Summary
Здесь предусмотрен протокол для исследования взаимодействия между родной формой, префибриллярными и зрелыми амилоидными фибриллями различных пептидов и белков с митохондриями, изолированными из различных тканей и различных областей мозга.
Abstract
Растущее количество доказательств указывает на то, что мембранная пермяковая, включая внутренние мембраны, такие как митохондрии, является общей чертой и основным механизмом амилоидной агрегированной токсичности при нейродегенеративных заболеваниях. Однако большинство отчетов, описывающих механизмы нарушения мембран, основаны на фосфолипидных модельных системах, и исследования, непосредственно нацеленные на события, происходящие на уровне биологических мембран, редки. Описана здесь модель для изучения механизмов токсичности амилоидов на мембранном уровне. Для митохондриальной изоляции, градиентная среда плотности используется для получения препаратов с минимальным загрязнением миелина. После подтверждения целостности митохондриальной мембраны, взаимодействие амилоидных фибриллов, возникающих из-за з-синуклеина, бычьего инсулина и куриного яичного белка лизозима (HEWL) с митохондриями мозга крысы, как биологическая модель in vitro, исследуется. Результаты показывают, что лечение митохондрий мозга с фибриллярными сборками может вызвать различные степени проницаемости мембраны и повышения содержания ROS. Это указывает на структурно-зависимые взаимодействия между амилоидными фибрилями и митохондриальной мембраной. Предполагается, что биофизические свойства амилоидных фибрилков и их специфические связывания с митохондриальными мембранами могут служить объяснением некоторых из этих наблюдений.
Introduction
Амилоидные расстройства, известные как амилоидозы, представляют собой большую группу заболеваний, определяемых появлением нерастворимых белковых отложений в различных тканях и органах1,2. Среди них нейродегенеративные расстройства являются наиболее часто встречаются формы, при которых белковые агрегаты появляются в центральной или периферической нервной системе2. Хотя ряд механизмов были предложены, чтобы участвовать в токсичности амилоидных агрегатов3, растущее количество доказательств указывает на нарушение клеточной мембраны и пермяки в качестве основного механизма амилоидной патологии4, 5. В дополнение к плазменной мембране, внутренние органеллы (т.е. митохондрии) также могут быть затронуты.
Интересно, что новые данные свидетельствуют о том, что митохондриальная дисфункция играет важную роль в патогенеза нейродегенеративных расстройств, в том числе болезни Альцгеймера и Паркинсона6,7. В соответствии с этим вопросом, многочисленные доклады указали связывание и накопление амилоида й-пептида, з-синуклеина, Хантингтина и связанных с ALS мутантов SOD1 белков митохондрии8,9,10, 11. Механизм мембранной пермяки амилоидных агрегатов, как полагают, происходит либо через образование дискретных каналов (пор) и/или через неспецифический моющее средство, как механизм5,12, 13. Следует отметить, что большинство из этих выводов были основаны на докладах с использованием фосфолипидных модельных систем, и исследования, непосредственно ориентированные на события, происходящие в биологических мембранах, редки. Очевидно, что эти искусственные липидные двуслойки не обязательно отражают внутренние свойства биологических мембран, в том числе митохондрий, которые являются неоднородными структурами и состоят из широкого спектра фосфолипидов и белков.
В настоящем исследовании, митохондрии, изолированные от мозга крыс используются в качестве биологической модели in vitro для изучения разрушительных эффектов амилоидных фибриллов, возникающих из-синуклеина (как амилоидогенный белок), инсулин абилоидогенных (в качестве модели пептида, показывающего значительные структурные гомологии с человеческим инсулином, участвующих в инъекционно-локализованных амилоидоз), и курица яичный белок лизозим (HEWL; как общий тип белка для изучения амилоидной агрегации). Взаимодействия и возможное повреждение митохондриальных мембран, индуцированных амилоидными фибриллами, затем исследуются, наблюдая за выбросом митохондриального малиата дегидрогеназы (MDH) (расположен в митохондриальной матрице) и митохондрий реактивного кислорода видов (ROS) повышение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) медицинских наук Тегеранского университета. Максимальные усилия были предприняты, чтобы свести к минимуму страдания и пагубные последствия для крыс путем заточки гильотины лезвия и применения решительных и быстрых движений лезвия.
1. Гомогенизация мозга и митохондриальная изоляция
ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты для митохондриальной изоляции были подготовлены в соответствии с Sims и Андерсон14.
- Подготовка буферов для митохондриальной изоляции
- Приготовьте раствор Tris-HCl массой 100 мм: взвесьте 0,605 г Tris-HCl и растворите его примерно в 40 мл деионизированной воды (DW) в стакане. Перенесите раствор в объемную колбу объемом 50 мл и увеличьте конечный объем до 50 мл, добавив DW.
