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Biochemistry

Interações com e permeabilização de membrana de mitocôndrias cerebrais por fibrilas amiloides

Published: September 28, 2019 doi: 10.3791/59883
Automatic Translation
1, *1, *1, *1, *1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, 45137-66731, Iran
* These authors contributed equally

Summary

Fornecido aqui é um protocolo para investigar as interações entre a forma nativa, prefibrillar, e fibrilas amiloides maduras de diferentes peptídeos e proteínas com mitocôndrias isoladas de diferentes tecidos e várias áreas do cérebro.

Abstract

Um corpo de evidência crescente indica que a permeabilização da membrana, incluindo as membranas internas tais como a mitocôndria, é uma característica comum e um mecanismo preliminar da toxicidade agregado-induzida amilóide em doenças neurodegenerativas. Entretanto, a maioria de relatórios que descrevem os mecanismos do rompimento da membrana são baseados em sistemas modelo do fosfolipídeo, e os estudos que alvejam diretamente os eventos que ocorrem no nível de membranas biológicas são raros. É descrito aqui um modelo para estudar os mecanismos da toxicidade do amilóide a nível da membrana. Para a isolação mitochondrial, o meio do inclinação da densidade é usado para obter preparações com contaminação mínima do mielina. Após a confirmação da integridade da membrana mitocondrial, é investigada a interação de fibrilas amilóides decorrentes de α-synucleina, insulina bovina e lisozima branca de ovo de galinha (HEWL) com mitocôndrias cerebrais de ratos, como modelo biológico in vitro. Os resultados demonstram que o tratamento de mitocôndrias cerebrais com conjuntos fibrilares pode causar diferentes graus de permeabilização da membrana e aprimoramento do conteúdo de Eros. Isto indica interações estrutura-dependentes entre fibrilas do amilóide e membrana mitochondrial. Sugere-se que as propriedades biofísicas das fibrilas amilóides e sua ligação específica às membranas mitocondriais possam fornecer explicações para algumas dessas observações.

Introduction

Transtornos relacionados ao amiloide, conhecidos como amiloiidoses, constituem um grande grupo de doenças definidas pelo surgimento de depósitos proteicos insolúveis em diferentes tecidos e órgãos1,2. Dentre eles, as desordens neurodegenerativas são as formas mais freqüentes em que os agregados proteicos aparecem no sistema nervoso central ou periférico2. Embora vários mecanismos tenham sido propostos para estarem envolvidos na toxicidade dos agregados amilóides3, um corpo crescente de evidências aponta para o rompimento da membrana celular e a permeabilização como o mecanismo primário da patologia amilóide4, a 5. Além da membrana plasmática, as organelas internas (ou seja, mitocôndrias) também podem ser afetadas.

Curiosamente, evidências emergentes sugerem que a disfunção mitocondrial desempenha um papel crítico na patogênese de distúrbios neurodegenerativos, incluindo a doença de Alzheimer e de Parkinson6,7. De acordo com essa questão, inúmeros relatos indicaram ligação e acúmulo de proteínas de peptídeo amilóide, α-sinucleina, huntingtina e SOD1 com as mitocôndrias8,9,10, 11. pensa-se que o mecanismo de permeabilização da membrana por agregados amiloides ocorra através da formação de canais discretos (poros) e/ou através de um mecanismo de detergente não específico5,12, trezeanos. Destaca-se que a maioria dessas conclusões tem sido baseada em relatos envolvendo sistemas de modelo fosfolipídeo, e estudos direcionados diretamente aos eventos que ocorrem nas membranas biológicas são raros. Claramente, esses bicamadas lipídico artificial não refletem necessariamente as propriedades intrínsecas das membranas biológicas, incluindo as das mitocôndrias, que são estruturas heterogêneas e compostas por uma grande variedade de fosfolipídios e proteínas.

No presente estudo, as mitocôndrias isoladas de cérebros de ratos são utilizadas como um modelo biológico in vitro para examinar os efeitos destrutivos das fibrilas amilóides decorrentes da α-sinucleina (como uma proteína amiloidogênica), a insulina bovina (como um peptídeo modelo mostrando homologia estrutural significativo com o insulin humano envolvido no amyloidosis injeção-localizado), e o lisozima branco do ovo de galinha (Hewl; como uma proteína modelo comum para o estudo da agregação do amilóide). As interações e possíveis danos das membranas mitocondriais induzidas por fibrilas amilóides são então investigadas observando-se a liberação de malato mitocondrial desidrogenase (MDH) (localizada na matriz mitocondrial) e de oxigênio reativo das mitocôndrias melhoramento de espécies (ROS).

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Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) de ciências médicas da Universidade de Teerão. Esforços máximos foram feitos para minimizar o sofrimento e os efeitos prejudiciais para os ratos, afiando as lâminas de guilhotina e aplicando movimentos resolutos e rápidos da lâmina.

