞をインキュベート(材料の表を参照)、リン酸緩衝生理食液で希釈(PBT、材料の表を参照)、一晩で4°Cで、PLAを介してミトファジー複合シグナリングを検出します。
- PLA信号を妨げないように、マウスまたはウサギで発生しなかったβ細胞同定に特異的なマーカーを用いて細胞を共インキュベートする。この場合、PBTで抗ヤギPDX1(1:500)で細胞をインキュベートする。すべての一次抗体を4°Cで一晩インキュベートし、溶液の上にプラスチックフィルムを使用して蒸発を防ぎます。
3. 近接ライゲーションアッセイ
- PLAプローブとカウンターステイン
- 製造業者の指示に従ってPLAプローブ溶液を準備し、すなわち、PBTで抗マウスおよび抗ウサギプローブ溶液の最終濃度1:5溶液を調製し、部屋で20分間インキュベートすることにより、サンプルあたり20μLのプローブ溶液を作る温度。
- 一晩インキュベーションした後、ロッカー上でそれぞれ5分間1x PBSで細胞を2回洗浄する。
- プローブ溶液を用いたインキュベーションの直前に、プローブ溶液に最終濃度1:600で抗ヤギCy5二次を加加える(内因性PDX1の検出用)。各細胞条件に20 μLプローブ溶液を加え、プラスチックフィルムで穏やかに覆い、37°Cで1時間インキュベートします。
- 結紮
- 室温で細胞を2回洗い、バッファーA(レシピの材料表を参照)をロッカー上でそれぞれ5分間洗います。
- ライゲーション溶液(検出試薬の一部、材料の表を参照)をメーカーの指示に従って準備します。このため、ジエチルパイロカーボネート(DEPC)処理水中の希釈ライゲーションストック(5x)1:5。インキュベーション直前に0.025 U/mLリゲスを追加します。細胞に20 μLライゲーション溶液を添加します。プラスチックフィルムで覆い、37°Cで30分間インキュベートします。
- 増幅
- 室温で細胞を2回バッファーAで2分間洗う。
- 製造元の指示に従って増幅液(検出試薬の一部、材料の表を参照)を作成します。DEPC処理水中の希釈増幅バッファー(5x)1:5を使用するまで暗く保管します。ポリメラーゼの1:80希釈(検出試薬の一部、材料の表を参照)を細胞に溶液を追加する直前に溶液に追加します。
- 細胞に20 μLの増幅液を加えます。プラスチックフィルムで覆い、最大信号のために1時間40分から2時間の間に37 °Cで暗闇の中に置きます。
- イメージングの準備
- ロッカーで室温で10分間、バッファーB(レシピの材料表を参照)で細胞を2回洗います。
- 最後に、0.01xバッファBに1回、ロッカーの室温で2分間細胞を洗浄します。
- 4',6-diamidino-2-フェニリンドール(DAPI)を含む取り付けメディアのドロップを追加し、メスブレードを使用してサンプルの上に慎重にカバースリップを配置して、形成された気泡を押し出すことによってサンプルをマウントします。シールは、エッジの周りに明確なマニキュアを使用してスリップをカバーします。
- レーザー走査共焦点顕微鏡や逆畳み込み機能を備えた反転蛍光顕微鏡など、複数の焦点面を捕捉できる顕微鏡上の画像サンプルは、少なくとも9種類の焦点面画像を撮影します。
- 約0.45mm zスタック高さで、100倍の倍率で画像をキャプチャします。550 nm励起、570 nm放出でPLAをキャプチャします。650 nm励起、670 nm放出でのカウンターステイン;405 nm励起、450 nm放出でDAPI。
- PLA事象(特に広視野顕微鏡)の下流解析のために蛍光画像の背景信号と迷光を最小限に抑えるために、2次元の破壊(最も近い隣人)アルゴリズムを使用して画像を処理します。選択の標準的なイメージ処理ソフトウェア。
注:オリンパスはCellSensを使用し、ニコンはNIS-エレメントを使用し、ライカはLAS X、ツァイスを使用します – ZEN、メタモルフ、MATLAB、ホイヘンスソフトウェアだけでなく、Image-Jを介して利用可能ないくつかのプラグイン。解析では、すべてのZスタック上の相互作用の総数をImage-Jソフトウェアを使用して分析し、Pdx-1陽性細胞のみが分析されるようにする必要があります(セクション3.5)。
- PLA相互作用の定量化
- 無料の Image-J ソフトウェア アプリケーションを開き、PLA イメージを開きます。最初のシャープに焦点を合わせ始める PLA イメージから開始します。
- [画像]タブをクリックし、[調整] を選択し、しきい値を選択します (図 1A)。 しきい値を調整して、すべての非特異的 PLA 信号を削除し、しきい値の調整をメモし、分析中に一貫性を保つようにします。
- プロセスタブをクリックし、バイナリを選択し、バイナリを作成します (図 1B)。バイナリ画像を使用して、[分析]タブをクリックし、パーティクルの分析を押し続けることで、パーティクルを測定します (図 1C)。
