Summary
Aquí se proporciona un protocolo para investigar las interacciones entre la forma nativa, las fibrillas prefibrilares y las fibrillas amiloideas maduras de diferentes péptidos y proteínas con mitocondrias aisladas de diferentes tejidos y diversas áreas del cerebro.
Abstract
Un creciente cuerpo de evidencia indica que la permeabilización de la membrana, incluyendo membranas internas como las mitocondrias, es una característica común y el mecanismo primario de toxicidad inducida por agregadoa amiloide en enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, la mayoría de los informes que describen los mecanismos de interrupción de la membrana se basan en sistemas de modelos de fosfolípidos, y los estudios dirigidos directamente a los eventos que ocurren a nivel de membranas biológicas son raros. Descrito aquí es un modelo para estudiar los mecanismos de toxicidad amiloide a nivel de membrana. Para el aislamiento mitocondrial, el medio de gradiente de densidad se utiliza para obtener preparaciones con una contaminación mínima de la mielina. Después de la confirmación de la integridad de la integridad de la membrana mitocondrial, se investiga la interacción de las fibrillas amiloide derivadas de la sinucleína, la insulina bovina y el lysozima blanca de huevo de hien (HEWL) con las mitocondrias cerebrales de rata, como modelo biológico in vitro. Los resultados demuestran que el tratamiento de las mitocondrias cerebrales con conjuntos fibrilares puede causar diferentes grados de permeabilización de la membrana y mejora del contenido de ROS. Esto indica interacciones dependientes de la estructura entre las fibrillas amiloideas y la membrana mitocondrial. Se sugiere que las propiedades biofísicas de las fibrillas amiloideas y su unión específica a las membranas mitocondriales pueden proporcionar explicaciones para algunas de estas observaciones.
Introduction
Los trastornos relacionados con el amiloide, conocidos como amiloidosis, constituyen un gran grupo de enfermedades definidas por la aparición de depósitos de proteínas insolubles en diferentes tejidos y órganos1,2. Entre ellos, los trastornos neurodegenerativos son las formas más frecuentes en las que aparecen agregados proteicos en el sistema nervioso central o periférico2. Aunque se ha propuesto que una serie de mecanismos participen en la toxicidad de los agregados amiloide3 , un creciente cuerpo de evidencia apunta a la alteración de la membrana celular y la permeabilización como el mecanismo primario de la patología amiloide4, 5. Además de la membrana plasmática, los orgánulos internos (es decir, las mitocondrias) también pueden verse afectados.
Curiosamente, la evidencia emergente sugiere que la disfunción mitocondrial juega un papel crítico en la patogénesis de los trastornos neurodegenerativos, incluyendo la enfermedad de Alzheimer y Parkinson6,7. De acuerdo con este número, numerosos informes han indicado la unión y acumulación de amiloides-péptido, sinucleína, Huntingtin, y proteínas MUTANTes SOD1 vinculadas a ELA a las mitocondrias8,9,10, 11. Se cree que el mecanismo de permeabilización de la membrana por agregados amiloide ocurre ya sea a través de la formación de canales discretos (poros) y/o a través de un mecanismo no específico similar al detergente5,12, 13. Cabe destacar que la mayoría de estas conclusiones se han basado en informes que involucran sistemas de modelos de fosfolípidos, y los estudios dirigidos directamente a los eventos que ocurren en las membranas biológicas son raros. Claramente, estas bicapas de lípidos artificiales no reflejan necesariamente las propiedades intrínsecas de las membranas biológicas, incluidas las de las mitocondrias, que son estructuras heterogéneas y están compuestas por una amplia variedad de fosfolípidos y proteínas.
En el presente estudio, las mitocondrias aisladas de cerebros de ratas se utilizan como modelo biológico in vitro para examinar los efectos destructivos de las fibrillas amiloideas derivadas de la sinucleína (como proteína amiloidógena), insulina bovina (como un péptido modelo que muestra homología estructural significativa con insulina humana implicada en la amiloidosis localizada por inyección), y lisozima blanca de huevo de gallina (HEWL; como una proteína modelo común para el estudio de la agregación amiloide). Las interacciones y posibles daños de las membranas mitocondriales inducidas por las fibrillas amiloides se investigan observando la liberación de malato mitocondrial deshidrogenasa (MDH) (ubicado en la matriz mitocondrial) y oxígeno reactivo mitocondria (ROS).
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Ciencias Médicas de la Universidad de Teherán. Se realizaron esfuerzos máximos para minimizar el sufrimiento y los efectos perjudiciales para las ratas afilando las cuchillas de guillotina y aplicando movimientos resueltas y rápidos de la hoja.
1. Homogeneización cerebral y aislamiento mitocondrial
NOTA: Todos los reactivos para el aislamiento mitocondrial se prepararon de acuerdo con Sims y Anderson14.
