Summary
Detta protokoll beskriver en metod för kvantitativ analys av mitophagy proteinkomplex formation specifikt i betaceller från primära Human Holmen prover. Denna teknik möjliggör därför analys av mitophagy från begränsat biologiskt material, som är avgörande i värdefulla mänskliga bukspottskörteln beta cell prover.
Abstract
Mitophagy är en viktig mitokondriell kvalitetskontroll väg, vilket är avgörande för bukspottskörteln holme beta cell blockeringar till bränsle glukos-stimulerad insulinfrisättning. Bedömning av mitophagy är utmanande och kräver ofta genetiska reportrar eller flera kompletterande tekniker som inte lätt utnyttjas i vävnadsprover, såsom primära mänskliga pankreasöar. Här visar vi en robust metod för att visualisera och kvantifiera bildandet av viktiga endogena mitofagkomplex i primära mänskliga pankreasöar. Utnyttja den känsliga närhet ligering assay teknik för att upptäcka interaktion av mitophagy regulatorer NRDP1 och USP8, vi har möjlighet att specifikt kvantifiera bildandet av viktiga mitophagy komplex in situ. Genom att koppla detta förhållningssätt till motfärgning för transkriptionsfaktorn PDX1 kan vi kvantifiera mitofagkomplex, och de faktorer som kan försämra mitophagy, specifikt inom betaceller. Den metodik vi beskriver övervinner behovet av stora mängder cellulära extrakt som krävs för andra protein-protein interaktionsstudier, såsom immunoprecipitation (IP) eller masspektrometri, och är idealisk för värdefulla mänskliga Holmen prover i allmänhet inte tillgängliga i tillräckliga kvantiteter för dessa metoder. Vidare, denna metod undanrömer behovet av flödes sortering tekniker för att rena betaceller från en heterogen holme population för nedströms protein tillämpningar. Således beskriver vi ett värdefullt protokoll för visualisering av mitophagy mycket kompatibel för användning i heterogena och begränsade cellpopulationer.
Introduction
Bukspottskörteln betaceller producerar det insulin som krävs för att upprätthålla normala glukos homeostas, och deras misslyckande resulterar i utvecklingen av alla former av diabetes. Beta celler behåller en robust mitokondriell förmåga att generera den energi som krävs för att par glukos metabolism med insulin release. Nyligen har det blivit uppenbart att upprätthållandet av funktionell mitokondriell massa är av avgörande betydelse för optimal betacellsfunktion1,2,3. För att upprätthålla funktionell mitokondriell massa, betaceller förlitar sig på mekanismer för kvalitetskontroll för att avlägsna dysfunktionella, skadade, eller åldrande mitokondrier4. Vi och andra har tidigare visat att betaceller förlitar sig på en specialiserad form av mitokondriell omsättning, som kallas mitokondriell autofagi (eller mitophagy), för att bibehålla mitokondriell kvalitetskontroll i både gnagare och Human öar1, 2,5. Tyvärr, det fanns dock ingen enkel metod för att upptäcka mitophagy, eller endogent uttryckte mitophagy komponenter, i mänskliga bukspottskörteln betaceller.
Vi har nyligen visat att uppströms regleringen av mitophagy i betaceller förlitar sig på bildandet av ett proteinkomplex som består av E3 Ligaser CLEC16A och NRDP1 och deubiquitinase USP81. NRDP1 och USP8 har visats självständigt påverka mitophagy genom åtgärder på nyckeln mitophagy initiativtagare Parkin6,7. NRDP1 mål Parkin för ubiquitination och nedbrytning för att stänga av mitophagy6, och USP8 specifikt deubiquitinates K6-länkade Parkin för att främja dess flyttning till mitokonen7. Proximity ligering assay (PLA) teknik har varit en nyligen förväg inom området protein interaktion biologi8, vilket möjliggör visualisering av endogena protein interaktioner in situ i enskilda celler, och begränsas inte av knappa provmaterial. Denna metod är särskilt lockande för Human Islet/beta cellbiologi, på grund av den glesa av urvalet tillgänglighet, kopplat till behovet av att förstå fysiologiskt relevanta proteinkomplex inom heterogena celltyper.