1. homogeneização cerebral e isolamento mitocondrial

Nota: todos os reagentes para isolamento mitocondrial foram preparados de acordo com Sims e Anderson14.

  1. Preparação de buffers para isolamento mitocondrial
    1. Prepare uma solução de Tris-HCl 100 mM: pesar 0,605 g de Tris-HCl e dissolvê-lo em aproximadamente 40 mL de água deionizada (DW) em uma taça. Transfira a solução para um balão volumétrico de 50 mL e aumente o volume final para 50 mL adicionando DW.
    2. Prepare uma solução de EDTA de 10 mM: pesar 0,202 g de EDTA e dissolvê-lo em aproximadamente 40 mL de DW em um copo. Transfira a solução para um balão volumétrico de 50 mL e aumente o volume final para 50 mL adicionando DW.
      Nota: ambas as soluções podem ser armazenadas a 4 ° c durante pelo menos 4 semanas.
    3. Prepare uma solução de estoque de Tris-HCl/EDTA/sacarose: Adicione 30 mL de Tris-HCl de 100 mM e 30 mL de EDTA de 10 mM em um copo. Pesar 32,86 g de sacarose e adicioná-lo ao copo enquanto mexendo com um agitador magnético. Quando a sacarose é dissolvida, transfira a solução para um balão volumétrico de 100 mL e aumente o volume final para 100 mL adicionando DW.
      Nota: esta solução pode ser armazenar a 4 ° c por até 3 dias.
    4. Prepare um tampão de isolamento (IB): Adicionar 100 mL de Tris-HCl/EDTA/sacarose para cerca de 150 mL de DW. Ajuste o pH a 7,4 adicionando 0,1 M HCl. Aumente o volume final para 300 mL adicionando DW.
    5. Prepare o meio de gradiente de densidade de 15% (v/v) com IB adicionando 1,5 mL de meio de gradiente de densidade a 8,5 mL de IB frio.
    6. Prepare 10 mg/mL de solução de albumina sérica bovina (BSA): pesar 20 mg de BSA sem ácidos graxos e dissolvê-lo em aproximadamente 1,5 mL DW em um frasco de 2 mL. Aumente o volume final para 2 mL, adicionando DW e armazená-lo no gelo até o uso.
      Nota: Prepare recentemente as soluções das etapas 1.1.4 – 1.1.6 no dia do isolamento mitocondrial e armazene-as no gelo até o uso.
  2. Isolação do cérebro do rato
    Nota: a decapitação e a remoção cerebral de ratos machos (150 – 200 g) foram realizadas de acordo com Sims e Anderson14.
    1. Coloque um copo de 30 mL em um balde de gelo e adicione 10 mL de IB frio ao béquer.
    2. Decapitar o rato com uma pequena guilhotina animal e remover o cérebro do crânio dentro de 1 min de decapitação para limitar a deterioração das propriedades mitocondrial.
    3. Transfira rapidamente o cérebro para o béquer contendo IB frio.
  3. Homogeneização cerebral e preparação de mitocôndrias
    Nota: as frações mitocondriais foram isoladas de acordo com o protocolo descrito por Sims e Anderson14, com algumas modificações descritas anteriormente15. É importante trabalhar rapidamente e manter tudo no gelo durante todo o procedimento.
    1. Lave o tecido 2x com 30 mL de IB, transfira para um béquer contendo IB frio, e finamente picar o cérebro com uma tesoura.
    2. Adicione 10 volumes de IB pré-resfriado (cerca de 10 mL de IB por cérebro de rato).
    3. Transfira a suspensão do tecido para um homogeneizador de 20 mL de dounce frio.
    4. Homogeneize as partes do tecido usando nove cursos up-and-down com um pilão motorizado.
      Nota: Deixe a mistura no gelo por aproximadamente 30 s após cada conjunto de três traçados de homogeneização para garantir que o homogeneizar permaneça frio.
    5. Transfira o homogeneate para um tubo de centrifugação pré-refrigerado de 10 mL e centrifugue a 1, 300X g e 4 ° c durante 3 min.
    6. Decantar cuidadosamente o sobrenadante e transferi-lo para um tubo de centrifugação pré-refrigerado de 10 mL e centrifugar a 21, 000x g a 4 ° c durante 10 min.
    7. Descarte o sobrenadante e ressuscita a pelota em uma solução média de gradiente de densidade de 15% fria (5 mL para cada cérebro) mexendo suavemente a mistura com uma pipeta.
    8. Centrifugador em um rotor do fixo-ângulo em 30, 700x g em 4 ° c por 5 minutos usando a aceleração lenta (45 s de 0 rpm a 500 RPM seguidos pela aceleração normal) e pela desaceleração (nenhuns freios). Isso deve produzir duas bandas distintas de material (Figura 1a, esquerda).
    9. Usando uma pipeta de Pasteur, remova a faixa afiada do material acumulada na parte superior do inclinação, que contem na maior parte o myelin. Em seguida, remova a solução média de gradiente de densidade sobrejacente o material (na banda 2), tanto quanto possível, sem perder nenhuma fração mitocondrial enriquecida na banda 2.
      Nota: a banda 2 contém as mitocôndrias sinápticas e não sinápticas.
    10. Adicione 8 mL de IB à fração mitocondrial enquanto mexendo suavemente a mistura com uma pipeta.
    11. Centrifugador em 16, 700x g em 4 ° c por 10 minutos e remova com cuidado o sobrenadante, deixando a pelota frouxa inferior unperturbado.
    12. Adicionar 1 mL de 10 mg/mL de ácido graxo BSA livre para o tubo de centrifugação, enquanto mexendo suavemente a mistura com a ponta de uma pipeta. Aumente o volume final para 5 mL por cérebro, adicionando IB.
    13. Centrifugador em 6, 900x g em 4 ° c por 10 minutos, que deve produzir uma pelota firme (Figura 1a, direita).
    14. Decantar o sobrenadante e resuspender suavemente a pelota mitocondrial em IB, alíquota-los em 0,5 tubos de ml, e armazenar em nitrogênio líquido até o uso.