- Preparación de tampones para el aislamiento mitocondrial
- Preparar una solución Tris-HCl de 100 mM: pesar 0,605 g de Tris-HCl y disolverla en aproximadamente 40 ml de agua desionizada (DW) en un vaso de precipitados. Transfiera la solución a un matraz volumétrico de 50 ml y aumente el volumen final a 50 ml añadiendo DW.
- Preparar una solución EDTA de 10 mM: pesar 0,202 g de EDTA y disolverla en aproximadamente 40 ml de DW en un vaso de precipitados. Transfiera la solución a un matraz volumétrico de 50 ml y aumente el volumen final a 50 ml añadiendo DW.
NOTA: Ambas soluciones se pueden almacenar a 4 oC durante al menos 4 semanas. - Preparar una solución de stock Tris-HCl/EDTA/sucrose: añadir 30 mL de 100 mM Tris-HCl y 30 mL de 10 mM EDTA en un vaso de precipitados. Pesar 32,86 g de sacarosa y añadirla al vaso de precipitados mientras se agita con un agitador magnético. Cuando la sacarosa se disuelva, transfiera la solución a un matraz volumétrico de 100 ml y aumente el volumen final a 100 ml añadiendo DW.
NOTA: Esta solución se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 3 días. - Preparar un tampón de aislamiento (IB): añadir 100 mL de stock Tris-HCl/EDTA/sucrose a aproximadamente 150 mL de DW. Ajuste el pH a 7.4 agregando 0.1 M HCl. Aumente el volumen final a 300 mL agregando DW.
- Prepare un medio de gradiente de densidad del 15% (v/v) con IB añadiendo 1,5 ml de medio de gradiente de densidad a 8,5 ml de IB frío.
- Preparar 10 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) solución: pesar 20 mg de BSA libre de ácidos grasos y disolveren en aproximadamente 1,5 ml dw en un vial de 2 ml. Aumente el volumen final a 2 ml añadiendo DW y guárdelo en hielo hasta su uso.
NOTA: Recién preparar las soluciones de los pasos 1.1.4–1.1.6 el día del aislamiento mitocondrial y almacenarlas en hielo hasta su uso.
- Aislamiento del cerebro de rata
NOTA: La decapitación y la eliminación cerebral de ratas macho (150-200 g) se realizaron según Sims y Anderson14.- Poner un vaso de precipitados de 30 ml en un cubo de hielo y añadir 10 ml de IB frío al vaso de precipitados.
- Decapitar a la rata con una pequeña guillotina animal y eliminar el cerebro del cráneo dentro de 1 min de la decapitación para limitar el deterioro de las propiedades mitocondriales.
- Transfiera rápidamente el cerebro al vaso de precipitados que contiene IB frío.
- Homogeneización cerebral y preparación de las mitocondrias
NOTA: Las fracciones mitocondriales se aislaron según el protocolo descrito por Sims y Anderson14,con algunas modificaciones como se describió anteriormente15. Es importante trabajar rápidamente y mantener todo en hielo durante todo el procedimiento.- Lavar el tejido 2x con 30 ml de IB, transferir a un vaso de precipitados que contiene IB frío, y picar finamente el cerebro con tijeras.
- Añadir 10 volúmenes de IB preenfriado (alrededor de 10 ml de IB por cerebro de rata).
- Transfiera la suspensión tisular a un homogeneizador Dounce frío de 20 ml.
- Homogeneizar las piezas de tejido utilizando nueve golpes arriba y abajo con un pestillo motorizado.
NOTA: Deje la mezcla sobre hielo durante aproximadamente 30 s después de cada conjunto de tres trazos de homogeneización para asegurarse de que el homogeneato permanezca frío. - Transfiera el homogeneizado a un tubo centrífugo preenfriado de 10 ml y centrífuga a 1.300 x g y 4 oC durante 3 min.
- Decantel cuidadosamente el sobrenadante y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 10 ml pre-enfriado y centrífuga a 21.000x g a 4oC durante 10 min.
- Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en una solución media de gradiente de densidad fría del 15% (5 ml para cada cerebro) revolviendo suavemente la mezcla con una pipeta.
- Centrífuga en un rotor de ángulo fijo a 30.700x g a 4 oC durante 5 min utilizando una aceleración lenta (45 s de 0 rpm a 500 rpm seguida de aceleración normal) y desaceleración (sin frenos). Esto debe producir dos bandas distintas de material(Figura 1A, izquierda).
- Usando una pipeta Pasteur, retire la banda afilada de material acumulado en la parte superior del degradado, que en su mayoría contiene mielina. A continuación, retire la solución de medio de gradiente de densidad que cubre el material (en la banda 2) tanto como sea posible sin perder ninguna de las fracciones mitocondriales enriquecidas en la banda 2.