- Приготовьте раствор EDTA массой 10 мм: взвесьте 0,202 г ЭДТА и растворите его примерно в 40 мл DW в стакане. Перенесите раствор в объемную колбу объемом 50 мл и увеличьте конечный объем до 50 мл, добавив DW.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оба раствора могут храниться при 4 градусах Цельсия в течение не менее 4 недель. - Подготовьте раствор запасов Tris-HCl/EDTA/sucrose: добавьте 30 мл 100 мм Tris-HCl и 30 мл 10 мм EDTA в стакане. Взвесить 32,86 г сахарозы и добавить его в стакан, помешивая с магнитным мешалкой. Когда сахароза растворяется, перенесите раствор в объемную колбу объемом 100 мл и увеличьте конечный объем до 100 мл, добавив DW.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение может храниться при 4 градусах По Цельсию в течение 3 дней. - Подготовьте изоляционный буфер (IB): добавьте 100 мл запасов Tris-HCl/EDTA/sucrose примерно до 150 мл DW. Отрегулируйте рН до 7,4, добавив 0,1 МЛЛ. Увеличьте конечный объем до 300 мл, добавив DW.
- Подготовка 15% (v/v) плотность градиента среды с IB, добавив 1,5 мл плотности градиента среднего до 8,5 мл холодного IB.
- Приготовьте 10 мг/мл раствора сыворотки крупного рогатого скота (BSA): взвесьте 20 мг безжирной кислоты BSA и растворите его примерно в 1,5 мл DW во флаконе 2 мл. Увеличьте конечный объем до 2 мл, добавив DW и храните его на льду до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Свежеподготовить решения из шагов 1.1.4-1.1.6 в день митохондриальной изоляции и хранить их на льду до использования.
- Изоляция крысиного мозга
ПРИМЕЧАНИЕ: Обезглавливание и удаление мозга крыс мужского пола (150-200 г) были выполнены в соответствии с Sims и Андерсон14.- Положите стакан 30 мл в ведро со льдом и добавьте 10 мл холодного ИБ в стакан.
- Обезглавить крысу с небольшой гильотиной животных и удалить мозг из черепа в течение 1 минуты обезглавливания, чтобы ограничить ухудшение митохондриальных свойств.
- Быстро переносите мозг в стакан, содержащий холодный Ib.
- Гомогенизация мозга и подготовка митохондрий
ПРИМЕЧАНИЕ: Митохондриальные фракции были изолированы в соответствии с протоколом, описанным Sims и Anderson14, с некоторыми изменениями, как описано ранее15. Важно работать быстро и держать все на льду на протяжении всей процедуры.- Вымойте ткань 2x с 30 мл IB, перенесите в стакан, содержащий холодный IB, и мелко фарш мозга ножницами.
- Добавьте 10 томов предварительно охлажденных IB (около 10 мл IB на мозг крыс).
- Перенесите тканевую подвеску на 20 мл холодного гомогенизатора Dounce.
- Гомогенизировать части ткани с помощью девяти вверх-вниз ударов с моторизованной пестик.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте смесь на льду примерно 30 с после каждого набора из трех гомогениззационных штрихов, чтобы гарантировать, что гоменат остается холодным. - Перенесите гоменат в предварительно охлажденный 10 мл центрифуги трубки и центрифуги на 1300x г и 4 КК в течение 3 мин.
- Тщательно освящите супернатант и перенесите его в предварительно охлажденный 10 мл центрифуги трубки и центрифуги на 21000x г при 4 КК в течение 10 минут.
- Откажитесь от супернатанта и resuspend гранулы в холодной 15% плотности градиент среднего раствора (5 мл для каждого мозга), мягко перемешивая смесь с пипеткой.
- Центрифуга в роторе с фиксированным углом 30700х г при 4 градусах по Цельсию в течение 5 минут с использованием медленного ускорения (45 с от 0 об/мин до 500 об/мин с последующим нормальным ускорением) и замедлением (без тормозов). Это должно производить две различные полосы материала(рисунок 1A, слева).
- Используя пипетку Pasteur, удалите острую полосу материала, накопленного в верхней части градиента, который в основном содержит миелин. Затем удалите градиентный средний раствор плотности, лежащий в основе материала (в полосе 2), насколько это возможно, не теряя ни одной обогащенной митохондриальной фракции в полосе 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Группа 2 содержит как синаптические, так и несинаптические митохондрии. - Добавьте 8 мл ИБ в митохондриальную фракцию, нежно помешивая смесь пипеткой.
- Центрифуга при 16700х г при 4 градусах по Цельсию в течение 10 мин и тщательно удалите супернатант, оставляя нижнюю свободу гранул спокойной.
- Добавьте 1 мл 10 мг/мл жирных кислот, свободных BSA в центрифугу трубки, нежно перемешивая смесь кончиком пипетки. Увеличьте конечный объем до 5 мл на мозг, добавив IB.
- Центрифуга при 6900х г при 4 градусах по Цельсию в течение 10 мин, которая должна производить твердые гранулы(рисунок 1A, справа).
