Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Amiloid Fibrils ile Beyin Mitokondrisi ile Etkileşimler ve Membran Permeabilizasyonu

Published: September 28, 2019 doi: 10.3791/59883
Automatic Translation
1, *1, *1, *1, *1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, 45137-66731, Iran
* These authors contributed equally

Summary

Burada verilen farklı dokulardan ve beynin çeşitli bölgelerinden izole mitokondri ile farklı peptidler ve proteinlerin yerli formu, prefibrillar ve olgun amiloid fibrils arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir protokoldür.

Abstract

Kanıt büyüyen bir vücut membran permeabilizasyon gösterir, mitokondri gibi iç membranlar da dahil olmak üzere, nörodejeneratif hastalıklarda amiloid agrega kaynaklı toksisite ortak bir özellik ve birincil mekanizma. Ancak, membran bozulma mekanizmaları açıklayan raporların çoğu fosfolipid model sistemlerine dayanmaktadır ve biyolojik membranlar düzeyinde meydana gelen olayları doğrudan hedefleyen çalışmalar nadirdir. Burada açıklanan membran düzeyinde amiloid toksisite mekanizmaları incelemek için bir modeldir. Mitokondriyal izolasyon için, yoğunluk gradyan ortamı minimal miyelin kontaminasyonu ile preparatlar elde etmek için kullanılır. Mitokondriyal membran bütünlüğü doğruladıktan sonra α-sinüklein, büyükbaş insülin ve tavuk yumurtası aknüksü (HEWL) ile sıçan beyni mitokondrisinden kaynaklanan amiloid fibrillerin in vitro biyolojik model olarak etkileşimi araştırılır. Sonuçlar fibriller meclisleri ile beyin mitokondri tedavisi membran permeabilizasyon ve ROS içerik geliştirme farklı derecelerde neden olabileceğini göstermektedir. Bu amiloid fibriller ve mitokondriyal membran arasındaki yapıya bağlı etkileşimleri gösterir. Amiloid fibrillerin biyofiziksel özellikleri nin ve mitokondriyal membranlara özel bağlanmasının bu gözlemlerin bazılarına açıklama getirebileceği ileri sürülebilir.

Introduction

Amiloidoz olarak bilinen amiloid ile ilişkili bozukluklar, farklı doku ve organlarda çözünmez protein yataklarının görünümü ile tanımlanan hastalıkların büyük bir grup oluşturmaktadır1,2. Bunlar arasında nörodejeneratif bozukluklar, protein agregalarının merkezi veya periferik sinir sisteminde en sık görülen formlardır2. Amiloid agregalarının toksisitesi dahil olduğu öne sürülse de3, amiloid patolojisinin birincil mekanizması olarak hücre zarının bozulması na ve permeabilizasyonuna işaret eden kanıt ların giderek arttığı bir vücut4, 5. Plazma zarına ek olarak, iç organeller (yani, mitokondri) de etkilenebilir.

İlginçtir, ortaya çıkan kanıtlar mitokondriyal disfonksiyon nörodejeneratif bozuklukların patogenezinde kritik bir rol oynadığını göstermektedir, Alzheimer ve Parkinson hastalıkları da dahil olmak üzere6,7. Bu soruna uygun olarak, çok sayıda rapor bağlanma ve amiloid β-peptid birikimi göstermiştir, α-sinüklein, Huntingtin, ve ALS bağlı mutant SOD1 proteinleri mitokondri8,9,10, 11. Amiloid agregalar tarafından membran permeabilizasyon mekanizması ya ayrık kanalların oluşumu ile meydana geldiği düşünülmektedir (gözenekleri) ve / veya nonspesifik bir deterjan benzeri mekanizma ile5,12, 13. yıl. Bu sonuçların çoğunun fosfolipid model sistemlerini içeren raporlara dayandığı ve biyolojik membranlarda meydana gelen olayları doğrudan hedef alan çalışmaların nadir olduğu dikkat çekicidir. Açıkçası, Bu yapay lipid iki katmanları mutlaka biyolojik membranların içsel özelliklerini yansıtmaz, mitokondri olanlar da dahil olmak üzere, heterojen yapılar ve fosfolipidler ve proteinlerin geniş bir yelpazede oluşan.

Bu çalışmada, sıçan beyinlerinden izole edilen mitokondri, α-sinükleinden kaynaklanan amiloid fibrillerin (amiloidojenik protein olarak), sığır insülininin (bir model peptid olarak gösteren bir model peptid olarak) yıkıcı etkilerini incelemek için in vitro biyolojik bir model olarak kullanılmaktadır. enjeksiyon lokalize amiloidoz dahil insan insülin ile önemli yapısal homoloji), ve tavuk yumurtası beyaz lysozyme (HEWL; amiloid agregasyon çalışması için ortak bir model protein olarak). Amiloid fibriller tarafından indüklenen mitokondriyal membranların etkileşimleri ve olası hasarı mitokondriyal magenaz (MDH) (mitokondriyal matrikste bulunan) ve mitokondri reaktif oksijen salınımı gözlemleyerek araştırılır. türler (ROS) geliştirme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri Tahran Üniversitesi Tıp Bilimleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) uyarınca yapılmıştır. Giyotin bıçaklarını keskinleştirerek ve bıçağın kararlı ve hızlı hareketlerini uygulayarak farelere yönelik acı ve zararlı etkileri en aza indirmek için maksimum çaba sarf edildi.

1. Beyin homojenizasyonu ve mitokondriyal izolasyon

NOT: Mitokondriyal izolasyon için tüm reaktifler Sims ve Anderson14'egöre hazırlanmıştır.

