Summary
Hier is een protocol voor het onderzoek van de interacties tussen inheemse vorm, prefibrillar, en volwassen amyloïde fibrillen van verschillende peptiden en eiwitten met mitochondriën geïsoleerd uit verschillende weefsels en verschillende gebieden van de hersenen.
Abstract
Een groeiende hoeveelheid bewijs geeft aan dat membraan permeabilization, met inbegrip van interne membranen zoals mitochondriën, is een gemeenschappelijk kenmerk en primaire mechanisme van amyloïde aggregaat-geïnduceerde toxiciteit in neurodegeneratieve ziekten. Echter, de meeste rapporten beschrijven de mechanismen van membraan verstoring zijn gebaseerd op fosfolipide modelsystemen, en studies direct targeting gebeurtenissen die zich voordoen op het niveau van biologische membranen zijn zeldzaam. Hier beschreven is een model voor het bestuderen van de mechanismen van amyloïde toxiciteit op membraan niveau. Voor mitochondriale isolatie wordt dichtheidsgradiënt gebruikt om preparaten met minimale myeline besmetting te verkrijgen. Na de mitochondriale membraan integriteit bevestiging, de interactie van amyloïde fibrillen die voortvloeien uit α-synucleine, runderinsuline, en kip eiwit lysozym (hewl) met rat hersenen mitochondriën, als een in vitro biologisch model, wordt onderzocht. De resultaten tonen aan dat de behandeling van de mitochondriën van de hersenen met fibrillar assemblies verschillende graden van membraan permeabilization en ROS inhoud Enhancement kan veroorzaken. Dit duidt op structuur afhankelijke interacties tussen amyloïde fibrillen en mitochondriaal membraan. Er wordt gesuggereerd dat biofysische eigenschappen van amyloïde fibrillen en hun specifieke binding aan mitochondriale membranen uitleg kunnen geven voor sommige van deze waarnemingen.
Introduction
Amyloïde-gerelateerde aandoeningen, bekend als amylodoses, vormen een grote groep van ziekten die worden gedefinieerd door het verschijnen van onoplosbare eiwit afzettingen in verschillende weefsels en organen1,2. Onder hen, neurodegeneratieve aandoeningen zijn de meest voorkomende vormen waarin eiwit aggregaten verschijnen in het centrale of perifere zenuwstelsel2. Hoewel een aantal mechanismen is voorgesteld om betrokken te zijn bij de toxiciteit van amyloïde aggregaten3, wijst een groeiend geheel van bewijsmateriaal op verstoring van de celmembraan en permeisatie als het primaire mechanisme van amyloïde pathologie4, 5. Naast plasma membraan, interne organellen (dat wil zeggen, mitochondriën) kan ook worden beïnvloed.
Interessant, opkomende bewijs suggereert dat mitochondriale dysfunctie speelt een cruciale rol in de pathogenese van neurodegeneratieve aandoeningen, met inbegrip van de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson6,7. In overeenstemming met deze kwestie, talrijke rapporten hebben aangegeven binding en accumulatie van amyloïde β-peptide, α-synuclein, huntingtine, en als-gebonden Mutant SOD1 eiwitten aan mitochondriën8,9,10, 11. het mechanisme van membraan permeisatie door amyloïde aggregaten wordt verondersteld te gebeuren door vorming van discrete kanalen (poriën) en/of door middel van een niet-specifiek detergens-achtige mechanisme5,12, 13. Het is opmerkelijk dat de meeste van deze conclusies zijn gebaseerd op rapporten met betrekking tot fosfolipide modelsystemen, en studies direct gericht op de gebeurtenissen die zich voordoen in biologische membranen zijn zeldzaam. Duidelijk, deze kunstmatige lipide bilayers niet noodzakelijkerwijs weerspiegelen de intrinsieke eigenschappen van biologische membranen, met inbegrip van die van de mitochondriën, die heterogene structuren en samengesteld uit een breed scala van fosfolipiden en eiwitten.
In de huidige studie, mitochondriën geïsoleerd van rat hersenen worden gebruikt als een in vitro biologisch model om te onderzoeken van de destructieve effecten van amyloïde fibrillen die voortvloeien uit α-synucleine (als een amyloidogenic eiwit), bovine insuline (als een model peptide tonen significante structurele homologie met humane insuline die betrokken zijn bij injectie-gelokaliseerde Amyloïdose), en kip eiwit lysozym (hewl; als een gemeenschappelijk model eiwit voor studie van amyloïde aggregatie). De interacties en mogelijke schade van mitochondriale membranen geïnduceerd door amyloïde fibrillen worden vervolgens onderzocht door het observeren van het vrijkomen van mitochondriale malaat dehydrogenase (MDH) (gelegen in de mitochondriale matrix) en mitochondriën reactieve zuurstof Soort (ROS) Enhancement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dier experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de medische wetenschappen van de Universiteit van Teheran. Er werden maximale inspanningen geleverd om het lijden en de nadelige effecten voor de ratten te minimaliseren door de guillotine bladen te verscherpen en resolute en snelle bewegingen van het blad toe te passen.
1. hersen homogenisatie en mitochondriale isolatie
Opmerking: alle reagentia voor mitochondriale isolatie werden bereid volgens de Sims en Anderson14.