- Декант супернатант и осторожно resuspend митохондриальной гранулы в IB, aliquot их в 0,5 мл труб, и хранить в жидком азоте до использования.
2. Определение концентрации белка
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация белка измеряется методом Lowry et al.16.
- Подготовка решений для асссеа Лоури
- Подготовка раствора A: весят 0,4 г NaOH и 2 г Na2CO3 и растворяйте в 80 мл DW, затем перенесите раствор на объемную колбу объемом 100 мл и увеличьте объем до 100 мл, добавив DW.
- Подготовка раствора B: весят 0,1 г тартрата калия натрия и 0,05 г CuSO4 и растворяйте в 8 мл DW, затем перенесите раствор в объемную колбу объемом 10 мл и увеличивайте объем до 10 мл, добавляя DW.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оба решения A и B могут оставаться стабильными при 4 градусах По Цельсию в течение 6 месяцев. - Подготовка раствора C: Добавьте 0,5 мл раствора фолина к 7,5 мл DW.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте раствор C свежим и держитесь подальше от света до использования. - Подготовьте стандарты BSA с окончательными концентрациями 0, 20, 40, 60, 80, 100 и 120 мкг/мл, объединив 0, 20, 40, 60, 80, 100 и 120 л 1 мг/мл BSA, соответственно, с достаточным количеством DW, чтобы сделать 1000 мл раствора.
- Измерение концентрации белка
ПРИМЕЧАНИЕ: Для большей точности, запустить этот шаг в тройной.- Добавьте 50 qL стандартных растворов и митохондриальный гомегенат к каждому колодцу пластины 96 скважин, а затем добавление 45 злителю раствора А. Затем инкубировать тарелку в течение 10 минут в теплой водяной бане, установленной при 50 градусах Цельсия.
- Добавьте 5 зл. раствора B и насигните тарелку в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре (RT).
- Добавьте 150 кл.л. раствора С и инкубируют тарелку в течение 10 минут в теплой водяной бане, установленной при 50 градусах Цельсия.
- Загрузите пластину в считыватель пластин и запишите значения абсорбции для стандартов и митохондриальной подвески на 650 нм. Затем, используя кривую калибровки, вычислите содержание белка в митохондриях.
3. Определение целостности митохондриальной мембраны
ПРИМЕЧАНИЕ: Целостность митохондриальной мембраны подтверждается путем измерения активности малита дегидрогеназы (MDH) в изолированных митохондриях до и после нарушения мембраны Triton X-100.
- Разбавить митохондриальный гомегенат до 1 мг/мл с холодным ИБ и поместить в две трубки 1,5 мл (обычно 195 л митохондрий на трубку).
- Добавьте 5 кЛ 20% (v/v) Triton X-100 (разбавленный DW) в одну трубку (в качестве положительного контроля для максимальной активности ферментов) и 5 ЗЛ DW в другую трубку (для контроля), а затем смешивание с мешалкой.
- Инкубировать трубки в течение 10 минут в теплой водяной бане, установленной при 30 градусах Цельсия.
- Пеллетные митохондрии путем центрифугирования труб в роторе с фиксированным углом при 16 000 х г и 4 кв 15 мин.
- Тщательно соберите полученные супернацианты для анализа активности митохондриальных MDH с помощью стандартного спектрофотометрического анализа, описанного в следующем разделе.
- Рассчитайте целостность митохондриальной мембраны следующим образом:
4. Определение активности MDH
ПРИМЕЧАНИЕ: Деятельность MDH была измерена спектрофотометрически, как описано Sottocasa и др.17.
- Подготовка решений для асссеа деятельности MDH
- Подготовьте раствор Tris-HCl 50 мм (pH 7.5): приготовьте раствор 7,9 мг/мл в DW с помощью Tris-HCl и отрегулируйте рН до 7,5 при 25 градусах Цельсия с 1,0 М.Н. НаОХ.
- Приготовьте раствор оксалоацета 50 мМ: приготовьте раствор 6,6 мг/мл с использованием оксалоацетата в Tris-HCl.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение не является стабильным один раз в растворе и должны быть подготовлены непосредственно перед использованием. - Приготовьте раствор 10 мМ и NADH: приготовьте раствор 7,81 мг/мл с помощью решения «NADH» в Tris-HCl.
- Определение активности MDH
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные концентрации асссея в реакционной смеси 1,0 мл составляют 50 мм Трис-ХКла, 5 мм оксалатацетата и 0,1 мм з-NADH.- Установите спектрофотометр до 25 градусов по Цельсию и 340 нм. Пепетт 890 l Tris-HCl буфер, 100 л раствора оксалатацета, и 10 зл NADH раствора для пустой cuvette и 880 L Tris-HCl буфер, 100 л раствора оксалатацета, и 10 л раствора NADH в образец cuvette.
