Summary
בתנאי זה הוא פרוטוקול לחקירת האינטראקציות בין הצורה הטבעית, prefibrillar, ו-עמילואיד בוגרים של פפטידים וחלבונים שונים עם המיטו, מבודדים מרקמות שונות ואזורים שונים של המוח.
Abstract
גוף הולך וגדל של ראיות מעיד על חדירות הממברנה, כולל קרומים פנימיים כגון המיטוגרם, היא תכונה נפוצה המנגנון העיקרי של רעילות המושרה עמילואיד במחלות ניווניות. עם זאת, רוב הדיווחים המתארים את המנגנונים של שיבוש הממברנה מבוססים על מערכות מודל פוספוליפיד, ומחקרים המכוונים ישירות לאירועים המתרחשים ברמת הקרומים הביולוגיים הם נדירים. המתואר כאן הוא מודל ללמוד את המנגנונים של רעילות עמילואיד ברמת הקרום. עבור בידוד מיטוכונדריאלי, צפיפות בינונית הדרגתי משמש להשגת ההכנות עם זיהום מיאלין מינימלי. לאחר אישור מיטוכונדריאלי שלמות הממברנה, האינטראקציה של העמילואיד סיבים עולה מ α-synuclein, אינסולין השור, ו ביצת חן לבן ליזוזים (hewl) עם המוח עכברוש המיטוa, כמו מודל ביולוגי מבחנה, הוא נחקר. התוצאות להפגין כי הטיפול של המיטו, המוח עם הרכבות fibrillar יכול לגרום לדרגות שונות של חדירות הקרום ו-ROS שיפור תוכן. הדבר מצביע על אינטראקציות תלויות-מבנה בין עמילואיד בקרום מיטוכונדריאלי. הוא הציע מאפיינים ביופיזיים של העמילואיד והכריכה הספציפית שלהם לקרומים מיטוכונדריאלי עשויים לספק הסברים לחלק מתצפיות אלה.
Introduction
הפרעות הקשורות עמילואיד, המכונה amyloidoses, מהווים קבוצה גדולה של מחלות המוגדרים על ידי מראה של פיקדונות חלבון מסיסים ברקמות שונות ואיברים1,2. ביניהם, הפרעות ניווניות הן הצורות התכופות ביותר שבהן מופיעות אגרגטים חלבונים במערכת העצבים המרכזית או ההיקפית2. למרות מספר מנגנונים הוצעו להיות מעורב רעילות של אגרגטים עמילואיד3, גוף גדל והולך של ראיות מצביע על שיבוש קרום התא והחדירות כמנגנון העיקרי של מחלות עמילואיד4, 5. המשך בנוסף קרום פלזמה, אורגלים פנימיים (כלומר, המיטו,) יכול להיות גם מושפע.
מעניין, הראיות המתעוררים עולה כי תפקוד מיטוכונדריאלי משחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של הפרעות ניווניות, כולל אלצהיימר ו פרקינסון מחלות6,7. בהתאם לבעיה זו, דיווחים רבים הצביעו על כריכה וצבירה של עמילואיד β-פפטיד, α-synuclein, huntingtin, ו-ALS מקושר מוטציה SOD1 חלבונים כדי המיטומטר8,9,10, 11. המנגנון של חדירות הממברנה על ידי מצרפים של עמילואיד נחשב להתרחש או באמצעות היווצרות של ערוצים נפרדים (נקבוביות) ו/או באמצעות מנגנון ניקוי שאינו מסוים כמו סבון5,12, . שלוש עשרה ראוי לציין כי מרבית המסקנות הללו התבססו על דוחות הכרוכים במערכות מודל פוספוליפיד, ומחקרים המכוונים ישירות לאירועים המתרחשים בקרומים ביולוגיים הם נדירים. ברור, אלה שומנים מלאכותיים מלאכותי לא בהכרח משקפים את התכונות הפנימיות של ממברנות ביולוגיים, כולל אלה של המיטו, אשר הם מבנים הטרוגנית מורכב מגוון רחב של פוספוליפידים וחלבונים.
במחקר הנוכחי, המיטו, מבודדים מן המוח חולדה משמשים כמודל ביולוגי בלתי מתורבת כדי לבחון את ההשפעות ההרסניות של העמילואיד סיבים הנובעים α-synuclein (כמו חלבון amyloidogenic), שור אינסולין (כמו פפטיד מודל מראה הומולוגיה מבנית משמעותית עם אינסולין אנושי מעורב עמילואידוזיס הזרקת מקומי), וביצת חן לבן ליזוזים (hewl; כחלבון מודל נפוץ לחקר מצבור עמילואיד). האינטראקציות והנזק האפשרי של ממברנות מיטוכונדריאלי הנגרמת על ידי העמילואיד נחקרים לאחר מכן על ידי התבוננות שחרורו של המאלף מיטוכונדריאז (MDH) (ממוקם במטריקס מיטוכונדריאלי) וחמצן תגובתי המיטוגרמה שיפור מיני (ROS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ניסויי החיות בוצעו בהתאם לועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) במדעי הרפואה של אוניברסיטת טהראן. מאמצים מרביים נעשו כדי למזער את הסבל ואת ההשפעות המזיקות על ידי חידוד להבי הגיליוטינה והפעלת תנועות החלטי ומהיר של הלהב.
1. המגון המוח ובידוד מיטוכונדריאלי
הערה: כל הריאגנטים לבידוד מיטוכונדריאלי הוכנו על פי סימס ואנדרסון14.