- 解析では、設定が次のようになります:サイズ= 0 - 無限大、円形= 0 ~1.0、[アウトラインの表示]、[結果の表示] チェック ボックス、および[結果のクリア] (図 1D)を確認します。[OK]をクリックします。サンプルを示すスプレッドシートで分析されたパーティクルの数と Z スタックの位置をメモします。
- サンプルのすべてのインフォーカス Z スタックが分析されるまで、手順 3.5.2 ~ 3.5.4 を繰り返します。スプレッドシート内のサンプルのパーティクルの合計数を合計して、インタラクションの総数を定量化します。
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Representative Results
MIN6膵β細胞株とSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞株SH-SY5Yで初期実験を行い、抗体の特異性と可視化されたタンパク質相互作用の両方を最適化・確認しました。MIN6細胞を30,000細胞/mLでカバースリップにめっきし、48時間、SH-SY5Y細胞を15,000細胞/mLでカバースリップ上にめっきし、24時間付着させた。PLA プロトコルは、ステップ 1.2.3 から始まり、上記のように続きました。PLAシグナルの特異性を確保するために、まず(i)一次抗体なし(図2A、図3A)、(ii)NRDP1抗体単独(図2B、図3B)、(iii)USP8抗体単独(iii)図2C、図3C、および(iv)両方のNRDP1およびUSP8抗体(図2D、図3D)。サンプルのセットアップを容易にするために、表 1は実験コントロールを適切にレイアウトする方法を示しています。特に、単一の一次抗体ではPLAシグナルを穿刺しないか、一次抗体対照条件を全く観察しないため、その場での相互作用において、両方の一次抗体の存在下でNRDP1とUSP8の間で特異的に観察され、MIN6と両方のMIN6とSH-SY5Y細胞。
次に、このアプローチをヒト島と共に用い、特に原発性ヒトベータ細胞内でのミトファジー複合体相互作用を解析した。ヒト島は、アルファ、β、デルタ、およびPP細胞9を含む機能的に異なる細胞の異種集団から構成される。β細胞が島質量の約80%を占めるマウス島とは対照的に、β細胞はヒト島内の比例的に小さい範囲(28〜75%)10、11、12を含む。したがって、PLA技術を使用して、ベータ細胞内に特異的にNRDP1-USP8ミトファギー複合体の存在を観察し、他のイストラクル細胞型からの交絡観察を観察しないことを可能にしました(これは、イレットの共免疫沈殿研究)。したがって、単一細胞を容易に判別し、さらに分析できるレベルに十分かつ均一なアイレット分散を確保することが重要である。図4に示すように、分散プロトコル(セクション1)は、下流分析のための顕微鏡視野の単一細胞を確保する上で非常に効率的です。β細胞を同定するために、PLAプロセス中にPDX1特異的抗血良剤との共染色を行った。PDX1は、主に核13内の成熟インスリン産生ベータ細胞に見出される重要なβ細胞特異的転写因子である。PDX1染色は、一次ヒト島におけるNRDP1:USP8 PLAに続いて保持された(図4)。重要なことに、我々は、PLA(ウサギ抗NRDP1およびマウス抗USP8)に使用される一次抗体との交差反応を避けるためにヤギPDX1抗セラを使用しました。したがって、PDX1カウンターステインの添加は、一次ヒトベータ細胞内の内因性ミトファジー複合体の特異的評価を可能にする。
これらのアプローチを利用して、NRDP1:USP8ミトファギー複合体の保持のスナップショットをコンパイルし、ベータ細胞内のミトファジー経路の能力を推測することができます。2型糖尿病14型をエミュレートする環境条件下での使用に対するこのアプローチを拡大するために、我々は、グルコリポ毒性を誘導するために、パルミテートおよび高グルコースでβ細胞株および原発性ヒト島を処理した。実際、PLAによる一次ヒトβ細胞と同様に、パルミテートおよび高グルコースの両方に対する48時間の曝露後にNRDP1とUSP8の相互作用が減少したことがわかった(図5および参照1)。この結果は、糖尿病性刺激に続く主要な内因性ミトファジー因子を評価するために、このアッセイの実現可能性を強調する。
図1:PLA相互作用の定量化のための画像J解析のワークフロー分析の重要な手順をここで強調表示します。(A) 特定のPLA信号解析を確実にするために、画像しきい値を調整する。(B) 画像をバイナリデータに変換して、簡単に定量化できるようにする。(C-D)ImageJ ソフトウェアで認識されたパーティクルを解析して解析を完成させる方法この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:NRDP1とUSP8は膵臓ベータ細胞で特異的に相互作用する。マウス膵臓細胞株MIN6の高倍率(100倍)画像を示す。(A-D)NRDP1:USP8相互作用のPLA信号は赤で示され、核はDAPIによって青色で描かれています。