Summary
여기에 제공된 것은 다른 조직과 뇌의 다양한 영역에서 분리된 미토콘드리아를 가진 다른 펩티드 및 단백질의 네이티브 형태, 프리피릴라 및 성숙한 아밀로이드 섬유사이의 상호작용을 조사하기 위한 프로토콜이다.
Abstract
증거의 성장 몸은 미토콘드리아와 같은 내부 막을 포함하여 막 관전이 신경 퇴행성 질환에서 아밀로이드 골재 유발 독성의 일반적인 특징및 1 차적인 메커니즘임을 나타냅니다. 그러나, 막 중단의 기계장치를 기술하는 대부분의 보고는 인지질 모형 시스템에 근거를 두고, 생물학 막의 수준에서 생기는 사건을 직접 표적으로 하는 연구 결과는 드뭅니다. 여기서 설명된 것은 막 수준에서 아밀로이드 독성의 메커니즘을 연구하기 위한 모델이다. 미토콘드리아 절연의 경우 밀도 구배 매미가 최소한의 미엘린 오염으로 제제를 얻는 데 사용됩니다. 미토콘드리아 막 무결성 확인 후, α-synuclein, 소 인슐린 및 암탉 계란 흰자 리소자임(HEWL)과 쥐 뇌 미토콘드리아에서 발생하는 아밀로이드 섬유소의 상호작용이 시험관내 생물학적 모델로서 조사된다. 결과는 섬유결집성으로 뇌 미토콘드리아를 치료하면 막 투과및 ROS 함량 향상의 다른 정도를 유발할 수 있음을 보여줍니다. 이것은 아밀로이드 섬유와 미토콘드리아 막 사이 구조 의존적인 상호 작용을 나타냅니다. 아밀로이드 섬유소의 생물학적 특성과 미토콘드리아 막에 대한 특정 결합이 이러한 관찰중 일부에 대한 설명을 제공할 수 있다고 제안됩니다.
Introduction
아밀로이드 관련 장애, 아밀로이드 로 알려진, 다른 조직과 장기에 불용성 단백질 예금의 출현에 의해 정의 된 질병의 큰 그룹을 구성1,2. 그 중, 신경 퇴행성 질환은 단백질 응집체가 중추 또는 말초 신경계에 나타나는 가장 빈번한 형태이다2. 아밀로이드 골재의 독성에 관여하는 다수의 기제가 제안되었지만3,세포막 파괴 및 투과를 아밀로이드 병리학의 1차 기전으로 가리키는 증거가 증가하고 있다4, 5. 혈장 막 이외에, 내부 세포기관 (즉, 미토콘드리아)도 영향을받을 수 있습니다.
흥미롭게도, 새로운 증거는 미토콘드리아 기능 장애가 알츠하이머병및 파킨슨병을 포함한 퇴행성 신경 질환의 발병기전에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다6,7. 이 문제에 따라, 수많은 보고서는 미토콘드리아8,9,10에아밀로이드 β-펩티드, α-synuclein, 헌팅틴 및 ALS 연결 돌연변이 SOD1 단백질의 결합 및 축적을나타냈다. 11. 아밀로이드 응집체에 의한 막 투과 메커니즘은 이산 채널 (모공)의 형성 및 / 또는 비특이적 세제와 같은메커니즘을통해 발생하는 것으로 생각된다5,12, 13. 이러한 결론의 대부분은 인지질 모델 시스템을 포함 하는 보고서에 근거 되었습니다 주목할 만, 그리고 직접 생물학적 막에서 발생 하는 이벤트를 대상으로 하는 연구는 드문. 분명히, 이러한 인공 지질 이중층은 반드시 이질적인 구조이고 다양한 인지질 및 단백질로 구성된 미토콘드리아를 포함한 생물학적 막의 본질적인 특성을 반영하지는 않는다.
본 연구에서, 쥐 뇌로부터 분리된 미토콘드리아는 α-synuclein(아밀로이드 단백질), 소 인슐린(모델 펩타이드로 서 식)에서 발생하는 아밀로이드 섬유소의 파괴적인 효과를 조사하기 위해 시험관내 생물학적 모델로 사용된다. 주사 국소화 된 아밀로이드증에 관여하는 인간 인슐린과 중요한 구조적 상동성, 및 암탉 계란 흰자 리소자임 (HEWL; 아밀로이드 응집 연구를위한 일반적인 모델 단백질). 아밀로이드 섬유소에 의해 유도된 미토콘드리아 막의 상호 작용 및 가능한 손상은 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소(MDH)(미토콘드리아 매트릭스에 위치)와 미토콘드리아 반응성 산소의 방출을 관찰함으로써 조사됩니다. 종 (ROS) 향상.
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Protocol
모든 동물 실험은 테헤란 대학의 의학 의학기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 따라 수행되었다. 기요틴 블레이드를 선명하게 하고 칼날의 단호하고 신속한 움직임을 적용하여 쥐의 고통과 해로운 영향을 최소화하기 위해 최대노력을 기울였습니다.
1. 뇌 균질화 및 미토콘드리아 분리
참고 : 미토 콘 드리 아 절연을위한 모든 시약은 심즈 앤더슨14에따라 제조되었다.
