Summary
Fourni ici est un protocole pour étudier les interactions entre la forme indigène, préfibrillaire, et les fibrilles amyloïdes matures de différents peptides et protéines avec des mitochondries isolées de différents tissus et diverses zones du cerveau.
Abstract
Un corps croissant de preuves indique que la perméabilisation de membrane, y compris les membranes internes telles que des mitochondries, est une caractéristique commune et le mécanisme primaire de la toxicité amyloïde d'agrégat-induite dans les maladies neurodegenerative. Cependant, la plupart des rapports décrivant les mécanismes de la perturbation de membrane sont basés sur des systèmes de modèle de phospholipid, et les études ciblant directement des événements se produisant au niveau des membranes biologiques sont rares. Décrit ici est un modèle pour étudier les mécanismes de la toxicité amyloïde au niveau de la membrane. Pour l'isolement mitochondrial, le milieu de gradient de densité est utilisé pour obtenir des préparations avec une contamination minimale de la myéline. Après confirmation d'intégrité de membrane mitochondriale, l'interaction des fibrilles amyloïdes résultant de la synuclein, de l'insuline bovine, et du lysozyme blanc d'oeuf de poule (HEWL) avec des mitochondries de cerveau de rat, comme modèle biologique in vitro, est étudiée. Les résultats démontrent que le traitement des mitochondries cérébrales avec des assemblages fibrillaires peut causer différents degrés de perméabilisation de la membrane et l'amélioration de la teneur en ROS. Ceci indique des interactions structure-dépendantes entre les fibrilles amyloïdes et la membrane mitochondriale. On lui suggère que les propriétés biophysiques des fibrilles amyloïdes et leur liaison spécifique aux membranes mitochondriales puissent fournir des explications pour certaines de ces observations.
Introduction
Les troubles amyloïdes, connus sous le nom d'amyloïdes, constituent un grand groupe de maladies définies par l'apparition de dépôts insolubles de protéines dans différents tissus et organes1,2. Parmi eux, les troubles neurodégénératifs sont les formes les plus fréquentes dans lesquelles les agrégats protéiques apparaissent dans le système nerveux central ou périphérique2. Bien qu'un certain nombre de mécanismes aient été proposés pour être impliqués dans la toxicité des agrégats amyloïdes3, un corps croissant de preuves indique la perturbation et la perméabilisation de membrane cellulaire comme mécanisme primaire de la pathologie amyloïde4, 5. En plus de la membrane plasmatique, les organites internes (c.-à-d. les mitochondries) peuvent également être affectés.
Fait intéressant, les preuves émergentes suggèrent que le dysfonctionnement mitochondrial joue un rôle critique dans la pathogénie des désordres neurodegenerative, y compris la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson6,7. Conformément à ce numéro, de nombreux rapports ont indiqué la liaison et l'accumulation de l'amyloïde- peptide, de la synucléine, de la huntingtine et des protéines SOD1 mutantes liées à la SLA aux mitochondries8,9,10, 11. On pense que le mécanisme de perméabilisation de la membrane par les agrégats amyloïdes se produit soit par la formation de canaux discrets (pores) et/ou par un mécanisme non spécifique de détergent-like5,12, 13. Il est à noter que la plupart de ces conclusions ont été basées sur des rapports impliquant des systèmes modèles phospholipides, et les études ciblant directement les événements se produisant dans les membranes biologiques sont rares. De toute évidence, ces bicouches lipidiques artificielles ne reflètent pas nécessairement les propriétés intrinsèques des membranes biologiques, y compris celles des mitochondries, qui sont des structures hétérogènes et composées d'une grande variété de phospholipides et de protéines.
Dans la présente étude, les mitochondries isolées du cerveau des rats sont utilisées comme modèle biologique in vitro pour examiner les effets destructeurs des fibrilles amyloïdes résultant de la synucléine (en tant que protéine amyloïdogénique), de l'insuline bovine (comme modèle de peptide montrant homologie structurale significative avec l'insuline humaine impliquée dans l'amyloidosis injection-localisée), et lysozyme blanc d'oeuf de poule (HEWL ; comme protéine modèle commune pour l'étude de l'agrégation amyloïde). Les interactions et les dommages possibles des membranes mitochondriales induites par les fibrilles amyloïdes sont alors étudiés en observant la libération de la déshydrogénase mitochondriale (MDH) (située dans la matrice mitochondriale) et de l'oxygène réactif des mitochondries l'amélioration des espèces (ROS).
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément au Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) des sciences médicales de l'Université de Téhéran. Des efforts maximaux ont été faits pour minimiser la souffrance et les effets néfastes pour les rats en aiguisant les lames de guillotine et en appliquant des mouvements résolus et rapides de la lame.
1. Homogénéisation du cerveau et isolement mitochondrial
REMARQUE: Tous les réactifs pour l'isolement mitochondrial ont été préparés selon Sims et Anderson14.
- Préparation de tampons pour l'isolement mitochondrial
- Préparer une solution Tris-HCl de 100 mM : peser 0,605 g de Tris-HCl et la dissoudre dans environ 40 ml d'eau déionisée (DW) dans un bécher. Transférer la solution sur un flacon volumétrique de 50 ml et augmenter le volume final à 50 ml en ajoutant DW.