Utnyttja PLA strategi, vi har möjlighet att observera viktiga endogena mitophagy komplex i primära mänskliga bukspottskörteln betaceller och neuronala cellinjer, och demonstrera effekterna av en diabetogena miljö på mitophagy väg1. Sammanfattnings, det övergripande målet med detta protokoll är att analysera specifika mitophagy proteinkomplex i vävnader som saknar rikligt material, eller där konventionella protein-interaktionsstudier inte är möjliga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användning av avidentifierade givare mänskliga bukspottskörteln öar är via en institutionell översyn Board (IRB) undantag och i enlighet med University of Michigan IRB politik. Mänskliga bukspottskörteln öar tillhandahölls av NIH/NIDDK-sponsrade Integrated Islet distribution program (IIDP).
1. beredning av mänskligt ö-prov
-
Separering av enstaka celler
- Kultur Human Holmen prover (4000-6000 Holmen motsvarigheter/10 mL Media) för minst 1 dag vid 37 ° c i bukspottskörteln Holmen media (PIM (S)) Media kompletterat med 1 mM glutamin (PIM (G)), 100 enheter/mL antimykotisk-antibiotikum, 1 mM natrium pyruvat och 10% fetal Nötkreatur serum (FBS) eller Human AB serum.
- Använd en dissektion ljusmikroskop vid 3x förstoring att räkna enskilda mänskliga öar från kulturen. Välj 40 holmar per behandling/villkor av intresse (såsom glukolipotoxicitet) i 1,5 ml rör i Holmen media.
- Centrifugera holmar vid 400 x g i 1 min vid 10 ° c till sediment.
- Tvätta prover, genom kort inversion av rören vid rumstemperatur, två gånger med 1 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som innehåller 50 μM PR619 (en deubiquitinase hämmare; för att bevara ubiquitin beroende proteininteraktioner), med centrifugering mellan varje tvätt på 400 x g i 1 min vid 10 ° c.
- Separera öar i enstaka celler med 125 μL av 0,25% trypsin innehållande 50 μM PR619 genom inkuberande trypsin (37 ° c) i 3 min med Holmen pellets. Fördela försiktigt holkar under denna tid med regelbunden, skonsam pipettering med en 200 μL pipett.
- Släcka trypsin med 1 mL värmas (37 ° c) PIM (S) media som innehåller 50 μM PR619, sedan sediment celler genom centrifugering vid 400 x g för 1 min.
- Tvätta celler genom centrifugering vid 400 x g i 1 min, två gånger, med PBS + 50 μm PR619.
- Slutligen, Omsuspendera celler i 150 μL PBS som innehåller 50 μM PR619.
-
Enkel cells anslutning och fixering
- Efter resuspension, snurra cell lösningen på frostat, laddade, Mikroskop diabilder med en cytocentrifug vid 28 x g i 10 min.
- Efter cytocentrifugering, skissera cellområdet med en hydrofoba penna (se tabellen av material) för att minimera antikroppar/PLA lösning volymer som behövs. Fixera celler med 4% PARAFORMALDEHYD i PBS i 15 minuter vid rumstemperatur.
FÖRSIKTIGHET: PFA är farligt och måste hanteras varsamt. - För bästa resultat, utför färgning/PLA omedelbart, eller inom 24 timmar. Om det behövs, förvara proverna i PBS vid 4 ° c tills färgning inte längre än 48 h.
2. immunohistokemi
-
Blockera
- Tvätta celler två gånger med 1x PBS i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Block cells lösning, för att eliminera bakgrunds färgning, med 10% Donkey serum i PBS som innehåller 0,3% tvättmedel (se tabellen av material) för 1 h vid rumstemperatur.