- 미토콘드리아 절연을 위한 완충제 준비
- 100 mM Tris-HCl 용액을 준비하십시오 : 트리스 -HCl 의 0.605 g의 무게를 측정하고 비커에 탈이온 수 (DW)의 약 40 mL에 용해하십시오. DW를 추가하여 용액을 50mL 체적 플라스크로 전송하고 최종 부피를 50mL로 늘립니다.
- 10 mM EDTA 용액을 준비하십시오 : EDTA 의 0.202 g의 무게를 비커에 약 40 mL의 DW에 용해하십시오. DW를 추가하여 용액을 50mL 체적 플라스크로 전송하고 최종 부피를 50mL로 늘립니다.
참고: 두 용액 모두 최소 4주 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다. - Tris-HCl/EDTA/자당 스톡 솔루션 준비: 비커에 100mMM Tris-HCl 30 mL, 10mM EDTA 30mL를 추가합니다. 자당의 32.86 g의 무게와 자기 교반기로 저어 동안 비커에 추가합니다. 자당이 용해되면 용액을 100 mL 체적 플라스크로 옮기고 DW를 추가하여 최종 부피를 100 mL로 늘립니다.
참고: 이 용액은 최대 3일 동안 4°C에 보관할 수 있습니다. - 격리 버퍼(IB): 트리스-HCl/EDTA/자당 스톡 100mL를 DW 의 약 150mL에 추가합니다. 0.1 M HCl을 추가하여 pH를 7.4로 조정합니다.
- 1.5mL의 밀도 그라데이션 매체를 8.5mL의 차가운 IB에 추가하여 IB로 15%(v/v) 밀도 그라데이션 매체를 준비합니다.
- 준비 10 mg/mL 소 혈 청 알부민 (BSA) 솔루션: 무게 20 지방산 무료 BSA의 mg와 2 mL 유리병에 약 1.5 mL DW에 용해. DW를 추가하여 최종 부피를 2mL로 늘리고 사용할 때까지 얼음에 보관합니다.
참고: 미토콘드리아 분리 당일 1.1.4-1.1.6단계에서 솔루션을 신선하게 준비하고 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오.
- 쥐 두뇌의 격리
참고 : 수컷 쥐 (150-200g)의 참수와 뇌 제거는 심들과 앤더슨14에따라 수행되었다.- 얼음 양동이에 30 mL 비커를 넣고 비커에 차가운 IB 10 mL을 추가하십시오.
- 작은 동물 기요틴으로 쥐를 참수하고 미토콘드리아 특성의 악화를 제한하기 위해 참수 1 분 이내에 두개골에서 뇌를 제거하십시오.
- 차가운 IB가 함유된 비커로 뇌를 빠르게 전달합니다.
- 미토콘드리아의 뇌 균질화 및 준비
참고: 미토콘드리아 분획은 심즈 및 앤더슨14에의해 설명된 프로토콜에 따라 격리되었고, 앞서설명한 15. 신속하게 작동하고 절차 전반에 걸쳐 얼음에 모든 것을 유지하는 것이 중요합니다.- 30 mL의 IB로 조직을 2x 씻고 차가운 IB가 들어있는 비커로 옮기고 가위로 뇌를 잘게 다듬습니다.
- 미리 냉각된 IB 10권(쥐 뇌 당 약 10mL)을 첨가합니다.
- 조직 현탁액을 20 mL 콜드 도운균질화로 옮김을 전달합니다.
- 전동 유봉으로 9 개의 상하 스트로크를 사용하여 조직 조각을 균질화하십시오.
참고: 균질화가 차가운 상태로 유지되도록 3개의 균질화 스트로크를 각각 설정한 후 약 30초 동안 얼음에 혼합물을 둡니다. - 1,300x g 및 4°C에서 미리 냉각된 10 mL 원심분리기 튜브 및 원심분리기로 3분 동안 균질체를 옮긴다.
- 상급체를 조심스럽게 장식하고 4 °C에서 21,000x g에서 미리 냉각된 10 mL 원심분리기 튜브 및 원심분리기로 10분 동안 옮긴다.
- 상급체를 버리고 펠릿을 15% 밀도 그라데이션 배지 용액(각 뇌에 대해 5 mL)에 넣고 피펫으로 혼합물을 부드럽게 교반하여 다시 놓습니다.
- 4°C에서 30,700x g의 고정각 로터의 원심분리기는 저속 가속(0 rpm에서 500rpm까지 45초, 일반 가속) 및 감속(브레이크 없음)을 사용하여 5분 동안 사용됩니다. 이렇게 하면 두 개의 서로 다른 재료 밴드가 생성됩니다(그림1A,왼쪽).
- 파스퇴르 파이펫을 사용하여, 주로 미엘린을 포함하는 그라데이션의 상단에 축적 된 재료의 날카로운 밴드를 제거합니다. 이어서, 밴드 2에서 농축된 미토콘드리아 분획을 잃지 않고 가능한 한 재료(밴드 2)에 오버라딩된 밀도 구배 배지 용액을 제거한다.
참고: 밴드 2에는 시냅스 미토콘드리아와 비시냅스 미토콘드리아가 모두 들어 있습니다. - 미토콘드리아 분획에 8 mL의 IB를 넣고 파이펫으로 혼합물을 부드럽게 저어줍니다.