- Инкубировать кюветы в спектрофотометр е 3-4 мин и ссылку на пустой.
- Затем добавьте 10 зЛ митохондриального гомегената (1 мг/мл) в образец кювета, немедленно перемешайте путем инверсии и зафиксируете снижение абсорбции из-за окисления NADH на 340 нм в течение 1 мин.
5. In vitro - синуклеин, инсулин крупного рогатого скота и фибрильное образование HEWL
- Препарат протеина
- - синуклеин:
ПРИМЕЧАНИЕ: Выражение и очищение рекомбинантного s-synuclein осуществляется, как описано Хойер и др.18 с некоторыми изменениями, и чистота-синуклеин подтверждается SDS-PAGE.- Диализ очищенный й-синуклеин в одночасье против фосфатно-буферного солира (PBS).
- Определить концентрацию белка с использованием коэффициента вымирания 5600 М-1 см-1 при 275 нм19.
- Aliquots белка в 1,5 мл труб и хранить при -80 градусов по Цельсию до использования.
- Коровий инсулин и HEWL:
- Обеспечить как бык инсулина и HEWL.
- Растворите каждый белок в 50 мм глицина буфера (рН 1,6; настроить рН с HCl).
- Определить концентрацию инсулина крупного рогатого скота и HEWL с использованием коэффициента вымирания 1,0 и 2,63 для 1,0 мг/мл при 276 нм и 280 нм, соответственно20,21.
- - синуклеин:
- Индукция амилоидной фибрилляции
- Приготовление растворов для амилоидной фибрилляции:
- Приготовьте буфер тиофлавин T (ThT): весьте 0,3 г2PO4 и растворите его в 80 мл DW, отрегулируйте рН до 6,5 и увеличьте объем до 100 мл, добавив DW.
- Подготовка ThT бульонный раствор (5 мм): весят 1,6 мг ThT и растворяйте его в 1 мл буфера ThT, пройдите через фильтровальную бумагу 0,22 мкм, и держитесь подальше от света при 4 градусах Цельсия до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение может храниться при 4 градусах По Цельсию в течение 4 недель. - Подготовьте решение ThT (1 мМ): добавьте 200 л стокового раствора ThT (5 мМ) до 800 л буфера ThT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение может храниться при 4 градусах Цельсия в течение 1 недели.
- В пробирке- синуклеидальное формирование фибрилкости:
- Добавьте аликвоты (294 л л) белкового раствора (200 мкм) и 6 л раствора ThT (1 мМ) к трубам 1,5 мл с последующим перемешиванием.
- Инкубировать трубки в термомиксе при 37 градусах Цельсия при постоянном перемешивании при 800 об/мин в течение 4 дней.
- Возьмите аликвоты (10 qL) инкубационных образцов после регулярных промежутков времени и добавьте 490 л буфера ThT, тщательно перемешайте и инкубируют в течение 5 минут на RT.
- Установите ширину щелей и эмиссии как 5 нм и 10 нм, соответственно, и измеряйте флуоресценцию ThT путем возбуждения на уровне 440 нм и излучение на уровне 485 нм с помощью спектрофотометра флуоресценции.
- В пробирке бычьего инсулина амилоидное фибрильное образование:
- Добавьте 637 л белкового раствора (250 мкм) в трубку 1,5 мл. Затем добавьте 13 кл л раствора ThT (1 мМ), после чего помешивая.
- Добавьте аликвоты (200 л) белкового раствора (250 мкм), содержащего по 20 мкм ТТ к каждой скважине из четкого дна 96 скважины и запечатайте пластину кристально чистой лентой для уплотнения.
- Загрузите пластину в считыватель флуоресценции и инкубировать при 57 градусах Цельсия без возбуждения.
- Измерьте флуоресценцию TH с интервалом 30 мин, с возбуждением на уровне 440 нм и выбросом на уровне 485 нм, на 12 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Встряхните пластину в течение 5 с перед каждым измерением.
- В пробирке HEWL амилоидное образование фибрилла:
- Добавьте аликвоты (200 л) белкового раствора (1 мМ), содержащего по 20 мкм ТТ к каждой скважине из четкого дна 96 скважины и загерметизуйте пластину кристально чистой уплотнительной лентой.
- Загрузите пластину в считыватель флуоресценции и инкубировать при 57 градусах Цельсия без возбуждения.
- Измерьте флуоресценцию ThT с интервалом 2 ч, с возбуждением на уровне 440 нм и выбросом при 485 нм, в течение 4 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех трех белков, образование амилоидной фибрильной подтверждается атомной микроскопии силы(рисунок 2B).
- Приготовление растворов для амилоидной фибрилляции:
6. Лечение митохондрий с амилоидными фибрилями, mDH релиз асссее, и ros измерения
- Инкубация изолированных митохондрий с амилоидными фибрилями
- Включите центрифугу и теплую водяную ванну и установите до 4 градусов по Цельсию и 30 градусов соответственно.