- Bereiding van buffers voor mitochondriale isolatie
- Bereid een 100 mM tris-HCl-oplossing voor: Weeg 0,605 g tris-HCl af en los deze op in ongeveer 40 mL gedeïoniseerd water (DW) in een bekerglas. Breng de oplossing over in een maatkolf van 50 mL en verhoog het eindvolume tot 50 mL door DW toe te voegen.
- Bereid een EDTA-oplossing van 10 mM: Weeg 0,202 g EDTA af en los deze op in ongeveer 40 mL DW in een bekerglas. Breng de oplossing over in een maatkolf van 50 mL en verhoog het eindvolume tot 50 mL door DW toe te voegen.
NB: beide oplossingen kunnen gedurende ten minste 4 weken bij 4 °C worden bewaard. - Bereid een tris-HCl/EDTA/sucrose stockoplossing: Voeg 30 mL 100 mM tris-HCl en 30 mL EDTA in een bekerglas toe. Weeg 32,86 g sucrose af en voeg deze toe aan het bekerglas terwijl u met een magneetroerder roeren. Wanneer de sacharose is opgelost, breng de oplossing over naar een maatkolf van 100 mL en verhoog het eindvolume tot 100 mL door DW toe te voegen.
Opmerking: deze oplossing kan maximaal 3 dagen bij 4 °C worden bewaard. - Maak een isolatie buffer (IB): Voeg 100 mL tris-HCl/EDTA/sucrose kolf toe aan ongeveer 150 mL DW. Pas de pH op 7,4 door toevoeging van 0,1 M HCl. Verhoog het eindvolume tot 300 mL door DW toe te voegen.
- Bereid 15% (v/v) dichtheidsgradiënt in met IB door toevoeging van 1,5 mL dichtheidsgradiënt medium aan 8,5 mL koude IB.
- Bereid 10 mg/mL boviene serumalbumine (BSA) oplossing: Weeg 20 mg vetzuur vrije BSA af en los deze op in ongeveer 1,5 mL DW in een 2 mL injectieflacon. Verhoog het eindvolume tot 2 mL door DW toe te voegen en op te slaan op ijs tot het gebruik.
Opmerking: bereid de oplossingen vers van stap 1.1.4 – 1.1.6 op de dag van de mitochondriale isolatie en bewaar ze op ijs tot gebruik.
- Isolatie van de hersenen van de rat
Opmerking: onthoofding en hersen verwijdering van mannetjesratten (150 – 200 g) werden uitgevoerd volgens de Sims en Anderson14.- Plaats een bekerglas van 30 mL in een ijsemmer en voeg 10 mL koude IB toe aan het bekerglas.
- Onthoofde rat met een kleine dierlijke guillotine en verwijder de hersenen van de schedel binnen 1 minuut na het onthoofding om de verslechtering van de mitochondriale eigenschappen te beperken.
- Breng de hersenen snel over in het bekerglas dat koude IB bevat.
- Brain homogenisatie en voorbereiding van mitochondriën
Opmerking: mitochondriale breuken werden geïsoleerd volgens het protocol beschreven door Sims en Anderson14, met enkele wijzigingen zoals eerder beschreven15. Het is belangrijk om snel te werken en alles op ijs te houden gedurende de hele procedure.- Was het weefsel 2x met 30 mL IB, breng het over in een beker met Cold IB en snijd de hersenen fijn met een schaar.
- Voeg 10 volumes voorgekoelde IB (ongeveer 10 mL IB per rat brein) toe.
- Breng de weefsel suspensie over in een koude Dounce homogenisator van 20 mL.
- Homogeniseren de weefsel stukken met behulp van negen omhoog-en-omlaag slagen met een gemotoriseerde stamper.
Opmerking: laat het mengsel op ijs gedurende ongeveer 30 sec. na elke set van drie homogenisatie slagen om ervoor te zorgen dat het homogenaat koud blijft. - Breng het homogenaat over in een voorgekoelde centrifugebuis van 10 mL en Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 1, 300x g en 4 °c.
- Decanteren zorgvuldig het supernatant en breng het over in een voorgekoelde centrifugebuis van 10 mL en centrifugeer op 21, 000x g bij 4 °c gedurende 10 minuten.
- Gooi het supernatant weg en regeer de pellet in een koude 15% dichtheidsgradiënt oplossing (5 mL voor elke hersenen) door het mengsel zachtjes met een pipet te roeren.
- Centrifugeer in een rotor met een vaste hoek bij 30, 700x g bij 4 °c gedurende 5 minuten met langzame acceleratie (45 s van 0 rpm tot 500 rpm, gevolgd door een normale acceleratie) en vertraging (geen remmen). Dit moet twee verschillende materiaal klassen produceren (Figuur 1a, links).
- Met behulp van een Pasteur-pipet verwijdert u de scherpe band van het materiaal dat aan de bovenkant van het verloop is opgebouwd, dat meestal myeline bevat. Verwijder vervolgens de dichtheidsgradiënt medium oplossing boven het materiaal (in band 2) zoveel mogelijk zonder verlies van een van de verrijkte mitochondriale breuk in band 2.
Opmerking: de band 2 bevat zowel de synaptische en niet-synaptische mitochondriën. - Voeg 8 mL IB toe aan de mitochondriale fractie terwijl het mengsel zachtjes met een pipet wordt geroerd.