  1. Mitokondriyal izolasyon için tampon hazırlanması
    1. 100 mM Tris-HCl çözeltisi hazırlayın: 0,605 g Tris-HCl ağırlığında ve yaklaşık 40 mL deiyonize su (DW) içinde bir kabın içinde çözün. Çözümü 50 mL hacimsel bir şişeye aktarın ve DW ekleyerek son hacmi 50 mL'ye yükseltin.
    2. 10 mM EDTA çözeltisi hazırlayın: 0,202 g EDTA ağırlığında ve bir kabın içinde yaklaşık 40 mL DW içinde çözün. Çözümü 50 mL hacimsel bir şişeye aktarın ve DW ekleyerek son hacmi 50 mL'ye yükseltin.
      NOT: Her iki çözelti de en az 4 hafta 4 °C'de saklanabilir.
    3. Tris-HCl/EDTA/sakaroz stok çözeltisi hazırlayın: 30 mL 100 mM Tris-HCl ve 30 mL 10 mM EDTA'yı bir kabın içinde ekleyin. Tartmak 32.86 g sakaroz ve manyetik bir karıştırıcı ile karıştırArak kabına ekleyin. Sakaroz çözündüğünde, çözeltiyi 100 mL hacimsel bir şişeye aktarın ve DW ekleyerek son hacmi 100 mL'ye yükseltin.
      NOT: Bu çözelti 4 °C'de 3 güne kadar saklanabilir.
    4. İzolasyon arabelleği (IB): 100 mL Tris-HCl/EDTA/sakaroz stoğunu yaklaşık 150 mL DW'ye ekleyin. 0,1 M HCl ekleyerek pH'ı 7,4'e ayarlayın. DW ekleyerek son hacmi 300 mL'ye yükseltin.
    5. 1,5 mL yoğunluk gradyan orta ilave edilerek IB ile %15 (v/v) yoğunluk gradyan ortamı nı 8,5 mL soğuk IB'ye ekleyerek hazırlayın.
    6. Hazırlamak 10 mg /mL sığır serum albumin (BSA) çözeltisi: 20 mg yağ asidi içermeyen BSA ağırlığında ve 2 mL şişede yaklaşık 1,5 mL DW içinde çözün. DW ekleyerek son hacmi 2 mL'ye yükseltin ve kullanıma kadar buzüzerinde saklayın.
      NOT: Mitokondriyal izolasyon gününde 1.1.4-1.1.6 adımlarından gelen çözümleri taze olarak hazırlayın ve kullanıma kadar buzüzerinde saklayın.
  2. Fare beyninin izolasyonu
    NOT: Erkek sıçanların beyin lerinin kesilmesi ve beyin denzimi (150-200 g) Sims ve Anderson14'egöre yapılmıştır.
    1. Bir buz kovasına 30 mL'lik bir kabı koyun ve kabına 10 mL soğuk IB ekleyin.
    2. Küçük bir hayvan giyotin ile sıçan decapitate ve mitokondriyal özelliklerinin bozulmasını sınırlamak için decapitation 1 dakika içinde kafatasından beyin kaldırmak.
    3. Beyni soğuk IB içeren kabına hızla aktarın.
  3. Beyin homojenizasyonu ve mitokondri hazırlanması
    NOT: Mitokondriyal kesirler Sims ve Anderson14tarafından açıklanan protokole göre izole edildi , daha önce açıklandığı gibi bazı değişiklikler ile15. Bu hızlı bir şekilde çalışmak ve prosedür boyunca buz üzerinde her şeyi tutmak önemlidir.
    1. Doku 2x IB 30 mL ile yıkayın, soğuk IB içeren bir beher transfer, ve ince makas ile beyin kıyma.
    2. Önceden soğutulmuş IB (sıçan beyni başına yaklaşık 10 mL IB) 10 cilt ekleyin.
    3. Doku süspansiyonuna 20 mL soğuk Dounce homogenizer aktarın.
    4. Bir motorlu pestle ile dokuz yukarı ve aşağı vuruş kullanarak doku parçaları homojenize.
      NOT: Homojenin soğuk kalmasını sağlamak için karışımı üç homojenizasyon vuruşundan sonra yaklaşık 30 s kadar buz üzerinde bırakın.
    5. Homojeni önceden soğutulmuş 10 mL santrifüj tüpe ve santrifüje 1300x g ve 4 °C'de 3 dakika aktarın.
    6. Supernatant'ı dikkatlice decant ve önceden soğutulmuş 10 mL santrifüj tüp ve santrifüj21.000x g 4 °C'de 10 dakika boyunca aktarın.
    7. Supernatant atın ve soğuk bir% 15 yoğunluk gradyan orta çözelti (her beyin için 5 mL) yavaşça bir pipet ile karışımı karıştırarak pelet resuspend.
    8. Sabit açılı rotorda 30.700 x 4 °C'de 5 dakika yavaş hızlanma (0 rpm'den 500 rpm'ye kadar 45 s) ve ardından normal hızlanma (fren yok) kullanarak santrifüj. Bu iki farklı malzeme bandı oluşturmalıdır(Şekil 1A, solda).
    9. Pasteur pipeti kullanarak, çoğunlukla miyelin içeren degradenin üst kısmında biriken keskin malzeme bandını çıkarın. Daha sonra, bant 2'deki zenginleştirilmiş mitokondriyal fraksiyonundan herhangi birini kaybetmeden malzemeyi (bant 2'de) örten yoğunluk gradyan orta çözeltisini mümkün olduğunca çıkarın.
      NOT: Grup 2 hem sinaptik hem de sinaptik olmayan mitokondriyi içerir.
    10. Mitokondriyal fraksiyona 8 mL IB eklerken karışımı bir pipetle hafifçe karıştırın.
    11. 10 dk için 4 °C'de 16.700 x g'de santrifüj edin ve alt takibe rahatsız edilmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın.
    12. Santrifüj tüpüne 1 mL 10 mg/mL yağ asidi içermeyen BSA ekleyin ve karışımı pipet ucuyla hafifçe karıştırın. IB ekleyerek beyin başına 5 mL son hacmi artırın.
    13. Santrifüj 6.900x g 4 °C 10 dakika için, hangi bir firma pelet üretmelidir(Şekil 1A, sağ).
    14. Supernatant decant ve yavaşça IB mitokondriyal pelet resuspend, 0.5 mL tüpler içine aliquot ve kullanıma kadar sıvı nitrojen saklayın.