- Préparer une solution EDTA de 10 mM : peser 0,202 g d'EDTA et la dissoudre dans environ 40 mL de DW dans un bécher. Transférer la solution sur un flacon volumétrique de 50 ml et augmenter le volume final à 50 ml en ajoutant DW.
REMARQUE : Les deux solutions peuvent être stockées à 4 oC pendant au moins 4 semaines. - Préparer une solution de bouillon Tris-HCl/EDTA/sucrose : ajouter 30 ml de 100 mL de Tris-HCl et 30 ml de 10 mM EDTA dans un bécher. Peser 32,86 g de saccharose et l'ajouter au bécher en remuant avec un agitateur magnétique. Lorsque le saccharose est dissous, transférer la solution sur un flacon volumétrique de 100 ml et augmenter le volume final à 100 ml en ajoutant DW.
REMARQUE : Cette solution peut être entremise à 4 oC jusqu'à 3 jours. - Préparer un tampon d'isolement (IB) : ajouter 100 ml de bouillon de Tris-HCl/EDTA/sucrose à environ 150 ml de DW. Ajustez le pH à 7,4 en ajoutant 0,1 M HCl. Augmentez le volume final à 300 ml en ajoutant DW.
- Préparer 15 % (v/v) milieu de gradient de densité avec IB en ajoutant 1,5 ml de gradient de densité moyen à 8,5 ml d'IB froid.
- Préparer 10 mg/mL d'albumine bovine (BSA) solution: peser 20 mg de BSA sans acide gras et le dissoudre dans environ 1,5 mL DW dans un flacon de 2 ml. Augmenter le volume final à 2 ml en ajoutant DW et le stocker sur la glace jusqu'à l'utilisation.
REMARQUE : Préparez fraîchement les solutions à partir des étapes 1.1.4-1.1.6 le jour de l'isolement mitochondrial et entreposez-les sur la glace jusqu'à leur utilisation.
- Isolement du cerveau de rat
REMARQUE : La décapitation et l'ablation du cerveau des rats mâles (150 à 200 g) ont été effectuées selon Sims et Anderson14.- Mettre un bécher de 30 ml dans un seau à glace et ajouter 10 ml d'IB froid au bécher.
- Décapiter le rat avec une guillotine petite animal et enlever le cerveau du crâne dans un délai de 1 min de décapitation pour limiter la détérioration des propriétés mitochondriales.
- Transférez rapidement le cerveau au bécher contenant de l'IB froid.
- Homogénéisation et préparation du cerveau des mitochondries
REMARQUE: Les fractions mitochondriales ont été isolées selon le protocole décrit par Sims et Anderson14, avec quelques modifications comme décrit précédemment15. Il est important de travailler rapidement et de garder tout sur la glace tout au long de la procédure.- Laver le tissu 2x avec 30 ml d'IB, transférer dans un bécher contenant de l'IB froid, et hacher finement le cerveau avec des ciseaux.
- Ajouter 10 volumes d'IB pré-réfrigéré (environ 10 ml d'IB par cerveau de rat).
- Transférer la suspension tissulaire dans un homogénéisateur Dounce froid de 20 ml.
- Homogénéiser les morceaux de tissu à l'aide de neuf coups de haut en bas avec un pilon motorisé.
REMARQUE : Laissez le mélange sur la glace pendant environ 30 s après chaque ensemble de trois coups d'homogénéisation pour s'assurer que l'homogénéité reste froide. - Transférer l'homogénéisation dans un tube de centrifugeuse préréfrigéré de 10 ml et une centrifugeuse à 1 300 x g et 4 oC pendant 3 min.
- Décanter soigneusement le supernatant et le transférer dans un tube de centrifugeuse préréfrigéré de 10 ml et une centrifugeuse à 21 000 x g à 4 oC pendant 10 min.
- Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans une solution froide de 15% de gradient de densité moyenne (5 ml pour chaque cerveau) en remuant doucement le mélange avec une pipette.
- Centrifugeuse dans un rotor à angle fixe à 30 700x g à 4 oC pendant 5 min à l'aide d'une accélération lente (45 s de 0 tr/min à 500 tr/min suivie d'une accélération normale) et de décélération (pas de freins). Cela devrait produire deux bandes distinctes de matériel(figure 1A, à gauche).
- À l'aide d'une pipette Pasteur, retirez la bande pointue de matière accumulée en haut du gradient, qui contient principalement de la myéline. Ensuite, retirez la solution moyenne de gradient de densité qui recense le matériau (dans la bande 2) autant que possible sans perdre la fraction mitochondriale enrichie de la bande 2.
REMARQUE : La bande 2 contient à la fois les mitochondries synaptiques et non synaptiques. - Ajouter 8 ml d'IB à la fraction mitochondriale tout en remuant doucement le mélange avec une pipette.
- Centrifugeuse à 16 700x g à 4 oC pendant 10 min et retirez soigneusement le supernatant, en laissant le fond de granulés lâches intacts.