- הכנת מאגרים לבידוד מיטוכונדריאלי
- להכין 100 mM טריס-HCl פתרון: שוקל 0.605 g של Tris-HCl ולפזר אותו כ 40 mL של מים מאועמים (DW) בגביע. להעביר את הפתרון 50 mL בקבוקון נפחי ולהגדיל את הנפח הסופי 50 mL על ידי הוספת DW.
- הכן 10 מ"מ פתרון EDTA: שוקל 0.202 g של EDTA ולפזר אותו כ 40 מ ל של DW בגביע. להעביר את הפתרון 50 mL בקבוקון נפחי ולהגדיל את הנפח הסופי 50 mL על ידי הוספת DW.
הערה: ניתן לאחסן את שני הפתרונות ב -4 ° c לפחות 4 שבועות. - להכין פתרון טריס-HCl/EDTA/סוכות המניה: להוסיף 30 מ מ של 100 mM טריס-HCl ו 30 מ מ של 10 מ"מ EDTA בגביע. שוקל 32.86 גרם של סוכרוז והוסף אותו לגביע תוך כדי ערבוב עם שטירר מגנטי. כאשר סוכרוז מומס, להעביר את הפתרון לבקבוקון 100 mL ולהגדיל את הנפח הסופי ל 100 mL על ידי הוספת DW.
הערה: ניתן לאחסן פתרון זה ב -4 ° c עד 3 ימים. - הכן מאגר בידוד (ליברות): הוסף 100 mL של טריס-HCl/EDTA/מלאי סוכרוז ל-כ 150 mL של DW. להתאים את ה-pH כדי 7.4 על ידי הוספת 0.1 M HCl. הגדל את הנפח הסופי ל 300 mL על ידי הוספת DW.
- הכן 15% (v/v) בינוני עם צפיפות מעבר הצבע עם ליברות על-ידי הוספת 1.5 mL של צפיפות מעבר בינונית ל-8.5 mL של הצטננות.
- הכינו 10 מ"ג/mL סרום אלבומין (BSA) פתרון: שוקל 20 מ ג של חומצות שומן בחינם BSA ולפזר אותו כ 1.5 mL במבחנה 2 mL. להגדיל את הנפח הסופי ל 2 מ ל על ידי הוספת DW ולאחסן אותו על הקרח עד השימוש.
הערה: הכינו את הפתרונות משלבים 1.1.4 – 1.1.6 ביום הבידוד היטוכונדריאלי ואחסנו אותם בקרח עד השימוש.
- בידוד של מוח חולדה
הערה: עריפת ראש והסרת המוח של חולדות גברים (150 – 200 גרם) בוצעו על פי סימס ו אנדרסון14.- לשים 30 מ"ל בגביע קרח ולהוסיף 10 מ ל של ליברות קר בגביע.
- ערפו את ראשו של העכברוש בגיליוטינה של בעל חיים קטן והסירו את המוח מהגולגולת בתוך 1 דקות של עריפת ראש כדי להגביל את הידרדרות הנכסים המידריאלי.
- מעבירים במהירות את המוח. לגביע המכיל את הקור
- המגון המוח והכנת המיטו,
הערה: שברים מיטוכונדריאלי מבודדים בהתאם לפרוטוקול שתיאר סימס ואנדרסון14, עם כמה שינויים כמתואר בעבר15. חשוב לעבוד מהר ולשמור על קרח בכל התהליך.- שוטפים את הרקמה 2x עם 30 מ ל של ליברות, העברה לגביע המכיל את ההצטננות, ומטפחת את המוח במספריים.
- הוסף 10 כרכים של מקורר לפני הקירור (כ-10 מ ל למוח חולדה).
- העבירו את הבולם הרקמות ל 20 מ ל.
- המגון המרקמת את חתיכות הרקמה באמצעות תשע משיכות למעלה ולמטה עם מנועי ממונע.
הערה: השאר את התערובת על הקרח במשך כ -30 שנות לאחר כל סדרה של שלוש משיכות הומומטר כדי להבטיח שהגון המאכלת יישאר קר. - העבר את ההגון עד מקורר 10 מ"ל שפופרת צנטריפוגה ו צנטריפוגה ב 1, 300x g ו 4 ° צ' עבור 3 דקות.
- בזהירות decant את supernatant ולהעביר אותו לפני מקורר 10 מ"ל שפופרת צנטריפוגה ו צנטריפוגה ב 21, 000x g ב 4 ° c עבור 10 דקות.
- השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה בתמיסה בינונית של 15% בצפיפות מעבר הצבע (5 מ ל לכל מוח) על ידי ערבוב עדין של התערובת עם פיפטה.
- צנטריפוגה ברוטור קבוע זווית ב 30, 700x g ב 4 ° צ' עבור 5 דקות באמצעות האצת איטי (45 s מ 0 סל ד כדי 500 סל ד ואחריו תאוצה רגילה) ו להאט (ללא בלמים). זה אמור לייצר שני להקות שונות של חומר (איור 1A, שמאל).
- באמצעות מצבר פסטר, להסיר את הרצועה החדה של חומר שנצבר בחלק העליון של מעבר הצבע, אשר מכיל בעיקר מיאלין. לאחר מכן, הסר את הצפיפות הבינונית של מעבר הצבע על החומר (בלהקה 2) ככל האפשר מבלי לאבד את השבר מיטוכונדריאלי המועשרת בלהקה 2.
הערה: הלהקה 2 מכילה הן את המיטוטיות הסינפטית והן הלא סינפטית. - הוסף 8 מ ל של ליברות לשבר מיטוכונדריאלי תוך ערבוב עדין של התערובת עם פיפטה.
- צנטריפוגה ב 16, 700x g ב 4 ° צ' עבור 10 דקות ובזהירות להסיר את supernatant, משאיר את הגלולה רופף התחתון ללא הפרעה.