-
Färgning
- Inkubera celler med primär mus-eller kanin-antikroppar mot USP8 (1:250) respektive NRDP1 (1:250) (se tabell över material) utspädd i fosfatbuffrad saltlösning med rengöringsmedel (PBT, se tabell över material), vid 4 ° c över natten, till detektera mitophagy Complex signalering via PLA.
- Co-Inkubera celler med en markör som är specifik för beta cell identifiering som inte togs upp i mus eller kanin för att inte störa PLA signal. I detta fall Inkubera celler med anti-get PDX1 (1:500) i PBT. Inkubera alla primära antikroppar över natten vid 4 ° c, med plastfilm ovanpå lösningen för att förhindra avdunstning.
3. analys av närhets ligering
- PLA sond och motfärgning
- Förbered PLA sond lösningen enligt tillverkarens anvisningar, dvs, gör 20 μL av sond lösningen per prov genom att förbereda en slutlig koncentration av 1:5 lösning av både anti-mus och anti-kanin sond lösning i PBT, och inkuberande för 20 min vid rums Temperatur.
- Efter övernattning inkubering, tvätta celler två gånger med 1x PBS för 5 min vardera, på en rocker.
- Strax före inkubering med sond lösning, tillsätt anti-get Cy5 sekundärt vid en slutlig koncentration av 1:600 till sond lösningen (för detektion av endogena PDX1). Tillsätt 20 μL sond lösning i varje cell tillstånd, täck varsamt med plastfilm och inkubera vid 37 ° c i 1 h.
- Ligatur
- Tvätta celler två gånger, vid rumstemperatur, med buffert A (se tabellen av material för receptet) för 5 min vardera, på en rocker.
- Förbered ligeringslösning (del av detekterings reagenser, se tabell över material) enligt tillverkarens anvisningar. För detta, späd ligering lager (5x) 1:5 i dietylenpyrokarbonat (DEPC)-behandlat vatten. Omedelbart före inkubering Tillsätt 0,025 U/mL Ligase. Tillsätt 20 μL ligeringslösning till cellerna. Täck med plastfilm och inkubera vid 37 ° c i 30 min.
- Förstärkning
- Tvätta celler två gånger vid rumstemperatur med buffert A för 2 min vardera.
- Gör förstärknings lösningen (del av detekterings reagenser, se tabell över material) enligt tillverkarens anvisningar. Späd amplifieringsbuffert (5x) 1:5 i DEPC-behandlat vatten och håll i mörkret tills användning. Tillsätt en 1:80 utspädning av polymeras (en del av detekterings reagenser, se tabell över material) till lösningen omedelbart innan du lägger till lösningen i cellerna.
- Tillsätt 20 μL amplifieringslösning till cellerna. Täck med plastfilm och placera i mörkret vid 37 ° c för mellan 1 h 40 min till 2 h för maximal signal.
- Förberedelse för avbildning
- Tvätta celler två gånger med buffert B (se tabellen av material för recept) för 10 min vid rumstemperatur, på en rocker.
- Slutligen, tvätta celler en gång i 0,01 x buffert B, för 2 min vid rumstemperatur på en rocker.
- Montera prover genom att lägga till en droppe av monteringsmaterial som innehåller 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) och försiktigt placera en täckslip över proverna med hjälp av en skalpell blad att trycka ut alla bubblor bildas. Tätnings täckglas med ett genomskinligt nagellack runt kanterna.
- Bild prov på ett mikroskop som kan fånga flera fokala plan, såsom ett laserskanning konfokala Mikroskop, eller en inverterad fluorescens Mikroskop med deconvolution kapacitet, med minst 9 olika fokalplan bilder.
- Ta bilder på 100x förstoring, med ca 0,45 mm z-stack höjd. Capture PLA vid 550 Nm excitation, 570 nm emission; Counter-Stain vid 650 Nm excitation, 670 nm emission; och DAPI vid 405 nm excitation, 450 nm emission.
- För att säkerställa fluorescensbild bakgrunds signaler och ströljus minimeras för nedströms analys av PLA händelser (särskilt på widefield Mikroskop), processbilder med hjälp av en tvådimensionell deconvolution (närmaste granne) algoritm genom en standardbild behandling programvara val.