- Ajouter 1 ml de 10 mg/mL de BSA sans acide gras au tube de centrifugeuse tout en remuant doucement le mélange avec la pointe d'une pipette. Augmenter le volume final à 5 ml par cerveau en ajoutant IB.
- Centrifugeuse à 6 900x g à 4 oC pendant 10 min, ce qui devrait produire une granule ferme(figure 1A, à droite).
- Décant le supernatant et resuspend doucement le granule mitochondrial dans L'IB, les aliquot dans des tubes de 0,5 ml, et stocker dans l'azote liquide jusqu'à l'utilisation.
2. Détermination de la concentration en protéines
REMARQUE : La concentration en protéines est mesurée à l'aide de la méthode Lowry et coll.16.
- Préparation de solutions pour l'essai Lowry
- Préparer la solution A : peser 0,4 g de NaOH et 2 g de Na2CO3 et dissoudre en 80 ml de DW, puis transférer la solution sur un flacon volumétrique de 100 ml et augmenter le volume à 100 ml en ajoutant DuW.
- Préparer la solution B : peser 0,1 g de tartrate de sodium de potassium et 0,05 g de CuSO4 et dissoudre en 8 ml de DW, puis transférer la solution sur un flacon volumétrique de 10 ml et augmenter le volume à 10 ml en ajoutant DuW.
REMARQUE : Les deux solutions A et B peuvent rester stables à 4 oC jusqu'à 6 mois. - Préparer la solution C : Ajouter 0,5 ml de solution de feuillin à 7,5 ml de DW.
REMARQUE : Préparer la solution C fraîche et garder à l'écart de la lumière jusqu'à l'utilisation. - Préparer les normes BSA avec des concentrations finales de 0, 20, 40, 60, 80, 100 et 120 g/mL en combinant 0, 20, 40, 60, 80, 100 et 120 oL de 1 mg/mL de BSA, respectivement, avec assez de DW pour faire 1000 l de solution.
- Mesure de la concentration en protéines
REMARQUE : Pour une plus grande précision, exécutez cette étape en tripler.- Ajouter 50 L de solutions standard et d'homogénéiser mitochondrial à chaque puits d'une plaque de puits de 96, suivi de l'ajout de 45 l de la solution A. Ensuite, incuber l'assiette pendant 10 min dans un bain d'eau chaude fixé à 50 oC.
- Ajouter 5 ll de la solution B et couver la plaque pendant 10 min dans l'obscurité à température ambiante (RT).
- Ajouter 150 l de solution C et incuber la plaque pendant 10 min dans un bain d'eau chaude fixé à 50 oC.
- Chargez la plaque dans un lecteur de plaque et enregistrez les valeurs d'absorption pour les normes et la suspension mitochondriale à 650 nm. Ensuite, à l'aide d'une courbe d'étalonnage, calculer la teneur en protéines des mitochondries.
3. Détermination de l'intégrité de la membrane mitochondriale
REMARQUE : L'intégrité mitochondriale de membrane est confirmée en mesurant l'activité de déshydrogénase de malate (MDH) dans les mitochondries isolées avant et après la perturbation de membrane par Triton X-100.
- Diluer l'homogénéisation mitochondriale à 1 mg/mL avec l'IB froid et placé dans deux tubes de 1,5 ml (généralement 195 l de mitochondries par tube).
- Ajouter 5 'L de 20% (v/v) Triton X-100 (dilué avec DW) à un tube (comme un contrôle positif pour l'activité enzymatique maximale) et 5 'L de DW à un autre tube (pour le contrôle) suivi d'un mélange avec un agitateur.
- Incuber les tubes pendant 10 min dans un bain d'eau chaude fixé à 30 oC.
- Pellet mitochondries par centrifugation des tubes dans un rotor à angle fixe à 16 000 x g et 4 oC pendant 15 min.
- Recueillir soigneusement les supernatants résultants pour l'analyse de l'activité de MDH mitochondrial en utilisant un essai spectrophotométrique standard décrit dans la section suivante.
- Calculez l'intégrité de la membrane mitochondriale comme suit :
4. Détermination de l'activité MDH
REMARQUE : L'activité de MDH a été mesurée spectrophotométriquement comme décrit par Sottocasa et autres17.
- Préparation de solutions pour l'essai d'activité MDH
- Préparer une solution Tris-HCl de 50 mM (pH à 7,5) : préparer une solution de 7,9 mg/mL en DW à l'aide de Tris-HCl, et ajuster le pH à 7,5 à 25 oC avec 1,0 M NaOH.
- Préparer une solution d'oxaloacée de 50 mM : préparer une solution de 6,6 mg/mL à l'aide d'oxaloacée dans Tris-HCl.
REMARQUE : Cette solution n'est pas stable une fois en solution et doit être préparée immédiatement avant l'utilisation. - Préparez une solution de 10 mM-NADH : préparez une solution de 7,81 mg/mL à l'aide de l'InSA-NADH dans Tris-HCl.