(A-C)PLAプロセス中に一次タンパク質抗体の両方(A)または1つ(B,C)が省略された場合、NRDP1:USP8相互作用に対する特定の穿刺シグナルは見られない。しかし、両方のタンパク質の相互作用は、両方の抗体が含まれると膵臓ベータ細胞(D)においてPLAによって見える。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:NRDP1とUSP8は神経芽細胞腫細胞で特異的に相互作用する。ヒト神経芽細胞腫細胞株SH-SY5Yの高倍率(100倍)画像が示されている。(A-D)NRDP1:USP8相互作用のPLA信号は赤で示され、核はDAPIによって青色で描かれています。(A-C)PLAプロセス中に一次タンパク質抗体の両方(A)または1つ(B,C)が省略された場合、NRDP1:USP8相互作用に対する特定の穿刺シグナルは見られない。しかし、両方のタンパク質の相互作用は、両方の抗体が含まれている場合、PLA(D)によって見える。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ベータ細胞ミトファジー複合体は、PLAによってその場の一次ヒト膵島で同定することができる。分散したヒト島の高倍率(100倍)画像が示されている。単一細胞はDAPI(青色)による核染色によって線行され、β細胞はPDX1染色(マゼンタ)で観察され、ミトファジー複合体はβ細胞と非β細胞(赤色)の両方で見られます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:NRDP1:USP8ミトファジー複合体は、グルコリポ毒性によりβ細胞において不安定化する。
コントロール(25mMグルコース+0.82%BSA)または高グルコース+パルミテート(25mMグルコース+0.4mMパルミテート/0.82%BSA)のいずれかで48時間処理されたMIN6細胞の高倍率(100倍)画像が示されている。(A-B)PLA(NRDP1:USP8)信号は、両方の治療群で見られる。PLAシグナルは、対照(A)と比較した場合、グルコリポ毒性(B)後のMIN6ベータ細胞において減少する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| サンプル | 抗体1(マウス抗NRDP1) | 抗体2(ウサギ抗USP8) | 抗体3(ヤギ抗PDX1)(オプションのカウンターステイン) |
| コントロール1:一次抗体なし(40島) | - | - | + |
| 制御 2: NRDP1 単独 (40 島) | + | - | + |
| コントロール 3: USP8 単独 (40 島) | - | + | + |
| 実験1-x:すべての実験条件(各40島) | + | + | + |
表 1: 実験設計のサンプル。
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Discussion
ここでは、上流のミトファジー複合体の形成を定量化するために目的の組織/細胞でNRDP1:USP8 PLAを使用するための簡単で効率的なアプローチについて説明する。我々は以前に、共免疫沈殿実験、無細胞相互作用研究、インビトロおよび細胞ベースを含むいくつかの方法論によって、膵臓ベータ細胞におけるCLEC16A-NRDP1-USP8ミトファジー複合体の形成を確認した。ユビキチン化アッセイは、この複合体ドライブがミトファギックフラックス1、15を調節する方法を実証した。ここで報告および説明するPLA研究は、一次ヒトベータ細胞に対して適応性の高いミトファジー経路の迅速、定量的、および細胞特異的な見解を可能にする。さらに、NRDP1:USP8 PLAはSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞のβ細胞生物学以外の使用に適応できることを示し、神経系のミトファギー複合体を監視するこの技術の潜在的な実現可能性を強調した。
PLA は簡単なアプローチです。ただし、プロトコル内の特定の手順は、明確で具体的な結果を確実にするために最も重要です。これには、(1)ヒト島の分散手順が、細胞の残液/損傷を防ぐのに十分に軽度であり、(2)デュエビキチニン酵素阻害剤、PR619の添加、固定直前および洗時の保存PLAによる最大信号観測のためのNRDP1-USP8複合体のユビキチン化状態(したがって結合)、および(3)画像JによるPLA事象の客観的定量化により、ミトファジー複合体の公平な評価を確保し、ミトファジーの変化は完全ではないが、統計的に有意/生物学的に関連する条件である。