- 4 °C에서 16,700x g에서 10 분 동안 원심 분리하고 조심스럽게 상류를 제거하고 바닥이 느슨한 펠렛을 방해받지 않고 둡니다.
- 피펫 끝으로 혼합물을 부드럽게 교반하면서 원심 분리튜브에 10 mg/mL 의 지방산이 없는 BSA 1 mL을 추가합니다. IB를 추가하여 뇌당 최종 부피를 5 mL로 늘립니다.
- 6,900x g에서 4 °C에서 10 분 동안, 단단한 펠릿을 생산해야합니다(그림 1A,오른쪽).
- 상류체를 장식하고 IB에서 미토콘드리아 펠릿을 부드럽게 재중단하고, 0.5 mL 튜브에 알리쿼트하고, 사용 될 때까지 액체 질소에 보관하십시오.
2. 단백질 농도 결정
참고 : 단백질 농도는 Lowry 외16의방법을 사용하여 측정됩니다.
- 로리 분석에 대한 솔루션 의 준비
- 용액 A 준비: NaOH 0.4 g과Na2CO3 2 g의 무게를 측정하고 80 mL의 DW에 용해한 다음 용액을 100 mL 체적 플라스크로 옮기고 DW를 추가하여 부피를 100 mL로 증가시다.
- 용액 B 준비: 타르트산 칼륨 0.1 g, CuSO4 0.05 g의 무게를 측정하고 8 mL의 DW에 용해한 다음 용액을 10 mL 체적 플라스크로 옮기고 DW를 추가하여 부피를 10 mL로 늘립니다.
참고: 두 솔루션 모두 A와 B는 최대 6개월 동안 4°C에서 안정적으로 유지될 수 있습니다. - 용액 준비 C: 7.5 mL의 DW에 0.5 mL의 폴린 용액을 추가합니다.
참고: 용액 C를 신선하게 준비하고 사용할 때까지 빛이 들어가지 않도록 하십시오. - 0, 20, 40, 60, 80, 100, 100, 120 μg/mL의 최종 농도로 BSA 표준을 준비하여 0, 20, 40, 60, 80, 100, 100 및 120 μL의 1mg/mL BSA를 각각 결합하여 1000 μL 의 용액을 만들기에 충분한 DW를 제공합니다.
- 단백질 농도 측정
참고: 정확도를 높이기 위해 이 단계를 세 배로 실행합니다.- 표준 용액 50 μL과 미토콘드리아 균질화를 96 웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 45 μL의 용액 A를 추가합니다. 이어서, 50°C로 설정된 따뜻한 수조에서 10분 동안 플레이트를 배양한다.
- 용액 B 5 μL을 넣고 실온(RT)에서 어두운 환경에서 10분 동안 플레이트를 배양합니다.
- 용액 C 150 μL을 넣고 50 °C로 설정된 따뜻한 수조에서 10 분 동안 접시를 배양하십시오.
- 플레이트를 플레이트 리더에 로드하고 표준 및 미토콘드리아 현탁액에 대한 흡광도 값을 650 nm로 기록합니다. 그런 다음 교정 곡선을 사용하여 미토콘드리아의 단백질 함량을 계산합니다.
3. 미토콘드리아 막 무결성 결정
참고: 미토콘드리아 멤브레인 무결성은 Triton X-100에 의한 막 파괴 전후에 분리된 미토콘드리아에서 말레이트 탈수소효소(MDH) 활성을 측정하여 확인됩니다.
- 미토콘드리아 균질화를 차가운 IB로 1 mg/mL로 희석하고 2개의 1.5 mL 튜브(일반적으로 튜브당 미토콘드리아 195 μL)에 넣습니다.
- 5 μL 의 20% (v/v) 트리톤 X-100 (DW로 희석) 한 튜브 (최대 효소 활성에 대한 긍정적 인 제어로)와 다른 튜브 (제어를위한)에 DW 5 μL을 넣고 교반기로 섞습니다.
- 30 °C에 설정된 따뜻한 수조에서 튜브를 10 분 동안 배양합니다.
- 펠렛 미토콘드리아는 16,000 x g 및 4°C에서 고정각 로터에서 튜브의 원심분리에 의해 15분 동안.
- 다음 절에 기재된 표준 분광도 측정 분석법을 사용하여 미토콘드리아 MDH의 활성을 분석하기 위한 생성된 상피제를 신중하게 수집한다.
- 다음과 같이 미토콘드리아 멤브레인의 무결성을 계산합니다.
4. MDH 활동 결정
참고: MDH 활성은 Sottocasa 외17에의해 설명된 바와 같이 분광광도측정으로 측정되었다.
- MDH 활성 분석법을 위한 솔루션 준비
- 50 mM Tris-HCl 용액(pH = 7.5): Tris-HCl을 사용하여 DW에서 7.9 mg/mL 용액을 준비하고, 1.0 M NaOH로 25°C에서 7.5로 pH를 조정합니다.
- 50 mM 옥살로아세테이트 용액 을 준비하십시오 : Tris-HCl에서 옥살로 아세테이트를 사용하여 6.6 mg / mL 용액을 준비하십시오.