- Détermination de l'activité MDH
REMARQUE : Les concentrations finales d'assay dans un mélange de réaction de 1,0 ml sont de 50 mM Tris-HCl, 5 mM d'oxaloacetate et 0,1 mM de NADH.- Définir le spectrophotomètre à 25 oC et 340 nm. Pipette 890 'L Tris-HCl tampon, 100 'L de solution d'oxaloacetate, et 10 'L de solution NADH à une cuvette vierge et 880 'L Tris-HCl tampon, 100 'L de solution d'oxaloacetate, et 10 'L de solution NADH dans un échantillon cuvette.
- Incuber les cuvettes dans le spectrophotomètre pendant 3 à 4 min et la référence contre le blanc.
- Ensuite, ajoutez 10 L d'homogénéité mitochondriale (1 mg/mL) à la cuvette de l'échantillon, mélangez immédiatement par inversion, et enregistrez des diminutions d'absorption dues à l'oxydation NADH à 340 nm pendant 1 min.
5. Formation in vitro de synucléine, d'insuline bovine et de fibril HEWL
- Préparation des protéines
- -synuclein:
REMARQUE : L'expression et la purification de la recombinante -synuclein est exécutée comme décrit par Hoyer et autres18 avec quelques modifications, et la pureté de la synucleine est confirmée par SDS-PAGE.- Dialyze purifiée -synuclein pendant la nuit contre la saline tamponnée de phosphate (PBS).
- Déterminer la concentration en protéines à l'aide d'un coefficient d'extinction de 5600 M-1 cm-1 à 275 nm19.
- Aliquots protéines dans des tubes de 1,5 ml et stocker à -80 oC jusqu'à l'utilisation.
- Insuline bovine et HEWL :
- Fournir à la fois de l'insuline bovine et de la HEWL.
- Dissoudre chaque protéine dans un tampon de glycine de 50 mM (pH à 1,6; ajuster le pH avec HCl).
- Déterminer la concentration d'insuline bovine et de HEWL à l'aide d'un coefficient d'extinction de 1,0 et 2,63 pour 1,0 mg/mL à 276 nm et 280 nm, respectivement20,21.
- -synuclein:
- Induction de fibrillation amyloïde
- Préparation de solutions pour la fibrillation amyloïde :
- Préparer le tampon thioflavine T (ThT) : pesez 0,3 g de NaH2PO4 et dissoutez-le en 80 ml de DW, ajustez le pH à 6,5 et augmentez le volume à 100 ml en ajoutant DW.
- Préparer la solution de bouillon ThT (5 mM) : peser 1,6 mg de ThT et le dissoudre dans 1 ml de tampon ThT, passer à travers un papier filtre de 0,22 m et se tenir à l'écart de la lumière à 4 oC jusqu'à l'utilisation.
REMARQUE : Cette solution peut être entremise à 4 oC jusqu'à 4 semaines. - Préparer la solution ThT (1 mM) : ajouter 200 l de solution de stock ThT (5 mM) à 800 oL de tampon ThT.
REMARQUE : Cette solution peut être stockée à 4 oC jusqu'à 1 semaine.
- Formation fibril amyloïde in vitro de synucléine :
- Ajouter des aliquots (294 l) de solution protéinée (200 M) et 6 l de la solution ThT (1 mM) à 1,5 ml de tubes suivis d'une agitation.
- Incuber les tubes dans un thermomélangeur à 37 oC sous un mouvement constant à 800 tr/min pendant 4 jours.
- Prenez des aliquots (10 l) d'échantillons incubés après intervalles de temps réguliers et ajoutez 490 l de tampon ThT, mélangés à fond, et incubés pendant 5 min à RT.
- Fixez les largeurs d'excitation et d'émission de 5 nm et 10 nm, respectivement, et mesurez la fluorescence thT par excitation à 440 nm et émettant à 485 nm à l'aide d'un spectrophotomètre de fluorescence.
- Formation in vitro d'amyloïde d'insuline bovine amyloïde :
- Ajouter 637 l de solution protéinée (250 m) à 1,5 ml tube. Ensuite, ajouter 13 l de la solution ThT (1 mm) puis en remuant.
- Ajouter des aliquots (200 l) de solution protéinée (250 M) contenant 20 M ThT à chaque puits d'une plaque de puits à fond clair de 96 et sceller la plaque avec du ruban adhésif cristallin.
- Chargez la plaque dans un lecteur de plaque de fluorescence et incubez à 57 oC sans agitation.
- Mesurer la fluorescence thT à intervalles de 30 min, avec une excitation à 440 nm et une émission à 485 nm, pendant 12 h.
REMARQUE : Secouez la plaque pendant 5 s avant chaque mesure.
- Formation fibrile amyloïde HEWL in vitro :
- Ajouter des aliquots (200 l) de solution protéinée )1 mM) contenant 20 M thT à chaque puits d'une plaque de puits à fond clair de 96 et sceller la plaque avec du ruban adhésif cristallin.
- Chargez la plaque dans un lecteur de plaque de fluorescence et incubez à 57 oC sans agitation.
- Mesurer la fluorescence thT à 2 h d'intervalle, avec une excitation à 440 nm et une émission de 485 nm, pendant 4 jours.
REMARQUE : Pour les trois protéines, la formation de fibril amyloïde est confirmée par microscopie par force atomique (figure 2B).