ヒトのイストレ研究におけるよく知られた課題は、β細胞と非β細胞の両方の不均一集団に対する懸念である。PDX1カウンターステインの使用により、β細胞内のミトファジー複合体形成(ならびにPDX1陰性非β細胞)の評価が可能です。PDX1をカウンターステインとして利用する潜在的な懸念の1つは、膵デルタ細胞16、17、18におけるその発現であり、ベータ細胞よりもはるかに低い程度であるにも関わらず、そのような他のマーカー(すなわち、NKX6.1)を用いることができる。ターゲットベータ細胞より具体的に。細胞中心分離および固定の直前に無傷の島を単一細胞に分散させることにより、薬物治療および/または薬物治療中の島の微小環境の中断を最小限に抑えながら、単細胞のミトファジー研究を行うこともできる。グルコリポ毒性暴露。しかし、我々は、血化分散が関連する治療とは無関係に細胞内のミトファジー複合体を妨げる可能性を排除することはできません。
より伝統的なタンパク質とタンパク質の相互作用研究は、共免疫沈殿やプロテオミックアプローチなどのヒト膵島で使用することができますが、これらの手順は一般的に大量の島溶解液を必要とし、困難を証明することができます利用可能な人間の化身材料の不足を与えられた。さらに、これらの伝統的な技術の間の細胞型特異性の懸念は、より明らかになるか、純粋なベータ細胞集団をソートするフローサイトメトリー法の追加の最適化を必要とする19,20、 21、22。したがって、我々のPLAアプローチは、ヒトベータ細胞におけるミトファジー経路のタンパク質とタンパク質相互作用研究のための魅力的で実用的な代替手段を提供する。特に、何千もの個々のβ細胞におけるミトファジー複合体の形成を定量化するために実験当たりわずか40個の総島/条件を使用する能力は、島の研究者が他の評価のための島の調製物を保存することを可能にする同じドナー。
NRDP1とUSP8が普遍的に発現しているので、この技術はベータ細胞を超えた細胞型におけるミトファジーの評価に価値があるかもしれないと推測する。可能性としては、他のイストレット細胞タイプ(アルファ細胞またはデルタ細胞に関連するカウンターステインを含む)や、ニューロンなどのミトファジーに大きく依存する細胞タイプが含まれます。このため、この技術をSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞(図2)またはPDX1陰性化物細胞(図4)に転移可能にした我々の観察は、他の細胞型におけるミトファジー経路に対する我々の技術の有用性を示唆する可能性がある。
NRDP1:USP8 PLAアプローチの容易さとシンプルさにもかかわらず、このアッセイの結果を混乱させる可能性のある課題があります。PLAは非常に近接した(40 nm)でタンパク質とタンパク質の相互作用を確認することができるが、特定の実験条件がNRDP1-USP8近接を維持しつつ、相互作用を妨害する可能性を排除しない。PLA アプローチ。さらに、NRDP1:USP8複合体形成が膵臓ベータ細胞における正規CLEC16A/PARKIN-mitophagy経路に対して有効な読み出しであることを実証したが、最近の研究では、ミトコンドリアにおけるPARKIN非依存ミトファジーの役割が観察されている。品質管理23,24.NRDP1:USP8複合体形成がパーキン独立ミトファジーの破壊によってどのように修飾されるのか、まだ分かっていません。したがって、ベータ細胞におけるミトファジーをアッセイするために、ここで説明する以上の相補的アプローチを使用することが望ましいであろう。最後に、このミトファジー複合体の安定性は、成分タンパク質のユビキチン化に依存し、試料調製時にユビキチン化を維持するためには広いスペクトルデュビキチナーゼ阻害剤PR619の添加が重要である。繰り返しますが、NRDP1-USP8複合体の成分のユビキチン化を間接的に妨害する可能性のあるベータ細胞の操作は、ミトファギー複合体形成の読み出しとしてNRDP1:USP8を分析する際に考慮する必要があります。
ミトコンドリアの品質管理の役割は、β細胞機能だけでなく、他の高度代謝細胞タイプにおいてもますます高く評価されるにつれて、ミトファジーの厳格な評価は、より迅速に希望するグループに困難で時間がかかることを証明することができます。重要なミトファジー成分の評価。我々が説明するPLAアプローチは、比較的低コストで分子レベルの可視化技術であり、ミトファギー複合体形成の定量的分析を少量のヒトイレットサンプルで単一細胞分解能で定量的に分析し、広く適用することができる。様々な細胞タイプ、治療法、または疾患状態に。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、JDRF(CDA-2016-189およびSRA-2018-539)、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所、国立衛生研究所(R01-DK-108921)、ブレム家、およびアンソニー家からの資金援助を認めている。S.A.S.へのJDRFキャリア開発賞は、ノボ・ノルディスク財団が支援するデンマーク糖尿病アカデミーの支援を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
References
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