- Используя IF, разбавить митохондриальный гомегенат до конечной концентрации 1 мг/мл.
- Подготовьте две серии из 1,5 мл трубок, содержащих митохондриальные гомогенаты (одна серия для асссы высвобождения MDH, а другая для измерения митохондриальной ROS).
- Добавить aliquots свежих или амилоидных фибрилки из-синуклеина, бычьего инсулина, или HEWL (при конечных концентрациях 5 мкм, 10 мкм, 20 мкм, и 25 мкм; используйте PBS или глицин буфер в качестве контроля) митохондриальный homogenate (окончательный том 200 мкм) (см. Таблица 1, Таблица 1 , Таблица 1 , Таблица 1 , Таблица 1 , Таблица 1 , Таблица 1 , Таблица 1 , Таблица 2 , , и таблица 3), а затем осторожно перемешивания раствора с пипеткой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки выпуска MDH используйте Triton X-100 (при конечной концентрации 0,5% «v/v») в качестве положительного контроля для максимального высвобождения ферментов. - Инкубировать трубки, содержащие митохондриальные суспензии в течение 30 минут в теплой водяной бане, установленной до 30 градусов по Цельсию.
- Измерьте митохондриальный выпуск MDH и содержание ROS, изложенные в разделах 6.2 и 6.3.
- Митохондриальный MDH релиз асссе
- Центрифуга инкубированных митохондриальных гомогений на 16000 х г в течение 15 минут, а затем тщательно собирать в результате супернатанты для ассеации деятельности митохондриальных MDH, как описано в разделе 4.
- Рассчитайте выпуск MDH как часть максимального эффекта (Triton X-100) следующим образом:
- Измерение митохондриального ROS
ПРИМЕЧАНИЕ: Содержание митохондриального ROS определяется с окислением чувствительных фторгенных прекурсоров dihydrodichlorcarboxboxyfluorescein диацетат (DCFDA)22.- Подготовьте решения для измерения митохондриального ROS. Подготовьте раствор 50 км DCFDA путем растворения в метаноле (подготовьте свежий) и растворяем растворение в DW растворяем растворение в 200 мМ.
- Пипетка 191 л инкубированных митохондриальных гомегената к каждой скважине 96 скважин и добавить 4 злиц из 50 ММ DCFDA (1 ММ конечной концентрации) и 5 qL 200 мМ succinate (5 мМ конечной концентрации).
- Инкубировать тарелку в течение 30 минут в теплой водяной бане, установленной при 30 градусах По Цельсию, нежно помешивая.
- Загрузите пластину в считыватель флуоресценции и измерьте интенсивность флуоресценции, с возбуждением на уровне 485 нм и выбросом на уровне 530 нм.
7. Статистический анализ
- Выполняйте все эксперименты по крайней мере в 2разаили или в 3 раза с тройными анализами и проводим соответствующие статистические тесты. Здесь результаты представлены в виде среднего SD, и для расчета статистической значимости был использован парный t-тестстудента. P-значения менее 0,01 и 0,05 были сочтены статистически значимыми (пч ч. 0; 0,05; зли; 0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол описывает модель для изучения взаимодействия амилоидной фибриль с митохондриями мозга крыскаки в качестве биологической модели in vitro. Для митохондриальной подготовки, 15% (v/v) плотность градиента среды был использован для удаления миелина в качестве основного загрязнения ткани мозга14. Как показано на рисунке 1A, центрифугация на 30700 х г производится две различные полосы материала, миелин (вкачестве основного компонента полосы 1) и полосы 2, которая содержит обогащенные митохондриальной фракции.
Путем изменять протокол описанный Sims и Anderson14,митохондриальная подвеска содержа и синаптические и non-синаптические митохондрии была подготовлена. Для приготовления чистых несинапических митохондрий, Симс и Андерсон ранее подробно протокол14. На заключительном этапе центрифугации,10 мг/мл жирных кислот, свободных BSA был добавлен для получения твердой митохондриальной гранулы (Рисунок 1A). Целостность митохондриальной мембраны оценивалась путем измерения активности MDH в изолированных митохондриях до и после нарушения мембраны и выпуска ферментов Triton X-100, как описано в протоколе.
Как правило, было установлено, что митохондриальные препараты были около 93% нетронутыми(рисунок 1B). Для мониторинга роста амилоидных фибриллов был проведен флуоресценция ThT. Как показано на рисунке 2A, кривая для амилоидной фибрилляции трех белков показала типичный сигмоидальный узор, который соответствует модерации-зависимых полимеризации моделей этих белков, как сообщалось ранее23,24 ,25. Самый высокий выброс флуоресценции ThT для з-синуклеина, инсулина крупного рогатого скота и HEWL наблюдался после 96 ч, 12 ч и 96 ч, соответственно, предполагая образование амилоидных фибриллов(рисунок 2A). Это было дополнительно подтверждено измерением AFM.
