المقدمة هنا هو بروتوكول للتحقيق في التفاعلات بين الشكل الأصلي ، بريفيبريلار ، والخلايا الليفية اميلويد ناضجه من الببتيدات مختلفه والبروتينات مع الميتوكوندريا معزولة من الانسجه المختلفة ومناطق مختلفه من الدماغ.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التفاعلات مع وغشاء التغلغل من الميتوكوندريا الدماغ بواسطة ألياف الليفية اميلويد
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وتشير مجموعه متزايدة من الادله إلى ان الغشاء يتخلله ، بما في ذلك الاغشيه الداخلية مثل الميتوكوندريا ، هو سمه مشتركه واليه الاوليه للسمية الناجمة عن الكلي اميلويد في الامراض التنكسية العصبية. ومع ذلك ، فان معظم التقارير التي تصف أليات اضطراب الغشاء تستند إلى أنظمه نموذجيه فوسفورية ، والدراسات التي تستهدف مباشره الاحداث التي تحدث علي مستوي الاغشيه البيولوجية نادره. وصف هنا هو نموذج لدراسة أليات سميه اميلويد علي مستوي الغشاء. للعزل الميتوكوندريا ، يتم استخدام الكثافة المتوسطة التدرج للحصول علي الاستعدادات مع الحد الأدنى من التلوث الميلين. بعد التاكد من سلامه غشاء الميتوكوندريا ، يتم التحقيق في تفاعل ألياف الليفية اميلويد الناشئة عن α-synuclein ، الانسولين البقري ، والدجاجة البيض الأبيض الليزوزيم (هيول) مع الميتوكوندريا الدماغ الفئران ، كنموذج في المختبر البيولوجية. وتبين النتائج ان علاج الميتوكوندريا الدماغ مع الجمعيات اللييفيه يمكن ان يسبب درجات مختلفه من تغلغل الغشاء وتعزيز المحتوي ROS. وهذا يشير إلى التفاعلات التي تعتمد علي البنية بين ألياف الليفية اميلويد وغشاء الميتوكوندريا. ومن المقترح ان الخصائص الفيزيائية الحيوية من ألياف الليفية اميلويد وملزمه محدده لاغشيه الميتوكوندريا قد توفر تفسيرات لبعض هذه الملاحظات.
المقدمة
الاضطرابات المرتبطة اميلويد ، المعروفة باسم اميلويدسيس ، تشكل مجموعه كبيره من الامراض المحددة من قبل ظهور رواسب البروتين غير القابلة للذوبان في الانسجه المختلفة والاجهزه1،2. ومن بينها ، الاضطرابات العصبية هي الاشكال الأكثر شيوعا التي تظهر المجاميع البروتين في الجهاز العصبي المركزي أو المحيطي2. علي الرغم من انه قد تم اقتراح عدد من أليات للمشاركة في سميه المجاميع اميلويد3، وهناك مجموعه متزايدة من الادله تشير إلى اضطراب غشاء الخلية والتغلغل باعتبارها اليه الرئيسية للامراض اميلويد4، 5- بالاضافه إلى غشاء البل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأجريت جميع التجارب الحيوانية وفقا للجنة المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها في العلوم الطبية بجامعه طهران. بذلت جهود قصوى للتقليل من المعاناة والآثار الضارة للفئران عن طريق شحذ شفرات المقصلة وتطبيق الحركات الحازمة والسريعة لنصل.
1. تجانس الدماغ والعزلة الميتوكوندريا
ملاحظه: تم اعداد جميع الكواشف للعزل الميتوكوندريا وفقا لسيمز وأندرسون14.