NOTA: La banda 2 contiene las mitocondrias sinápticas y no sinápticas. - Agregue 8 ml de IB a la fracción mitocondrial mientras remueve suavemente la mezcla con una pipeta.
- Centrífuga a 16.700x g a 4oC durante 10 min y retire cuidadosamente el sobrenadante, dejando el pellet suelto inferior intacto.
- Agregue 1 ml de BSA libre de ácidos grasos de 10 mg/ml al tubo centrífugo mientras remueve suavemente la mezcla con la punta de una pipeta. Aumente el volumen final a 5 ml por cerebro añadiendo IB.
- Centrífuga a 6.900g a 4oC durante 10 min, que debe producir un pellet firme(Figura 1A,derecha).
- Decantar el sobrenadante y resuspender suavemente el pellet mitocondrial en IB, alífera en tubos de 0,5 ml, y almacenar en nitrógeno líquido hasta su uso.
2. Determinación de la concentración de proteínas
NOTA: La concentración de proteínas se mide utilizando el método de Lowry et al.16.
- Preparación de soluciones para el ensayo Lowry
- Preparar la solución A: pesar 0,4 g de NaOH y 2 g de Na2CO3 y disolver en 80 ml de DW, luego transferir la solución a un matraz volumétrico de 100 ml y aumentar el volumen a 100 ml añadiendo DW.
- Preparar la solución B: pesar 0,1 g de tartrato de sodio de potasio y 0,05 g de CuSO4 y disolver en 8 ml de DW, luego transferir la solución a un matraz volumétrico de 10 ml y aumentar el volumen a 10 ml añadiendo DW.
NOTA: Las dos soluciones A y B pueden permanecer estables a 4 oC durante un máximo de 6 meses. - Preparar la solución C: Añadir 0,5 ml de solución de folin a 7,5 ml de DW.
NOTA: Prepare la solución C fresca y manténgala alejada de la luz hasta su uso. - Preparar las normas de BSA con concentraciones finales de 0, 20, 40, 60, 80, 100 y 120 g/ml combinando 0, 20, 40, 60, 80, 100 y 120 l de 1 mg/ml de BSA, respectivamente, con suficiente DW para hacer 1000 l de solución.
- Medición de la concentración de proteínas
NOTA: Para una mayor precisión, ejecute este paso en triplicado.- Añadir 50 l de soluciones estándar y homogeneización mitocondrial a cada pocto de una placa de 96 pocillos, seguido de la adición de 45 s de solución A. A continuación, incubar la placa durante 10 minutos en un baño de agua caliente a 50 oC.
- Añadir 5 l de solución B e incubar la placa durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente (RT).
- Añadir 150 s l de solución C e incubar la placa durante 10 minutos en un baño de agua tibia a 50 oC.
- Cargue la placa en un lector de placas y registre los valores de absorción para estándares y suspensión mitocondrial a 650 nm. A continuación, utilizando una curva de calibración, calcule el contenido proteico de las mitocondrias.
3. Determinación de la integridad de la membrana mitocondrial
NOTA: La integridad de la membrana mitocondrial se confirma midiendo la actividad de malato deshidrogenasa (MDH) en mitocondrias aisladas antes y después de la interrupción de la membrana por Triton X-100.
- Diluir el homogeneato mitocondrial a 1 mg/ml con IB frío y colocarse en dos tubos de 1,5 ml (normalmente 195 ml de mitocondrias por tubo).
- Añadir 5 sl de 20% (v/v) Triton X-100 (diluido con DW) a un tubo (como un control positivo para la actividad máxima enzimática) y 5 l de DW a otro tubo (para el control) seguido de la mezcla con un agitador.
- Incubar los tubos durante 10 minutos en un baño de agua tibia a 30oC.
- Mitocondrias de pellets por centrifugación de tubos en un rotor de ángulo fijo a 16.000 x g y 4 oC durante 15 min.
- Recoja cuidadosamente los sobrenatantes resultantes para evaluar la actividad de MDH mitocondrial utilizando un ensayo espectrofotométrico estándar descrito en la siguiente sección.
- Calcule la integridad de la membrana mitocondrial de la siguiente manera:
4. Determinación de la actividad MDH
NOTA: La actividad de MDH se midió espectrofotométricamente según lo descrito por Sottocasa et al.17.
- Preparación de soluciones para el ensayo de actividad de MDH
- Preparar una solución Tris-HCl de 50 mM (pH a 7,5): preparar una solución de 7,9 mg/ml en DW con Tris-HCl y ajustar el pH a 7,5 a 25 oC con 1,0 M NaOH.
- Preparar una solución de oxaloacetato de 50 mM: preparar una solución de 6,6 mg/ml con oxaloacetato en Tris-HCl.