참고: 이 솔루션은 용액에서 한 번 안정적이지 않으며 사용하기 직전에 준비해야 합니다. - 10 mM β-NADH 용액을 준비: 트리스-HCl에서 β-NADH를 사용하여 7.81 mg/mL 용액을 준비한다.
- MDH 활성 결정
참고: 1.0 mL 반응 혼합물에서의 최종 분석 농도는 50 mM Tris-HCl, 5 mM 옥살로아세테이트, 및 0.1 mM β-NADH이다.- 분광광도계를 25°C 및 340nm로 설정합니다. 파이펫 890 μL Tris-HCl 버퍼, 100 μL의 옥살로아세테이트 용액, 10 μL의 NADH 용액을 빈 큐벳 및 880 μL Tris-HCl 버퍼, 100 μL의 옥살로아세테이트 용액, 10 μL의 NADH 용액을 샘플 큐벳에넣습니다.
- 분광광도계에서 3-4분 동안 큐벳큐벳을 인큐베이팅하고 블랭크에 대한 참조.
- 그런 다음 시료 큐벳에 미토콘드리아 균질10μg(1 mg/mL)을 넣고, 즉시 반전하여 혼합하고, NADH 산화로 인한 흡광도가 1분 동안 340nm로 감소합니다.
5. 체외 α-synuclein, 소 인슐린, 및 HEWL 섬유형성
- 단백질 제제
- α-시누클레인:
참고: 재조합 α-시누클레인의 발현 및 정제는 호이어외 18에 의해 기재된 바와 같이 일부 변형으로 수행되고, α-시누클레인의 순도는 SDS-PAGE에 의해 확인된다.- 투석은 인산염 완충식염수(PBS)에 대해 밤새 정제된 α-synuclein을 정제하였다.
- 275 nm19에서5600M-1 cm-1의 소멸 계수를 사용하여 단백질 농도를 결정한다.
- 1.5 mL 튜브에 단백질을 알리쿼트하고 사용할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
- 소 인슐린과 HEWL:
- 소 인슐린과 HEWL을 모두 제공합니다.
- 각 단백질을 50 mM 글리신 완충액으로 용해시십시오 (pH = 1.6; HCl로 pH를 조정하십시오).
- 소 인슐린 및 HEWL 농도를 각각 276 nm 및 280 nm에서 1.0 mg/mL에 대해 1.0 및 2.63의 소멸 계수를 사용하여 결정합니다,20,21.
- α-시누클레인:
- 아밀로이드 세동 유도
- 아밀로이드 세동용 솔루션 준비:
- 티오플라빈 T(ThT) 버퍼 준비: NaH2PO4의 0.3 g의 무게를 측정하고 DW의 80 mL에 용해시키고, pH를 6.5로 조정하고, DW를 추가하여 부피를 100 mL로 증가시다.
- ThT 스톡 솔루션(5 mM) 준비: ThT 1.6 mg의 무게를 측정하고 ThT 버퍼의 1 mL에 용해하고 0.22 μm 필터 용지를 통과하고 사용 될 때까지 4 °C에서 빛을 멀리하십시오.
참고: 이 용액은 최대 4주 동안 4°C에 보관할 수 있습니다. - ThT 용액(1mM) 준비: ThT 완충액의 800 μL에 200 μL의 ThT 스톡 솔루션(5 mM)을 추가합니다.
참고: 이 용액은 최대 1주동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
- 생체외 α-시누클레인 아밀로이드 피Bril 형성:
- 단백질 용액(200 μM)의 aliquots(294 μL)와 ThT 용액(1 mM)의 6 μL을 1.5 mL 튜브에 넣고 교반합니다.
- 4일 동안 800 rpm에서 일정한 교반하에 37°C에서 써모믹서에 튜브를 배양하였다.
- 규칙적인 시간 간격 후에 배양된 샘플의 aliquots (10 μL)를 취하고 ThT 버퍼의 490 μL을 추가하고 철저히 혼합하고 RT에서 5 분 동안 배양합니다.
- 여기 및 방출 슬릿 폭을 각각 5 nm 및 10 nm로 설정하고 형광 분광광도계를 사용하여 440 nm에서 여기 및 방출 485 nm에서 ThT 형광을 측정합니다.
- 생체 외 소 인슐린 아 밀 로이드 fibril 형성:
- 1.5 mL 튜브에 637 μL의 단백질 용액 (250 μM)을 추가하십시오. 이어서, ThT 용액(1 mM)의 13 μL을 넣고 교반한다.
- 20 μM ThT를 함유한 단백질 용액(250 μM)의 aliquots(200 μL)를 각 웰에 추가하여 투명한 바닥 96웰 플레이트를 제거하고 투명한 밀봉 테이프로 플레이트를 밀봉합니다.
- 플레이트를 형광 플레이트 리더기에 적재하고 교반없이 57°C에서 배양합니다.
- 30 분 간격으로 ThT 형광을 측정하고 440 nm에서 여기를, 485 nm에서 방출, 12 시간 동안.
참고: 각 측정 전에 접시를 5s로 흔들어 주세요.
- 체외 HEWL 아밀로이드 섬유질 형성:
- 20 μM ThT를 함유한 단백질 용액(1 mM)의 aliquots(200 μL)를 각 웰에 추가하고 투명 한 바닥 96 웰 플레이트의 각 웰을 추가하고 수정처럼 맑은 밀봉 테이프로 플레이트를 밀봉합니다.