2. Protein konsantrasyonu tayini

NOT: Protein konsantrasyonu Lowry ve ark.16yöntemi kullanılarak ölçülür.

  1. Lowry tsay için çözümlerin hazırlanması
    1. A çözeltisini hazırlayın: 0,4 g NaOH ve 2 g Na2CO3 ağırlığında ve 80 mL DW'de çözünün, ardından çözeltiyi 100 mL hacimsel bir şişeye aktarın ve DW ekleyerek hacmi 100 mL'ye yükseltin.
    2. Çözelti sin B: 0,1 g potasyum sodyum tartarat ve 0,05 g CuSO4 tartat ve 8 mL DW içinde çözünür, sonra 10 mL hacimsel bir şişe ye solüsyonu aktarın ve DW ekleyerek hacmi 10 mL'ye çıkarın.
      NOT: Her iki A ve B çözeltisi de 4 °C'de 6 aya kadar sabit kalabilir.
    3. Çözelti yi hazırlayın C: 7,5 mL DW'ye 0,5 mL folin çözeltisi ekleyin.
      NOT: Çözelti C'yi taze hazırlayın ve kullanıma kadar ışıktan uzak tutun.
    4. 0, 20, 40, 60, 80, 100 ve 120 μg/mL son konsantrasyonları ile BSA standartlarını hazırlamak 0, 20, 40, 60, 80, 100 ve 120 μL 1 mg/mL BSA'yı birleştirerek 1000 μL çözelti yapmaya yetecek kadar DW ile hazırlayın.
  2. Protein konsantrasyonu ölçümü
    NOT: Daha fazla doğruluk için bu adımı triplicate olarak çalıştırın.
    1. 96 kuyu plakasının her kuyuya 50 μL standart çözelti ve mitokondriyal homojen ekleyin ve ardından 45 μL'lik a çözeltisi ekleyin. Daha sonra, 50 °C'de belirlenen ılık su banyosunda tabağı 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    2. 5 μL çözelti B ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) karanlıkta 10 dakika boyunca plakayı kuluçkaya yatırın.
    3. 150 μL çözelti C ekleyin ve 50 °C'de belirlenen ılık su banyosunda tabağı 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    4. Plakayı bir plaka okuyucusuna yükleyin ve 650 nm'de standartlar ve mitokondriyal süspansiyon için emicideğerleri kaydedin. Daha sonra, bir kalibrasyon eğrisi kullanarak, mitokondri protein içeriğini hesaplamak.

3. Mitokondriyal membran bütünlüğü tayini

NOT: Triton X-100 ile membran bozulmasından önce ve sonra izole mitokondride maat dehidrogenaz (MDH) aktivitesi ölçülerek mitokondriyal membran bütünlüğü doğrulanır.

  1. Seyreltik mitokondriyal homojen 1 mg/mL soğuk IB ile ve iki yerleştirilir 1.5 mL tüpler (genellikle tüp başına mitokondri 195 μL).
  2. Bir tüpe %20 (v/v) Triton X-100 (DW ile seyreltilmiş) 5 μL (maksimum enzim aktivitesi için pozitif kontrol olarak) ve 5 μL DW'yi başka bir tüpe (kontrol için) ilave edin ve ardından bir karıştırıcı ile karıştırın.
  3. Tüpleri 30 °C'de ılık su banyosunda 10 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. 16.000 x g ve 4 °C'de 15 dk.'da sabit açılı rotordaki tüplerin santrifüjü ile pelet mitokondrisi.
  5. Aşağıdaki bölümde açıklanan standart bir spektrofotometrik test kullanarak mitokondriyal MDH aktivitesini tetmek için ortaya çıkan süpernatantları dikkatlice toplayın.
  6. Mitokondriyal membranın bütünlüğünü aşağıdaki gibi hesaplayın:
    Equation 1

4. MDH faaliyet tayini

NOT: MDH aktivitesi Sottocasa ve ark.17tarafından açıklandığı gibi spektrofotometrik olarak ölçüldü.

  1. MDH aktivite tsanına yönelik çözümlerin hazırlanması
    1. 50 mM Tris-HCl çözeltisi (pH = 7,5): Tris-HCl kullanarak DW'de 7,9 mg/mL çözeltihazırlayın ve pH'ı 25 °C'de 1,0 M NaOH ile 7,5'e ayarlayın.
    2. 50 mM oksaloasetat çözeltisi hazırlayın: Tris-HCl'de okaloasetat kullanarak 6.6 mg/mL çözelti hazırlayın.
      NOT: Bu çözelti bir kez çözümde sabit değildir ve kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır.
    3. 10 mM β-NADH çözeltisi hazırlayın: Tris-HCl'de β-NADH kullanarak 7.81 mg/mL çözelti hazırlayın.
  2. MDH faaliyet tayini
    NOT: 1.0 mL reaksiyon karışımındaki son tahlil konsantrasyonları 50 mM Tris-HCl, 5 mM okaloasetat ve 0.1 mM β-NADH'dır.
    1. Spektrofotometreyi 25 °C ve 340 nm'ye ayarlayın. Pipet 890 μL Tris-HCl tamponu, 100 μL oksaloasetat çözeltisi ve boş bir cuvette ve 880 μL Tris-HCl tamponuna 10 μL NADH çözeltisi, 100 μL oksaloasetat çözeltisi ve 10 μL NADH çözeltisi numune cuvette içine.
    2. 3-4 dk ve boş karşı referans için spektrofotometre içinde kuluçka cuvettes.
    3. Daha sonra örnek cuvette 10 μL mitokondriyal homojenate (1 mg/mL) ekleyin, hemen ters çevrilerek karıştırın ve 1 dk için 340 nm'de NADH oksidasyonuna bağlı olarak absorbansta rekor düşüşler kaydedin.