NOTA: Esta solución no es estable una vez en solución y debe prepararse inmediatamente antes de su uso. - Preparar una solución de 10 mM-NADH: preparar una solución de 7,81 mg/ml utilizando el uso de NADH en Tris-HCl.
- Determinación de la actividad MDH
NOTA: Las concentraciones finales de ensayo en una mezcla de reacción de 1,0 ml son 50 mM Tris-HCl, 5 mM de oxaloacetato y 0,1 mM de NADH.- Ajuste el espectrofotómetro a 25 oC y 340 nm. Pipetear 890 l Tris-HCl tampón, 100 ml de solución de oxaloacetato y 10 ml de solución de NADH a una cubeta en blanco y tampón Tris-HCl de 880 l, 100 ml de solución de oxaloacetato y 10 ml de solución de NADH en una cubeta demuestra.
- Incubar cubetas en el espectrofotómetro durante 3-4 min y hacer referencia contra el espacio en blanco.
- A continuación, añadir 10 l de homogeneato mitocondrial (1 mg/ml) a la cubeta de muestra, mezclar inmediatamente por inversión, y registrar disminuciones en la absorbancia debido a la oxidación de NADH a 340 nm durante 1 min.
5. In vitro-sinucleína, insulina bovina y formación de fibrila HEWL
- Preparación de proteínas
- - Sinucleína:
NOTA: La expresión y purificación de la sinucleina recombinante se realiza como lo describe Hoyer et al.18 con algunas modificaciones, y la pureza de la sinucleína se confirma por SDS-PAGE.- Dialyze purificado de la sinucleina durante la noche contra la solución salina tamponada de fosfato (PBS).
- Determinar la concentración de proteínas utilizando un coeficiente de extinción de 5600 M-1 cm-1 a 275 nm19.
- Proteína Aliquots en tubos de 1,5 ml y almacenar a -80 oC hasta su uso.
- Insulina bovina y HEWL:
- Proporcione insulina bovina y HEWL.
- Disolver cada proteína en tampón de glicina de 50 mM (pH a 1,6; ajustar el pH con HCl).
- Determinar la concentración de insulina bovina y HEWL utilizando un coeficiente de extinción de 1,0 y 2,63 para 1,0 mg/ml a 276 nm y 280 nm, respectivamente20,21.
- - Sinucleína:
- Inducción de fibrilación amiloide
- Preparación de soluciones para la fibrilación amiloide:
- Preparar tampón de tioflavina T (ThT): pesar 0,3 g de NaH2PO4 y disolverlo en 80 ml de DW, ajustar el pH a 6,5 y aumentar el volumen a 100 ml añadiendo DW.
- Preparar la solución de culata (5 mM): pesar 1,6 mg de ThT y disolverla en 1 ml de tampón de TT, pasar a través de un papel de filtro de 0,22 m y mantener alejado de la luz a 4 oC hasta su uso.
NOTA: Esta solución se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 4 semanas. - Preparar la solución ThT (1 mM): añadir 200 ml de solución de stock de TT (5 mM) a 800 ml de tampón De ThT.
NOTA: Esta solución se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 semana.
- Formación de fibrilade amiloide in vitro:
- Añadir alícuotas (294 ml) de solución proteica (200 m) y 6 l de solución de TT (1 mM) a tubos de 1,5 ml seguidos de agitación.
- Incubar los tubos en un termomezclador a 37oC bajo agitación constante a 800 rpm durante 4 días.
- Tomar alícuotas (10 l) de muestras incubadas después de intervalos de tiempo regulares y añadir 490 l de tampón de ThT, mezclado a fondo e incubar durante 5 min a RT.
- Establezca las anchuras de la excitación y de la ranura de emisión en 5 nm y 10 nm, respectivamente, y mida la fluorescencia ThT mediante excitación a 440 nm y la emisión a 485 nm utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia.
- Formación de fibrilade insulina bovina in vitro:
- Añadir 637 ml de solución proteica (250 m) a un tubo de 1,5 ml. A continuación, añadir 13 sal de solución de ThT (1 mM) seguido de agitación.
- Añadir alícuotas (200 ml) de solución proteica (250 oM) que contengan 20 oM de thT a cada pocto de una placa de 96 pocillos de fondo transparente y sellar la placa con cinta de sellado cristalina.
- Cargue la placa en un lector de placas de fluorescencia e incubar a 57 oC sin agitación.
- Mida la fluorescencia ThT a intervalos de 30 min, con excitación a 440 nm y emisión a 485 nm, durante 12 h.
NOTA: Agitar la placa durante 5 s antes de cada medición.
- Formación in vitro de fibrilación amiloide HEWL:
- Añadir alícuotas (200 ml) de solución proteica (1 mM) que contengan 20 oM de thT a cada pocto de una placa de 96 pocillos de fondo transparente y sellar la placa con cinta de sellado cristalina.