- Centrifugeer op 16, 700x g bij 4 °c gedurende 10 minuten en verwijder voorzichtig het supernatant, waardoor de onderste losse pellet ongestoord wordt verwijderd.
- Voeg 1 mL van 10 mg/mL vetzuur vrije BSA toe aan de centrifugebuis terwijl het mengsel zachtjes met de punt van een pipet wordt geroerd. Verhoog het eindvolume tot 5 mL per hersenen door het toevoegen van IB.
- Centrifugeer op 6, 900x g bij 4 °c gedurende 10 minuten, wat een stevige pellet moet produceren (Figuur 1a, rechts).
- Decanteer de supernatant en breng de mitochondriale pellet in IB, aliquot ze in 0,5 mL tubes, en bewaar in vloeibare stikstof tot gebruik.
2. bepaling van de eiwitconcentratie
Opmerking: de eiwitconcentratie wordt gemeten met behulp van de methode van Lowry et al.16.
- Bereiding van oplossingen voor Lowry assay
- Oplossing voorbereiden A: Weeg 0,4 g NaOH en 2 g na2co3 af en los op in 80 ml DW, breng de oplossing over in een maatkolf van 100 ml en verhoog het volume tot 100 ml door DW toe te voegen.
- Bereid oplossing B: Weeg 0,1 g kalium natriumtartraat en 0,05 g CuSO4 en los in 8 ml DW op, breng de oplossing over in een maatkolf van 10 ml en verhoog het volume tot 10 ml door DW toe te voegen.
NB: beide oplossingen A en B kunnen gedurende maximaal 6 maanden stabiel blijven bij 4 °C. - Oplossing bereiden C: Voeg 0,5 mL Folin oplossing toe aan 7,5 mL DW.
Opmerking: bereid de oplossing C vers voor en houd ze uit de buurt van licht tot gebruik. - Bereid de BSA-normen voor met de uiteindelijke concentraties van 0, 20, 40, 60, 80, 100 en 120 μg/mL door respectievelijk 0, 20, 40, 60, 80, 100 en 120 μL van 1 mg/mL BSA te combineren met voldoende DW om 1000 μL oplossing te maken.
- Meting van de eiwitconcentratie
Opmerking: Voer deze stap uit in Triplicate voor meer nauwkeurigheid.- Voeg 50 μL standaard oplossingen en mitochondriale homogenaat toe aan elk goed van een 96-put, gevolgd door toevoeging van 45 μL oplossing A. Inbroed vervolgens de plaat 10 min in een warmwaterbad ingesteld op 50 °C.
- Voeg 5 μL oplossing B toe en inincuberen de plaat gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur (RT).
- Voeg 150 μL oplossing C toe en inincuberen de plaat gedurende 10 minuten in een warmwaterbad ingesteld op 50 °C.
- Laad de plaat in een plaat lezer en noteer de absorptie waarden voor standaarden en mitochondriale suspensie bij 650 nm. Vervolgens, met behulp van een kalibratiecurve, bereken het eiwitgehalte van de mitochondriën.
3. bepaling van de integriteit van mitochondriale membraan
Opmerking: de integriteit van mitochondriale membraan wordt bevestigd door het meten van malaat dehydrogenase (MDH) activiteit in geïsoleerde mitochondriën voor en na verstoring van het membraan door Triton X-100.
- Verdun mitochondriale homogenaat tot 1 mg/mL met Cold IB en geplaatst in twee buisjes van 1,5 mL (gewoonlijk 195 μL mitochondriën per buis).
- Voeg 5 μL 20% (v/v) Triton X-100 (verdund met DW) toe aan één buis (als een positieve controle voor maximale enzymactiviteit) en 5 μL DW naar een andere buis (voor controle) gevolgd door menging met een roerder.
- Inbroed de buisjes gedurende 10 min in een warmwaterbad ingesteld op 30 °C.
- De mitochondriën van de pellet door centrifugeren van buizen in een vaste hoekrotor bij 16.000 x g en 4 °c gedurende 15 minuten.
- Verzamel zorgvuldig de resulterende supernatanten voor het aszeggen van de activiteit van mitochondriale MDH met behulp van een standaard spectrofotometrische assay zoals beschreven in de volgende sectie.
- Bereken de integriteit van het mitochondriale membraan als volgt:
4. bepaling van de MDH-activiteit
Opmerking: MDH-activiteit werd gemeten spectrophotometrisch zoals beschreven door Sottocasa et al.17.
- Voorbereiding van oplossingen voor de MDH-activiteitstest
- Bereid een 50 mM tris-HCl oplossing (pH = 7,5): bereid een 7,9 mg/mL oplossing in DW met tris-HCl en stel de pH in op 7,5 bij 25 °C met 1,0 M NaOH.
- Bereid een 50 mM Oxaloacetaat oplossing voor: bereid een 6,6 mg/mL oplossing met behulp van Oxaloacetaat in tris-HCl.
Opmerking: deze oplossing is niet stabiel eenmaal in de oplossing en moet onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik worden bereid. - Bereid een 10 mM β-NADH oplossing: bereid een 7,81 mg/mL oplossing met β-NADH in tris-HCl.