- 플레이트를 형광 플레이트 리더기에 적재하고 교반없이 57°C에서 배양합니다.
- ThT 형광을 2 시간 간격으로 측정하고 440 nm에서 여기를, 485 nm에서 방출하여 4 일 동안.
참고 : 세 가지 단백질 모두 아밀로이드 섬유소 형성은 원자력 현미경 검사법에 의해 확인됩니다(그림 2B).
- 아밀로이드 세동용 솔루션 준비:
6. 아밀로이드 섬유소, MDH 방출 분석 및 ROS 측정으로 미토콘드리아 치료
- 아밀로이드 섬유를 가진 고립된 미토콘드리아의 배양
- 원심분리기와 따뜻한 수조를 켜고 각각 4°C 및 30°C로 설정합니다.
- IF를 사용하여 미토콘드리아 균질계를 1 mg/mL의 최종 농도로 희석시.
- 미토콘드리아 균질제(MDH 방출 분석용 계열 및 미토콘드리아 ROS 측정을 위한 다른 계열)를 포함하는 2개의 계열 1.5 mL 튜브를 준비합니다.
- α-synuclein, 소 인슐린 또는 HEWL(최종 농도5 μM, 10 μM, 20 μM 및 25 μM; PBS 또는 글리신 버퍼를 대조군으로 사용)의 신선 또는 아밀로이드 삼절을 미토콘드리아 균질 호모게네이트(최종 부피 = 200 μL 참조)에 추가합니다(표 1 참조) 및 표 3)이어서 파이펫으로 용액을 부드럽게 교반하였다.
참고: MDH 방출 분석의 경우, 트리톤 X-100(최종 농도 0.5% [v/v])을 효소 방출을 위한 양성 대조군으로 사용하십시오. - 30°C로 설정된 온수 욕조에서 30분 동안 미토콘드리아 현탁액을 함유하는 튜브를 배양한다.
- 섹션 6.2 및 6.3에 설명된 바와 같이 미토콘드리아 MDH 방출 및 ROS 함량을 측정합니다.
- 미토콘드리아 MDH 방출 분석
- 배양된 미토콘드리아 균질생성을 15분 동안 16,000 x g에서 원심분리한 다음, 섹션 4에 기재된 바와 같이 미토콘드리아 MDH의 활성을 시음하기 위한 생성된 초월제를 신중하게 수집한다.
- MDH의 릴리스를 최대 효과(트리톤 X-100)의 일부로 계산합니다.
- 미토콘드리아 ROS 측정
참고: 미토콘드리아 ROS 함량은 산화 에 민감한 형광전구체 디하이드로디클로로카르복시플루아세신 디아세이테이트(DCFDA)22로결정된다.- 미토콘드리아 ROS 측정을 위한 솔루션을 준비합니다. 50 μM DCFDA 용액을 메탄올(신선준비)에 용해시킴으로써 및 200 mM 의 수시네이트 용액을 DW에서 용해시킴으로써 준비한다.
- 피펫 191 μL의 배양 된 미토콘드리아 균질화는 96 웰 플레이트의 각 웰에 50 μM DCFDA (1 μM 최종 농도)의 4 μL및 200 mM 의 5 μL (5 mM 최종 농도)를 추가합니다.
- 30°C로 설정된 따뜻한 수조에서 30분간 접시를 배양하면서 부드럽게 교반한다.
- 플레이트를 형광 플레이트 리더에 로드하고 485 nm에서 여기와 530 nm에서 방출하여 형광 강도를 측정합니다.
7. 통계분석
- 모든 실험을 삼중항 법실험으로 2배 또는 3배 이상 수행하고 적절한 통계 검사를 수행합니다. 여기서, 결과는 평균 ±SD로 제시되고, 학생의 짝을 이루는 t-test는 통계적 유의를 계산하기 위해 이용되었다. P 값은 0.01 및 0.05 미만으로 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다(*p&0.05; **p&0.01).
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Representative Results
프로토콜은 시험관 내 생물학적 모델로서 쥐 뇌 미토콘드리아와 아밀로이드 섬유의 상호 작용을 연구하기위한 모델을 설명합니다. 미토콘드리아 제제의 경우, 15% (v/v) 밀도 그라데이션 배지를 사용하여 뇌 조직의 주요 오염물질로서 미엘린을제거하였다 14. 그림 1A에도시된 바와 같이, 30,700 x g의 원심분리는 농축된 미토콘드리아 분획을 포함하는 두 개의 별개의 물질인 미엘린(밴드 1의 주요 성분)과 밴드 2를 생산하였다.
Sims 및 Anderson14에의해 기술된 프로토콜을 수정함으로써, 시냅스 및 비시냅스 미토콘드리아를 모두 포함하는 미토콘드리아 현탁액을 제조하였다. 순수한 비 시냅스 미토콘드리아의 준비를 위해, 심들과 앤더슨은 이전에 프로토콜14를상세히 설명했다. 원심분리의 마지막 단계에서, 10 mg/mL 지방산-무첨가 BSA를 첨가하여 단단한 미토콘드리아 펠릿을얻었다(도 1A). 미토콘드리아 막 무결성은 프로토콜에 기재된 바와 같이 트리톤 X-100에 의한 막 파괴 및 효소 방출 전후에 분리된 미토콘드리아에서 MDH 활성을 측정함으로써 평가되었다.