- Cargue la placa en un lector de placas de fluorescencia e incubar a 57 oC sin agitación.
- Mida la fluorescencia ThT a intervalos de 2 h, con excitación a 440 nm y emisión a 485 nm, durante 4 días.
NOTA: Para las tres proteínas, la formación de fibrilar amiloide se confirma mediante microscopía de fuerza atómica(Figura 2B).
- Preparación de soluciones para la fibrilación amiloide:
6. Tratamiento de las mitocondrias con fibrillas amiloideas, ensayo de liberación de MDH y medición ROS
- Incubación de mitocondrias aisladas con fibrillas amiloideas
- Encienda la centrífuga y el baño de agua tibia y ajuste a 4 oC y 30 oC, respectivamente.
- Usando IF, diluir el homogeneato mitocondrial a una concentración final de 1 mg/ml.
- Preparar dos series de tubos de 1,5 ml que contienen homogenetes mitocondriales (una serie para el ensayo de liberación de MDH y otra para la medición de ROS mitocondrial).
- Añadir alícuotas de fibrillas frescas o amiloideas de la sinucleina, la insulina bovina o HEWL (a concentraciones finales de 5 m, 10 m, 20 m y 25 m; utilizar PBS o tampón de glicina como control) para homogeneizar mitocondrial (volumen final de 200 ol) (véase la Tabla 1, Tabla 2 , y la Tabla 3) seguido de agitar suavemente la solución con una pipeta.
NOTA: Para el ensayo de liberación de MDH, utilice Triton X-100 (a una concentración final de 0,5% [v/v]) como control positivo para la máxima liberación de enzimas. - Incubar tubos que contengan suspensiones mitocondriales durante 30 minutos en baño de agua tibia a 30 oC.
- Mida la liberación mitocondrial de MDH y el contenido de ROS como se describe en las secciones 6.2 y 6.3.
- Ensayo de liberación de MDH mitocondrial
- Centrifugar los homogenetes mitocondrialines incubados a 16.000 x g durante 15 min, luego recoger cuidadosamente los sobrenadores resultantes para evaluar la actividad de MDH mitocondrial como se describe en la sección 4.
- Calcule la liberación de MDH como una fracción del efecto máximo (Triton X-100) de la siguiente manera:
- Medición de ROS mitocondrial
NOTA: El contenido de ROS mitocondrial se determina con el precursor fluorogénico sensible a la oxidación dihidrodiclorocarboxboxyfluoresceína diacetato (DCFDA)22.- Preparar soluciones para la medición mitocondrial ROS. Preparar una solución dcFDA de 50 m disolviendo en metanol (preparar fresco) y una solución de succinato de 200 mM disolviéndose en DW.
- Pipetear 191 ml de homogeneato mitocondrial incubado a cada pocal de una placa de 96 pocillos y añadir 4 ml de DCFDA de 50 oM (concentración final de 1 m) y 5 ml de succinato de 200 mM (concentración final de 5 mM).
- Incubar la placa durante 30 minutos en un baño de agua tibia a 30oC mientras se agita suavemente.
- Cargue la placa en un lector de placas de fluorescencia y mida la intensidad de la fluorescencia, con excitación a 485 nm y emisión a 530 nm.
7. Análisis estadístico
- Realice todos los experimentos de al menos 2x o 3x con ensayos triplicados y realice pruebas estadísticas apropiadas. Aquí, los resultados se presentan como media - SD, y la prueba temparejada de un estudiante se utilizó para calcular la significación estadística. Los valores P inferiores a 0,01 y 0,05 se consideraron estadísticamente significativos (*p < 0,05; **p < 0,01).
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Representative Results
El protocolo describe un modelo para estudiar las interacciones de la fibrilla amiloide con las mitocondrias cerebrales de rata como un modelo biológico in vitro. Para la preparación mitocondrial, se utilizó un medio de gradiente de densidad del 15% (v/v) para eliminar la mielina como contaminación importante del tejido cerebral14. Como se muestra en la Figura 1A,la centrifugación a 30.700 x g produjo dos bandas distintas de material, la mielina (comoel componente principal de la banda 1) y la banda 2, que contiene fracción mitocondrial enriquecida.
Mediante la modificación del protocolo descrito por Sims y Anderson14, se preparó una suspensión mitocondrial que contiene mitocondrias sinápticas y no sinápticas. Para la preparación de mitocondrias puras no sinápticas, Sims y Anderson detallaban previamente el protocolo14. En el paso final de centrifugación, se añadieron 10 mg/ml de BSA libre de ácidos grasos para obtener un pellet mitocondrial firme(Figura 1A). La integridad de la membrana mitocondrial se evaluó midiendo la actividad de MDH en mitocondrias aisladas antes y después de la interrupción de la membrana y la liberación de enzimas por Triton X-100, como se describe en el protocolo.