- Préparation de solutions pour la fibrillation amyloïde :
6. Traitement des mitochondries avec des fibrilles amyloïdes, test de libération de MDH, et mesure de ROS
- Incubation de mitochondries isolées avec des fibrilles amyloïdes
- Allumer la centrifugeuse et le bain d'eau chaude et les mettre à 4 oC et 30 oC, respectivement.
- À l'aide de SI, diluer l'homogénéisation mitochondriale jusqu'à une concentration finale de 1 mg/mL.
- Préparer deux séries de tubes de 1,5 ml contenant des homogénéates mitochondriaux (une série pour l'analyse de libération de MDH et une autre pour la mesure mitochondriale de ROS).
- Ajouter des aliquots de fibrilles fraîches ou amyloïdes de 'synuclein, d'insuline bovine ou de HEWL (aux concentrations finales de 5 M, 10 M, 20 et 25 'M; utiliser pbS ou tampon glycine comme un contrôle) à l'homogénéité mitochondriale (volume final de 200 l) (voir tableau 1, tableau 2 , et tableau 3) suivi d'une brassage en douceur de la solution à l'aube d'une pipette.
REMARQUE : Pour l'essai de libération de MDH, utilisez Triton X-100 (à une concentration finale de 0,5 % [v/v]) comme un contrôle positif pour la libération maximale d'enzymes. - Incuber les tubes contenant des suspensions mitochondriales pendant 30 min dans un bain d'eau chaude réglé à 30 oC.
- Mesurer la libération mitochondriale de MDH et la teneur en ROS telles qu'indiquées dans les sections 6.2 et 6.3.
- Test de libération de MDH mitochondrial
- Centrifugeles les homogénéités mitochondriales incubées à 16 000 x g pendant 15 min, puis recueillez soigneusement les supernatants résultants pour l'analyse de l'activité de MDH mitochondrial tel que décrit dans la section 4.
- Calculez la libération de MDH comme une fraction de l'effet maximum (Triton X-100) comme suit :
- Mesure mitochondriale DE ROS
REMARQUE : La teneur mitochondriale de ROS est déterminée avec le précurseur fluorogenic sensible dihydrodichlorochlorocarboxyfluorescein diacète (DCFDA)22.- Préparer des solutions pour la mesure mitochondriale ROS. Préparer une solution DCFDA de 50 MM en se dissolvant dans le méthanol (préparer frais) et une solution de succinate de 200 mM en se dissolvant en DW.
- Pipette 191 L d'homogénéisation mitochondriale incubée à chaque puits d'une plaque de puits de 96 et ajouter 4 L de 50 M DCFDA (1 m de concentration finale) et 5 l de 200 mM de succinate (concentration finale de 5 mM).
- Incuber l'assiette pendant 30 min dans un bain d'eau chaude fixé à 30 oC tout en remuant doucement.
- Chargez la plaque dans un lecteur de plaque de fluorescence et mesurez l'intensité de fluorescence, avec une excitation de 485 nm et une émission de 530 nm.
7. Analyse statistique
- Effectuez toutes les expériences au moins 2x ou 3x avec des essais tripliques et effectuez des tests statistiques appropriés. Ici, les résultats sont présentés comme étant la moyenne de la DD, et le test tapparié d'un étudiant a été utilisé pour calculer la signification statistique. Les valeurs P inférieures à 0,01 et 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives (p 'lt; 0.05; 'p 'lt; 0.01).
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Representative Results
Le protocole décrit un modèle pour étudier les interactions du fibril amyloïde avec les mitochondries de cerveau de rat comme modèle biologique in vitro. Pour la préparation mitochondriale, 15% (v/v) milieu de gradient de densité a été utilisé pour enlever la myéline comme contamination majeure du tissu cérébral14. Comme le montre la figure 1A, la centrifugation à 30 700 x g a produit deux bandes distinctes de matériel, la myéline (entant que composante principale de la bande 1) et la bande 2, qui contient une fraction mitochondriale enrichie.
En modifiant le protocole décrit par Sims et Anderson14, une suspension mitochondriale contenant des mitochondries synaptiques et non-synaptiques a été préparée. Pour la préparation de mitochondries non-synaptiques pures, Sims et Anderson ont précédemment détaillé le protocole14. À l'étape finale de la centrifugation, 10 mg/mL de BSA sans acide gras a été ajouté pour obtenir une granule mitochondriale ferme (figure 1A). L'intégrité mitochondriale de membrane a été évaluée en mesurant l'activité de MDH dans les mitochondries isolées avant et après la perturbation de membrane et la libération d'enzyme par Triton X-100, comme décrit dans le protocole.
On a généralement constaté que les préparations mitochondriales étaient intactes à environ 93 %(figure 1B). Un assay de fluorescence de ThT a été effectué pour surveiller la croissance des fibrilles amyloïdes. Comme le montre la figure 2A, la courbe de la fibrillation amyloïde de trois protéines a montré un modèle sigmoïdal typique, qui est en ligne avec les modèles de polymérisation nucléation-dépendantde de ces protéines comme rapporté précédemment23,24 ,25. L'émission de fluorescence ThT la plus élevée pour la synucléine, l'insuline bovine et le HEWL les plus élevées a été observée après 96 h, 12 h et 96 h, respectivement, suggérant la formation de fibrilles amyloïdes (figure 2A). Cela a été confirmé par la mesure de l'AFM.