2. determinação da concentração proteica

Nota: a concentração proteica é medida utilizando-se o método de Lowry et al.16.

  1. Preparação de soluções para o ensaio Lowry
    1. Prepare a solução a: pesar 0,4 g de NaOH e 2 g de na2co3 e dissolva-se em 80 ml de DW, em seguida, transfira a solução para um balão volumétrico de 100 ml e aumente o volume para 100 ml adicionando DW.
    2. Prepare a solução B: pesar 0,1 g de tartarato de sódio de potássio e 0, 5 g de CuSO4 e dissolver em 8 ml de DW, em seguida, transferir a solução para um balão volumétrico de 10 ml e aumentar o volume para 10 ml adicionando DW.
      Nota: ambas as soluções A e B podem permanecer estáveis a 4 ° c por até 6 meses.
    3. Preparar a solução C: Adicionar 0,5 mL de solução de folina a 7,5 mL de DW.
      Nota: Prepare a solução C fresca e mantenha-a afastada da luz até ao uso.
    4. Prepare os padrões de BSA com concentrações finais de 0, 20, 40, 60, 80, 100 e 120 μg/mL combinando 0, 20, 40, 60, 80, 100 e 120 μL de 1 mg/mL de BSA, respectivamente, com DW suficiente para fazer 1000 μL de solução.
  2. Medição da concentração proteica
    Nota: para maior precisão, execute esta etapa em Triplicate.
    1. Adicionar 50 μL de soluções padrão e homogeneato mitocondrial a cada poço de uma placa de poço 96, seguida da adição de 45 μL de solução A. Em seguida, incubar a placa por 10 min em um banho de água morna fixado em 50 ° c.
    2. Adicionar 5 μL de solução B e incubar a placa durante 10 min no escuro à temperatura ambiente (RT).
    3. Adicionar 150 μL de solução C e incubar a placa durante 10 min num banho de água quente a 50 ° c.
    4. Coloque a placa em um leitor de placas e registre os valores de absorvância para padrões e suspensão mitocondrial em 650 nm. Em seguida, usando uma curva de calibração, calcule o teor de proteínas da mitocôndria.

3. determinação da integridade da membrana mitocondrial

Nota: a integridade da membrana mitocondrial é confirmada pela medição da atividade da malato desidrogenase (MDH) nas mitocôndrias isoladas antes e após o rompimento da membrana por Triton X-100.

  1. Diluir o homogeneato mitocondrial para 1 mg/mL com IB frio e colocado em dois tubos de 1,5 mL (tipicamente 195 μL de mitocôndrias por tubo).
  2. Adicionar 5 μL de 20% (v/v) Triton X-100 (diluído com DW) a um tubo (como um controlo positivo para a atividade enzimática máxima) e 5 μL de DW para outro tubo (para controlo) seguido de mistura com um agitador.
  3. Incubar os tubos por 10 min em um banho de água morna fixado em 30 ° c.
  4. Mitocôndria da pelota pela centrifugação dos tubos em um rotor do fixo-ângulo em 16.000 x g e em 4 ° c por 15 minutos.
  5. Colete cuidadosamente os sobrenadantes resultantes para ensaio a atividade de MDH mitocondrial usando um ensaio espectrofotométrico padrão descrito na seção a seguir.
  6. Calcule a integridade da membrana mitocondrial da seguinte forma:
    Equation 1

4. determinação da atividade de MDH

Nota: a atividade da MDH foi mensurada espectrofotometricamente, conforme descrito por Sottocasa et al.17.