Por lo general se encontró que las preparaciones mitocondriales estaban alrededor del 93% intactas(Figura 1B). Se llevó a cabo un ensayo de fluorescencia ThT para monitorear el crecimiento de fibrillas amiloideas. Como se muestra en la Figura 2A, la curva para la fibrilación amiloide de tres proteínas mostró un patrón sigmoidal típico, que está en línea con los modelos de polimerización dependientes de la nucleación de estas proteínas según lo informado anteriormente23,24 ,25. La emisión de fluorescencia ThT más alta para la sinucleína, la insulina bovina y el HEWL se observó después de 96 h, 12 h y 96 h, respectivamente, lo que sugiere la formación de fibrillas amiloideas(Figura 2A). Esto fue confirmado por la medición de AFM.
Como se ilustra en la Figura 2B,se observaron fibrillas maduras bien definidas con morfología amiloide típica para tres proteínas incubadas en condiciones amiloidatos. Se investigaron las interacciones y el posible daño y permeabilización de las membranas mitocondriales por fibrillas amiloideas. Esto se logró mediante el seguimiento de la liberación de MDH mitocondrial y la medición mitocondrial ROS tras la adición de la sinucleina, la insulina bovina o las fibrillas amiloideas mimiloides HEWL a las suspensiones mitocondriales y siguiendo los procedimientos descritos. Los experimentos preliminares mostraron que la presencia de TT (hasta 3 m) no tuvo ningún efecto sobre la liberación de MDH y el contenido de ROS mitocondrial (datos no mostrados).
Como se muestra en la Figura 3,se observó una liberación sustancial de MDH a la adición de fibrillas amiloide de la sinucleina a las mitocondrias de una manera dependiente de la concentración. Aunque se detectó una ligera liberación tras la adición de fibrillas de insulina amiloide bovina, se encontró que las fibrillas HEWL eran ineficaces(Figura 3). Si bien no se observó una mejora significativa en el contenido de ROS mitocondrial al agregar fibrillas de insulina bovina o amiloide HEWL, el tratamiento con fibrillas de sinucleína condujo a un aumento considerable en el contenido de ROS de las mitocondrias cerebrales en un manera dependiente de la concentración(Figura 4).
Figura 1: Aislamiento mitocondrial y determinación de la integridad de la membrana. (A) Izquierda: aspecto típico de un tubo centrífugo después de resuspender el pellet en frío 15% densidad gradiente solución media siguiendo por centrifugación. La mielina es el componente principal de la banda 1, que se acumula en la parte superior. La banda 2 contiene la fracción mitocondrial altamente enriquecida. Derecha: se produjo un pellet firme después de la adición de 10 mg/ml de BSA libre de ácidos grasos y centrifugación a 6900 x g. (B) La integridad de la membrana mitocondrial se determinó midiendo la actividad de MDH en mitocondrias aisladas antes y después interrupción de la membrana por Triton X-100. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Fibrilación amiloide de la sinucleina, insulina bovina y HEWL. (A) La cinética de la formación de fibrilo amiloide indicada por el aumento de la intensidad de fluorescencia de ThT a 485 nm. (B) Se muestran imágenes AFM de tres proteínas, que fueron incubadas en condiciones amiloiógenas para tiempos regulares. Las barras de escala representan 500 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Liberación de MDH mitocondrial tras la interacción con monómero y fibrilla amiloide de la sinucleina, la insulina bovina y el HEWL. La liberación se expresa como el porcentaje del máximo observado en el tratamiento con 0,5% (v/v) Triton X-100. Cada valor representa la media de SD (n a 3; *p < 0,05, **p < 0,01). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Contenido de ROS mitocondrial tras la interacción con monómero y fibrilla amiloide de la sinucleina, la insulina bovina y el HEWL. Los datos se expresan como el porcentaje de valores en las mitocondrias de control. Cada valor representa la media de SD (n a 3; *p < 0,05; **p < 0,01). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Homogénesis mitocondrial (1 mg/ml) | Monómero de sinucleína (200 m) | Fibrilar de sinucleína (200 m) | Búfer de aislamiento | Pbs | Tritón x-100 20% (v/v) | |
| Control | 175 l | 0 | 0 | 25 l | 0 | 0 |
| Pbs | 175 l | 0 | 0 | 0 | 25 l | 0 |
| Monómero 25 m | 175 l | 25 l | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Fibril 5M | 175 l | 0 | 5 l | 20 l | 0 | 0 |
| Fibril 10M | 175 l | 0 | 10 l | 15 l | 0 | 0 |
| Fibril 20 M | 175 l | 0 | 20 l | 5 l | 0 | 0 |
| Fibril 25 M | 175 l | 0 | 25 l | 0 | 0 | 0 |
| Control positivo | 175 l | 0 | 0 | 20 l | 0 | 5 l |
Tabla 1: Tratamiento de las mitocondrias con diversas concentraciones de fibrillas amiloideas de la sinucleina.