Comme illustré dans la figure 2B, des fibrilles matures bien définies avec une morphologie amyloïde typique ont été observées pour trois protéines incubées dans des conditions amyloïdes. Des interactions et des dommages possibles et la perméabilisation des membranes mitochondriales par des fibrilles amyloïdes ont été étudiés. Ceci a été accompli en surveillant la libération de La mDH mitochondriale et de la mesure mitochondriale de ROS sur l'addition de la synuclein, de l'insuline bovine, ou des fibrilles amyloïdes de HEWL aux suspensions mitochondriques et suivant les procédures décrites. Les expériences préliminaires ont montré que la présence de ThT (jusqu'à 3 M) n'avait aucun effet sur la libération de MDH et la teneur en ROS mitochondrial (données non montrées).
Comme le montre la figure 3, on a observé une libération substantielle de MDH lors de l'ajout de fibrilles amyloïdes de la synucléine à la mitochondrie d'une manière dépendante de la concentration. Bien qu'une légère libération ait été détectée lors de l'ajout de fibrilles amyloïdes d'insuline bovine, les fibrilles HEWL se sont avérées inefficaces (figure 3). Bien qu'aucune amélioration significative de la teneur en ROS mitochondriale n'ait été observée lors de l'ajout d'insuline bovine ou de fibrilles amyloïdes HEWL, le traitement des fibrilles de la synuclein a conduit à une augmentation considérable de la teneur en ROS des mitochondries cérébrales dans un concentration-dépendante (Figure 4).
Figure 1 : Isolation mitochondriale et détermination de l'intégrité de la membrane. (A) Gauche : aspect typique d'un tube de centrifugeuse après avoir resuspendu la granule dans la solution moyenne froide de gradient de densité de 15% suivant par centrifugation. La myéline est la composante principale de la bande 1, qui s'accumule au sommet. La bande 2 contient la fraction mitochondriale hautement enrichie. Droite : une pastille ferme a été produite après l'ajout de 10 mg/mL de BSA sans acide gras et la centrifugation à 6900 x g. (B) L'intégrité de la membrane mitochondriale a été déterminée en mesurant l'activité de MDH dans les mitochondries isolées avant et après perturbation de la membrane par Triton X-100. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Fibrillation amyloïde de la synucléine, de l'insuline bovine et de la HEWL. (A) Cinétique de la formation fibrile amyloïde indiquée par l'augmentation de l'intensité de fluorescence de ThT à 485 nm. (B) Des images AFM de trois protéines sont montrées, qui ont été incubées dans des conditions amyloïdes pendant des temps réguliers. Les barres d'échelle représentent 500 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Libération mitochondriale de MDH sur l'interaction avec le fibril monomère et amyloïde de la synuclein, de l'insuline bovine, et de heWL. La libération est exprimée comme le pourcentage du maximum observé lors du traitement avec 0,5 % (v/v) Triton X-100. Chaque valeur représente la moyenne de SD (n '3; 'p 'lt; 0.05, 'p 'lt; 0.01). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Contenu mitochondrial de ROS sur l'interaction avec le fibril monomère et amyloïde de la synucléine, de l'insuline bovine, et de heWL. Les données sont exprimées comme le pourcentage de valeurs dans les mitochondries de contrôle. Chaque valeur représente la moyenne de La DS (n '3; 'p 'lt; 0.05; 'p 'lt; 0.01). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Homogénéisé mitochondrial (1 mg/mL) | monomère de synucléine (200 m) | Fibril de synuclein (200 M) | Tampon d'isolement | Pbs | Triton x-100 20% (v/v) | |
| autorité | 175 l | 0 | 0 | 25 l | 0 | 0 |
| Pbs | 175 l | 0 | 0 | 0 | 25 l | 0 |
| Monomère 25 M | 175 l | 25 l | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Fibril 5 M | 175 l | 0 | 5 ll | 20 l | 0 | 0 |
| Fibril 10 M | 175 l | 0 | 10 l | 15 l | 0 | 0 |
| Fibril 20 M | 175 l | 0 | 20 l | 5 ll | 0 | 0 |
| Fibril 25 M | 175 l | 0 | 25 l | 0 | 0 | 0 |
| Contrôle positif | 175 l | 0 | 0 | 20 l | 0 | 5 ll |
Tableau 1 : Traitement des mitochondries avec diverses concentrations de fibrilles amyloïdes de la synucléine.