Как показано на рисунке 2B, четко определенные зрелые фибриллы с типичной амилоидной морфологии наблюдались для трех белков, инкубированных под амилоидогенными условиями. Исследованы взаимодействия и возможные повреждения и пермяки митохондриальных мембран амилоидными фибрилями. Это было достигнуто путем мониторинга выпуска митохондриальных MDH и митохондриальных измерений ROS при добавлении з-синуклеина, инсулина крупного рогатого скота, или HEWL амилоидных фибрилов митохондриальных суспензий и после описанных процедур. Предварительные эксперименты показали, что наличие ThT (до 3 ММ) не влияет на содержание MDH и митохондриального ROS (данные не показаны).
Как показано на рисунке 3, существенное освобождение MDH наблюдалось при добавлении амилоидных фибриллов в митохондрии в концентрационно-зависимым образом. Хотя небольшое высвобождение было обнаружено при добавлении крупного рогатого скота инсулина амилоидных фибриллов, HEWL фибриллы были признаны неэффективными(Рисунок 3). Хотя никакого значительного повышения содержания митохондриального ROS не наблюдалось при добавлении инсулина крупного рогатого скота или HEWL амилоидных фибриллов, лечение фибрилями с синуклеином привело к значительному увеличению содержания ROS митохондрий мозга в концентрационно-зависимым образом(рисунок 4).
Рисунок 1: Митохондриальная изоляция и определение целостности мембраны. (A)Слева: типичный вид центрифуги трубки после повторного приостановки гранулы в холодной 15% плотности градиент среднего раствора после центрифугирования. Миелин является основным компонентом полосы 1, которая накапливается в верхней части. Группа 2 содержит высокообогащенную митохондриальную фракцию. Справа: твердые гранулы были произведены после добавления 10 мг/мл жирных кислот без BSA и центрифугации при 6900 х г. (B) Целостность митохондриальной мембраны была определена путем измерения активности MDH в изолированных митохондриях до и после нарушение мембраны Triton X-100. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Амилоидная фибрилляция з-синуклеина, инсулина крупного рогатого скота и HEWL. ()Кинетика амилоидного образования фибрилка указывается на увеличение интенсивности флуоресценции ThT на 485 нм. (B) изображения AFM 3 протеинов показаны, которые были инкубированы под амилоидогенными условиями для регулярно времен. Шкала баров представляют 500 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Митохондриальный MDH релиз при взаимодействии с мономером и амилоидной фибриль из-синуклеин, бычьего инсулина, и HEWL. Высвобождение выражается как процент от максимального наблюдаемого при лечении 0,5% (v/v) Triton X-100. Каждое значение представляет среднее значение SD (n No 3; qp qlt; 0,05, qp lt; 0.01). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Содержание митохондриального ROS при взаимодействии с мономером и амилоидной фибрилью из-синуклеина, бычьего инсулина и HEWL. Данные выражаются как процент значений в контрольной митохондриях. Каждое значение представляет среднее значение SD (n no 3; qp qlt; 0,05; qp lt; 0.01). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Митохондриальный гомегенат (1 мг/мл) | Мономер синуклеин (200 мкм) | Фибриль синуклеина (200 мкм) | Изоляционный буфер | Pbs | Тритон x-100 20% (v/v) | |
| Управления | 175 л | 0 | 0 | 25 зл. | 0 | 0 |
| Pbs | 175 л | 0 | 0 | 0 | 25 зл. | 0 |
| Мономер 25 мкм | 175 л | 25 зл. | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Фибриль 5 мкм | 175 л | 0 | 5 зл | 20 зл | 0 | 0 |
| Фибриль 10 мкм | 175 л | 0 | 10 зл | 15 зл | 0 | 0 |
| Фибриль 20 мкм | 175 л | 0 | 20 зл | 5 зл | 0 | 0 |
| Фибриль 25 мкм | 175 л | 0 | 25 зл. | 0 | 0 | 0 |
| Положительный контроль | 175 л | 0 | 0 | 20 зл | 0 | 5 зл |
Таблица 1: Лечение митохондрий с различными концентрациями амилоидных фибрилков с синуклеином.
| Митохондриальный гомегенат (1 мг/мл) | Мономер инсулина из крупного рогатого скота (250 мкм) | Фибрил инсулинового фибрила крупного рогатого скота (250 мкм) | Изоляционный буфер | Глицин буфер | Тритон x-100 20% (v/v) | |
| Управления | 175 л | 0 | 0 | 25 зл. | 0 | 0 |
| Глицин буфер | 175 л | 0 | 0 | 0 | 25 зл. | 0 |
| Мономер 25 мкм | 175 л | 20 зл | 0 | 5 зл | 0 | 0 |
| Фибриль 5 мкм | 175 л | 0 | 4 л | 21 зл | 0 | 0 |
| Фибриль 10 мкм | 175 л | 0 | 8 зл | 17 Зл | 0 | 0 |
| Фибриль 20 мкм | 175 л | 0 | 16 Зл | 9 зл. | 0 | 0 |
| Фибриль 25 мкм | 175 л | 0 | 20 зл | 5 зл | 0 | 0 |
| Положительный контроль | 175 л | 0 | 0 | 20 зл | 0 | 5 зл |
Таблица 2: Лечение митохондрий с различными концентрациями крупного рогатого скота инсулина амилоидных фибриллов.