| Homogénesis mitocondrial (1 mg/ml) | Monómero de insulina bovina (250 m) | Fibrilla de insulina bovina (250 m) | Búfer de aislamiento | Tampón de glicina | Tritón x-100 20% (v/v) | |
| Control | 175 l | 0 | 0 | 25 l | 0 | 0 |
| Tampón de glicina | 175 l | 0 | 0 | 0 | 25 l | 0 |
| Monómero 25 m | 175 l | 20 l | 0 | 5 l | 0 | 0 |
| Fibril 5M | 175 l | 0 | 4 l | 21 l | 0 | 0 |
| Fibril 10M | 175 l | 0 | 8 l | 17 l | 0 | 0 |
| Fibril 20 M | 175 l | 0 | 16 l | 9 l | 0 | 0 |
| Fibril 25 M | 175 l | 0 | 20 l | 5 l | 0 | 0 |
| Control positivo | 175 l | 0 | 0 | 20 l | 0 | 5 l |
Tabla 2: Tratamiento de las mitocondrias con diversas concentraciones de fibrillas de insulina bovina amiloide.
| Homogénesis mitocondrial (1 mg/ml) | Monómero HEWL (1 mM) | Fibrilar HEWL (1 mM) | Búfer de aislamiento | Tampón de glicina | Tritón x-100 20% (v/v) | |
| Control | 175 l | 0 | 0 | 25 l | 0 | 0 |
| Tampón de glicina | 175 l | 0 | 0 | 0 | 25 l | 0 |
| Monómero 25 m | 175 l | 5 l | 0 | 20 l | 0 | 0 |
| Fibril 5M | 175 l | 0 | 1 L | 24 l | 0 | 0 |
| Fibril 10M | 175 l | 0 | 2 l | 23 l | 0 | 0 |
| Fibril 20 M | 175 l | 0 | 4 l | 21 l | 0 | 0 |
| Fibril 25 M | 175 l | 0 | 5 l | 20 l | 0 | 0 |
| Control positivo | 175 l | 0 | 0 | 20 l | 0 | 5 l |
Tabla 3: Tratamiento de las mitocondrias con diversas concentraciones de fibrillas amiloideas HEWL.
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Discussion
Una gran cantidad de resultados experimentales apoya la hipótesis de que la citotoxicidad de los agregados fibrilares se asocia significativamente con su capacidad para interactuar y permeabilizar las membranas biológicas4,5. Sin embargo, la mayoría de los datos se basan en bicapas de lípidos artificiales que no reflejan necesariamente las propiedades intrínsecas de las membranas biológicas, que son estructuras heterogéneas con una amplia variedad de fosfolípidos y proteínas. Aquí, utilizando mitocondrias cerebrales como una membrana biológica in vitro, se describe un modelo para el estudio de la citotoxicidad fibrilar a nivel de membrana.
Durante el experimento, es importante trabajar rápidamente y mantener todo en hielo para preparar mitocondrias funcionalmente activas con membranas intactas. Por otra parte, la concentración mitocondrial (basada en la medición total de proteínas) es un factor importante que afecta la interacción de la fibrilla entre membrana y amiloide; por lo tanto, debe mantenerse constante durante todo el protocolo. En el presente estudio, las preparaciones mitocondriales contenían mitocondrias sinápticas y no sinápticas. Para la preparación mitocondrial pura no sináptica, se debe utilizar un medio de gradiente de densidad de densidad del 40%, 23% y 15% (v/v), como lo describen los Sims y Anderson14. Debido a que la mitocondria es un orgánulo con una membrana bien caracterizada, puede servir como un sistema modelo biológico extremadamente útil en estudios moleculares relacionados con los mecanismos de citotoxicidad amiloide a nivel de membrana (especialmente en relación con neurodegenerativas). Este protocolo permite investigar las interacciones y el alcance de las membranas mitocondriales permeabilización examinando la liberación de diversas moléculas y enzimas ubicadas en diferentes compartimentos (es decir, las incrustadas en las membranas externas e internas y los ubicados en el espacio intermembrana o matriz mitocondrial).
Después de la confirmación de la integridad de la membrana mitocondrial(Figura 1B)y la formación de fibrilaa amiloide(Figura 2), la interacción, el daño y la permeabilización de las membranas mitocondriales tras la adición de la sinucleina, la insulina bovina y el HEWL fibrillas amiloideas fueron investigadas. Los resultados demostraron claras diferencias en el alcance de la permeabilización de la membrana y la mejora mitocondrial ros inducida por las fibrillas amiloideas(Figura 3 y Figura 4),lo que sugiere variaciones en la capacidad de varias fibrillas amiloideas interactuar y dañar las membranas mitocondriales.