전형적으로 미토콘드리아 제제는 약 93% 손상되지 않은 것으로나타났다(도 1B). ThT 형광 분석은 아밀로이드 섬유소의 성장을 모니터링하기 위해 수행되었다. 도 2A에도시된 바와 같이, 3개의 단백질의 아밀로이드 세동에 대한 곡선은 전형적인 지막형 패턴을 나타내었으며, 이는 이들 단백질의 핵형성 의존적 중합 모델과 일치하여 이전에 보고된23,24 ,25. α-시누클레인, 소 인슐린 및 HEWL에 대한 가장 높은 ThT 형광 방출은 각각 96 시간, 12 시간 및 96 시간 후에 관찰되었으며, 아밀로이드 섬유소의 형성을 시사하였다(도2A). 이것은 AFM 측정에 의해 추가로 확인되었다.
도 2B에도시된 바와 같이, 전형적인 아밀로이드 형태를 가진 잘 정의된 성숙한 섬유소는 아밀로이드 조건 하에서 배양된 3개의 단백질에 대해 관찰되었다. 아밀로이드 섬유에 의한 미토콘드리아 막의 상호 작용 및 가능한 손상 및 투과성도 조사되었다. 이는 α-synuclein, 소 인슐린 또는 HEWL 아밀로이드 섬유소가 미토콘드리아 현탁액에 첨가된 후 미토콘드리아 MDH 및 미토콘드리아 ROS 측정의 방출을 모니터링하고 설명된 절차를 수행함으로써 달성되었습니다. 예비 실험은 ThT (최대 3 μM)의 존재가 MDH 방출 및 미토콘드리아 ROS 함량에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었다 (데이터는 도시되지 않음).
도 3에나타낸 바와 같이, MDH의 실질적인 방출은 농도 의존적 방식으로 미토콘드리아에 α-시누클레인 아밀로이드 피브릴을 첨가한 후 관찰되었다. 소 인슐린 아밀로이드 섬유소의 첨가시 약간의 방출이 검출되었지만, HEWL 섬유소는 효과가 없는 것으로나타났다(도 3). 미토콘드리아 ROS 함량이 현저한 개선은 소 인슐린 또는 HEWL 아밀로이드 섬유소의 첨가시 관찰되지 않았지만, α-synuclein 피브릴을 통한 치료는 뇌 미토콘드리아의 ROS 함량이 상당히 증가하는 것으로 나타났다. 농도 의존적방식(그림 4).
그림 1: 미토콘드리아 절연 및 멤브레인 무결성 결정. (A)왼쪽: 원심분리에 의한 다음 의15% 밀도 그라데이션 배지 용액에서 펠렛을 재중단한 후 원심분리기 튜브의 전형적인 외관. 미엘린은 상단에 축적 밴드 1의 주요 구성 요소입니다. 밴드 2는 고농축 미토콘드리아 분획을 함유하고 있다. 오른쪽: 10 mg/mL 지방산이 없는 BSA를 첨가한 후 6900 x g. (B)미토콘드리아 막 무결성을 첨가한 후, 미토콘드리아 의 MDH 활성을 측정하여 제조하였다. 트리톤 X-100에 의해 막 중단. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: α-시누클레인, 소 인슐린 및 HEWL의 아밀로이드 세동. (A)485 nm에서 ThT의 형광 강도를 증가시킴으로써 나타난 아밀로이드 섬유형성의 역학. (B)3개의 단백질의 AFM 이미지가 도시되고, 이는 규칙적인 시간 동안 아밀로이드게제조건하에서 배양되었다. 축척 막대는 500 nm을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 미토콘드리아 MDH는 α-시누클레인, 소 인슐린 및 HEWL의 단량체 및 아밀로이드 섬유와의 상호작용시 방출한다. 방출은 0.5% (v/v) 트리톤 X-100으로 처리 시 관찰된 최대의 백분율로 표현된다. 각 값은 평균 ± SD (n = 3; *lt; 0.05, **p < 0.01)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: α-시누클레인, 소 인슐린 및 HEWL의 단량체 및 아밀로이드 섬유와의 상호작용시 미토콘드리아 ROS 함량. 데이터는 대조군 미토콘드리아에서 값의 백분율로 표현됩니다. 각 값은 평균 ± SD(n = 3; *lt; 0.05; **p< 0.01)를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 미토콘드리아 균질산 (1 mg/mL) | α-시누누틴 단량체 (200 μM) | α-시누클레인 피브릴 (200 μM) | 격리 버퍼 | Pbs | 트리톤 x-100 20% (v/v) | |
| 컨트롤 | 175 μL | 0 | 0 | 25 μL | 0 | 0 |
| Pbs | 175 μL | 0 | 0 | 0 | 25 μL | 0 |
| 단량체 25 μM | 175 μL | 25 μL | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 피브릴 5 μM | 175 μL | 0 | 5 μL | 20 μL | 0 | 0 |
| 피브릴 10 μM | 175 μL | 0 | 10 μL | 15 μL | 0 | 0 |
| 피브릴 20 μM | 175 μL | 0 | 20 μL | 5 μL | 0 | 0 |
| 피브릴 25 μM | 175 μL | 0 | 25 μL | 0 | 0 | 0 |
| 포지티브 컨트롤 | 175 μL | 0 | 0 | 20 μL | 0 | 5 μL |
표 1: α-시누클레인 아밀로이드 피브릴의 다양한 농도로 미토콘드리아의 치료.