| Митохондриальный гомегенат (1 мг/мл) | HeWL мономер (1 мМ) | ФИбриль HEWL (1 мМ) | Изоляционный буфер | Глицин буфер | Тритон x-100 20% (v/v) | |
| Управления | 175 л | 0 | 0 | 25 зл. | 0 | 0 |
| Глицин буфер | 175 л | 0 | 0 | 0 | 25 зл. | 0 |
| Мономер 25 мкм | 175 л | 5 зл | 0 | 20 зл | 0 | 0 |
| Фибриль 5 мкм | 175 л | 0 | 1 зл | 24 зл. | 0 | 0 |
| Фибриль 10 мкм | 175 л | 0 | 2 л | 23 Зл | 0 | 0 |
| Фибриль 20 мкм | 175 л | 0 | 4 л | 21 зл | 0 | 0 |
| Фибриль 25 мкм | 175 л | 0 | 5 зл | 20 зл | 0 | 0 |
| Положительный контроль | 175 л | 0 | 0 | 20 зл | 0 | 5 зл |
Таблица 3: Лечение митохондрий с различными концентрациями HEWL амилоидных фибриллов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Богатство экспериментальных результатов подтверждает гипотезу о том, что цитотоксичность фибриллярных агрегатов в значительной степени связана с их способностью взаимодействовать и пронизать биологические мембраны4,5. Однако большая часть данных основана на искусственных липидных двуслойных, которые не обязательно отражают внутренние свойства биологических мембран, которые являются неоднородными структурами с широким разнообразием фосфолипидов и белков. Здесь, используя митохондрии мозга в качестве биологической мембраны in vitro, описана модель изучения фибриллярных агрегатов цитотоксичности на мембранном уровне.
Во время эксперимента важно быстро работать и держать все на льду, чтобы подготовить функционально активные митохондрии с нетронутыми мембранами. Кроме того, концентрация митохондрий (на основе общего измерения белка) является важным фактором, влияющим на взаимодействие мембранно-амилоидного фибрилла; таким образом, он должен сохраняться на всем протяжении протокола. В настоящем исследовании митохондриальные препараты содержали как синаптические, так и несинаптические митохондрии. Для чистого несинаптического митохондриального препарата, 40%, 23%, и 15% (v/v) плотность градиента среды должны быть использованы, как описано Sims и Андерсон14. Поскольку митохондрии являются органеллой с хорошо охарактеризованной мембраной, она может служить чрезвычайно полезной биологической моделью системы в молекулярных исследованиях, связанных с механизмами амилоидной цитотоксичности на мембранном уровне (особенно в отношении нейродегенеративных заболеваний). Этот протокол позволяет иссмотреть взаимодействия и степень проникания митохондриальных мембран путем изучения выпуска различных молекул и ферментов, расположенных в разных отсеках (т.е. встроенных во внешние и внутренние мембраны и те, которые расположены в межмембранном пространстве или митохондриальной матрице).
После подтверждения целостности митохондриальной мембраны(рисунок 1B)и амилоидного образования фибрилла(рисунок 2), взаимодействие, повреждение и permeabilization митохондриальных мембран при добавлении з-синуклеина, инсулина крупного рогатого скота, и HEWL амилоидные фибрилки были исследованы. Результаты продемонстрировали явные различия в степени мембраны permeabilization и митохондриальной ROS повышение индуцированных амилоидных фибриллов(Рисунок 3 и Рисунок 4), предлагая изменения в способности различных амилоидных фибрилки взаимодействовать с митохондриальными мембранами и повреждать их.
Для мембраны permeabilization инициации, амилоидные фибрилли должны достигать митохондриальной поверхности. Было показано, что ассоциация, локализация и вставка белков в заряженные мембраны зависит от неспецифических электростатических взаимодействий и гидрофобной природы белков26,27,28. Что касается токсичности амилоидов, растущее количество доказательств сильно подразумевает ключевую роль белка агрегатной гидрофобности поверхности в их цитотоксичности29,30. Хотя HEWL несет чистый положительный заряд в широком диапазоне уровней рН и имеет высокое сродство к анионическим и нейтральным фосфолипидам31 (например, митохондриальная мембрана23), нет митохондриальной мембраны permeabilization и ROS повышение наблюдались(рисунок 3 и рисунок 4). Объяснение для этого наблюдения может быть связано с уменьшением поверхностной гидрофобности фибрилов HEWL из-за бокового фибриль-фибрибельных взаимодействий23,32, что приводит к потере способности вызывать повреждение мембраны.