Para el inicio de la permeabilización de la membrana, las fibrillas amiloideas deben llegar a la superficie mitocondrial. Se ha demostrado que la asociación, localización e inserción de proteínas en membranas cargadas depende de interacciones electrostáticas inespecíficos y de la naturaleza hidrofóbica delasproteínas26,27,28. En cuanto a la toxicidad amiloide, un creciente cuerpo de evidencia implica fuertemente un papel clave de la hidrofobicidad de la superficie agregada de proteínas en su citotoxicidad29,30. Aunque HEWL tiene una carga positiva neta sobre una amplia gama de niveles de pH y tiene una alta afinidad por los fosfolípidos aniónicos y neutros31 (por ejemplo, la membrana mitocondrial23), sin permebilización de membrana mitocondrial y mejora ROS (Figura3 y Figura 4). Una explicación para esta observación puede estar relacionada con una reducción de la hidrofobicidad superficial de las fibrillas HEWL debido a las interacciones fibril-fibrilar laterales23,32, lo que conduce a la pérdida de la capacidad de causar daño de la membrana.
En el caso de la insulina bovina, a pesar de una exposición significativa de las regiones hidrofóbicas en el curso de la formación de fibrilar22, se observó una ligera liberación de enzimas tras la adición de fibrillas amiloideas de 25 M(Figura 3) sin efectos significativos sobre contenido MItocondrial ROS (Figura 4). Dado que tanto las mitocondrias cerebrales como las fibrillas de insulina bovina tienen un potencial zeta negativo en sus superficies24,se sugiere que las fuerzas repulsivas entre la membrana mitocondrial y las fibrillas amiloideas de insulina bovina pueden explicar su incapacidad para efectivamente interactuar con y dañar las membranas mitocondriales24. Los incrementos más altos de permeabilización y ROS mitocondriales se observaron al adicionar fibrillas de sinucleína(Figura 3 y Figura 4).
Esta observación puede atribuirse a la alta capacidad de la sinucleina para interactuar con membranas biológicas que tienen superficies cargadas negativamente33,34,como las mitocondrias. A este respecto, algunos estudios han demostrado una unión e importación específicas de la -sinucleína en las mitocondrias, donde se asocian predominantemente con la membrana interna35. Curiosamente, Ghio et al. informaron que la unión, mediada por cardiolipina (un fosfolípido enriquecido exclusivamente en la membrana mitocondrial interna), de la sinucleína puede ser un mecanismo importante para la asociación y la interrupción de las membranas mitocondriales36.
Curiosamente, hay evidencia clara de unión y acumulación de varios péptidos y proteínas amiloidógenas, incluyendo amiloide-péptido, sinucleína, Huntingtin, y mutante ligal SOD1 a las mitocondrias35,37, 38,39. Además, estudios previos han demostrado que los conjuntos amiloidógenos de amiloide (25–35)15 y SOD 140 tienen la capacidad de interactuar y causar permeabilización de la membrana mitocondrial. Según la literatura, se sugiere que las fibrillas amiloideas son demasiado grandes para cruzar la membrana; por lo tanto, el tamaño medio de las fibrilas no debe ser un factor en la aparente falta de efectos inducidos por la insulina bovina y las fibrillas amiloideas hemiloideas HEWL. Aunque se necesitan más estudios para dilucidar los mecanismos detallados involucrados, se propone que las características biofísicas de las fibrillas amiloideas (es decir, carga superficial, hidrofobicidad, y poseer una membrana mitocondrial específica dirigida a la secuencia) pueden desempeñar un papel importante en su capacidad para interactuar y dañar las membranas biológicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación del Instituto de Estudios Avanzados en Ciencias Básicas (IASBS), Zanjan, Irán.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
| Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
| Black 96-well plate | Corning | ||
| Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
| Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
| Centrifuge | Sigma | ||
| Crystal clear sealing tape | Corning | ||
| CuSO4 | Sigma | 451657 | |
| Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
| Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Fluorescence plate reader | BioTek | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
| Folin | Merck | F9252 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Guillotine | Made in Iran | ||
| HCl | Merck | H1758 | |
| Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
| Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
| NaOH | Merck | S8045 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
| Percoll | GE Healthcare | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
| Quartz cuvette | Sigma | ||
| Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
| Succinate | Sigma | S2378 | |
| Sucrose | Merck | 1076871000 | |
| Thermomixer | Eppendorph | ||
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
| Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tryptone | QUELAB | ||
| Water bath | Memmert | ||
| Yeast Extract | QUELAB | ||
| β-NADH | Sigma | N8129 |
References
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