5. In vitro α-sinüklein, sığır insülin ve HEWL fibril oluşumu

  1. Protein hazırlama
    1. α-synüklein:
      NOT: Rekombinant α-sinüklein ekspresyonu ve saflaştırması Hoyer ve ark.18 tarafından bazı değişikliklerle tanımlanır ve α-sinüklein saflığı SDS-PAGE tarafından doğrulanır.
      1. Bir gecede fosfat tamponlu saline (PBS) karşı saflaştırılmış α-sinüklein diyaliz.
      2. 275 nm 19'da 5600 M-1 cm-1'lik bir yok olma katsayısı kullanarak proteinkonsantrasyonununbelirlenmesi.
      3. Aliquots protein 1.5 mL tüpler ve kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
    2. Sığır insülin ve HEWL:
      1. Hem büyükbaş insülin hem de HEWL sağlayın.
      2. Her proteini 50 mM glisin tamponunda çözün (pH = 1.6; pH'ı HCl ile ayarlayın).
      3. 276 nm ve 280 nm, sırasıyla20,211.0 mg/mL için 1.0 ve 2.63 bir yok olma katsayısı kullanarak sığır insülin ve HEWL konsantrasyonu belirleyin.
  2. Amiloid fibrilasyon indüksiyonu
    1. Amiloid fibrilasyon için çözelti hazırlanması:
      1. Tioflavin T (ThT) tamponunu hazırlayın: 0,3 g NaH2PO4 ağırlığında ve 80 mL DW'de eritin, pH'ı 6,5'e ayarlayın ve DW ekleyerek hacmi 100 mL'ye yükseltin.
      2. ThT stok çözeltisini (5 mM) hazırlayın): 1,6 mg ThT ağırlığında ve 1 mL ThT tamponunda eritin, 0,22 μm'lik filtre kağıdından geçirin ve kullanıma kadar 4 °C'de ışıktan uzak tutun.
        NOT: Bu çözelti 4 °C'de 4 haftaya kadar saklanabilir.
      3. ThT çözeltisini hazırlayın (1 mM): 200 μL ThT stok çözeltisi (5 mM) ila 800 μL ThT tampon ekleyin.
        NOT: Bu çözelti 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.
    2. In vitro α-synüklein amiloid fibril oluşumu:
      1. 1,5 mL'lik tüplere protein çözeltisi (200 μM) ve 6 μL ThT çözeltisi (1 mM) ekleyin.
      2. Tüpleri 37 °C'de bir termomikte 800 rpm'de 4 gün boyunca sürekli karıştırarak tüplerle inküler.
      3. Düzenli zaman aralıklarından sonra kuluçkaya yatan numunelerden (10 μL) alın ve 490 μL ThT tamponu ekleyin, iyice karıştırın ve RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
      4. Uyarma ve emisyon yarık genişliklerini sırasıyla 5 nm ve 10 nm olarak ayarlayın ve 440 nm'de uyarma ve 485 nm'de floresan spektrofotometre ile emisyon ölçün.
    3. In vitro sığır insülin amiloid fibril oluşumu:
      1. 1,5 mL tüpe 637 μL protein çözeltisi (250 μM) ekleyin. Daha sonra 13 μL ThT çözeltisi (1 mM) ekleyin ve ardından karıştırın.
      2. 20 μM ThT içeren protein çözeltisi (200 μL) temiz dipli 96 kuyu plakasının her kuyuya aliquots (200 μL) ekleyin ve plakayı kristal berraklığında sızdırmazlık bandıile kapatın.
      3. Plakayı bir floresan levha okuyucusuna yükleyin ve ajitasyon olmadan 57 °C'de kuluçkaya yatırın.
      4. ThT floresanını 30 dk aralıklarla, 440 nm'de uyarma ve 485 nm'de emisyon la 12 saat ölçün.
        NOT: Her ölçümden önce plakayı 5 s kadar çalkalayın.
    4. In vitro HEWL amiloid fibril oluşumu:
      1. 20 μM ThT içeren protein çözeltisi (1 mM) aliquots (1 mM) açık dipli 96 kuyu plakasının her kuyuya ekleyin ve plakayı kristal berraklığında sızdırmazlık bandı ile kapatın.
      2. Plakayı bir floresan levha okuyucusuna yükleyin ve ajitasyon olmadan 57 °C'de kuluçkaya yatırın.
      3. ThT floresanını 2 saat aralıklarla, 440 nm'de uyarma ve 485 nm'de 485 nm'de 4 gün boyunca emisyon ölçün.
        NOT: Her üç protein için de amiloid fibril oluşumu atomik kuvvet mikroskobu ile doğrulanır (Şekil 2B).