Obs: för Olympus använda CellSens, Nikon använder NIS-element, Leica använder LAS X, Zeiss-ZEN, METAMORPH, MATLAB, Huygens programvara, samt flera plugins tillgängliga via image-J. För analys, det totala antalet interaktioner över alla z-stackar bör analyseras med hjälp av image-J programvara, att endast PDX-1 positiva celler analyseras (avsnitt 3,5).
- Kvantifiering av PLA-interaktioner
- Öppna den kostnadsfria image-J-programvaran och öppna PLA-bilden. Börja från den första skarpt i-fokus PLA bild.
- Klicka på fliken bild och välj Justeraoch sedan tröskelvärde (bild 1a). Justera tröskeln för att ta bort alla icke-specifika PLA signal, anteckna tröskelvärdet justering och försöka hålla den konsekvent under hela analysen.
- Klicka på fliken process och välj binäroch gör sedan binär (figur 1b). Använd den binära bilden för att mäta partiklar genom att klicka på fliken "analysera" och trycka på analysera partiklar (figur 1c).
- För analys Kontrollera att inställningarna är följande: storlek = 0 – oändlighet, loopkontroll = 0 – 1,0, Visa = konturer, kryssrutor för visningsresultatoch tydliga resultat (bild 1d). Klicka på OK. Ta del av antalet partiklar analyseras i ett kalkylblad som betecknar prov, och z-stackposition.
- Upprepa steg 3.5.2 – 3.5.4 tills alla i-fokus z-stackar för provet har analyserats. Summera det totala antalet partiklar för provet i kalkylbladet för att kvantifiera det totala antalet interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi genomförde initiala experiment i MIN6 bukspottskörteln beta cell linjen och sh-SY5Y neuroblastom cellinjer sh-SY5Y, att optimera och bekräfta både specificitet av antikropparna och visualiserade proteininteraktioner. MIN6 celler var pläterade på täckglas på 30 000 celler/mL och vänster för att fästa för 48 h, SH-SY5Y celler var pläterade på täckglas på 15 000 celler/mL och vänster för att följa 24 h. Den PLA-protokollet följdes sedan som ovan, med början i steg 1.2.3. För att säkerställa specificiteten hos PLA-signaler utförde vi först denna metod i närvaro av (i) ingen primär antikropp (figur 2A, figur 3a), (II) enbart NRDP1 antikropp (figur 2b, figur 3b), (III) enbart USP8 antikropp ( Figur 2C, figur 3c) och (IV) både NRDP1-och USP8-antikroppar (figur 2D, figur 3D). För att underlätta prov uppsättningen anger tabell 1 hur experimentella kontroller ska layoutas korrekt. Särskilt, vi observerar ingen punktat PLA signal i enda primär antikropp eller inga primära antikroppar kontrollvillkor, vilket bekräftar att in situ interaktioner specifikt observeras mellan NRDP1 och USP8 i närvaro av både primära antikroppar, i både MIN6 och SH-SY5Y celler.
Vi anpassade sedan denna metod för användning med mänskliga öar för att analysera mitophagy komplexa interaktioner specifikt inom primära mänskliga betaceller. Humana öar består av en heterogen population av funktionellt skilda celler, inklusive alfa, beta, delta och PP-celler9. I motsats till mus öar där betaceller står för ~ 80% av Holmen Mass, betaceller omfattar ett proportionellt mindre intervall inom mänskliga öar (mellan 28-75%)10,11,12. Således försökte vi använda PLA teknik för att tillåta oss att observera närvaron av NRDP1-USP8 mitophagy komplex specifikt inom betaceller och se till att vi inte observera confounding observationer från andra öar celltyper (som kan uppstå från samtidig immunoprecipitation av ö-lysater). Därför är det viktigt att säkerställa adekvat och enhetlig ö spridning till en sådan nivå att enstaka celler lätt kan diskrimineras och ytterligare analyseras. Som framgår av figur 4, är dispersionsprotokollet (avsnitt 1) mycket effektivt för att säkerställa att enstaka celler i Mikroskop synfält för nedströms analys. För att identifiera betaceller, utförde vi Co-färgning med PDX1 specifika anti-serum under PLA processen. PDX1 är en viktig beta cells specifik transkriptionsfaktor, som återfinns i mogna insulinproducerande betaceller främst inom Nucleus13. PDX1 infärgning behölls efter NRDP1: USP8 PLA i primära humana öar (figur 4). Viktigt, vi använde Goat PDX1 anti-sera för att undvika korreaktivitet med primära antikroppar som används för PLA (kanin anti-NRDP1 och Mouse anti-USP8, respektive). Sålunda, tillägget av PDX1 motfärgning möjliggör en specifik bedömning av endogena mitofagkomplex inom primära mänskliga betaceller.