- Bepaling van de MDH-activiteit
NB: de Eindassay concentraties in een reactiemengsel van 1,0 mL zijn 50 mM tris-HCl, 5 mM Oxaloacetaat en 0,1 mM β-NADH.- Stel de spectrofotometer in op 25 °C en 340 nm. Pipetteer 890 μL tris-HCl-buffer, 100 μL Oxaloacetaat oplossing en 10 μL NADH-oplossing voor een lege cuvette en 880 μL tris-HCl-buffer, 100 μL Oxaloacetaat oplossing en 10 μL NADH-oplossing in een monster Cuvette.
- Incuberen cuvetten in de spectrofotometer gedurende 3 – 4 minuten en verwijzen naar blanco.
- Voeg vervolgens 10 μL mitochondriaal homogenaat (1 mg/mL) toe aan de monster cuvette, meng onmiddellijk door inversie, en record dalingen in de extinctie als gevolg van NADH-oxidatie bij 340 nm gedurende 1 minuut.
5. in vitro α-synucleine, boviene insuline en HEWL fibril vorming
- Eiwit preparaat
- α-synuclein:
Opmerking: expressie en zuivering van recombinant α-synuclein wordt uitgevoerd zoals beschreven door Hoyer et al.18 met enkele modificaties, en de zuiverheid van α-synuclein wordt bevestigd door SDS-page.- Dialyze gezuiverde α-synuclein 's nachts tegen fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Bepaal de eiwitconcentratie met een extinctiecoëfficiënt van 5600 M-1 cm-1 bij 275 nm19.
- Aliquots eiwit in 1,5 mL buizen en bewaren bij-80 °C tot het gebruik.
- Boviene insuline en HEWL:
- Zorg voor zowel runderinsuline als HEWL.
- Los elk eiwit op in 50 mM Glycine buffer (pH = 1,6; Pas de pH aan met HCl).
- Bepaal de concentratie van runderinsuline en hewl met een extinctiecoëfficiënt van 1,0 en 2,63 voor 1,0 mg/ml bij 276 nm en 280 nm, respectievelijk20,21.
- α-synuclein:
- Amyloid fibrillatie inductie
- Bereiding van oplossingen voor amyloïde fibrillatie:
- Bereiding thioflavin T (ThT) buffer: Weeg 0,3 g van NaH2po4 en los het op in 80 ml DW, stel de pH in op 6,5 en verhoog het volume tot 100 ml door DW toe te voegen.
- Bereiding ThT Stock Solution (5 mM): Weeg 1,6 mg ThT en los het op in 1 mL ThT buffer, loop door een 0,22 μm filtreerpapier en blijf bij 4 °C uit de buurt van licht tot gebruik.
Opmerking: deze oplossing kan maximaal 4 weken bij 4 °C worden bewaard. - ThT-oplossing voorbereiden (1 mM): Voeg 200 μL ThT-stamoplossing (5 mM) toe aan 800 μL ThT-buffer.
Opmerking: deze oplossing kan maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard.
- In vitro α-synuclein amyloïde fibril vorming:
- Voeg aliquots (294 μL) eiwit oplossing (200 μM) en 6 μL ThT-oplossing (1 mM) toe aan buizen van 1,5 mL, gevolgd door roeren.
- Incuberen de buisjes in een thermomixer bij 37 °C onder constant roeren bij 800 rpm gedurende 4 dagen.
- Neem aliquots (10 μL) van geïnde monsters na regelmatige tijdsintervallen en voeg 490 μL ThT-buffer toe, grondig gemengd, en inincuberen gedurende 5 minuten bij RT.
- Stel excitatie-en emissie spleet breedtes in als respectievelijk 5 nm en 10 nm en meet ThT fluorescentie door excitatie bij 440 nm en uitstoot bij 485 nm met behulp van een fluorescentie spectrofotometer.
- In vitro bovine insuline amyloïde fibril vorming:
- Voeg 637 μL eiwit oplossing (250 μM) toe aan de buis van 1,5 mL. Voeg vervolgens 13 μL ThT-oplossing (1 mM) toe, gevolgd door roeren.
- Voeg aliquots (200 μL) eiwit oplossing (250 μM) met 20 μM ThT toe aan elk goed van een 96 goed met een heldere bodem en sluit de plaat af met een kristalheldere afdichtingsband.
- Plaats de plaat in een fluorescentie plaat lezer en incuberen bij 57 °C zonder roeren.
- Meet de fluorescentie op 30 min-intervallen, met excitatie bij 440 nm en emissie bij 485 nm, gedurende 12 uur.
Opmerking: schud de plaat 5 sec. vóór elke meting.
- In vitro HEWL-amyloïde fibril vorming:
- Voeg aliquots (200 μL) eiwit oplossing) 1 mM) met 20 μM ThT aan elk goed van een heldere bodem 96 goed plaat en verzegelen de plaat met kristalheldere afdichtingsband.
- Plaats de plaat in een fluorescentie plaat lezer en incuberen bij 57 °C zonder roeren.
- Meet de fluorescentie bij 2 uur, met excitatie bij 440 nm en emissie bij 485 nm, gedurende 4 dagen.
Opmerking: voor alle drie de eiwitten wordt de amyloïde fibril vorming bevestigd door een atoom kracht microscopie (Figuur 2b).