6. Amiloid fibriller, MDH salınım teksi ve ROS ölçümü ile mitokondri tedavisi

  1. Amiloid fibriller ile izole mitokondri inkübasyonu
    1. Santrifüj ve ılık su banyosunu açın ve sırasıyla 4 °C ve 30 °C'ye ayarlayın.
    2. IF kullanarak, 1 mg/mL son konsantrasyona mitokondriyal homojen.
    3. Mitokondriyal homojenler içeren 1.5 mL'lik iki tüp serisi hazırlayın (MDH salınım ıstasalı analiz için bir seri ve mitokondriyal ROS ölçümü için başka bir seri).
    4. Α-synüklein, büyükbaş insülin veya HEWL'nin taze veya amiloid fibrüllerini ekleyin (5 μM, 10 μM, 20 μM ve 25 mm son konsantrasyonlarda; pbs veya glisin tamponu kontrol olarak kullanın) mitokondriyal homojenat (son hacim = 200 μL) (bkz. Tablo 1, Tablo 2 , ve Tablo 3) yavaşça bir pipet ile çözelti karıştırma izledi.
      NOT: MDH salınım testi için, maksimum enzim salınımı için pozitif kontrol olarak Triton X-100'ü (%0,5 nihai konsantrasyonda [v/v]) kullanın.
    5. 30 °C'ye ayarlanmış ılık su banyosunda 30 dk mitokondriyal süspansiyon içeren kuluçka tüpleri.
    6. Bölüm 6.2 ve 6.3'te belirtildiği gibi mitokondriyal MDH salınımı ve ROS içeriğini ölçün.
  2. Mitokondriyal MDH serbest tayı
    1. 15 dakika boyunca 16.000 x g'de kuluçkaya yatan mitokondriyal homojenleri santrifüj edin, sonra bölüm 4'te açıklandığı gibi mitokondriyal MDH'nin aktivitesini saptamak için ortaya çıkan süpernatanları dikkatlice toplayın.
    2. MDH'nin serbest bırakılmasını maksimum etkinin (Triton X-100) bir kesiti olarak aşağıdaki gibi hesaplayın:

Equation 1

  1. Mitokondriyal ROS ölçümü
    NOT: Oksidasyona duyarlı florojenik öncül dihidrodichlorocarboxyfluorescein diasetat (DCFDA)22ile mitokondriyal ROS içeriği belirlenir.
    1. Mitokondriyal ROS ölçümü için çözümler hazırlayın. Metanolde eriterek 50 μM DCFDA çözeltisi hazırlayın (taze hazırlayın) ve DW'de eriterek 200 mM sinknat çözeltisi hazırlayın.
    2. Pipet 191 μL inkümlenmiş mitokondriyal homojen 96 kuyunun her kuyusu ve 4 μL 50 μM DCFDA (1 μM son konsantrasyon) ve 5 μL 200 mM sközat (5 mM son konsantrasyon) ekleyin.
    3. Tabağı 30 °C'de ılık su banyosunda 30 dakika boyunca hafifçe karıştırarak kuluçkaya yatırın.
    4. Plakayı bir floresan levha okuyucuya yükleyin ve floresan şiddetini ölçün, 485 nm'de uyarma ve 530 nm'de emisyon.

7. İstatistiksel analiz

  1. Tüm deneyleri en az 2x veya 3x triplicate tahlilleri ile gerçekleştirin ve uygun istatistiksel testler yapın. Burada sonuçlar ortalama ± SD olarak sunulmuş ve istatistiksel anlamlılık hesaplamak için öğrencinin eşleştirilmiş t-testi kullanılmıştır. 0.01 ve 0.05'ten küçük P değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi (*p < 0.05; **p < 0.01).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokol bir in vitro biyolojik model olarak sıçan beyin mitokondri ile amiloid fibril etkileşimleri incelenmesi için bir model açıklar. Mitokondriyal preparat için beyin dokusunun majör kontaminasyonu olarak miyelini çıkarmak için %15 (v/v) yoğunluk gradyan ortamı kullanılmıştır14. Şekil 1A'dagösterildiği gibi, 30.700 x g'daki santrifüj, zenginleştirilmiş mitokondriyal fraksiyoniçeren miyelin (bant1'in ana bileşeni olarak) ve bant 2 olmak üzere iki ayrı malzeme bandı üretti.

Sims ve Anderson14tarafından tanımlanan protokolü değiştirerek, hem sinaptik hem de sinaptik olmayan mitokondri içeren bir mitokondriyal süspansiyon hazırlandı. Saf non-sinaptik mitokondri hazırlanması için, Sims ve Anderson daha önce protokol14ayrıntılı . Santrifüjün son basamacında, 10 mg/mL yağ asidiiçermeyen BSA sağlam bir mitokondriyal pelet elde etmek için eklenmiştir (Şekil 1A). Protokolde açıklandığı gibi, triton X-100 tarafından membran bozulması ve enzim salınımından önce ve sonra izole mitokondride MDH aktivitesi ölçülerek mitokondriyal membran bütünlüğü değerlendirildi.

Tipik olarak mitokondriyal preparatların %93 oranında sağlam olduğu saptamıştır(Şekil 1B). Amiloid fibrillerin büyümesini izlemek için ThT floresan tartışımı yapıldı. Şekil 2A'dagösterildiği gibi, üç proteinin amiloid fibrilasyon eğrisi tipik bir sigmoidal desen gösterdi, daha önce bildirilen bu proteinlerin nükleasyona bağımlı polimerizasyon modelleri ile uyumlu olan23,24 ,25. Α-sinüklein, büyükbaş insülin ve HEWL için en yüksek ThT floresan emisyonu sırasıyla 96 saat, 12 saat ve 96 h'den sonra gözlendi ve amiloid fibrillerin oluşumunu düşündürdü (Şekil 2A). Bu daha fazla AFM ölçümü ile doğrulandı.