- הוסף 1 mL של 10 mg/mL חומצת שומן חינם BSA לצינורית הצנטריפוגה תוך ערבוב עדין של התערובת עם קצה של פיפטה. הגדל את אמצעי האחסון הסופי ל-5 מ ל למוח על-ידי הוספת ליברות.
- צנטריפוגה ב 6, 900 x g ב 4 ° c עבור 10 דקות, אשר אמור לייצר גלולה המשרד (איור 1a, ימין).
- מחדש את הסופרנטאנט ולהשעות בעדינות את הגלולה המיטוכונדריטית ב-ליברות, ל0.5 לצינורות mL ולאחסן בחנקן נוזלי עד לשימוש.
2. קביעת ריכוז החלבון
הערה: ריכוז החלבון נמדד באמצעות שיטת לאורי ואח '16.
- הכנת פתרונות לשיטת לאורי
- הכנת פתרון: שוקל 0.4 g של NaOH ו 2 גרם של Na2CO3 ו לפזר 80 mL של DW, ולאחר מכן להעביר את הפתרון לבקבוקון 100 mL מנפחי ולהגדיל את נפח 100 mL על ידי הוספת DW.
- להכין פתרון B: שוקל 0.1 g של אשלגן הנתרן tartrate ו 0.05 g של CuSO4 ו לפזר 8 מ ל של DW, ולאחר מכן להעביר את הפתרון 10 ml בקבוקון נפחי ולהגדיל את נפח 10 מ ל על ידי הוספת DW.
הערה: הפתרונות A ו-B יכולים להישאר יציבים ב-4 ° c עד 6 חודשים. - הכנת פתרון C: להוסיף 0.5 mL של הפתרון folin 7.5 mL של DW.
הערה: הכינו את התמיסה C רעננה והתרחקי מהאור עד השימוש. - להכין סטנדרטים BSA עם ריכוזי הסופי של 0, 20, 40, 60, 80, 100, ו-120 μg/mL על ידי שילוב של 0, 20, 40, 60, 80, 100, ו-120 μL של 1 מ"ג/mL BSA, בהתאמה, עם מספיק DW לעשות 1000 μL של פתרון.
- מדידת ריכוז החלבון
הערה: לדיוק יותר, הפעל שלב זה בטרילקאט.- הוסף 50 μL של פתרונות סטנדרטיים הומומיטוכונדריאלי כל טוב של 96 צלחת הבאר, ואחריו תוספת של 45 μL של פתרון A. לאחר מכן, מודקת את הצלחת במשך 10 דקות באמבט מים חמים הממוקם ב50 ° c.
- הוסף 5 μL של פתרון B ו-מודקת את הצלחת עבור 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר (RT).
- הוסף 150 μL של פתרון C ו מודקת את הצלחת 10 דקות באמבטיה מים חמים להגדיר ב 50 ° c.
- לטעון את הצלחת לתוך קורא צלחת ולהקליט את ערכי ספיגה עבור תקנים והשעיית מיטוכונדריאלי ב 650 nm. לאחר מכן, באמצעות עקומת כיול, לחשב את תכולת החלבון של המיטו,.
3. קביעת שלמות הממברנה היטוכונדריאלי
הערה: השלמות הממברנה מיטוכונדריאלי מאושרת על ידי מדידת הפעילות המיטו, לפני ואחרי הפרעה ממברנה על ידי טריטון X-100.
- לדלל הומומיטוכונדריאלי 1 מ"ג/mL עם ליברות קר והניח בשני 1.5 מ"ל צינורות (בדרך כלל 195 μL של המיטומטר לצינור).
- הוסף 5 μL של 20% (v/v) טריטון X-100 (מדולל עם DW) לצינור אחד (כפקד חיובי לפעילות אנזימים מקסימלית) ו-5 μL של DW לצינור אחר (עבור שליטה) ואחריו ערבוב עם מערבב.
- מודקון את הצינורות במשך 10 דקות באמבט מים חמים להגדיר 30 ° c.
- גלולה המיטוa על ידי צנטריפוגה של צינורות ברוטור קבוע זווית ב 16,000 x g ו 4 ° צ' עבור 15 דקות.
- לאסוף בקפידה את הסופרנטנים המתקבלים על מנת לומר את הפעילות של MDH מיטוכונדריאלי באמצעות שיטת spectrophotometric סטנדרטית המתוארת בסעיף הבא.
- לחשב את שלמות קרום מיטוכונדריאלי כדלקמן:
4. קביעת פעילות MDH
הערה: פעילות MDH נמדדה בspectrophotometrically כמתואר בידי Sottocasa ואח '17.
- הכנת פתרונות לשיטת הפעילות MDH
- הכנת 50 mM טריס-HCl פתרון (pH = 7.5): 7.9 להכין פתרון משנת mg/mL ב-DW באמצעות Tris-HCl, ולהתאים את ה-pH כדי 7.5 ב -25 ° c עם 1.0 M NaOH.
- להכין פתרון 50 mM oxaloacetate: להכין פתרון 6.6 mg/mL באמצעות oxaloacetate ב טריס-HCl.
הערה: פתרון זה אינו יציב פעם אחת בפתרון ויש להכין אותו מיד לפני השימוש. - להכין פתרון 10 מ"מ β-NADH: להכין פתרון 7.81 mg/mL באמצעות β-NADH ב Tris-HCl.