- Bereiding van oplossingen voor amyloïde fibrillatie:
6. behandeling van mitochondriën met amyloïde fibrils, MDH-vrijgave test en ROS-meting
- Incubatie van geïsoleerde mitochondriën met amyloïde fibrillen
- Schakel centrifuge en warmwaterbad in en stel deze in op respectievelijk 4 °C en 30 °C.
- Gebruik indien, Verdun mitochondriale homogenaat tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg/mL.
- Bereid twee series van 1,5 mL buisjes met mitochondriale homogenaten (één reeks voor de MDH-afgifte test en een andere voor de mitochondriale ROS-meting).
- Voeg aliquots toe van verse of amyloïde fibrillen van α-synucleine, runderinsuline of hewl (in de uiteindelijke concentraties van 5 μm, 10 μm, 20 μm en 25 μm; gebruik PBS of Glycine buffer als een controle) op mitochondriale homogenaat (eindvolume = 200 μL) (Zie tabel 1, tabel 2 en tabel 3) gevolgd door de oplossing zachtjes te roeren met een pipet.
Opmerking: gebruik voor de MDH-vrijgave test de Triton X-100 (bij een eindconcentratie van 0,5% [v/v]) als een positieve controle voor de maximale afgifte van enzymen. - Incubate buisjes met mitochondriale suspensies gedurende 30 min in warmwaterbad ingesteld op 30 °C.
- Meet de mitochondriale MDH-release en ROS-inhoud zoals beschreven in de paragrafen 6,2 en 6,3.
- Mitochondriale MDH release assay
- Centrifugeer de geïnincubeerde mitochondriale homogeniteert bij 16.000 x g gedurende 15 minuten en verzamel vervolgens zorgvuldig de resulterende supernatanten voor het aszeggen van de activiteit van mitochondriale MDH zoals beschreven in rubriek 4.
- Bereken de afgifte van MDH als een fractie van het maximale effect (Triton X-100) als volgt:
- Mitochondriale ROS meting
Opmerking: mitochondriale ROS-inhoud wordt bepaald met de oxidatie gevoelige fluorogene precursor dihydrodichloorcarboxyfluorescein DIACETAAT (DCFDA)22.- Bereid oplossingen voor mitochondriale ROS meting. Bereid een oplossing van 50 μM DCFDA door oplossen in methanol (bereid vers) en een 200 mM succinaat oplossing door oplossen in DW.
- Pipetteer 191 μL geïnineerd mitochondriaal homogenaat tot elke put van een 96-goed plaat en voeg 4 μL 50 μM DCFDA (eindconcentratie van 1 μM) en 5 μL 200 mM succinaat (eindconcentratie van 5 mM) toe.
- Inbroed de plaat gedurende 30 minuten in een warmwaterbad ingesteld op 30 °C terwijl deze zachtjes roeren.
- Plaats de plaat in een fluorescentie plaat lezer en meet de intensiteit van de fluorescentie, met een excitatie van 485 nm en een emissie van 530 nm.
7. statistische analyse
- Voer alle experimenten ten minste 2x of 3x uit met drievoud assays en voer de juiste statistische tests uit. Hier worden de resultaten gepresenteerd als gemiddelde ± SD, en de gekoppelde t-toets van een student werd gebruikt om statistische significantie te berekenen. P-waarden kleiner dan 0,01 en 0,05 werden als statistisch significant beschouwd (* p < 0,05; * * p < 0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol beschrijft een model voor het bestuderen van de interacties van amyloïde fibril met rat hersenen mitochondriën als een in vitro biologisch model. Voor de mitochondriale bereiding werd 15% (v/v) dichtheidsgradiënt medium gebruikt om myeline te verwijderen als grote besmetting van hersenweefsel14. Zoals weergegeven in Figuur 1a, produceerde centrifugeren op 30.700 x g twee verschillende materiaal klassen, myeline (als de belangrijkste component van band 1) en band 2, die verrijkt mitochondriale breuk bevat.
Door het wijzigen van het protocol beschreven door Sims en Anderson14, een mitochondriale suspensie met zowel synaptische en niet-synaptische mitochondriën werd voorbereid. Voor de bereiding van zuivere niet-synaptische mitochondriën, Sims en Anderson eerder gedetailleerd het protocol14. Bij de laatste stap van centrifugeren werd 10 mg/mL vetzuur vrije BSA toegevoegd om een stevige mitochondriale pellet te verkrijgen (Figuur 1a). De integriteit van mitochondriale membraan werd beoordeeld door het meten van MDH-activiteit in geïsoleerde mitochondriën voor en na membraan verstoring en enzym afgifte door Triton X-100, zoals beschreven in het protocol.
Het werd meestal gevonden dat mitochondriale preparaten ongeveer 93% intact waren (Figuur 1b). Er werd een ThT-fluorescentie test uitgevoerd om de groei van amyloïde fibrillen te monitoren. Zoals weergegeven in Figuur 2atoonde de curve voor amyloïde fibrillatie van drie eiwitten een karakteristiek sigmoïdale patroon, dat in lijn is met nucleatie afhankelijke polymerisatie modellen van deze eiwitten, zoals eerder gemeld23,24 ,25. De hoogste tht-fluorescentie-emissie voor α-synucleine, runderinsuline en hewl werd waargenomen na respectievelijk 96 h, 12 uur en 96 h, wat suggereert dat de vorming van amyloïde fibrillen werd gesuggereerd (Figuur 2a). Dit werd verder bevestigd door de AFM-meting.