| Homogénéisé mitochondrial (1 mg/mL) | Monomère d'insuline bovine (250 m) | Fibril d'insuline bovine (250 M) | Tampon d'isolement | Tampon de glycine | Triton x-100 20% (v/v) | |
| autorité | 175 l | 0 | 0 | 25 l | 0 | 0 |
| Tampon de glycine | 175 l | 0 | 0 | 0 | 25 l | 0 |
| Monomère 25 M | 175 l | 20 l | 0 | 5 ll | 0 | 0 |
| Fibril 5 M | 175 l | 0 | 4 l | 21 l | 0 | 0 |
| Fibril 10 M | 175 l | 0 | 8 ll | 17 l | 0 | 0 |
| Fibril 20 M | 175 l | 0 | 16 l | 9 l | 0 | 0 |
| Fibril 25 M | 175 l | 0 | 20 l | 5 ll | 0 | 0 |
| Contrôle positif | 175 l | 0 | 0 | 20 l | 0 | 5 ll |
Tableau 2 : Traitement des mitochondries avec diverses concentrations de fibrilles amyloïdes d'insuline bovine.
| Homogénéisé mitochondrial (1 mg/mL) | monomère HEWL (1 mM) | FIbril HEWL (1 mM) | Tampon d'isolement | Tampon de glycine | Triton x-100 20% (v/v) | |
| autorité | 175 l | 0 | 0 | 25 l | 0 | 0 |
| Tampon de glycine | 175 l | 0 | 0 | 0 | 25 l | 0 |
| Monomère 25 M | 175 l | 5 ll | 0 | 20 l | 0 | 0 |
| Fibril 5 M | 175 l | 0 | 1 l | 24 l | 0 | 0 |
| Fibril 10 M | 175 l | 0 | 2 l | 23 l | 0 | 0 |
| Fibril 20 M | 175 l | 0 | 4 l | 21 l | 0 | 0 |
| Fibril 25 M | 175 l | 0 | 5 ll | 20 l | 0 | 0 |
| Contrôle positif | 175 l | 0 | 0 | 20 l | 0 | 5 ll |
Tableau 3 : Traitement des mitochondries avec diverses concentrations de fibrilles amyloïdes HEWL.
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Discussion
Une multitude de résultats expérimentaux appuie l'hypothèse que la cytotoxicité des agrégats fibrillaires est significativement associée à leur capacité d'interagir avec les membranes biologiques et de perméabilize4,5. Cependant, la plupart des données sont basées sur des bicouches lipidiques artificielles qui ne reflètent pas nécessairement les propriétés intrinsèques des membranes biologiques, qui sont des structures hétérogènes avec une grande variété de phospholipides et de protéines. Ici, utilisant des mitochondries de cerveau comme membrane biologique in vitro, un modèle pour étudier la cytotoxicité d'agrégats fibrillaires au niveau de membrane est décrit.
Pendant l'expérience, il est important de travailler rapidement et de garder tout sur la glace pour préparer des mitochondries fonctionnellement actives avec des membranes intactes. En outre, la concentration mitochondriale (basée sur la mesure totale de protéine) est un facteur important affectant l'interaction fibril de membrane-amyloïde ; ainsi, il doit être constant tout au long du protocole. Dans la présente étude, les préparations mitochondriales ont contenu les mitochondries synaptiques et non-synaptiques. Pour la préparation mitochondriale non-synaptique pure, 40%, 23%, et 15% (v/v) milieu de gradient de densité devrait être utilisé, comme décrit par Sims et Anderson14. Parce que les mitochondries sont une organelle avec une membrane bien caractérisée, il peut servir de système de modèle biologique extrêmement utile dans les études moléculaires liées aux mécanismes de cytotoxicité amyloïde au niveau de la membrane (en particulier maladies neurodégénératives). Ce protocole permet d'enquêter sur les interactions et l'étendue de la perméabilisation des membranes mitochondriales en examinant la libération de diverses molécules et enzymes situées dans différents compartiments (c.-à-d. celles intégrées dans les membranes extérieures et intérieures. et ceux situés dans l'espace intermembrane ou la matrice mitochondriale).
Après confirmation de l'intégrité de la membrane mitochondriale (Figure 1B) et formation fibrile amyloïde (figure 2), l'interaction, les dommages et la perméabilisation des membranes mitochondriales à l'ajout de la synucléine, de l'insuline bovine et de la HEWL Fibrils amyloïdes a été étudié. Les résultats ont démontré des différences claires dans l'étendue de la perméabilisation membranaire et de l'amélioration mitochondriale du ROS induite par les fibrilles amyloïdes(figure 3 et figure 4), suggérant des variations dans la capacité de divers fibrilles amyloïdes d'interagir avec et d'endommager les membranes mitochondriales.
Pour l'initiation à la perméabilisation de la membrane, les fibrilles amyloïdes doivent atteindre la surface mitochondriale. Il a été démontré que l'association, la localisation et l'insertion de protéines dans les membranes chargées dépendent d'interactions électrostatiques non spécifiques et de la nature hydrophobe des protéines26,27,28. En ce qui concerne la toxicité amyloïde, un nombre croissant de preuves implique fortement un rôle clé de l'hydrophobicité de surface des agrégats protéiques dans leur cytotoxicité29,30. Bien que HEWL porte une charge positive nette sur un large éventail de niveaux de pH et a une forte affinité pour les phospholipides anioniques et neutres31 (par exemple, la membrane mitochondriale23), pas de perméabilisation de la membrane mitochondriale et l'amélioration du ROS ont été observées(figure 3 et figure 4). Une explication de cette observation peut être liée à une réduction de l'hydrophobicité de surface des fibrilles HEWL dues aux interactions fibril-fibriles latérales23,32, conduisant à la perte de la capacité de causer des dommages à la membrane.