- קביעת פעילות MDH
הערה: ריכוזי הסדר הסופי בתערובת 1.0 mL הם 50 mM Tris-HCl, 5 מ"מ oxaloacetate, ו 0.1 mM β-NADH.- הגדר את הספקטרוסקופיה ל -25 ° צ' ו 340 ננומטר. פיפטה 890 μL טריס-HCl מאגר, 100 μL של פתרון oxaloacetate, ו 10 μL של פתרון NADH קובט ריק ו 880 μL טריס-HCl מאגר, 100 μL של פתרון oxaloacetate, ו 10 μL של פתרון NADH למדגם קובט.
- כימיקלים דגירה ב ספקטרוסקופיה עבור 3 – 4 דקות והתייחסות נגד ריק.
- ואז להוסיף 10 μL של הומומטר מיטוכונדריאלי (1 מ"ג/mL) למדגם קובט, מיד לערבב על ידי היפוך, והשיא פוחתת בגלל חמצון NADH ב 340 nm עבור 1 דקות.
5. בתוך הפריה חוץ גופית-synuclein, פרה אינסולין, ו HEWL fibril ריל היווצרות
- הכנת חלבון
- α-סירוס:
הערה: ביטוי וטיהור של רקומביננטי α-סירוס מבוצע כפי שמתואר על ידי Hoyer ואח '18 עם כמה שינויים, ואת הטוהר של α-synuclein מאושר על ידי SDS-PAGE.- Dialyze מטוהר α-סירוס לילה כנגד מלוחים באגירה פוספט (PBS).
- לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות מקדם הכחדה של 5600 M-1 ס מ-1 ב 275 nm19.
- שימוש בחלבון בצינורות 1.5 mL ובחנות ב-80 ° צ' עד השימוש.
- פרה אינסולין ו HEWL:
- לספק גם אינסולין בשור וגם HEWL.
- מפזר כל חלבון ב 50 מאגר גליצין מ"מ (pH = 1.6; להתאים את ה-pH עם HCl).
- לקבוע אינסולין שור וריכוז hewl באמצעות מקדם הכחדה של 1.0 ו 2.63 עבור 1.0 mg/mL ב 276 nm ו-280 nm, בהתאמה20,21.
- α-סירוס:
- פרפור פרוזדורים אינדוקציה
- הכנת פתרונות פרפור פרוזדורים:
- להכין את thioflavin T (ThT) מאגר: שוקל 0.3 g של נה2פו4 ו לפזר אותו ב 80 mL של DW, להתאים את ה-pH כדי 6.5, ולהגדיל את נפח 100 mL על ידי הוספת DW.
- להכין את הפתרון מלאי tht (5 מ"מ): שוקלים 1.6 מ"ג של tht ולפזר אותו 1 מ ל של מאגר tht, לעבור דרך נייר 0.22 יקרומטר מסנן, ולהתרחק אור ב 4 ° צ' עד השימוש.
הערה: ניתן לאחסן פתרון זה ב -4 ° c עד 4 שבועות. - הכינו פתרון ThT (1 מ"מ): להוסיף 200 μL של פתרון מלאי ThT (5 מ"מ) כדי 800 μL של מאגר ThT.
הערה: ניתן לאחסן פתרון זה ב-4 ° צ' עד לשבוע אחד.
- במערך להפריה חוץ גופית:
- הוספת אלימטים (294 μL) של תמיסת חלבון (200 μM) ו-6 μL של פתרון ThT (1 מ"מ) ועד 1.5 mL ואחריו ערבוב.
- מודטה את הצינורות בthermomixer ב 37 ° c תחת ערבוב קבוע ב 800 סל ד עבור 4 ימים.
- לקחת את ali, (10 μL) של דגימות הדגירה לאחר מרווחי זמן רגיל ולהוסיף 490 μL של מאגר ThT, מעורב ביסודיות, ו-דגירה עבור 5 דקות ב RT.
- הגדר עירור ורוחבי פליטה כמו 5 ננומטר ו 10 ננומטר, בהתאמה, ולמדוד את הזריחה של ThT על ידי עירור ב 440 ננומטר ופליטה ב 485 ננומטר באמצעות ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית.
- בתוך המבנה של הפרה מתורבת היווצרות של אינסולין:
- הוסף 637 μL של תמיסת חלבון (250 μM) ל-1.5 mL. לאחר מכן, להוסיף 13 μL של פתרון ThT (1 מ"מ) ואחריו ערבוב.
- הוספת ali, (200 μL) של פתרון חלבון (250 μM) המכיל 20 μM ThT כדי כל טוב של ברור התחתית ברורה 96 הצלחת לאטום את הצלחת עם נייר איטום ברור קריסטל.
- לטעון את הצלחת לתוך קורא צלחת הזריחה ו הדגירה ב 57 ° c ללא עצבנות.
- למדוד את הזריחה ב 30 דקות, עם עירור ב 440 ננומטר ופליטה ב 485 nm, עבור 12 h.
הערה: לנער את הצלחת עבור 5 s לפני כל מדידה.
- בתוך מבחנה במבנה עמילואיד בבריל:
- הוספת ali, (200 μL) של פתרון חלבון) 1 מ"מ) המכיל 20 μM ThT לכל טוב של ברור התחתית 96 צלחת הבאר לאטום את הצלחת עם נייר איטום קריסטל ברור.
- לטעון את הצלחת לתוך קורא צלחת הזריחה ו הדגירה ב 57 ° c ללא עצבנות.
- למדוד את הזריחה ב 2 מרווחי זמן, עם עירור ב 440 ננומטר ופליטה ב 485 nm, במשך 4 ימים.
הערה: עבור כל שלושת החלבונים, היווצרות עמילואיד בריל מאושר על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (איור 2B).
- הכנת פתרונות פרפור פרוזדורים:
6. טיפול המיטומטר עם עמילואיד fibrils, שחרור MDH ומדידה ROS
- דגירה של מיטוכונמיטוציה מבודדים עם עמילואיד
- הפעל צנטריפוגה ומרחץ מים חמים והגדר ל -4 ° c ו-30 ° c, בהתאמה.