Zoals geïllustreerd in Figuur 2b, werden goed gedefinieerde rijpe fibrillen met typische amyloïde morfologie waargenomen voor drie eiwitten die onder amyloidogene condities werden geïnnobeerd. Interacties en mogelijke schade en permeisatie van mitochondriale membranen door amyloïde fibrillen werden onderzocht. Dit werd bereikt door het monitoren van de vrijlating van mitochondriale MDH en mitochondriale ROS meting op de toevoeging van α-synucleine, runderinsuline, of HEWL amyloïde fibrillen aan mitochondriale suspensies en volgens de beschreven procedures. De voorbereidende experimenten toonden aan dat de aanwezigheid van ThT (tot 3 μM) geen effect had op de MDH-release en het mitochondriale ROS-gehalte (gegevens niet weergegeven).
Zoals weergegeven in Figuur 3, werd aanzienlijke afgifte van MDH waargenomen bij de toevoeging van α-synuclein amyloïde fibrillen aan mitochondriën in een concentratieafhankelijke manier. Hoewel lichte afgifte werd gedetecteerd bij de toevoeging van amyloïde fibrillen met runderinsuline bleken de hewl fibrillen ondoeltreffend te zijn (Figuur 3). Hoewel geen significante verbetering in mitochondriale Ros-inhoud werd waargenomen bij de toevoeging van runderinsuline of hewl-amyloïde fibrillen, leidde de behandeling met α-synuclein fibrillen tot een aanzienlijke toename van het Ros-gehalte van de mitochondriën van de hersenen in een concentratieafhankelijke wijze (Figuur 4).
Figuur 1: mitochondriale isolatie en bepaling van membraan integriteit. (A) links: typische verschijning van een centrifugebuis na het resuspeneren van de pellet in koude 15% dichtheidsgradiënt middelmatige oplossing na centrifugeren. Myeline is de belangrijkste component van band 1, die zich aan de top ophoveert. Band 2 bevat de zeer verrijkte mitochondriale fractie. Rechts: een stevige pellet werd geproduceerd na de toevoeging van 10 mg/mL vetzuur vrij BSA en centrifugeren bij 6900 x g. B) de integriteit van het mitochondriale membraan werd bepaald door het meten van de MDH-activiteit in geïsoleerde mitochondriën voor en na membraan verstoring door Triton X-100. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: amyloïde fibrillatie van α-synucleine, runderinsuline en HEWL. A) kinetiek van amyloïde fibril vorming, aangegeven door de intensiteit van de fluorescentie van tht bij 485 nm te verhogen. B) AFM-beelden van drie eiwitten worden weergegeven, die in de regelmatige tijd onder amyloïdegene condities werden geïnnobeerd. Schaal staven vertegenwoordigen 500 nm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: mitochondriale MDH vrijkomen bij interactie met monomeer en amyloïde fibril van α-synucleine, runderinsuline en HEWL. Afgifte wordt uitgedrukt als het percentage van de maximaal waargenomen bij behandeling met 0,5% (v/v) Triton X-100. Elke waarde vertegenwoordigt gemiddelde ± SD (n = 3; * p < 0,05, * * p < 0,01). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: mitochondriale Ros-gehalte bij interactie met monomeer en amyloïde fibril van α-synucleine, runderinsuline en HEWL. De gegevens worden uitgedrukt als het percentage van de waarden in de controle mitochondriën. Elke waarde vertegenwoordigt het gemiddelde ± SD (n = 3; * p < 0,05; * * p < 0,01). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Mitochondriaal homogenaat (1 mg/mL) | α-synuclein monomeer (200 μM) | α-synuclein fibril (200 μM) | Isolatie buffer | Pbs | Triton x-100 20% (v/v) | |
| Controle | 175 μL | 0 | 0 | 25 μL | 0 | 0 |
| Pbs | 175 μL | 0 | 0 | 0 | 25 μL | 0 |
| Monomeer 25 μM | 175 μL | 25 μL | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Fibril 5 μM | 175 μL | 0 | 5 μL | 20 μL | 0 | 0 |
| Fibril 10 μM | 175 μL | 0 | 10 μL | 15 μL | 0 | 0 |
| Fibril 20 μM | 175 μL | 0 | 20 μL | 5 μL | 0 | 0 |
| Fibril 25 μM | 175 μL | 0 | 25 μL | 0 | 0 | 0 |
| Positieve controle | 175 μL | 0 | 0 | 20 μL | 0 | 5 μL |
Tabel 1: behandeling van mitochondriën met verschillende concentraties van α-synuclein amyloïde fibrillen.