  1. Preparação de soluções para o ensaio de atividade MDH
    1. Prepare uma solução de Tris-HCl 50 mM (pH = 7,5): Prepare uma solução de 7,9 mg/mL em DW usando Tris-HCl, e ajuste o pH para 7,5 a 25 ° c com 1,0 M NaOH.
    2. Prepare uma solução de oxaloacetato de 50 mM: Prepare uma solução de 6,6 mg/mL utilizando oxaloacetato em Tris-HCl.
      Nota: esta solução não é estável uma vez na solução e deve ser preparada imediatamente antes do uso.
    3. Prepare uma solução de β-NADH de 10 mM: Prepare uma solução de 7,81 mg/mL utilizando β-NADH em Tris-HCl.
  2. Determinação da atividade de MDH
    Nota: as concentrações finais de ensaio numa mistura de reacção de 1,0 mL são de 50 mM de Tris-HCl, oxaloacetato de 5 mM e 0,1 mM de β-NADH.
    1. Ajuste o espectrofotômetro a 25 ° c e a 340 nm. Pipetar 890 μL de tampão Tris-HCl, 100 μL de solução de oxaloacetato e 10 μL de solução de NADH para uma cubeta em branco e 880 μL de tampão Tris-HCl, 100 μL de solução de oxaloacetato e 10 μL de solução de NADH para uma amostra de uma cubeta.
    2. Incubar as Cutelas no espectrofotômetro por 3 – 4 min e referência em branco.
    3. Em seguida, adicione 10 μL de homogeneizar mitocondrial (1 mg/mL) à cubeta da amostra, misture imediatamente por inversão e grave diminuições na absorvência devido à oxidação de NADH a 340 nm durante 1 min.

5. α-sinucleina in vitro, insulina bovina e formação de fibrila Hewl

  1. Preparação de proteínas
    1. α-synuclein:
      Nota: a expressão e purificação da α-synucleina recombinante é realizada conforme descrito por Hoyer et al.18 com algumas modificações, e a pureza da α-synucleina é confirmada por SDS-PAGE.
      1. Dialyze purified α-synuclein durante a noite de encontro ao Saline fosfato-tamponado (PBS).
      2. Determinar a concentração proteica utilizando um coeficiente de extinção de 5600 M-1 cm-1 a 275 Nm19.
      3. Aliquots proteína em 1,5 mL tubos e armazenar a-80 ° c até o uso.
    2. Insulina bovina e HEWL:
      1. Forneça a insulina bovina e a HEWL.
      2. Dissolver cada proteína em tampão glicina 50 mM (pH = 1,6; ajustar o pH com HCl).
      3. Determinar a concentração de insulina bovina e Hewl usando um coeficiente de extinção de 1,0 e 2,63 para 1,0 mg/ml a 276 nm e 280 nm, respectivamente20,21.
  2. Indução de fibrilação amilóide
    1. Preparação de soluções para fibrilação amilóide:
      1. Prepare a tioflavina T (ThT) tampão: pesar 0,3 g de NaH2po4 e dissolvê-lo em 80 ml de DW, ajustar o pH para 6,5, e aumentar o volume para 100 ml, adicionando DW.
      2. Prepare a solução de ações ThT (5 mM): pesar 1,6 mg de ThT e dissolvê-lo em 1 mL de tampão ThT, passar por um papel de filtro de 0,22 μm, e manter afastado da luz a 4 ° c até o uso.
        Nota: esta solução pode ser armazenar a 4 ° c por até 4 semanas.
      3. Preparar a solução ThT (1 mM): Adicionar 200 μL de solução de stock ThT (5 mM) a 800 μL de tampão ThT.
        Nota: esta solução pode ser armazenada a 4 ° c por até 1 semana.
    2. Formação de fibrila in vitro α-synuclein amilóide:
      1. Adicionar alíquotas (294 μL) de solução proteica (200 μM) e 6 μL de solução de ThT (1 mM) a 1,5 mL de tubos seguidos de agitação.
      2. Incubar os tubos em um termomisturador a 37 ° c agitação constante a 800 rpm por 4 dias.
      3. Tome alíquotas (10 μL) de amostras incubadas após intervalos de tempo regulares e adicione 490 μL de tampão ThT, misturado completamente, e incubar por 5 min em RT.
      4. Ajuste a excitação e as larguras da fenda da emissão como 5 nanômetro e 10 nanômetro, respectivamente, e a fluorescência da medida ThT pela excitação em 440 nanômetro e pela emissão em 485 nanômetro usando um espectrofotômetro da fluorescência.
    3. Formação de fibrila de insulina amilóide bovina in vitro:
      1. Adicionar 637 μL de solução proteica (250 μM) a 1,5 mL de tubo. Em seguida, adicione 13 μL de solução de ThT (1 mM) seguido de agitação.
      2. Adicionar alíquotas (200 μL) de solução proteica (250 μM) contendo 20 μM ThT a cada poço de uma placa de poço de fundo transparente 96 e selar a placa com fita de vedação cristalina.
      3. Coloque a placa num leitor de placas de fluorescência e incubar a 57 ° c sem agitação.
      4. Medir a fluorescência de ThT em intervalos de 30 minutos, com excitação a 440 nm e emissão a 485 nm, por 12 h.
        Nota: agitar a chapa durante 5 s antes de cada medição.
    4. Formação de fibrila in vitro HEWL amilóide:
      1. Adicionar alíquotas (200 μL) de solução proteica) 1 mM) contendo 20 μM ThT a cada poço de uma placa de poço de fundo transparente 96 e selar a placa com fita de vedação cristalina.
      2. Coloque a placa num leitor de placas de fluorescência e incubar a 57 ° c sem agitação.
      3. Meça a fluorescência de ThT em intervalos de 2 h, com excitação em 440 nanômetro e emissão em 485 nanômetro, por 4 dias.
        Nota: para todas as três proteínas, a formação de fibrila amilóide é confirmada por microscopia de força atômica (Figura 2b).