- שימוש IF, לדלל את המיטוכונדריאלי לריכוז הסופי של 1 מ"ג/mL.
- להכין שתי סדרות של 1.5 mL המכילים הומוגרם מיטוכונדריאלי (סדרה אחת עבור היקף שחרור MDH ועוד עבור מדידת ROS מיטוכונדריאלי).
- הוסף מאגר של מחדש או עמילואיד של α-synuclein, או אינסולין בקר, או HEWL (בריכוזים הסופיים של 5 μM, 10 μM, 20 μM, ו -25 μM; השתמש במאגר ה-PBS או גליצין כפקד) כדי הומומטר מיטוכונדריאני (בכרך הסופי = 200 μl) (ראה טבלה , ושולחן 3) ואחריו בעדינות ערבוב הפתרון עם פיפטה.
הערה: לגבי שחרור MDH, השתמש טריטון X-100 (בריכוז סופי של 0.5% [v/v]) כפקד חיובי עבור שחרור האנזים המקסימלי. - מערכת הצינורות המכילה משעיות מיטוכונדריליות במשך 30 דקות באמבט מים חמים מוגדר ל -30 ° c.
- למדוד שחרור MDH מיטוכונדריאלי ו-ROS תוכן כפי שמתואר בסעיפים 6.2 ו 6.3.
- מיטוכונדריאלי שחרור MDH
- צנטריפוגה את המומנת מיטוכונדריאלי המארת מתטים ב 16,000 x g עבור 15 דקות, ולאחר מכן בזהירות לאסוף את supernatants וכתוצאה מכך על מנת לומר את הפעילות של מיטוכונדריאה כמתואר בסעיף 4.
- חשב את שחרורו של MDH כחלק מאפקט המקסימום (טריטון X-100) כדלקמן:
- מדידת רוס מיטוכונדריאלי
הערה: התוכן של מיטוכונדריאלי הוא נחוש בפני החמצון הרגיש fluorogenic מקודמן באמצעות פלואור (DCFDA)22.- הכינו פתרונות למדידה מיטוכונדריאלי של רוס. להכין פתרון μM 50 מיקרומטר על ידי המסת ב מתנול (להכין טרי) ו 200 mM פתרון מילימטר על ידי המסת ב-DW.
- פיפטה 191 μL של הומומיטוכונדריאלי המוקשה לאכול כל הבאר של 96 צלחת הבאר ולהוסיף 4 μL של 50 μM DCFDA (1 μM ריכוז סופי) ו 5 μL של 200 mM (5 מ"מ ריכוז סופי).
- מודקת את הצלחת 30 דקות באמבט מים חמים להגדיר ב 30 ° c תוך ערבוב עדין.
- לטעון את הצלחת לתוך קורא צלחת הזריחה למדוד את עוצמת הקרינה, עם עירור ב 485 ננומטר ופליטה ב 530 nm.
7. אנליזה סטטיסטית
- בצע את כל הניסויים לפחות 2x או 3x עם מטרילקאט בחני ולבצע בדיקות סטטיסטיות מתאימות. כאן, התוצאות מוצגות כממוצע ± SD, ומבחן tמזווג של סטודנט היה מנוצל כדי לחשב משמעות סטטיסטית. P-ערכים פחות מ 0.01 ו 0.05 נחשבו משמעותיים סטטיסטית (* p < 0.05; * * p < 0.01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול מתאר מודל ללמוד את האינטראקציות של עמילואיד עם מיטוכונטובית של המוח העכברוש כמו מודל ביולוגי מבחנה. עבור הכנה מיטוכונדריאלי, 15% (v/v) צפיפות מעבר הצבע בינונית שימש להסרת המיאלין כזיהום העיקרי של רקמת המוח14. כפי שמוצג באיור 1A, הצנטריפוגה ב-30,700 x g הפיקה שתי להקות של חומר, מיאלין (כמרכיב העיקרי של להקה 1) ולהקה 2, המכילה שבר מיטוכונדריאלי מועשר.
על ידי שינוי הפרוטוקול המתואר על ידי סימס ו אנדרסון14, השעיה מיטוכונדריאלי המכיל הן סינפטית ולא סינפטית המיטוסים היה מוכן. לקראת ההכנה של המיטוסים טהור לא סינפטית, סימס ו אנדרסון בעבר הפרטים את פרוטוקול14. בשלב האחרון של צנטריפוגה, 10 mg/mL חומצות שומן חינם BSA התווסף להשיג גלולה מיטוכונדריאלי מוצק (איור 1A). שלמות הממברנה מיטוכונדריאלי הוערך על ידי מדידת פעילות MDH בתוך המיטו, לפני ואחרי הפרעה ממברנה שחרור האנזים על ידי טריטון X-100, כפי שמתואר בפרוטוקול.
בדרך כלל נמצא כי ההכנות מיטוכונדריאלי היו כ 93% שלמים (איור 1B). שיטת הקרינה הפלואורסצנטית בוצעה כדי לנטר את צמיחת העמילואיד בדגים. כפי שמוצג באיור 2a, העקומה עבור פרפור פרוזדורים של שלושה חלבונים הראו תבנית סיגמואידית טיפוסית, שהיא בקנה מידה של מודלים פולימוניזציה תלויי הנוקלאוציה של חלבונים אלה כפי שדווח בעבר23,24 ,25. פליטת הקרינה הגבוהה ביותר ThT עבור α-synuclein, אינסולין השור, ו HEWL נצפתה לאחר 96 h, 12 h, ו 96 h, בהתאמה, מציע היווצרות של העמילואיד (איור 2A). זה אושר נוסף על ידי מדידת AFM.