| Mitochondriaal homogenaat (1 mg/mL) | Bovine insuline monomeer (250 μM) | Bovine insuline fibril (250 μM) | Isolatie buffer | Glycine buffer | Triton x-100 20% (v/v) | |
| Controle | 175 μL | 0 | 0 | 25 μL | 0 | 0 |
| Glycine buffer | 175 μL | 0 | 0 | 0 | 25 μL | 0 |
| Monomeer 25 μM | 175 μL | 20 μL | 0 | 5 μL | 0 | 0 |
| Fibril 5 μM | 175 μL | 0 | 4 μL | 21 μL | 0 | 0 |
| Fibril 10 μM | 175 μL | 0 | 8 μL | 17 μL | 0 | 0 |
| Fibril 20 μM | 175 μL | 0 | 16 μL | 9 μL | 0 | 0 |
| Fibril 25 μM | 175 μL | 0 | 20 μL | 5 μL | 0 | 0 |
| Positieve controle | 175 μL | 0 | 0 | 20 μL | 0 | 5 μL |
Tabel 2: behandeling van mitochondriën met verschillende concentraties van runderinsuline amyloïde fibrillen.
| Mitochondriaal homogenaat (1 mg/mL) | HEWL monomeer (1 mM) | HEWL fibril (1 mM) | Isolatie buffer | Glycine buffer | Triton x-100 20% (v/v) | |
| Controle | 175 μL | 0 | 0 | 25 μL | 0 | 0 |
| Glycine buffer | 175 μL | 0 | 0 | 0 | 25 μL | 0 |
| Monomeer 25 μM | 175 μL | 5 μL | 0 | 20 μL | 0 | 0 |
| Fibril 5 μM | 175 μL | 0 | 1 μL | 24 μL | 0 | 0 |
| Fibril 10 μM | 175 μL | 0 | 2 μL | 23 μL | 0 | 0 |
| Fibril 20 μM | 175 μL | 0 | 4 μL | 21 μL | 0 | 0 |
| Fibril 25 μM | 175 μL | 0 | 5 μL | 20 μL | 0 | 0 |
| Positieve controle | 175 μL | 0 | 0 | 20 μL | 0 | 5 μL |
Tabel 3: behandeling van mitochondriën met verschillende concentraties van HEWL amyloïde fibrillen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een schat aan experimentele resultaten ondersteunt de hypothese dat de cytotoxiciteit van fibrillar aggregaten significant wordt geassocieerd met hun vermogen om te interageren met en permeabilize biologische membranen4,5. Echter, de meeste van de gegevens zijn gebaseerd op kunstmatige lipide-bilayers die niet noodzakelijkerwijs de intrinsieke eigenschappen van biologische membranen weerspiegelen, die heterogene structuren met een breed scala van fosfolipiden en eiwitten. Hier, met behulp van de hersenen mitochondriën als een in vitro biologisch membraan, een model voor het bestuderen van fibrillar aggregaten cytotoxiciteit op membraan niveau wordt beschreven.
Tijdens het experiment is het belangrijk om snel te werken en alles op ijs te houden om functioneel actieve mitochondriën met intacte membranen te bereiden. Bovendien is mitochondriale concentratie (gebaseerd op totale eiwit meting) een belangrijke factor die invloed heeft op membraan-amyloïde fibril interactie; het moet dus constant blijven gedurende het gehele protocol. In de huidige studie, mitochondriale preparaten bevatte zowel synaptische en niet-synaptische mitochondriën. Voor zuivere niet-synaptische mitochondriale voorbereiding, moet 40%, 23% en 15% (v/v) dichtheidsgradiënt medium worden gebruikt, zoals beschreven door Sims en Anderson14. Omdat de mitochondriën is een organel met een goed gekarakteriseerd membraan, het kan dienen als een zeer nuttig biologisch modelsysteem in moleculaire studies met betrekking tot de mechanismen van amyloïde cytotoxiciteit op membraan niveau (vooral met betrekking tot neurodegeneratieve ziekten). Dit protocol kan onderzoek van de interacties en de omvang van de mitochondriale membranen permeabilization door te kijken naar de vrijlating van verschillende moleculen en enzymen gelegen in verschillende compartimenten (dat wil zeggen, die ingebed in de buitenste en binnenste membranen die zich in de intermembraan ruimte of mitochondriale matrix bevinden).
Na de mitochondriale membraan integriteits bevestiging (Figuur 1b) en amyloïde fibril vorming (Figuur 2), de interactie, beschadiging en permeabilization van mitochondriale membranen na toevoeging van α-synucleine, runderinsuline en hewl amyloïde fibrillen werd onderzocht. De resultaten toonden duidelijke verschillen in de mate van membraan permeabilization en mitochondriale Ros Enhancement geïnduceerd door amyloïde fibrillen (Figuur 3 en Figuur 4), suggereren variaties in het vermogen van verschillende amyloïde fibrillen om te communiceren met en schade aan de mitochondriale membranen.
Voor membraan permeabilization initiatie moeten amyloïde fibrillen het mitochondriale oppervlak bereiken. Het is aangetoond dat associatie, lokalisatie, en inbrengen van eiwitten aan geladen membranen is afhankelijk van niet-specifieke Elektrostatische interacties en de hydrofobe aard van eiwitten26,27,28. Met betrekking tot amyloïde toxiciteit, een groeiende hoeveelheid bewijs neemt sterk een belangrijke rol van eiwit geaggregeerde oppervlakte hydrofobiciteit in hun cytotoxiciteit29,30. Hoewel HEWL een netto positieve lading over een breed scala van pH-niveaus draagt en een hoge affiniteit heeft voor anionische en neutrale fosfolipiden31 (bijv. het mitochondriale membraan23), geen mitochondriale membraan PERMEABILIZATION en Ros Enhancement waargenomen (Figuur 3 en Figuur 4). Een verklaring voor deze waarneming kan verband houden met een vermindering van de oppervlakte hydrofobiciteit van hewl fibrillen als gevolg van laterale fibril-fibril interacties23,32, wat leidt tot verlies van het vermogen om membraan beschadiging te veroorzaken.