| 미토콘드리아 균질산 (1 mg/mL) | 소 인슐린 단량체 (250 μM) | 소 인슐린 피브릴 (250 μM) | 격리 버퍼 | 글리신 버퍼 | 트리톤 x-100 20% (v/v) | |
| 컨트롤 | 175 μL | 0 | 0 | 25 μL | 0 | 0 |
| 글리신 버퍼 | 175 μL | 0 | 0 | 0 | 25 μL | 0 |
| 단량체 25 μM | 175 μL | 20 μL | 0 | 5 μL | 0 | 0 |
| 피브릴 5 μM | 175 μL | 0 | 4 μL | 21 μL | 0 | 0 |
| 피브릴 10 μM | 175 μL | 0 | 8 μL | 17 μL | 0 | 0 |
| 피브릴 20 μM | 175 μL | 0 | 16 μL | 9 μL | 0 | 0 |
| 피브릴 25 μM | 175 μL | 0 | 20 μL | 5 μL | 0 | 0 |
| 포지티브 컨트롤 | 175 μL | 0 | 0 | 20 μL | 0 | 5 μL |
표 2 : 소 인슐린 아밀로이드 섬유소의 다양한 농도로 미토콘드리아의 치료.
| 미토콘드리아 균질산 (1 mg/mL) | HEWL 단량체 (1 mM) | HEWL 피브릴 (1 mM) | 격리 버퍼 | 글리신 버퍼 | 트리톤 x-100 20% (v/v) | |
| 컨트롤 | 175 μL | 0 | 0 | 25 μL | 0 | 0 |
| 글리신 버퍼 | 175 μL | 0 | 0 | 0 | 25 μL | 0 |
| 단량체 25 μM | 175 μL | 5 μL | 0 | 20 μL | 0 | 0 |
| 피브릴 5 μM | 175 μL | 0 | 1 μL | 24 μL | 0 | 0 |
| 피브릴 10 μM | 175 μL | 0 | 2 μL | 23 μL | 0 | 0 |
| 피브릴 20 μM | 175 μL | 0 | 4 μL | 21 μL | 0 | 0 |
| 피브릴 25 μM | 175 μL | 0 | 5 μL | 20 μL | 0 | 0 |
| 포지티브 컨트롤 | 175 μL | 0 | 0 | 20 μL | 0 | 5 μL |
표 3: HEWL 아밀로이드 섬유의 다양한 농도로 미토콘드리아의 치료.
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Discussion
풍부한 실험 결과는 세브릴라 응집체의 세포 독성이 생물학적 막과 상호 작용하고 투과하는 능력과 유의하게 연관되어 있다는 가설을 뒷받침합니다4,5. 그러나, 대부분의 데이터는 반드시 다양한 인지질 및 단백질을 가진 이기종 구조인 생물학적 막의 본질적인 특성을 반영하지 않는 인공 지질 이중층을 기반으로 합니다. 여기서, 뇌 미토콘드리아를 시험관내 생물학적 막으로 사용하여, 막 수준에서 세포독성을 세포독성을 연구하기 위한 모델이 기술된다.
실험 하는 동안, 신속 하 게 작동 하 고 그대로 막 기능 활성 미토 콘 드리 아를 준비 하기 위해 얼음에 모든 것을 유지 하는 것이 중요 하다. 더욱이, 미토콘드리아 농도(총 단백질 측정기준)는 막-아밀로이드 피브릴 상호작용에 영향을 미치는 중요한 인자이다. 따라서 프로토콜 전체에서 일정하게 유지되어야 합니다. 본 연구에서, 미토 콘 드리 아 준비 모두 시 냅 스 및 비 시 냅 스 미토 콘 드리 아를 포함. 순수한 비 시냅스 미토콘드리아 제제의 경우, 심즈 및 앤더슨14에의해 설명된 바와 같이, 40%, 23%, 및 15%(v/v) 밀도 그라데이션 배지를 사용되어야 한다. 미토콘드리아는 잘 특성화 된 막을 가진 세포기관이기 때문에 막 수준에서 아밀로이드 세포 독성의 메커니즘과 관련된 분자 연구에서 매우 유용한 생물학적 모델 시스템으로 작용할 수 있습니다 (특히 퇴행성 신경 질환). 이 프로토콜은 다른 구획에 있는 각종 분자 및 효소의 방출을 조사하여 미토콘드리아 막 투과성의 상호 작용 그리고 넓이의 조사를 허용합니다 (즉, 외부 및 내부 막에 내장된 효소) 및 막 간 공간 또는 미토콘드리아 매트릭스에 있는 사람들).