Använda dessa metoder, kan vi sammanställa en ögonblicksbild av bevarandet av NRDP1: USP8 mitophagy Complex att dra slutsatsen kompetensen hos mitophagy vägen inom betaceller. För att utvidga denna metod för användning inom miljöförhållanden som emulerar dem av typ 2-diabetes14behandlade vi beta cells linjer och primära humana öar med palmitat och högt glukos för att inducera glukolipotoxicitet. I själva verket fann vi att samspelet mellan NRDP1 och USP8 minskade efter en 48 h exponering för palmitat och hög glukos i både beta cellinjer samt primära mänskliga betaceller av PLA (figur 5 och referens1). Detta resultat belyser genomförbarheten av denna analys för att bedöma viktiga endogena mitophagy faktorer efter diabetogena stimuli.
Figur 1: arbetsflöde för bild J analys för kvantifiering av PLA interaktioner. De viktiga analysstegen belyses här. (A) justering av bild tröskeln för att säkerställa specifik PLA-signalanalys. (B) omvandling av bild till binära data för att möjliggöra enkel kvantifiering. (C-D) Hur man Slutför analys genom att analysera de partiklar som erkänns av ImageJ programvara. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: NRDP1 och USP8 specifikt interagerar i bukspottskörteln betaceller. Hög förstoring (100x) bilder av mus bukspottskörteln cell linje, MIN6, visas. (a-D) PLA signal för NRDP1: USP8 interaktion visas i rött, och kärnor är avgränsade med DAPI i blått. (a-C) Ingen specifik punktat signal för NRDP1: USP8 interaktion ses om både (a) eller antingen en (B, C) av de primära protein ANTIkropparna utelämnas under PLA-processen. Emellertid, interaktion av båda proteiner är synlig genom PLA i bukspottskörteln betaceller (D) när båda antikroppar ingår. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: NRDP1 och USP8 interagerar specifikt i neuroblastom celler. Hög förstoring (100x) bilder av Human neuroblastom cell linjen, sh-SY5Y, visas. (a-D) PLA signal för NRDP1: USP8 interaktion visas i rött, och kärnor är avgränsade med DAPI i blått. (a-C) Ingen specifik punktat signal för NRDP1: USP8 interaktion ses om både (a) eller antingen en (B, C) av de primära protein ANTIkropparna utelämnas under PLA-processen. Emellertid, interaktion av båda proteiner är synlig genom PLA (D) när båda antikroppar ingår. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: beta cell mitophagy komplex kan identifieras i primära mänskliga pankreasöar in situ av pla. Hög förstoring (100x) bilder av spridda mänskliga öar visas. Enstaka celler avgränsas med nukleär färgning med DAPI (blå), betaceller observeras med PDX1 färgning (magenta), och mitophagy komplex kan ses i både betaceller och icke-betaceller (röd). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: den NRDP1: USP8 mitophagy Complex destabiliseras i betaceller av glukolipotoxicitet.