Voor runderinsuline werd, ondanks een significante blootstelling van hydrofobe gebieden in de loop van fibril vorming22, een lichte enzym afgifte waargenomen bij de toevoeging van 25 μM amyloïde fibrillen (Figuur 3) zonder significante effecten op mitochondriale ROS-inhoud (Figuur 4). Aangezien beide hersen mitochondriën en runderinsuline fibrillen een negatief Zeta-potentieel dragen op hun oppervlakken24, wordt gesuggereerd dat repulsieve krachten tussen mitochondriaal membraan en runderinsuline amyloïde fibrillen rekening kunnen effectief interactie met en schade mitochondriale membranen24. De verhogingen van de hoogste permeabilization en mitochondriale Ros werden waargenomen bij toevoeging van α-synuclein fibrillen (Figuur 3 en Figuur 4).
Deze observatie kan worden toegeschreven aan de hoge capaciteit van α-synuclein voor interactie met biologische membranen die negatief geladen oppervlakken33,34, zoals mitochondriën. In dit verband, sommige studies hebben aangetoond specifieke binding en de invoer van α-synuclein mitochondriën, waar ze voornamelijk worden geassocieerd met het binnenste membraan35. Interessant is dat Ghio et al. meldde dat binding, gemedieerd door cardiolipine (een fosfolipide uniek verrijkt in innerlijke mitochondriale membraan), van α-synuclein kan een belangrijk mechanisme voor associatie en verstoring van de mitochondriale membranen36.
Belangwekkend, er is duidelijk bewijs voor binding en accumulatie van verschillende amyloidogenic peptiden en eiwitten met inbegrip van amyloïde β-peptide, α-synuclein, huntingtine, en als-linked Mutant SOD1 naar mitochondriën35,37, 38,39. Bovendien, eerdere studies hebben aangetoond dat amyloidogenic assemblages van amyloïde β (25 – 35)15 en SOD 140 hebben de mogelijkheid om te communiceren met en veroorzaken mitochondriale membraan permeabilization. Volgens de literatuur, wordt gesuggereerd dat amyloïde fibrillen te groot zijn om het membraan over te steken; Daarom mag de gemiddelde fibril grootte geen factor zijn in het schijnbare gebrek aan effecten veroorzaakt door runderinsuline en HEWL amyloïde fibrillen. Hoewel verdere studies nodig zijn om de gedetailleerde mechanismen te verhelderen, wordt voorgesteld dat de biofysische kenmerken van amyloïde fibrillen (d.w.z. oppervlakte lading, hydrofobiciteit, en het bezitten van een specifieke sequentie gerichte mitochondriale membraan) kan een belangrijke rol spelen in hun vermogen om te communiceren met en schade aan biologische membranen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van de Onderzoeksraad van het Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, Iran.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
| Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
| Black 96-well plate | Corning | ||
| Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
| Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
| Centrifuge | Sigma | ||
| Crystal clear sealing tape | Corning | ||
| CuSO4 | Sigma | 451657 | |
| Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
| Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Fluorescence plate reader | BioTek | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
| Folin | Merck | F9252 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Guillotine | Made in Iran | ||
| HCl | Merck | H1758 | |
| Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
| Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
| NaOH | Merck | S8045 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
| Percoll | GE Healthcare | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
| Quartz cuvette | Sigma | ||
| Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
| Succinate | Sigma | S2378 | |
| Sucrose | Merck | 1076871000 | |
| Thermomixer | Eppendorph | ||
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
| Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tryptone | QUELAB | ||
| Water bath | Memmert | ||
| Yeast Extract | QUELAB | ||
| β-NADH | Sigma | N8129 |
References
- Merlini, G., Bellotti, V.
- Berg, I. Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , Linköping University. Linköping Institute of Technology, Department of Physics, Chemistry and Biology (2010).
- Kagan, B. L. Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage. Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. Uversky, V. N., Fink, A. L. , Springer US. New York. 223-236 (2006).
- Demuro, A., et al. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers. The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).
- Kayed, R., et al. Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).
- Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage. Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).
- Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues. Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R.
- Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations. Nature. 418, 291 (2002).
- Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).
- Ghobeh, M., et al. Interaction of Aβ (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products. Peptide Science. 102, 473-486 (2014).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria. Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).
- Hoyer, W., et al. Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions. Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).
- Weinreb, P. H., et al. NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded. Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).
- Porter, R. R. Partition chromatography of insulin and other proteins. The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).
- Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme. Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).
- Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol. Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).
- Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products. Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).
- Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).
- Fink, A. L. The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).
- Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains. Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).
- Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. Lipid bilayer disruption by oligomeric α-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core. Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).
- Kourie, J. I., Henry, C. L. Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 29, 741-753 (2002).
- Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
- Bolognesi, B., et al. ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species. ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).
- Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content. Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).
- Roqanian, S., et al. Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action. International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).
- Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein. The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).
- Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains. Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).
- Devi, L., et al. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. Interaction of α-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Oladzad Abbasabadi, A., et al. Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1. International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).