Для крупного рогатого скота инсулина, несмотря на значительное воздействие гидрофобных регионов в ходе формирования фибрила22, небольшое высвобождение фермента наблюдалось при добавлении 25 ММ амилоидных фибрилки (Рисунок 3) без значительного воздействия на содержание митохондриального ROS(рисунок 4). Поскольку митохондрии мозга и фибриллы инсулина крупного рогатого скота несут отрицательный потенциал зеты на их поверхностях24,предполагается, что отталкивающие силы между митохондриальной мембраной и бычьим инсулином амилоидных фибриллов может объяснить их неспособность эффективно взаимодействовать с митохондриальными мембранами24. Самые высокие пермяки и митохондриальные приращения ROS наблюдались при добавлении фибрильса ссинуклеина(рисунок 3 и рисунок 4).
Это наблюдение может быть связано с высокой мощностью s-synuclein для взаимодействия с биологическими мембранами, которые имеют отрицательно заряженные поверхности33,34, такие как митохондрии. В связи с этим, некоторые исследования показали, конкретные связывания и импорта -синуклеина в митохондрии, где они становятся преимущественно связаны с внутренней мембраной35. Интересно, что Ghio et al. сообщили, что связывание, опосредовано кардиолипином (фосфолипид, однозначно обогащенный во внутренней митохондриальной мембране), з-синуклеина может быть важным механизмом для ассоциации и нарушения митохондриальных мембран36.
Интересно, что есть четкие доказательства для связывания и накопления различных амилоидогенных пептидов и белков, включая амилоидный пептид, з-синуклеин, Хантингтин, и ALS-связанных мутант SOD1 в митохондрии35,37, 38,39. Кроме того, предыдущие исследования показали, что амилоидогенные сборки амилоидов No (25-35)15 и SOD 140 обладают способностью взаимодействовать с митохондриальной мембраной пермяки. Согласно литературе, предполагается, что амилоидные фибрилки слишком велики, чтобы пересечь мембрану; поэтому средний размер фибрила не должен быть фактором очевидного отсутствия эффектов, вызванных инсулином крупного рогатого скота и ФИбрилями HEWL амилоидных. Хотя необходимы дальнейшие исследования для выяснения подробных механизмов, предполагается, что биофизические особенности амилоидных фибриллов (т.е. поверхностный заряд, гидрофобность и обладающие определенной последовательностью таргетинга митохондриальной мембраны) может играть важную роль в их способности взаимодействовать с биологическими мембранами и наносить им ущерб.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Научно-исследовательского совета Института перспективных исследований в области фундаментальных наук (IASBS), Занджан, Иран.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
| Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
| Black 96-well plate | Corning | ||
| Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
| Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
| Centrifuge | Sigma | ||
| Crystal clear sealing tape | Corning | ||
| CuSO4 | Sigma | 451657 | |
| Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
| Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Fluorescence plate reader | BioTek | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
| Folin | Merck | F9252 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Guillotine | Made in Iran | ||
| HCl | Merck | H1758 | |
| Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
| Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
| NaOH | Merck | S8045 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
| Percoll | GE Healthcare | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
| Quartz cuvette | Sigma | ||
| Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
| Succinate | Sigma | S2378 | |
| Sucrose | Merck | 1076871000 | |
| Thermomixer | Eppendorph | ||
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
| Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tryptone | QUELAB | ||
| Water bath | Memmert | ||
| Yeast Extract | QUELAB | ||
| β-NADH | Sigma | N8129 |
References
- Merlini, G., Bellotti, V.
- Berg, I. Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , Linköping University. Linköping Institute of Technology, Department of Physics, Chemistry and Biology (2010).
- Kagan, B. L. Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage. Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. Uversky, V. N., Fink, A. L. , Springer US. New York. 223-236 (2006).
- Demuro, A., et al. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers. The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).
- Kayed, R., et al. Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).
- Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage. Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).
- Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues. Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R.
- Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations. Nature. 418, 291 (2002).
- Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).
- Ghobeh, M., et al. Interaction of Aβ (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products. Peptide Science. 102, 473-486 (2014).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria. Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).
- Hoyer, W., et al. Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions. Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).
- Weinreb, P. H., et al. NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded. Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).
- Porter, R. R. Partition chromatography of insulin and other proteins. The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).
- Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme. Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).
- Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol. Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).
- Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products. Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).
- Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).
- Fink, A. L. The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).
- Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains. Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).
- Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. Lipid bilayer disruption by oligomeric α-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core. Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).
- Kourie, J. I., Henry, C. L. Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 29, 741-753 (2002).
- Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
- Bolognesi, B., et al. ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species. ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).
- Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content. Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).
- Roqanian, S., et al. Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action. International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).
- Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein. The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).
- Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains. Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).
- Devi, L., et al. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. Interaction of α-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Oladzad Abbasabadi, A., et al. Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1. International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).