Pour l'insuline bovine, malgré une exposition significative des régions hydrophobes au cours de la formation fibrile22, une légère libération d'enzymes a été observée lors de l'ajout de 25 fibrilles amyloïdes de 25 M (figure 3) sans effets significatifs sur teneur en ROS mitochondriaux (Figure 4). Comme les mitochondries cérébrales et les fibrilles d'insuline bovine ont un potentiel de zeta négatif à leur surface24, il est suggéré que les forces répulsives entre la membrane mitochondriale et les fibrilles amyloïdes d'insuline bovine puissent expliquer leur incapacité à interagir efficacement avec et endommager les membranes mitochondriales24. Les incréments de perméabilisation et de ROS mitochondriales les plus élevés ont été observés lors de l'ajout de fibrilles de synucléine(figure 3 et figure 4).
Cette observation peut être attribuée à la capacité élevée de la synucléine pour interagir avec les membranes biologiques qui ont des surfaces chargées négativement33,34, telles que les mitochondries. À cet égard, certaines études ont montré une liaison spécifique et l'importation de la synucléine dans les mitochondries, où ils deviennent principalement associés à la membrane interne35. Fait intéressant, Ghio et coll. ont signalé que la liaison, médiée par la cardiolipine (un phospholipide unique enrichi dans la membrane mitochondriale interne), de la synucléine peut être un mécanisme important pour l'association et la perturbation des membranes mitochondriales36.
Fait intéressant, il existe des preuves claires pour la liaison et l'accumulation de divers peptides et protéines amyloïdes, y compris l'amyloïde-peptide, -synuclein, Huntingtin, et la SLA liée mutant SOD1 aux mitochondries35,37, 38,39. En outre, des études antérieures ont démontré que les assemblages amyloïdes de l'amyloïde (25-35)15 et soD 140 ont la capacité d'interagir avec et de provoquer la perméabilisation de la membrane mitochondriale. Selon la littérature, il est suggéré que les fibrilles amyloïdes sont trop grandes pour traverser la membrane; par conséquent, la taille moyenne de fibril ne devrait pas être un facteur dans l'absence apparente d'effets induits par l'insuline bovine et les fibrilles amyloïdes de HEWL. Bien que d'autres études soient nécessaires pour élucider les mécanismes détaillés impliqués, il est proposé que les caractéristiques biophysiques des fibrilles amyloïdes (c.-à-d., charge de surface, hydrophobicité, et possédant une membrane mitochondriale séquence-ciblage spécifique) jouer un rôle important dans leur capacité d'interagir avec les membranes biologiques et d'endommager.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par des subventions du Conseil de recherche de l'Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), À Zanjan, en Iran.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
| Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
| Black 96-well plate | Corning | ||
| Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
| Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
| Centrifuge | Sigma | ||
| Crystal clear sealing tape | Corning | ||
| CuSO4 | Sigma | 451657 | |
| Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
| Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Fluorescence plate reader | BioTek | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
| Folin | Merck | F9252 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Guillotine | Made in Iran | ||
| HCl | Merck | H1758 | |
| Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
| Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
| NaOH | Merck | S8045 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
| Percoll | GE Healthcare | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
| Quartz cuvette | Sigma | ||
| Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
| Succinate | Sigma | S2378 | |
| Sucrose | Merck | 1076871000 | |
| Thermomixer | Eppendorph | ||
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
| Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tryptone | QUELAB | ||
| Water bath | Memmert | ||
| Yeast Extract | QUELAB | ||
| β-NADH | Sigma | N8129 |
References
- Merlini, G., Bellotti, V.
- Berg, I. Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , Linköping University. Linköping Institute of Technology, Department of Physics, Chemistry and Biology (2010).
- Kagan, B. L. Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage. Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. Uversky, V. N., Fink, A. L. , Springer US. New York. 223-236 (2006).
- Demuro, A., et al. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers. The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).
- Kayed, R., et al. Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).
- Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage. Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).
- Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues. Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R.
- Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations. Nature. 418, 291 (2002).
- Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).
- Ghobeh, M., et al. Interaction of Aβ (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products. Peptide Science. 102, 473-486 (2014).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria. Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).
- Hoyer, W., et al. Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions. Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).
- Weinreb, P. H., et al. NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded. Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).
- Porter, R. R. Partition chromatography of insulin and other proteins. The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).
- Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme. Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).
- Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol. Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).
- Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products. Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).
- Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).
- Fink, A. L. The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).
- Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains. Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).
- Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. Lipid bilayer disruption by oligomeric α-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core. Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).
- Kourie, J. I., Henry, C. L. Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 29, 741-753 (2002).
- Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
- Bolognesi, B., et al. ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species. ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).
- Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content. Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).
- Roqanian, S., et al. Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action. International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).
- Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein. The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).
- Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains. Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).
- Devi, L., et al. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. Interaction of α-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Oladzad Abbasabadi, A., et al. Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1. International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).