6. tratamento das mitocôndrias com fibrilas amilóides, ensaio de libertação de MDH e medição de ROS

  1. Incubação de mitocôndrias isoladas com fibrilas amilóides
    1. Gire sobre o centrifugador e o banho de água morno e ajuste a 4 ° c e a 30 ° c, respectivamente.
    2. Usando se, diluir homogeneate mitocondrial para uma concentração final de 1 mg/mL.
    3. Prepare duas séries de 1,5 mL de tubos contendo homogeneatos mitocondriais (uma série para ensaio de liberação de MDH e outra para medição de ROS mitocondrial).
    4. Adicionar alíquotas de fibrilas frescas ou amilóides de α-synucleina, insulina bovina ou HEWL (em concentrações finais de 5 μM, 10 μM, 20 μM e 25 μM; usar PBS ou tampão glicina como controle) para homogeneato mitocondrial (volume final = 200 μL) (ver tabela 1, tabela 2 , e tabela 3) seguida de agitar suavemente a solução com uma pipeta.
      Nota: para o ensaio de libertação de MDH, utilize Triton X-100 (numa concentração final de 0,5% [v/v]) como um controlo positivo para a libertação máxima da enzima.
    5. Incubar tubos contendo suspensões mitocondrial por 30 min em banho de água morna definido para 30 ° c.
    6. Meça a liberação mitochondrial MDH e o índice dos ROS como esboçado nas seções 6,2 e 6,3.
  2. Ensaio de libertação de MDH mitocondrial
    1. Centrifugue os homogeneatos mitocondriais incubados a 16.000 x g durante 15 minutos e, em seguida, colete cuidadosamente os sobrenadantes resultantes da atividade de MDH mitocondrial, conforme descrito na seção 4.
    2. Calcule a liberação de MDH como uma fração do efeito máximo (Triton X-100) como segue:

Equation 1

  1. Medição de ROS mitocondrial
    Nota: o conteúdo de ROS mitocondrial é determinado com o diacetato de diidrodichlorocarboxyfluorescein (DCFDA)22de precursores fluorogénicos sensíveis à oxidação.
    1. Prepare soluções para medição de ROS mitocondrial. Prepare uma solução de 50 μM de DCFDA dissolvendo-se em metanol (Prepare fresco) e uma solução de succinato de 200 mM dissolvendo-se em DW.
    2. Pipetar 191 μL de homogeneiza mitocondrial incubada a cada poço de uma placa de poço de 96 e adicionar 4 μL de 50 μM de DCFDA (1 μM de concentração final) e 5 μL de succinato de 200 mM (concentração final de 5 mM).
    3. Incubar a placa por 30 min em um banho de água morna ajustada em 30 ° c ao agitar delicadamente.
    4. Carregue a placa em um leitor da placa da fluorescência e meça a intensidade da fluorescência, com excitação em 485 nanômetro e emissão em 530 nanômetro.

7. análise estatística

  1. Realize todos os experimentos pelo menos 2x ou 3x com ensaios de triplicado e realize testes estatísticos adequados. Aqui, os resultados são apresentados como média ± DP, e o teste tpareado de Student foi utilizado para calcular significância estatística. Os valores de p inferiores a 0, 1 e 0, 5 foram considerados estatisticamente significantes (* p < 0, 5; * * p < 0, 1).

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Representative Results

O protocolo descreve um modelo para estudar as interações do fibrila do amilóide com as mitocôndria do cérebro do rato como um modelo in vitro biológico. Para a preparação mitocondrial, o meio de gradiente de densidade de 15% (v/v) foi usado para remover mielina como maior contaminação do tecido cerebral14. Como mostrado na Figura 1a, a centrifugação em 30.700 x g produziu duas bandas distintas de material, mielina (como o principal componente da banda 1) e banda 2, que contém fração mitocondrial enriquecida.