Şekil 2B'degösterildiği gibi, amiloidojenik koşullarda kuluçkaya yatırılan üç proteinde tipik amiloid morfolojisi ile iyi tanımlanmış olgun fibriller gözlendi. Amiloid fibriller tarafından mitokondriyal membranların olası hasarı ve permeabilizasyonu araştırıldı. Bu, mitokondriyal MDH ve mitokondriyal ROS ölçümünün α-sinüklein, sığır insülini veya HEWL amiloid fibrillerin mitokondriyal süspansiyonlara eklenmesi üzerine salınımının izlenmesi ve belirtilen prosedürleri izleyerek gerçekleştirilmiştir. Ön deneyler, ThT'nin (3 μM'ye kadar) varlığının MDH salınımı ve mitokondriyal ROS içeriği üzerinde hiçbir etkisi olmadığını göstermiştir (veriler gösterilmemiştir).

Şekil 3'tegösterildiği gibi, α-sinüklein amiloid fibrillerin konsantrasyona bağlı olarak mitokondriye eklenmesi yle MDH'nin önemli salınımı gözlendi. Sığır insülin amiloid fibrillerin eklenmesi yle hafif salınım saptanmasına rağmen HEWL fibrillerinin etkisiz olduğu saptanmıştır(Şekil 3). Sığır insülini veya HEWL amiloid fibrillerin eklenmesi yle mitokondriyal ROS içeriğinde önemli bir gelişme gözlenmezken, α-sinüklein fibrilleri ile tedavi, beyin mitokondrisinin ROS içeriğinde önemli bir artışa yol açtı. konsantrasyona bağımlı şekilde (Şekil 4).

Figure 1
Şekil 1: Mitokondriyal izolasyon ve membran bütünlüğü tayini. (A) Sol: santrifüj ile takip eden soğuk% 15 yoğunluk gradyan orta çözeltide pelet resuspend sonra bir santrifüj tüp tipik görünümü. Myelin üst te birikir bant 1, ana bileşenidir. Bant 2 son derece zenginleştirilmiş mitokondriyal fraksiyonu içerir. Sağ: 10 mg/mL yağ-asitsiz BSA ilave edildikten sonra firma pelet ilerlemiş ve 6900 x g. (B) Mitokondriyal membran bütünlüğü izole mitokondri öncesi ve sonrası MDH aktivitesi ölçülerek santrifüj Triton X-100 ile membran bozulması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Α-sinüklein, sığır insülini ve HEWL amiloid fibrilasyon. (A) Amiloid fibril oluşumunun kinetik 485 nm tht floresan yoğunluğunu artırarak gösterilir. (B) Düzenli olarak amiloidojenik koşullarda kuluçkaya yatırılan üç proteinin AFM görüntüleri gösterilmiştir. Ölçek çubukları 500 nm'yi temsil ediyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Α-sinüklein, sığır insülini ve HEWL monomer ve amiloid fibril ile etkileşim üzerine mitokondriyal MDH salınımı. Serbest lik % 0.5 (v/v) Triton X-100 ile tedavi de gözlenen maksimum yüzdesi olarak ifade edilir. Her değer ortalama ± SD'yi temsil eder (n = 3; *p < 0.05, **p < 0.01). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Α-sinüklein, sığır insülini ve HEWL monomer ve amiloid fibril ile etkileşim üzerine mitokondriyal ROS içeriği. Veriler kontrol mitokondri değerlerinin yüzdesi olarak ifade edilir. Her değer ± SD (n = 3; *p < 0,05; **p < 0,01) ortalamasını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Mitokondriyal homojen (1 mg/mL) α-synüklein monomer (200 μM) α-synuclein fibril (200 μM) İzolasyon arabelleği Pbs Triton x-100 %20 (v/v)
Denetim 175 μL 0 0 25 μL 0 0
Pbs 175 μL 0 0 0 25 μL 0
Monomer 25 μM 175 μL 25 μL 0 0 0 0
Fibril 5 μM 175 μL 0 5 μL 20 μL 0 0
Fibril 10 μM 175 μL 0 10 μL 15 μL 0 0
Fibril 20 μM 175 μL 0 20 μL 5 μL 0 0
Fibril 25 μM 175 μL 0 25 μL 0 0 0
Pozitif kontrol 175 μL 0 0 20 μL 0 5 μL

Tablo 1: Mitokondrinin çeşitli α-sinüklein amiloid fibrillerle tedavisi.

  Mitokondriyal homojen (1 mg/mL) Büyükbaş insülin monomer (250 μM) Büyükbaş insülin fibril (250 μM) İzolasyon arabelleği Glisin tamponu Triton x-100 %20 (v/v)
Denetim 175 μL 0 0 25 μL 0 0
Glisin tamponu 175 μL 0 0 0 25 μL 0
Monomer 25 μM 175 μL 20 μL 0 5 μL 0 0
Fibril 5 μM 175 μL 0 4 μL 21 μL 0 0
Fibril 10 μM 175 μL 0 8 μL 17 μL 0 0
Fibril 20 μM 175 μL 0 16 μL 9 μL 0 0
Fibril 25 μM 175 μL 0 20 μL 5 μL 0 0
Pozitif kontrol 175 μL 0 0 20 μL 0 5 μL

Tablo 2: Sığır insülin amiloid fibriller çeşitli konsantrasyonlarda mitokondri tedavisi.