כפי שמודגם באיור 2b, סיבים בוגרים מוגדרים היטב עם מורפולוגיה עמילואיד טיפוסית נצפו עבור שלושה חלבונים מודבטים תחת תנאים amyloidogenic. אינטראקציות ונזקים אפשריים והחדירות של ממברנות מיטוכונדריאלי על ידי העמילואיד נחקרו. זה הושג על ידי ניטור שחרורו של מיטוכונדריאלי mdh ו-ROS מיטוכונדריאלי מדידה על תוספת של α-synuclein, האינסולין בשור, או הג הללו עמילואיד סיבים השעיות מיטוכונדריאלי ובעקבות ההליכים המתוארים. הניסויים הראשוניים הראו כי הנוכחות של ThT (עד 3 μM) לא היתה השפעה על שחרור MDH ותוכן רוס מיטוכונדריאלי (נתונים לא מוצגים).
כפי שמוצג באיור 3, שחרור משמעותי של mdh נצפתה על תוספת של α-synuclein עמילואיד בדרך למיטומטר בצורה תלוית ריכוז. למרות שחרור קל זוהה על תוספת של הפרה האינסולין עמילואיד סיבים, hewl סיבים נמצאו לא יעילים (איור 3). בעוד שיפור משמעותי בתוכן רוס מיטוכונדריאלי נצפתה על התוספת של אינסולין או בעלי המים עמילואיד סיבים, טיפול עם α-synuclein סיבים הוביל לעלייה ניכרת בתוכן ROS של המיטו, המוח ב באופן תלוי ריכוז (איור 4).
איור 1: בידוד מיטוכונדריאלי ונחישות שלמות הממברנה. (א) שמאל: המראה האופייני של צינורית צנטריפוגה לאחר השעיית הגלולה קר 15% צפיפות הדרגתי פתרון בינוני לאחר צנטריפוגה. מיאלין הוא המרכיב העיקרי של להקה 1, המצטבר בפסגה. להקה 2 מכילה את שבר מיטוכונדריאלי העשיר ביותר. מימין: גלולה המשרד הופק לאחר תוספת של 10 מ"ג/mL-חומצה שומן חינם BSA ו צנטריפוגה ב 6900 x g. (ב) שלמות הממברנה מיטוכונדריאלי נקבע על ידי מדידת פעילות mdh במיטומטר מבודדים לפני ואחרי הפרעה ממברנה על ידי טריטון X-100. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: העמילואיד פרוזדורים של α-synuclein, פרה אינסולין, ו HEWL. (א) קינטיקה של היווצרות עמילואיד המצוין על ידי הגדלת עוצמת הזריחה של tht ב 485 nm. (ב) afm תמונות של שלושה חלבונים מוצגים, אשר היו מודבטים תחת תנאים amyloidogenic לזמנים רגילים. סרגלי קנה מידה מייצגים 500 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מיטוכונדריאלי שחרור MDH על האינטראקציה עם מונומר ו עמילואיד פיברילות של α-synuclein, האינסולין בשור, ו HEWL. השחרור מתבטא כאחוז המקסימלי הנצפה על הטיפול עם 0.5% (v/v) טריטון X-100. כל ערך מייצג ממוצע ± SD (n = 3; * p < 0.05, * * p < 0.01). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוכן מיטוכונדריאלי של רוס על אינטראקציה עם מונומר ו עמילואיד של α-synuclein, האינסולין בשור, ו HEWL. הנתונים מבוטאים כאחוז הערכים במיטו, שליטה. כל ערך מייצג את הממוצע ± SD (n = 3; * p < 0.05; * * p < 0.01). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| הומומיטוכונדריאלי (1 מ"ג/mL) | α-סירוס מוניומר (200 μM) | α-סירוס fibril ריל (200 μM) | מאגר בידוד | PBS | טריטון x-100 20% (v/v) | |
| פקד | 175 מיקרומטר | 0 | 0 | 25 μL | 0 | 0 |
| PBS | 175 מיקרומטר | 0 | 0 | 0 | 25 μL | 0 |
| מונומר 25 μM | 175 מיקרומטר | 25 μL | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Fibril ריל 5 μM | 175 מיקרומטר | 0 | 5 מיקרומטר | 20 μL | 0 | 0 |
| Fibril ריל 10 μM | 175 מיקרומטר | 0 | 10 מיקרומטר | 15 μL | 0 | 0 |
| פיברילות 20 μM | 175 מיקרומטר | 0 | 20 μL | 5 מיקרומטר | 0 | 0 |
| פיברילות 25 μM | 175 מיקרומטר | 0 | 25 μL | 0 | 0 | 0 |
| שליטה חיובית | 175 מיקרומטר | 0 | 0 | 20 μL | 0 | 5 מיקרומטר |
טבלה 1: טיפול של המיטו, עם ריכוזים שונים של α-הסירוס עמילואיד.
| הומומיטוכונדריאלי (1 מ"ג/mL) | שור אינסולין מונומר (250 μM) | שור אינסולין פיבריל (250 μM) | מאגר בידוד | מאגר גליצין | טריטון x-100 20% (v/v) | |
| פקד | 175 מיקרומטר | 0 | 0 | 25 μL | 0 | 0 |
| מאגר גליצין | 175 מיקרומטר | 0 | 0 | 0 | 25 μL | 0 |
| מונומר 25 μM | 175 מיקרומטר | 20 μL | 0 | 5 מיקרומטר | 0 | 0 |
| Fibril ריל 5 μM | 175 מיקרומטר | 0 | 4 מיקרומטר | 21 μL | 0 | 0 |
| Fibril ריל 10 μM | 175 מיקרומטר | 0 | 8 μL | 17 μL | 0 | 0 |
| פיברילות 20 μM | 175 מיקרומטר | 0 | 16 μL | 9 מיקרומטר | 0 | 0 |
| פיברילות 25 μM | 175 מיקרומטר | 0 | 20 μL | 5 מיקרומטר | 0 | 0 |
| שליטה חיובית | 175 מיקרומטר | 0 | 0 | 20 μL | 0 | 5 מיקרומטר |
שולחן 2: טיפול המיטו, עם ריכוזים שונים של הפרה האינסולין עמילואיד סיבים.