Ao modificar o protocolo descrito por Sims e Anderson14, uma suspensão mitocondrial contendo ambas as mitocôndria sináptica e não-sináptica foi preparada. Para a preparação de mitocôndria não-Synaptic puras, os Sims e o Anderson detalhou previamente o protocolo14. Na etapa final da centrifugação, a BSA sem ácidos graxos 10 mg/mL foi adicionada para obter uma pelota mitocondrial firme (Figura 1a). A integridade da membrana mitocondrial foi avaliada pela mensuração da atividade da MDH em mitocôndrias isoladas antes e após ruptura da membrana e liberação enzimática por Triton X-100, conforme descrito no protocolo.

Verificou-se tipicamente que as preparações mitocondriais eram cerca de 93% intacta (Figura 1b). Um ensaio da fluorescência de tht foi realizado para monitorar o crescimento de fibrilas do amilóide. Como mostrado na Figura 2a, a curva de fibrilação amilóide de três proteínas mostrou um padrão sigmoidal típico, que está em consonância com os modelos de polimerização dependentes de nucleação dessas proteínas, conforme relatado anteriormente23,24 ,25. A maior emissão de fluorescência ThT para α-synucleina, insulina bovina e HEWL foi observada após 96 h, 12 h e 96 h, respectivamente, sugerindo formação de fibrilas amilóides (Figura 2a). Isto foi confirmado mais pela medida de AFM.

Como ilustrado na Figura 2b, foram observadas fibrilas maduras bem definidas com morfologia amilóide típica para três proteínas incubadas condições amiloidogênicas. As interações e possíveis danos e permeabilização das membranas mitocondriais por fibrilas amilóides foram investigadas. Isto foi conseguido monitorando a liberação da medida mitocondrial de MDH e de Ros mitochondrial em cima da adição de α-synuclein, de insulina bovina, ou de fibrilas do amilóide de Hewl às suspensões mitochondrial e seguindo os procedimentos esboçados. Os experimentos preliminares mostraram que a presença de ThT (até 3 μM) não teve efeito na liberação de MDH e no conteúdo de ROS mitocondrial (dados não mostrados).

Como mostrado na Figura 3, a liberação substancial de MDH foi observada após a adição de fibrilas da α-synuclein amilóide às mitocôndria em uma maneira concentração-dependente. Embora discreta liberação tenha sido detectada após a adição de fibrilas de insulina amilóide bovina, as fibrilas de HEWL foram ineficazes (Figura 3). Embora não tenha sido observado realce significativo no conteúdo de ROS mitocondrial após a adição de insulina bovina ou fibrilas amilóides HEWL, o tratamento com fibrilas α-synuclein levou a um aumento considerável no conteúdo de ROS de mitocôndrias cerebrais em um forma dependente da concentração (Figura 4).

Figure 1
Figura 1: isolamento mitocondrial e determinação da integridade da membrana. (A) esquerda: aparência típica de um tubo de centrifugação após Ressuspender a pelota em solução média de gradiente de densidade de 15% fria seguindo por centrifugação. A mielina é o principal componente da banda 1, que se acumula na parte superior. A banda 2 contém a fração mitocondrial altamente enriquecida. Direita: uma pelota firme foi produzida após a adição de 10 mg/mL de BSA sem ácidos graxos e centrifugação a 6900 x g. (B) a integridade da membrana mitocondrial foi determinada medindo-se a atividade de MDH em mitocôndrias isoladas antes e após ruptura da membrana por Triton X-100. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: fibrilação amilóide de α-sinucleina, insulina bovina e HEWL. (A) cinética da formação de fibrila amilóide indicada pelo aumento da intensidade de fluorescência de tht a 485 nm. (B) imagens de AFM de três proteínas são mostradas, que foram incubadas condições modula para épocas regulares. As barras de escala representam 500 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: liberação de MDH mitocondrial após interação com monômero e fibrila amilóide de α-synucleina, insulina bovina e HEWL. A liberação é expressa como a porcentagem do máximo observado no momento do tratamento com 0,5% (v/v) Triton X-100. Cada valor representa a média ± DP (n = 3; * p < 0, 5, * * p < 0, 1). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: conteúdo de Ros mitocondrial na interação com monômero e fibrila amilóide de α-synucleina, insulina bovina e HEWL. Os dados são expressos como a porcentagem de valores nas mitocôndrias de controle. Cada valor representa a média ± DP (n = 3; * p < 0, 5; * * p < 0, 1). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Homogeneato mitocondrial (1 mg/mL) monômero α-synuclein (200 μM) α-synuclein fibrila (200 μM) Buffer de isolamento Pbs Triton x-100 20% (v/v)
Controle 175 μL 0 0 25 μL de 0 0
Pbs 175 μL 0 0 0 25 μL de 0
Monômero 25 μM 175 μL 25 μL de 0 0 0 0
Fibril 5 μM 175 μL 0 5 μL de 20 μL de 0 0
Fibril 10 μM 175 μL 0 10 μL de 15 μL de 0 0
Fibril 20 μM 175 μL 0 20 μL de 5 μL de 0 0
Fibril 25 μM 175 μL 0 25 μL de 0 0 0
Controle positivo 175 μL 0 0 20 μL de 0 5 μL de

Tabela 1: tratamento de mitocôndrias com várias concentrações de fibrilas amilóides α-synuclein.