  Mitokondriyal homojen (1 mg/mL) HEWL monomer (1 mM) HEWL fibril (1 mM) İzolasyon arabelleği Glisin tamponu Triton x-100 %20 (v/v)
Denetim 175 μL 0 0 25 μL 0 0
Glisin tamponu 175 μL 0 0 0 25 μL 0
Monomer 25 μM 175 μL 5 μL 0 20 μL 0 0
Fibril 5 μM 175 μL 0 1 μL 24 μL 0 0
Fibril 10 μM 175 μL 0 2 μL 23 μL 0 0
Fibril 20 μM 175 μL 0 4 μL 21 μL 0 0
Fibril 25 μM 175 μL 0 5 μL 20 μL 0 0
Pozitif kontrol 175 μL 0 0 20 μL 0 5 μL

Tablo 3: HeWL amiloid fibriller çeşitli konsantrasyonlarda mitokondri tedavisi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Deneysel sonuçlar zenginliği fibriller agregaların sitotoksisitesi önemli ölçüde etkileşim ve biyolojik membranlar 4 permeabilize yetenekleri ile ilişkili olduğu hipotezini destekler4,5. Ancak, verilerin çoğu mutlaka fosfolipidler ve proteinlerin geniş bir yelpazede heterojen yapılar olan biyolojik membranların içsel özelliklerini yansıtmayan yapay lipid iki katmanları dayanmaktadır. Burada beyin mitokondrisi in vitro biyolojik membran olarak kullanılmakta, membran düzeyinde fibriller agregaların sitotoksisitesini incelemek için bir model tanımlanmıştır.

Deney sırasında, hızlı bir şekilde çalışmak ve bozulmamış membranlar ile fonksiyonel olarak aktif mitokondri hazırlamak için buz üzerinde her şeyi tutmak önemlidir. Ayrıca, mitokondriyal konsantrasyon (toplam protein ölçümüne dayalı) membran-amiloid fibril etkileşimini etkileyen önemli bir faktördür; bu nedenle, protokol boyunca sabit tutulmalıdır. Bu çalışmada mitokondriyal preparatlar hem sinaptik hem de sinaptik olmayan mitokondriyi içermişler. Saf non-sinaptik mitokondriyal preparat için, 40%, 23%, ve 15% yoğunluk gradyan orta kullanılmalıdır, Sims ve Anderson tarafından açıklandığı gibi14. Mitokondri iyi karakterize bir membrana sahip bir organel olduğundan, membran düzeyindeki amiloid sitotoksisite mekanizmaları ile ilgili moleküler çalışmalarda son derece yararlı bir biyolojik model sistemi olarak hizmet verebilir (özellikle nörodejeneratif hastalıklar). Bu protokol, farklı bölmelerde bulunan çeşitli molekül ve enzimlerin salınımını araştırarak mitokondriyal membranların permeabilizasyonetkileşimlerinin ve kapsamının araştırılmasına olanak sağlar (yani dış ve iç zarlara gömülü olanlar ve intermembran uzay veya mitokondriyal matris bulunan).

Mitokondriyal membran bütünlüğü doğrulanmasından sonra(Şekil 1B) ve amiloid fibril oluşumu(Şekil 2),α-sinüklein, sığır insülini ve HEWL ilavesi üzerine mitokondriyal membranların etkileşimi, hasarı ve permeabilizasyonu amiloid fibriller araştırıldı. Sonuçlar, amiloid fibriller(Şekil 3 ve Şekil 4)tarafından indüklenen membran permeferizasyon ve mitokondriyal ROS geliştirmesinin boyutunda belirgin farklılıklar olduğunu göstererek, çeşitli amiloid fibrillerin kapasitesinde farklılıklar olduğunu düşündürmektedir. mitokondriyal membranlarla etkileşime girebilmek ve hasar vermek.

Membran permeabilizasyon inisiyasyonu için, amiloid fibrils mitokondriyal yüzeye ulaşmak gerekir. Bu dernek, lokalizasyon ve yüklü membranlar proteinlerin yerleştirilmesi nonspesifik elektrostatik etkileşimleri ve proteinlerin hidrofobikdoğasınabağlı olduğu gösterilmiştir 26,27,28. Amiloid toksisitesi ile ilgili olarak, kanıt büyüyen bir vücut kuvvetle kendi sitotoksisite protein agrega yüzey hidrofobik önemli bir rol ima29,30. HEWL, çok çeşitli pH düzeyleri üzerinde net pozitif yük taşımasına ve aniyonik ve nötr fosfolipidlere olan yakınlığı nın yüksek olmasına rağmen31 (örneğin, mitokondriyal membran23),mitokondriyal membran permeabilizasyon ve ROS geliştirmesi yoktur gözlenmiştir (Şekil 3 ve Şekil 4). Bu gözlem için bir açıklama lateral fibril-fibril etkileşimleri nedeniyle HEWL fibrils yüzey hidrofobiklik bir azalma ile ilgili olabilir23,32, membran hasarına neden olma yeteneğini kaybına yol açan.

Büyükbaş insülin için, fibrül oluşumu22seyrinde hidrofobik bölgelerin önemli bir maruziyetine rağmen, 25 μM amiloid fibrüllerin eklenmesi yle hafif bir enzim salınımı gözlenmiştir (Şekil 3) mitokondriyal ROS içeriği (Şekil 4). Hem beyin mitokondri hem de sığır insülin fibrilleri yüzeylerinde negatif zeta potansiyeli taşıdığından24, mitokondriyal membran ve sığır insülin amiloid fibriller arasındaki itici kuvvetlerin etkili bir şekilde etkileşen ve mitokondriyal membranlara zarar24. Α-sinüklein fibrillerinin eklenmesi yle en yüksek permeabilizasyon ve mitokondriyal ROS artışları gözlendi (Şekil 3 ve Şekil 4).

Bu gözlem, mitokondri gibi negatif yüklüyüzeyleresahip biyolojik membranlarla etkileşim edebilen α-sinüklein yüksek kapasitesine bağlanabilir. Bu bağlamda, bazı çalışmalar α-sinükleinin mitokondriye özel bağlanması ve ithalatı nı göstermiştir, burada ağırlıklı olarak iç zar35ile ilişkilidir. İlginçtir, Ghio ve ark. bağlanma, kardiyolipin aracılık bildirdi (bir fosfolipid benzersiz iç mitokondriyal membran zenginleştirilmiş), α-sinüklein ilişki ve mitokondriyal membranların bozulması için önemli bir mekanizma olabilir36.