| הומומיטוכונדריאלי (1 מ"ג/mL) | מוניומר HEWL (1 מ"מ) | HEWL fibril ריל (1 ממ) | מאגר בידוד | מאגר גליצין | טריטון x-100 20% (v/v) | |
| פקד | 175 מיקרומטר | 0 | 0 | 25 μL | 0 | 0 |
| מאגר גליצין | 175 מיקרומטר | 0 | 0 | 0 | 25 μL | 0 |
| מונומר 25 μM | 175 מיקרומטר | 5 מיקרומטר | 0 | 20 μL | 0 | 0 |
| Fibril ריל 5 μM | 175 מיקרומטר | 0 | 1 ליטר | 24 μL | 0 | 0 |
| Fibril ריל 10 μM | 175 מיקרומטר | 0 | 2 מיקרומטר | 23 μL | 0 | 0 |
| פיברילות 20 μM | 175 מיקרומטר | 0 | 4 מיקרומטר | 21 μL | 0 | 0 |
| פיברילות 25 μM | 175 מיקרומטר | 0 | 5 מיקרומטר | 20 μL | 0 | 0 |
| שליטה חיובית | 175 מיקרומטר | 0 | 0 | 20 μL | 0 | 5 מיקרומטר |
שולחן 3: טיפול במיטומטר עם ריכוזים שונים של עמילואיד במים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שפע של תוצאות ניסיוני תומך ההשערה כי רעילות ציטוהfibrillar של אגרגטים משויך באופן משמעותי עם יכולתם לתקשר עם הממברנות ביולוגיות4,5. עם זאת, רוב הנתונים מבוססים על bilayers השומנים מלאכותי שאינם משקפים בהכרח את המאפיינים הפנימיים של ממברנות ביולוגיים, אשר הם מבנים הטרוגנית עם מגוון רחב של פוספוליפידים וחלבונים. כאן, באמצעות המיטו, המוח כמו קרום ביולוגי מבחנה, מודל לימוד fibrillar אגרגטים הרעילות ברמת קרום מתוארת.
במהלך הניסוי, חשוב לעבוד במהירות ולשמור על הקרח על מנת להכין מיטוכונמיטויום פעיל פונקציונלית עם קרום שלם. יתר על כן, ריכוז מיטוכונדריאלי (על בסיס מדידה מוחלטת של חלבון) הוא גורם חשוב להשפיע על האינטראקציה ממברנה-עמילואיד fibril ריל; לכן, זה חייב להיות קבוע לאורך כל הפרוטוקול. במחקר הנוכחי, ההכנות מיטוכונדריאלי הכילו הן המיטוטיות והלא סינפטית. עבור הכנה מיטוכונדריאלי טהור לא סינפטית, 40%, 23%, ו 15% (v/v) צפיפות מעבר הצבע יש להשתמש, כפי שמתואר על ידי סימס ו אנדרסון14. בגלל המיטו, הוא אורגונל עם קרום מאופיין היטב, זה עשוי לשמש מערכת מודל ביולוגי שימושי ביותר במחקרים מולקולריים הקשורים למנגנונים של הרעלת עמילואיד ברמת הממברנה (בעיקר המתייחס מחלות ניווניות). פרוטוקול זה מאפשר חקירה של האינטראקציות וההיקף של חדירות מיטוכונדריזציה על ידי התבוננות בשחרור של מולקולות ואנזימים שונים המצויים בתאים שונים (כלומר, אלה המוטבעים בקרומים החיצוניים והפנימיים ואלה הממוקמים במרחב הבין-ממברנה או מטריצה מיטוכונדריאלי).
לאחר אישור מיטוכונדריאלי שלמות הממברנה (איור 1B) ו בריל היווצרות (איור 2), האינטראקציה, נזק, וחדירה של ממברנות מיטוכונדריאלי על התוספת של α-synuclein, הפרה אינסולין, ו hewl העמילואיד נחקר. התוצאות הראו הבדלים ברורים במידה של חדירות הממברנה ושיפור מיטוכונדריאלי של רוס הנגרמת על ידי העמילואיד סיבים (איור 3 ואיור 4), מציע וריאציות על היכולת של השונים עמילואיד שונים לתקשר עם ולהזיק לקרומים המיטוכונדריאלי.
לקבלת חדירות הממברנה, העמילואיד חייב להגיע אל פני השטח היטוכונדריאלי. זה הוכח כי האגודה, לוקליזציה, והחדרת חלבונים לקרומים טעונה תלויה באינטראקציות לא מוגדרות אלקטרוסטטית ואת הטבע הידרופובי של חלבונים26,27,28. לגבי רעילות עמילואיד, גוף גדל והולך של ראיות מאוד מדגיש תפקיד מפתח של חלבון משטח צבירה הידרופוטביטי ב-הרעילות שלהם29,30. למרות HEWL נושאת טעינה חיובית נטו על פני מגוון רחב של רמות pH ויש לו זיקה גבוהה לאניונית ו פוספוליפידים ניטרליים31 (למשל, ממברנה מיטוכונדריאלי23), לא חדירות מיטוכונדריזציה ו ROS שיפור נצפו (איור 3 ואיור 4). הסבר להתבוננות זו עשוי להיות קשור לירידה של הידרו פני השטח של hewl סיבים בשל אינטראקציות לרוחב-fiבריל,32, מובילה לאובדן היכולת לגרום נזק ממברנה.