  Homogeneato mitocondrial (1 mg/mL) Monômero de insulina bovina (250 μM) Insulina bovina fibrila (250 μM) Buffer de isolamento Tampão da glicina Triton x-100 20% (v/v)
Controle 175 μL 0 0 25 μL de 0 0
Tampão da glicina 175 μL 0 0 0 25 μL de 0
Monômero 25 μM 175 μL 20 μL de 0 5 μL de 0 0
Fibril 5 μM 175 μL 0 4 μL de 21 μL de 0 0
Fibril 10 μM 175 μL 0 8 μL de 17 μL de 0 0
Fibril 20 μM 175 μL 0 16 μL de 9 μL de 0 0
Fibril 25 μM 175 μL 0 20 μL de 5 μL de 0 0
Controle positivo 175 μL 0 0 20 μL de 0 5 μL de

Tabela 2: tratamento de mitocôndrias com várias concentrações de fibrilas de insulina amilóide bovina.

  Homogeneato mitocondrial (1 mg/mL) Monômero HEWL (1 mM) Fibrila de HEWL (1 milímetro) Buffer de isolamento Tampão da glicina Triton x-100 20% (v/v)
Controle 175 μL 0 0 25 μL de 0 0
Tampão da glicina 175 μL 0 0 0 25 μL de 0
Monômero 25 μM 175 μL 5 μL de 0 20 μL de 0 0
Fibril 5 μM 175 μL 0 1 μL de 24 μL de 0 0
Fibril 10 μM 175 μL 0 2 μL de 23 μL de 0 0
Fibril 20 μM 175 μL 0 4 μL de 21 μL de 0 0
Fibril 25 μM 175 μL 0 5 μL de 20 μL de 0 0
Controle positivo 175 μL 0 0 20 μL de 0 5 μL de

Tabela 3: tratamento de mitocôndrias com várias concentrações de fibrilas amilóides HEWL.

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Discussion

Uma riqueza de resultados experimentais sustenta a hipótese de que a citotoxicidade dos agregados fibrilares está significativamente associada à sua capacidade de interagir e permeabilizar as membranas biológicas4,5. No entanto, a maioria dos dados são baseados em bicamadas lipídico artificial que não refletem necessariamente as propriedades intrínsecas das membranas biológicas, que são estruturas heterogêneas com uma grande variedade de fosfolipídios e proteínas. Aqui, usando mitocôndria do cérebro como uma membrana biológica in vitro, um modelo para estudar a citotoxicidade dos agregados fibrilar no nível da membrana é descrito.

Durante o experimento, é importante trabalhar rapidamente e manter tudo no gelo para preparar mitocôndrias funcionalmente ativas com membranas intactas. Além disso, a concentração mitochondrial (baseada na medida total da proteína) é um fator importante que afeta a interação da fibrila da membrana-amyloid; assim, deve ser manter constante em todo o protocolo. No presente estudo, as preparações mitocondriais continham mitocôndria sináptica e não-sináptica. Para preparação mitocondrial não-sináptica pura, 40%, 23% e 15% (v/v) gradiente de densidade médio deve ser usado, como descrito por Sims e Anderson14. Como a mitocôndria é uma organela com uma membrana bem caracterizada, pode servir como um sistema de modelo biológico extremamente útil em estudos moleculares relacionados aos mecanismos de citotoxicidade amilóide no nível da membrana (especialmente em relação à doenças neurodegenerativas). Este protocolo permite a investigação das interações e extensão da permeabilização das membranas mitocondriais, olhando para a liberação de várias moléculas e enzimas localizadas em diferentes compartimentos (ou seja, aqueles embutidos nas membranas externa e interna e aqueles localizados no espaço intermembrana ou matriz mitocondrial).

Após a confirmação da integridade da membrana mitocondrial (Figura 1b) e formação de fibrila amilóide (Figura 2), a interação, dano e permeabilização das membranas mitocondriais após a adição de α-synucleina, insulina bovina e Hewl as fibrilas do amilóide foram investigadas. Os resultados demonstraram diferenças claras na extensão da permeabilização da membrana e no realce do Eros mitocondrial induzido por fibrilas amilóides (Figura 3 e Figura 4), sugerindo variações na capacidade de várias fibrilas amilóides para interagir e danificar as membranas mitocondriais.