미토콘드리아 막 무결성확인(도 1B)및 아밀로이드 섬유소형성(도 2),α-시누클레인, 소 인슐린 및 HEWL을 첨가한 후 미토콘드리아 막의 상호작용, 손상 및 투과성 아밀로이드 섬유를 조사했다. 결과는 아밀로이드 섬유에 의해 유도된 막 투과및 미토콘드리아 ROS 향상의 정도에 있는 명확한 다름을 보여주었습니다(그림 3 및 그림 4),각종 아밀로이드 섬유의 기능에 있는 변이를 건의하는 상호 작용 하 고 미토 콘 드리 아 막을 손상.
막 투과 개시를 위해, 아밀로이드 섬유는 미토콘드리아 표면에 도달해야 합니다. 전하 막에 단백질의 연관성, 국소화 및 삽입은 비특이적 정전기 상호작용 및 단백질의 소수성 성질26,27,28에의존하는 것으로 나타났다. 아밀로이드 독성에 관하여, 증거의 증가바디는 그들의 세포독성29,30에있는 단백질 집합체 표면 소수성의 중요한 역할을 강하게 연루한다. HEWL은 광범위한 pH 수준에 걸쳐 순 양성 전하를 지니고 있지만 음이온 및 중성인지질(31)에 대한 높은 친화력을 가지고 있지만(예를 들어, 미토콘드리아 막23),미토콘드리아 막 투과및 ROS 향상없음 관찰하였다(그림3 및 그림 4). 이러한 관찰에 대한 설명은 측면 섬유-섬유상호작용(23,32)에의한 HEWL 섬유의표면 소수성의감소와관련될 수 있으며, 이는 막 손상을 유발하는 능력의 상실을 초래한다.
소 인슐린의 경우,섬유형성(22)의과정에서 소수성 영역의 유의한 노출에도 불구하고, 25 μM 아밀로이드 섬유소(도 3)를 첨가할 때 약간의 효소 방출이 관찰되었다(그림3)에큰 영향을 미치지 않고 미토콘드리아 ROS 콘텐츠(그림 4). 뇌 미토콘드리아와 소 인슐린 섬유모두표면(24)에서부정적인 제타 전위를 지니고 있기 때문에, 미토콘드리아 막과 소 인슐린 아밀로이드 섬유소 사이의 반발력이 무기능을 설명할 수 있다고 제안됩니다. 효과적으로 상호 작용하고 미토콘드리아 막을 손상24. α-시누클레인 피브릴을 첨가한 후 가장 높은 투과및 미토콘드리아 ROS 증분을 관찰하였다(도3 및 도 4).
이러한 관찰은 미토콘드리아와 같은 표면33,34,음전하를 가진 생물학적 막과 상호작용하는 α-synuclein의 고용량에 기인할 수 있다. 이와 관련하여, 일부 연구는 α-synuclein을 미토콘드리아로 특정 결합 및 수입을 보여주었으며, 여기서 그들은 주로 내부 막(35)과관련이 있게된다. 흥미롭게도, Ghio 등은 카디오리핀(내부 미토콘드리아 막에서 유일하게 농축된 인지질)에 의해 매개되는 결합, α-시누클레인의 미토콘드리아 막의 연관성 및 파괴를 위한 중요한 메커니즘일 수 있다고보고36.
흥미롭게도, 아밀로이드 β-펩티드, α-시누클레인, 헌팅틴 및 ALS 연계 돌연변이 SOD1을 미토콘드리아35,37, 37,등 다양한 아밀로이드 펩티드 및 단백질의 결합 및 축적에 대한 명확한 증거가있다. 38,39. 더욱이, 이전 연구는 아밀로이드 β (25-35)15 및 SOD 140의 아밀로이드 가셈이 미토콘드리아 막 투과와 상호 작용하고 일으키는 능력을 가지고 있음을 입증했다. 문헌에 따르면, 아밀로이드 섬유는 막을 교차하기에 너무 큰 것이 좋습니다; 그러므로, 평균 섬유소 크기는 소 인슐린과 HEWL 아밀로이드 섬유에 의해 유도된 효력의 명백한 부족에 있는 요인이 되어서는 안됩니다. 관련된 상세한 메커니즘을 밝히기 위해 추가 연구가 필요하지만, 아밀로이드 섬유소의 생체 물리학적 특징(즉, 표면 전하, 소수성 및 특정 서열 표적 미토콘드리아 막을 소유하는 것)이 제안된다. 상호 작용 하 고 생물 막 손상 그들의 능력에 중요 한 역할을 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 기본 과학 연구소 (IASBS), 잔잔, 이란의 연구위원회의 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
| Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
| Black 96-well plate | Corning | ||
| Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
| Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
| Centrifuge | Sigma | ||
| Crystal clear sealing tape | Corning | ||
| CuSO4 | Sigma | 451657 | |
| Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
| Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Fluorescence plate reader | BioTek | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
| Folin | Merck | F9252 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Guillotine | Made in Iran | ||
| HCl | Merck | H1758 | |
| Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
| Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
| NaOH | Merck | S8045 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
| Percoll | GE Healthcare | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
| Quartz cuvette | Sigma | ||
| Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
| Succinate | Sigma | S2378 | |
| Sucrose | Merck | 1076871000 | |
| Thermomixer | Eppendorph | ||
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
| Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tryptone | QUELAB | ||
| Water bath | Memmert | ||
| Yeast Extract | QUELAB | ||
| β-NADH | Sigma | N8129 |
References
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