עבור אינסולין בשור, למרות חשיפה משמעותית של אזורים הידרופובי במהלך היווצרות פיבריל22, שחרור אנזים קל נצפתה על תוספת של 25 מיקרומטר עמילואיד סיבים (איור 3) ללא השפעות משמעותיות על מיטוכונדריאלי תוכן רוס (איור 4). כמו שני המיטותינו המוח ו בשור אינסולין סיבים לשאת פוטנציאל זטה שלילית על משטחים שלהם24, הוא הציע כי כוחות דוחים בין קרום מיטוכונדריאלי ו-עמילואיד לאינסולין בשור עלול להסביר את חוסר יכולתם ל ביעילות אינטראקציה עם ונזק ממברנות מיטוכונדריאלי24. החדירות הגבוהות ביותר והדרגות המיטוכונדריתיות של רוס נצפו על תוספת של α-syנוקלאופילס (איור 3 ואיור 4).
התבוננות זו ניתן לייחס את הקיבולת הגבוהה של α-synuclein לאינטראקציה עם ממברנות ביולוגיים כי יש שלילית משטחים33,34, כגון המיטוa. לענין זה, מחקרים מסוימים הראו מחייב מסוים ויבוא של α-הסירוס לתוך המיטולוגיה, שם הם הופכים בעיקר קשור הממברנה הפנימית35. מעניין, Ghio et al דיווח כי מחייב, מתווך על ידי קרדיוליפין (פוספוליפיד מועשר באופן ייחודי בקרום מיטוכונדריאלי פנימי), של α-synuclein עשוי להיות מנגנון חשוב עבור התאגדות ושיבוש של ממברנות מיטוכונדריאלי36.
מעניין, יש ראיות ברורות לכריכה והצטברות של פפטידים amyloidogenic שונים וחלבונים כולל עמילואיד β-פפטיד, α-synuclein, huntingtin, ו-ALS מקושר מוטציה SOD1 כדי המיטוa35,37, 38,39. יתר על כן, מחקרים קודמים הוכיחו כי הרכבות amyloidogenic של עמילואיד β (25 – 35)15 והסוד 140 יש את היכולת אינטראקציה עם ולגרום חדירות קרום מיטוכונדריאלי. על פי הספרות, הוא הציע כי העמילואיד הם גדולים מדי כדי לחצות את הקרום; לכן, גודל fibril ינוני ממוצע לא צריך להיות גורם בחוסר לכאורה של השפעות הנגרמת על ידי אינסולין של שור ו-HEWL עמילואיד. למרות שמחקרים נוספים נחוצים כדי להבהיר את המנגנונים המפורטים המעורבים, הוא מוצע כי התכונות הביופיסיים של העמילואיד (כלומר, מטען השטח, הידרופוביניטי, ובעל ממברנה מיוחדת מכוונת רצף מיטוכונדריאלי) עשוי לשחק תפקיד חשוב ביכולתם לקיים אינטראקציה עם ולגרום נזק לקרומים הביולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים ממועצת המחקר של המכון ללימודים מתקדמים במדעי היסוד (IASBS), זנג'אן, איראן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
| Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
| Black 96-well plate | Corning | ||
| Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
| Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
| Centrifuge | Sigma | ||
| Crystal clear sealing tape | Corning | ||
| CuSO4 | Sigma | 451657 | |
| Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
| Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Fluorescence plate reader | BioTek | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
| Folin | Merck | F9252 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Guillotine | Made in Iran | ||
| HCl | Merck | H1758 | |
| Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
| Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
| NaOH | Merck | S8045 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
| Percoll | GE Healthcare | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
| Quartz cuvette | Sigma | ||
| Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
| Succinate | Sigma | S2378 | |
| Sucrose | Merck | 1076871000 | |
| Thermomixer | Eppendorph | ||
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
| Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tryptone | QUELAB | ||
| Water bath | Memmert | ||
| Yeast Extract | QUELAB | ||
| β-NADH | Sigma | N8129 |
References
- Merlini, G., Bellotti, V.
- Berg, I. Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , Linköping University. Linköping Institute of Technology, Department of Physics, Chemistry and Biology (2010).
- Kagan, B. L. Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage. Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. Uversky, V. N., Fink, A. L. , Springer US. New York. 223-236 (2006).
- Demuro, A., et al. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers. The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).
- Kayed, R., et al. Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).
- Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage. Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).
- Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues. Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R.
- Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations. Nature. 418, 291 (2002).
- Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).
- Ghobeh, M., et al. Interaction of Aβ (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products. Peptide Science. 102, 473-486 (2014).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria. Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).
- Hoyer, W., et al. Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions. Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).
- Weinreb, P. H., et al. NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded. Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).
- Porter, R. R. Partition chromatography of insulin and other proteins. The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).
- Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme. Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).
- Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol. Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).
- Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products. Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).
- Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).
- Fink, A. L. The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).
- Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains. Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).
- Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. Lipid bilayer disruption by oligomeric α-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core. Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).
- Kourie, J. I., Henry, C. L. Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 29, 741-753 (2002).
- Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
- Bolognesi, B., et al. ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species. ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).
- Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content. Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).
- Roqanian, S., et al. Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action. International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).
- Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein. The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).
- Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains. Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).
- Devi, L., et al. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. Interaction of α-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Oladzad Abbasabadi, A., et al. Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1. International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).