Para a iniciação da permeabilização da membrana, as fibrilas amilóides devem atingir a superfície mitocondrial. Demonstrou-se que a associação, a localização e a inserção de proteínas nas membranas carregadas dependem de interações eletrostáticas inespecíficas e da natureza hidrofóbica das proteínas26,27,28. Em relação à toxicidade amilóide, um crescente corpo de evidências implica fortemente um papel fundamental da hidrofobicidade da superfície agregada de proteínas em sua citotoxicidade29,30. Embora Hewl carregue uma carga positiva líquida sobre uma escala larga de níveis do pH e tenha uma afinidade elevada para fosfolípidos aniônicos e neutros31 (por exemplo, a membrana mitochondrial23), nenhuma permeabilização mitocondrial da membrana e realce de Ros foram observados (Figura 3 e Figura 4). Uma explanação para esta observação pode ser relacionada a uma redução da hidrofobicity de superfície de fibrilas de Hewl devido às interações laterais do fibril-fibril23,32, conduzindo à perda da habilidade de causar dano da membrana.

Para a insulina bovina, apesar de uma exposição significativa das regiões hidrofóbicas no decurso da formação de fibrila22, observou-se uma ligeira libertação enzimática após a adição de fibrilas amilóides de 25 ΜM (Figura 3) sem efeitos significativos na conteúdo de ROS mitocondrial (Figura 4). Como as mitocôndrias cerebrais e as fibrilas de insulina bovina carregam um potencial zeta negativo em suas superfícies24, sugere-se que as forças repulsivas entre a membrana mitocondrial e as fibrilas de amilóides de insulina bovina possam ser responsáveis por sua incapacidade de efetivamente interagir com e danificar as membranas mitocondrial24. Os maiores incrementos de permeabilização e ROS mitocondrial foram observados após a adição de fibrilas α-synuclein (Figura 3 e Figura 4).

Esta observação pode ser atribuída à alta capacidade de α-synuclein para interagir com membranas biológicas que têm superfícies carregadas negativamente33,34, como as mitocôndrias. A este respeito, alguns estudos têm demonstrado ligação específica e importação de α-sinucleina em mitocôndria, onde se tornam predominantemente associados com a membrana interna35. Curiosamente, Ghio et al. relataram que a ligação, mediada por cardiolipina (um fosfolipídeo excepcionalmente enriquecido em membrana mitocondrial interna), de α-sinucleina pode ser um importante mecanismo de associação e ruptura das membranas mitocondriais36.

Curiosamente, há evidências claras de ligação e acúmulo de vários peptídeos e proteínas amiloidogênicas, incluindo peptídeo amilóide, α-synucleina, huntingtina e SOD1 mutante ligado à mitocôndria35,37, 38,39. Além disso, estudos prévios demonstraram que as assembléias amiloidogênicas de amilóides β (25 – 35)15 e SOD 140 têm a capacidade de interagir e causar permeabilização da membrana mitocondrial. De acordo com a literatura, sugere-se que as fibrilas amilóides são muito grandes para atravessar a membrana; Portanto, o tamanho médio da fibrila não deve ser um fator na aparente falta de efeitos induzidos por insulina bovina e fibrilas amilóides HEWL. Embora mais estudos sejam necessários para elucidar os mecanismos detalhados envolvidos, propõe-se que as características biofísicas de fibrilas amilóides (ou seja, carga superficial, hidrofobicidade e possuindo uma seqüência específica-alvo de membrana mitocondrial) pode desempenhar um papel importante na sua capacidade de interagir e danificar as membranas biológicas.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por subsídios do Conselho de pesquisa do Instituto de estudos avançados em ciências básicas (IASBS), Zanjan, Irã.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma 35845
Ammonium sulfate Merck 1012171000
Black 96-well plate Corning
Black Clear-bottomed 96-well plate Corning
Bovine insulin Sigma I6634
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A2153
BSA essentially fatty acid-free Sigma A6003
Centrifuge Sigma
Crystal clear sealing tape Corning
CuSO4 Sigma 451657
Dialysis bag (cut off 2 KDa) Sigma D2272
Dounce homogenizer Potter Elvehjem
EDTA Sigma E9884
Fluorescence plate reader BioTek
Fluorescence spectrophotometer Cary Eclipse VARIAN
Folin Merck F9252
Glycine Sigma G7126
Guillotine Made in Iran
HCl Merck H1758
Hen Egg White Lysozyme (HEWL) Sigma L6876
Na2CO3 Sigma S7795
NaH2PO4 Sigma S7907
NaOH Merck S8045
Oxaloacetate Sigma O4126
Percoll GE Healthcare
Phosphate Buffer Saline (PBS) Sigma CS0030
PMSF Sigma P7626
Potassium sodium tartrate Sigma 217255
Quartz cuvette Sigma
Spectrophotometer analytik jena SPEKOL 2000 model
Succinate Sigma S2378
Sucrose Merck 1076871000
Thermomixer Eppendorph
Thioflavin T Sigma T3516
Tris-HCl Merck 1082191000
Triton X-100 Sigma T9284
Tryptone QUELAB
Water bath Memmert
Yeast Extract QUELAB
β-NADH Sigma N8129

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