- اعداد المخازن المؤقتة للعزل الميتوكوندريا
- اعداد 100 mM تريس-HCl حل: تزن 0.605 غرام من تريس-HCl وتذوب في حوالي 40 مل من الماء منزوع الأيونات (DW) في الكاس. نقل الحل إلى قارورة 50 mL الحجمي وزيادة حجم النهائي إلى 50 مل عن طريق أضافه DW.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يصف البروتوكول نموذجا لدراسة التفاعلات من الليفي اميلويد مع الميتوكوندريا الدماغ الفئران كنموذج البيولوجية في المختبر. لاعداد الميتوكوندريا ، تم استخدام 15 ٪ (v/v) كثافة التدرج المتوسطة لأزاله الميلين كتلوث الرئيسية للانسجه الدماغ14. كما هو مبين في الشكل 1a ، أنتجتطرد في 30,700 x g نطاقين متميزين من المواد ، المايلين (كالمكون الرئيسي للنطاق 1) والنطاق 2 ، الذي يحتوي علي كسر الميتوكوندريا المخصب.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وتدعم ثروة من النتائج التجريبية فرضيه ان السمية الخلوية للييفي المجاميع يرتبط بشكل كبير مع قدرتها علي التفاعل مع ويتخلل الاغشيه البيولوجية4,5. ومع ذلك ، تستند معظم البيانات علي الطبقات الدهنية الاصطناعية التي لا تعكس بالضرورة الخصائص الجوهرية لاغشيه بيولوجية ، والتي هي هياكل غير متجانسة مع مجموعه واسعه من الدهون الفوسفاتية والبروتينات. هنا ، باستخدام الميتوكوندريا الدماغ كغشاء بيولوجي في المختبر ، يتم وصف نموذج لدراسة لييفي المجاميع الخلوية علي مستوي الغشاء.
.......الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
شكر وتقدير
وكان هذا العمل مدعوما بمنح من مجلس البحوث التابع لمعهد الدراسات العليا في العلوم الاساسيه ، زانجان ، إيران.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2 & prime ؛ 7 & -ثنائي كلورو ثنائي هيدروفلوريسين ثنائي الأسيتات | Sigma | 35845 | |
| كبريتات الأمونيوم | Merck | 1012171000 | |
| لوحة سوداء 96 بئر | Corning | ||
| Black صفيحة 96 بئر صفيحة | Corning | ||
| البقر الأنسولين البقري | Sigma | I6634 | |
| مصل البقر الألبومين (BSA) | Sigma | A2153 | |
| BSA بشكل أساسي خال من الأحماض الدهنية | Sigma | A6003 | |
| جهاز طرد مركزي | Sigma | ||
| شريط ختم شفاف | كريستال Corning | ||
| CuSO4 | Sigma | 451657 | |
| كيس غسيل الكلى (مقطوع 2 كيلو دالتون) | Sigma | D2272 | |
| الخالط | بوتر Elvehjem | ||
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| قارئ الألواح الفلورية | BioTek | ||
| الطيف الضوئي | الفلوري Cary Eclipse VARIAN | ||
| Folin | Merck | F9252 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| المقصلة | صنع في إيران | ||
| HCl | Merck | H1758 | |
| دجاجة بياض البيضة ليزوزيم (HEWL) | سيجما | L6876 | |
| Na2CO3 | سيجما | S7795 | |
| NaH2PO4 | سيجما | S7907 | |
| NaOH | Merck | S8045 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
| Percoll | GE Healthcare | ||
| ملحي عازل للفوسفات (PBS) | Sigma | CS0030 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| طرطرات الصوديوم البوتاسيوم | Sigma | 217255 | |
| كوفيتز | Sigma | ||
| مقياس الطيف | التحليلي jena | SPEKOL 2000 موديل | |
| Succinate | Sigma | S2378 | |
| السكروز | ميرك | 1076871000 | |
| خلاط حراري | Eppendorph | ||
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
| Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tryptone | QUELAB | ||
| حمام مائي | Memmert | ||
| مستخلص الخميرة | QUELAB | ||
| & beta ؛ NADH | Sigma | N8129 |
المراجع
- Merlini, G., Bellotti, V. Molecular mechanisms of amyloidosis. New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).
- Berg, I. Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , Linköping University. L....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