Hög förstoring (100x) bilder av MIN6 celler som behandlats för 48 h med antingen kontroll (25 mm glukos + 0,82% BSA) eller hög glukos + palmitat (25 mm glukos + 0,4 mm paliperidonpalmitat/0,82% BSA) visas. (a-B) PLA (NRDP1: USP8) signalen ses i båda behandlingsgrupperna. PLA signal minskar i MIN6 betaceller efter glukolipotoxicitet (B) jämfört med kontroller (a). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Prov | Antikropp 1 (mus anti-NRDP1) | Antikropp 2 (kanin anti-USP8) | Antikropp 3 (get anti-PDX1) (Tillval) |
| KONTROLL 1: ingen primär antikropp (40 islets) | - | - | + |
| KONTROLL 2: NRDP1 Alone (40 islets) | + | - | + |
| KONTROLL 3: USP8 Alone (40 islets) | - | + | + |
| EXPERIMENTELL 1-x: alla experimentella förhållanden (40 öar vardera) | + | + | + |
Tabell 1: exempel på experimentell design inställning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett enkelt och effektivt sätt att använda NRDP1: USP8 PLA i vävnader/celler av intresse för att kvantifiera bildandet av uppströms mitofagkomplex. Vi bekräftade tidigare bildandet av CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy Complex i bukspottskörteln betaceller av flera metoder, inklusive Co-immunoprecipitation experiment, cellfria interaktionsstudier, och in vitro-samt cellbaserade ubiquitination analyser, och visade hur denna komplexa enheter reglerade mitophagic Flux1,15. Den PLA studier vi rapporterar och beskriver här möjliggör en snabb, kvantitativ och cellspecifik syn på mitophagy väg som är mycket anpassningsbar till primära mänskliga betaceller. Dessutom har vi visat att NRDP1: USP8 PLA kan anpassas för användning utanför beta cellbiologi i sh-SY5Y neuroblastom celler, belyser den potentiella genomförbarheten av denna teknik för att övervaka mitophagy komplex i neuronala system samt.
PLA är en enkel metod; vissa steg i protokollet är dock av yttersta vikt för att säkerställa tydliga och specifika resultat. Dessa inkluderar: (1) att se till att spridnings förfarandet för humana öar är milt nog för att förhindra cell lysis/skador för att optimera bilder, (2) tillsats av deubiquitinase hämmare, PR619, omedelbart före fixering och under tvättar för att bevara ubiquitination State (och därmed bindande) av NRDP1-USP8 Complex för maximal signal observation av PLA, och (3) den objektiva kvantifieringen av PLA-händelser genom ImageJ för att säkerställa en opartisk bedömning av mitofagkomplex och även möjliggöra bestämning av förändringar på mitofagi inte kan vara fullständiga men fortfarande statistiskt signifikanta/biologiskt relevanta.
En välkänd utmaning inom human Holmen studier är oron för den heterogena populationen av både betaceller och icke-betaceller. Vår användning av PDX1 motfärgning möjliggör bedömning av mitophagy komplex formation inom betaceller (samt PDX1 negativa icke-betaceller). En potentiell oro utnyttjar PDX1 som en motfläck är dess uttryck i bukspottskörteln delta celler16,17,18, om än till en mycket lägre grad än i betaceller, som sådana andra markörer (dvs., NKX 6,1) skulle kunna användas för att mål betaceller mer specifikt. Genom att sprida intakta öar till enstaka celler omedelbart före cytocentrifugering och fixering, kan vi även utföra enstaka cells mitofagstudier med endast minimala störningar av den lilla ön mikromiljön under läkemedelsbehandlingar och/eller glukolipotoxisk exponering. Emellertid, vi kan inte utesluta möjligheten att Holmen dispersion kan störa mitophagic komplex i celler oberoende av relevanta behandlingar.
Medan mer traditionella protein-protein interaktionsstudier kan användas i mänskliga pankreasöar, såsom Co-immunoprecipitation och/eller proteomiska metoder, dessa förfaranden kräver i allmänhet en stor mängd holme lysate, som kan visa sig utmanande med tanke på bristen på human Holmen material tillgänglig. Dessutom, oron för celltyp-specificitet under dessa traditionella tekniker blir mer uppenbar eller kräver ytterligare optimering av flödescytometri metoder för att sortera ren beta cellpopulationer19,20, 21,22. Sålunda, vår PLA-metoden ger ett attraktivt och praktiskt alternativ för protein-protein interaktionsstudier av mitophagy vägen i mänskliga betaceller. I synnerhet möjligheten att använda så få som 40 totalt öar/tillstånd per experiment för att kvantifiera mitophagy komplex formation i tusentals enskilda beta-celler tillåter ö-forskare möjligheten att bevara sina Holmen preparat för andra bedömningar från samma givare.
Som NRDP1 och USP8 är ubiquitously uttrycks, vi spekulerar denna teknik kan ha värde för bedömning av mitophagy i celltyper bortom betaceller. Möjligheterna omfattar andra öar celltyper (med relevanta motfläckar för alfaceller eller delta celler) eller celltyper som starkt förlitar sig på mitophagy, såsom nervceller. För detta ändamål, vår observation av överförbarheten av denna teknik till sh-SY5Y neuroblastom celler (figur 2) eller PDX1-negativa ö-celler (figur 4) kan föreslå nyttan av vår teknik för mitophagy vägen i andra celltyper.
Trots den lätthet och enkelhet i NRDP1: USP8 PLA strategi, det finns utmaningar som kunde blanda ihop resultaten av denna analys. Medan PLA kan förvissa protein-protein interaktioner i mycket nära närhet (40 Nm), utesluter det inte ut möjligheten att vissa experimentella förhållanden kan upprätthålla NRDP1-USP8 närhet medan störa interaktionen, som skulle missas av PLA-metoden. Vidare, medan vi har visat att NRDP1: USP8 komplex formation är en giltig avläsning för Canonical CLEC16A/PARKIN-mitophagy väg i bukspottskörteln betaceller, nyare studier har observerat roller för PARKIN-oberoende mitophagy i mitokondriell kvalitetskontroll23,24. Vi vet ännu inte hur NRDP1: USP8 komplex formation ändras av störningen av PARKIN-oberoende mitophagy. Således, användning av en kompletterande metod utöver de som beskrivs här för att analysen mitophagy i betaceller skulle vara tillrådligt. Slutligen, stabiliteten i detta mitofagkomplex är beroende av ubiquitination av komponenten proteiner, så att tillsats av ett brett spektrum deubiquitinase inhibitor PR619 är avgörande för att bibehålla ubiquitination under provberedning. Återigen, manipulationer av betaceller som indirekt kan störa ubiquitination av komponenter i NRDP1-USP8 komplexa måste övervägas när man analyserar NRDP1: USP8 som en avläsning för mitophagy komplex formation.
Eftersom rollen av mitokondriell kvalitetskontroll alltmer uppskattas i inte bara betacellsfunktion utan även andra mycket metaboliska celltyper, kan den rigorösa bedömningen av mitofagy visa sig vara utmanande och tidskrävande för grupper som vill ha en snabbare bedömning av viktiga mitofagkomponenter. Den PLA strategi vi beskriver är en relativt låg kostnad, molekylär nivå visualiseringsteknik som kan ge kvantitativ analys av mitophagy komplex formation med Single cell resolution i liten mängd Human Holmen prover och kan i stort sett tillämpas olika typer av celler, behandlingar eller sjukdomstillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner finansiering stöd från JDRF (CDA-2016-189 och SRA-2018-539), det nationella institutet för diabetes och mag-och njursjukdomar, National Institutes of Health (R01-DK-108921), familjen Brehm, och Anthony familjen. JDRF-utmärkelsen för karriärutveckling till S.A.S. stöds delvis av den danska diabetes akademin, som stöds av stiftelsen Novo Nordisk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
References
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. (0), (2015).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y.
- Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
- Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
- Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
- Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).
- Silva Xavier, D. a, G,
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).
- Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
- Poitout, V., et al.
- Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
- Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).