İlginçtir, çeşitli amiloidojenik peptidler ve amiloid β-peptid, α-sinüklein, Huntingtin ve ALS bağlantılı mutant SOD1 mitokondri35,37 dahil olmak üzere proteinlerin bağlanması ve birikimi için açık kanıtlar vardır,37, 38,39. Ayrıca daha önceki çalışmalarda amiloid β (25-35)15 ve SOD 140'ın amiloidojenik derlemelerinin mitokondriyal membran permeabilizasyonu ile etkileşim eve sahip olduğu gösterilmiştir. Literatüre göre, amiloid fibrils membran geçmek için çok büyük olduğu ileri sürülmaktadır; bu nedenle, ortalama fibrül boyutu sığır insülin ve HEWL amiloid fibrils tarafından indüklenen etkilerin belirgin eksikliği bir faktör olmamalıdır. Dahil olan ayrıntılı mekanizmaları açıklamak için daha ileri çalışmalara ihtiyaç olmasına rağmen, amiloid fibrillerin biyofiziksel özelliklerinin (örn. yüzey yükü, hidrofobiklik ve belirli bir dizi hedefleme mitokondriyal membrana sahip olması) önerilmektedir. biyolojik membranlarla etkileşim ve hasar verme kapasitelerinde önemli bir rol oynayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, İran'ın Zanjan kentinde ki Temel Bilimler İleri Araştırmalar Enstitüsü Araştırma Konseyi'nin (IASBS) hibeleri ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma 35845
Ammonium sulfate Merck 1012171000
Black 96-well plate Corning
Black Clear-bottomed 96-well plate Corning
Bovine insulin Sigma I6634
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A2153
BSA essentially fatty acid-free Sigma A6003
Centrifuge Sigma
Crystal clear sealing tape Corning
CuSO4 Sigma 451657
Dialysis bag (cut off 2 KDa) Sigma D2272
Dounce homogenizer Potter Elvehjem
EDTA Sigma E9884
Fluorescence plate reader BioTek
Fluorescence spectrophotometer Cary Eclipse VARIAN
Folin Merck F9252
Glycine Sigma G7126
Guillotine Made in Iran
HCl Merck H1758
Hen Egg White Lysozyme (HEWL) Sigma L6876
Na2CO3 Sigma S7795
NaH2PO4 Sigma S7907
NaOH Merck S8045
Oxaloacetate Sigma O4126
Percoll GE Healthcare
Phosphate Buffer Saline (PBS) Sigma CS0030
PMSF Sigma P7626
Potassium sodium tartrate Sigma 217255
Quartz cuvette Sigma
Spectrophotometer analytik jena SPEKOL 2000 model
Succinate Sigma S2378
Sucrose Merck 1076871000
Thermomixer Eppendorph
Thioflavin T Sigma T3516
Tris-HCl Merck 1082191000
Triton X-100 Sigma T9284
Tryptone QUELAB
Water bath Memmert
Yeast Extract QUELAB
β-NADH Sigma N8129

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Merlini, G., Bellotti, V. Molecular mechanisms of amyloidosis. New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).
  2. Berg, I. Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , Linköping University. Linköping Institute of Technology, Department of Physics, Chemistry and Biology (2010).
  3. Kagan, B. L. Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage. Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. Uversky, V. N., Fink, A. L. , Springer US. New York. 223-236 (2006).
  4. Demuro, A., et al. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers. The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).
  5. Kayed, R., et al. Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).
  6. Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage. Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).
  7. Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues. Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).
  8. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
  9. Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
  10. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
  11. Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
  12. Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R. Amyloid peptide channels. The Journal of Membrane Biology. 202, 1-10 (2004).
  13. Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations. Nature. 418, 291 (2002).
  14. Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).
  15. Ghobeh, M., et al. Interaction of Aβ (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products. Peptide Science. 102, 473-486 (2014).
  16. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry. 193, 265-275 (1951).
  17. Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria. Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).
  18. Hoyer, W., et al. Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions. Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).
  19. Weinreb, P. H., et al. NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded. Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).
  20. Porter, R. R. Partition chromatography of insulin and other proteins. The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).
  21. Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme. Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).
  22. Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol. Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).
  23. Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products. Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).
  24. Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).
  25. Fink, A. L. The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).
  26. Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains. Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).
  27. Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. Lipid bilayer disruption by oligomeric α-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core. Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).
  28. Kourie, J. I., Henry, C. L. Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 29, 741-753 (2002).
  29. Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
  30. Bolognesi, B., et al. ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species. ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).
  31. Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content. Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).
  32. Roqanian, S., et al. Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action. International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).
  33. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein. The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).
  34. Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains. Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).
  35. Devi, L., et al. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
  36. Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. Interaction of α-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).
  37. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
  38. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
  39. Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
  40. Oladzad Abbasabadi, A., et al. Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1. International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).

Tags

Biyokimya Sayı 151 mitokondri amiloid fibril membran permeabilizasyonu toksisite malate dehidrogenaz reaktif oksijen türleri tioflavin T atomik kuvvet mikroskopisi α-sinüklein sığır insülini tavuk yumurtası beyaz lisozym
Amiloid Fibrils ile Beyin Mitokondrisi ile Etkileşimler ve Membran Permeabilizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zadali, R., Ghareghozloo, E. R.,… More

Zadali, R., Ghareghozloo, E. R., Ramezani, M., Hassani, V., Rafiei, Y., Chiyaneh, S. M., Meratan, A. A. Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils. J. Vis. Exp. (151), e59883, doi:10.3791/59883 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter