Summary
Forudsat her er en protokol til at undersøge samspillet mellem Native form, prefibrillar, og modne amyloid fibriller af forskellige peptider og proteiner med mitokondrier isoleret fra forskellige væv og forskellige områder af hjernen.
Abstract
En voksende mængde af beviser indikerer, at membran permeabilisering, herunder interne membraner såsom mitokondrier, er et fælles træk og primære mekanisme af amyloid aggregat-induceret toksicitet i neurodegenerative sygdomme. Men de fleste rapporter, der beskriver mekanismerne for membran afbrydelse er baseret på phospholipid modelsystemer, og undersøgelser direkte rettet mod hændelser, der forekommer på niveauet af biologiske membraner er sjældne. Beskrevet her er en model til undersøgelse af mekanismerne for amyloid toksicitet på membran niveau. For mitokondriel isolering anvendes tæthed gradient medium til at opnå præparater med minimal myelin forurening. Efter bekræftelse af mitokondriel membran integritet er samspillet mellem amyloid fibriller, der hidrører fra α-synuclein, bovin insulin, og høne æggehvide lysozym (hewl) med rotte hjernen mitokondrier, som en in vitro biologisk model, undersøgt. Resultaterne viser, at behandling af hjernen mitokondrier med fibrillar forsamlinger kan forårsage forskellige grader af membran permeabilization og ROS indhold ekstraudstyr. Dette indikerer struktur afhængige interaktioner mellem amyloid fibriller og mitokondriel membran. Det foreslås, at biofysiske egenskaber af amyloid fibriller og deres specifikke binding til mitokondrielle membraner kan give forklaringer på nogle af disse observationer.
Introduction
Amyloid-relaterede lidelser, kendt som amyloidoser, udgør en stor gruppe af sygdomme defineret ved fremkomsten af uopløselige protein aflejringer i forskellige væv og organer1,2. Blandt dem er neurodegenerative lidelser de hyppigst anvendte former, hvor protein aggregater optræder i det centrale eller perifere nervesystem2. Selv om en række mekanismer er blevet foreslået at være involveret i toksiciteten af amyloid aggregater3, en voksende mængde af beviser peger på celle membran afbrydelse og permeabilisering som den primære mekanisme af amyloid patologi4, 5. Ud over plasma membran, interne organeller (dvs., mitochondrier) kan også blive påvirket.
Interessant, nye beviser tyder på, at mitokondriel dysfunktion spiller en afgørende rolle i patogenesen af neurodegenerative lidelser, herunder Alzheimers og Parkinsons sygdomme6,7. I overensstemmelse med dette spørgsmål har talrige rapporter indikeret binding og akkumulering af amyloid β-peptid, α-synuclein, huntingtin og Als-sammenkædede mutant SOD1 proteiner til mitokondrier8,9,10, 11. mekanismen for membran permeabilisering ved amyloid aggregater menes at forekomme enten gennem dannelse af diskrete kanaler (porer) og/eller gennem en ikke-specifik vaskemiddel lignende mekanisme5,12, 13. Det er bemærkelsesværdigt, at de fleste af disse konklusioner har været baseret på rapporter, der involverer phospholipid modelsystemer, og undersøgelser direkte rettet mod de hændelser, der forekommer i biologiske membraner er sjældne. Det er klart, disse kunstige lipid dobbeltlag ikke nødvendigvis afspejler de iboende egenskaber af biologiske membraner, herunder de af mitokondrier, som er heterogene strukturer og består af en bred vifte af phospholipider og proteiner.
I nærværende undersøgelse anvendes mitokondrier isoleret fra rotte hjerner som en in vitro biologisk model til at undersøge de ødelæggende virkninger af amyloid fibriller, der opstår som følge af α-synuclein (som et monomer protein), bovin insulin (som et model peptid, som viser signifikant strukturel homologi med humant insulin involveret i injektion-lokaliseret amyloidose), og høne æggehvide lysozym (HEWL; som en fælles model protein til undersøgelse af amyloid sammenlægning). Interaktioner og mulige skader af mitokondrie membraner induceret af amyloid fibriller er derefter undersøgt ved at observere frigivelsen af mitokondrie Malate dehydrogenase (MDH) (placeret i mitokondrie matrix) og mitokondrier reaktiv ilt art (ROS) ekstraudstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med den institutionelle dyrepleje og brug Komité (IACUC) af medicinske videnskaber på Teheran Universitet. Der blev gjort en maksimal indsats for at minimere lidelser og skadelige virkninger for rotterne ved at skærpe guillotine bladene og anvende knivene resolut og hurtigt.
1. hjernens homogenisering og mitokondriel isolation
Bemærk: alle reagenser til mitokondriel isolation blev udarbejdet i henhold til Sims og Anderson14.
- Fremstilling af buffere til mitokondriel isolering
- Forbered en 100 mM Tris-HCl-opløsning: vejer 0,605 g Tris-HCl og opløses i ca. 40 mL deioniseret vand (DW) i et bægerglas. Opløsningen overføres til en 50 mL målekolbe, og den endelige volumen øges til 50 mL ved tilsætning af DW.
- Forbered en 10 mM EDTA opløsning: vejer 0,202 g EDTA og opløses den i ca. 40 mL DW i et bægerglas. Opløsningen overføres til en 50 mL målekolbe, og den endelige volumen øges til 50 mL ved tilsætning af DW.
Bemærk: begge opløsninger kan opbevares ved 4 °C i mindst 4 uger. - Forbered en Tris-HCl/EDTA/saccharose stamopløsning: Tilsæt 30 mL 100 mM Tris-HCl og 30 mL 10 mM EDTA i et bægerglas. Der afvejes 32,86 g saccharose, og det tilsættes til bægerglasset under omrøring med en magnetisk omrører. Når saccharose opløses, overføres opløsningen til en 100 mL målekolbe, og den endelige volumen øges til 100 mL ved tilsætning af DW.
Bemærk: denne løsning kan opbevares ved 4 °C i op til 3 dage. - Forbered en isolations buffer (IB): Tilsæt 100 mL Tris-HCl/EDTA/saccharose bestand til ca. 150 mL DW. Juster pH til 7,4 ved at tilføje 0,1 M HCl. Forøg den endelige lydstyrke til 300 mL ved at tilføje DW.
- Forbered 15% (v/v) tæthed gradient medium med IB ved at tilføje 1,5 mL tæthed gradient medium til 8,5 mL kold IB.
- Forbered 10 mg/mL bovin serumalbumin (BSA) opløsning: vejer 20 mg fedtsyrefri BSA og opløses i ca. 1,5 mL DW i et 2 mL hætteglas. Forøg den endelige volumen til 2 mL ved at tilføje DW og opbevar den på is indtil brug.
Bemærk: frisk forberede løsningerne fra trin 1.1.4-1.1.6 på dagen for mitokondriel isolation og gemme dem på is indtil brug.
- Isolering af rotte hjernen
Bemærk: Decapitation og hjerne fjernelse af hanrotter (150 – 200 g) blev udført i henhold til Sims og Anderson14.- Læg et 30 mL bægerglas i en isspand og tilsæt 10 mL kold IB til bægerglasset.
- Decapitate rotten med en lille dyr guillotine og fjerne hjernen fra kraniet inden for 1 minut af hugning at begrænse forringelse af mitokondrie egenskaber.
- Hurtigt overføre hjernen til bægerglasset, der indeholder kold IB.
- Hjernens homogenisering og forberedelse af mitokondrier
Bemærk: mitokondrielle fraktioner blev isoleret i henhold til den protokol, der blev beskrevet af Sims og Anderson14, med nogle ændringer som beskrevet tidligere15. Det er vigtigt at arbejde hurtigt og holde alt på is under hele proceduren.- Vask vævet 2x med 30 mL IB, Overfør til et bægerglas, der indeholder kold IB, og finhak hjernen med en saks.
- Tilsæt 10 volumener af forkølet IB (ca. 10 mL IB pr. rotte hjerne).
- Overfør vævs suspensionen til en 20 mL kold Dounce-homogenisator.
- Homogenisere vævet stykker ved hjælp af ni op-og-ned slagtilfælde med en motoriseret Pestle.
Bemærk: Lad blandingen være på is i ca. 30 s efter hvert sæt af tre homogenisering strøg for at sikre, at homogenatet forbliver koldt. - Homogenatet overføres til et forkølet 10 mL centrifugeglas og centrifugeres ved 1, 300x g og 4 °c i 3 min.
- Supernatanten deformerer forsigtigt, og den overføres til et forkølet 10 mL centrifugeglas og centrifugeres ved 21, 000x g ved 4 °c i 10 min.
- Supernatanten kasseres og opslæmmes i en kold 15% tætheds gradient medium opløsning (5 mL for hver hjerne) ved forsigtigt at omrøre blandingen med en pipette.
- Centrifugeres i en rotor med fast vinkel ved 30, 700x g ved 4 °c i 5 minutter ved hjælp af langsom acceleration (45 s fra 0 rpm til 500 rpm efterfulgt af normal acceleration) og deceleration (ingen bremser). Dette bør producere to særskilte bånd af materiale (figur 1a, venstre).
- Ved hjælp af en Pasteur-pipette fjernes det skarpe bånd af materiale akkumuleret i toppen af gradienten, som for det meste indeholder myelin. Fjern derefter tætheden gradient medium løsning overliggende materialet (i band 2) så meget som muligt uden at miste nogen af de beriget mitokondrie fraktion i band 2.
Bemærk: bandet 2 indeholder både den synaptiske og ikke-synaptisk mitochondrier. - Der tilsættes 8 mL IB til mitokondrie fraktionen, mens blandingen forsigtigt omrøstes med en pipette.
- Centrifugeres ved 16, 700x g ved 4 °c i 10 minutter og fjern forsigtigt supernatanten, så den nederste løse pellet ikke forstyrres.
- Der tilsættes 1 mL 10 mg/mL fedtsyrefri BSA til centrifugeglasset, mens blandingen forsigtigt omrøstes med spidsen af en pipette. Den endelige volumen øges til 5 mL pr. hjerne ved at tilføje IB.
- Der centrifugeres ved 6, 900x g ved 4 °c i 10 min., som skal producere en fast pellet (figur 1a, højre).
- Supernatanten resuspenderes forsigtigt mitokondrie pellet i IB, alikvot i 0,5 mL rør, og opbevares i flydende nitrogen indtil brug.
2. bestemmelse af protein koncentrationen
Bemærk: protein koncentrationen måles ved hjælp af metoden Lowry et al.16.
- Fremstilling af opløsninger til Lowry-analyse
- Opløsning A: afvejes 0,4 g NaOH og 2 g na2co3 og OPLØSES i 80 ml DW, hvorefter opløsningen overføres til en 100 ml målekolbe, og volumenet øges til 100 ml ved tilsætning af DW.
- Klargøring af opløsningen B: vejer 0,1 g kaliumnatriumtartrat og 0,05 g CuSO4 og opløses i 8 ml DW, hvorefter opløsningen overføres til en 10 ml målekolbe, og volumenet øges til 10 ml ved tilsætning af DW.
Bemærk: begge opløsninger A og B kan forblive stabile ved 4 °C i op til 6 måneder. - Klargøring af opløsningen C: tilsæt 0,5 ml Ciocalteu-opløsning til 7,5 ml DW.
Bemærk: Forbered opløsningen C frisk og hold den væk fra lys indtil brug. - Klargør BSA-standarderne med de endelige koncentrationer på 0, 20, 40, 60, 80, 100 og 120 μg/mL ved at kombinere henholdsvis 0, 20, 40, 60, 80, 100 og 120 μL af 1 mg/mL BSA med nok DW til at fremstille 1000 μL opløsning.
- Måling af protein koncentration
Bemærk: for større nøjagtighed, køre dette trin i triplicate.- Tilsæt 50 μL standardopløsninger og mitokondrie homogenat til hver brønd af en 96 brønd plade, efterfulgt af tilsætning af 45 μL opløsning A. Derefter inkubatér pladen i 10 minutter i et varmt vandbad, der er indstillet til 50 °C.
- Tilsæt 5 μL opløsning B og Inkuber pladen i 10 minutter i mørke ved stuetemperatur (RT).
- Der tilsættes 150 μL opløsning C, og pladen inkubates i 10 minutter i et varmt vandbad sat til 50 °C.
- Læg pladen i en plade læser, og Optag absorbansværdierne for standarder og mitokondriel suspension ved 650 nm. Derefter, ved hjælp af en kalibreringskurve, beregne proteinindholdet af mitokondrier.
3. bestemmelse af mitokondriel membran integritet
Bemærk: mitokondriel membran integritet bekræftes ved at måle malat dehydrogenase (MDH) aktivitet i isolerede mitokondrier før og efter membran afbrydelse af Triton X-100.
- Mitokondriel homogenierer til 1 mg/mL med kold IB og anbringes i to 1,5 mL rør (typisk 195 μL mitokondrier pr. tube).
- Der tilsættes 5 μL 20% (v/v) Triton X-100 (fortyndet med DW) til ét rør (som en positiv kontrol for maksimal enzymaktivitet) og 5 μL DW til et andet rør (til kontrol) efterfulgt af blanding med en omrører.
- Rørene inkuberes i 10 minutter i et varmt vandbad, der er sat til 30 °C.
- Pellet mitochondrier ved centrifugering af rør i en fast vinkel rotor ved 16.000 x g og 4 °c i 15 min.
- Indsaml omhyggeligt de resulterende supernatanter til analyse af mitokondrie MDHS aktivitet ved hjælp af en standard spektrofotometrisk assay, der er beskrevet i det følgende afsnit.
- Beregn integriteten af mitokondriel membran som følger:
4. bestemmelse af MDH-aktivitet
Bemærk: MDH-aktivitet blev målt spektrofotometrisk som beskrevet af Sottocasa et al.17.
- Klargøring af opløsninger til MDH-aktivitetsanalyse
- Forbered en 50 mM Tris-HCl opløsning (pH = 7,5): Forbered en 7,9 mg/mL opløsning i DW ved hjælp af Tris-HCl, og Juster pH til 7,5 ved 25 °C med 1,0 M NaOH.
- Forbered en 50 mM oxaloacetat opløsning: Forbered en 6,6 mg/mL opløsning ved hjælp af oxaloacetat i Tris-HCl.
Bemærk: denne opløsning er ikke stabil én gang i opløsningen og bør forberedes umiddelbart før brug. - Forbered en 10 mM β-NADH opløsning: Forbered en 7,81 mg/mL opløsning ved hjælp af β-NADH i Tris-HCl.
- Vurdering af MDH-aktivitet
Bemærk: endelige analyse koncentrationer i en 1,0 mL reaktionsblanding er 50 mM Tris-HCl, 5 mM oxaloacetat og 0,1 mM β-NADH.- Spektrofotometer indstilles til 25 °C og 340 nm. Pipette 890 μL Tris-HCl buffer, 100 μL oxaloacetat opløsning, og 10 μL NADH opløsning til en blank kuvette og 880 μL Tris-HCl buffer, 100 μL oxaloacetat opløsning, og 10 μL NADH opløsning i en prøve cuvette.
- Inkuber kuvetter i Spektrofotometer i 3 – 4 min. og reference mod blank.
- Tilsæt derefter 10 μL mitokondrie homogenat (1 mg/mL) til prøve kuvette, bland straks efter inversion, og Optag fald i absorbans på grund af NADH oxidation ved 340 nm i 1 min.
5. in vitro α-synuclein, bovin insulin og hewl og dannelse
- Protein præparat
- α-synuclein:
Bemærk: udtryk og oprensning af rekombinant α-synuclein udføres som beskrevet af Hoyer et al.18 med visse modifikationer, og renheden af α-synuclein BEKRÆFTES af SDS-Page.- Dialyze renset α-synuclein natten over mod fosfat-bufferet saltvand (PBS).
- Proteinkoncentrationen bestemmes ved hjælp af en ekstinktionskoefficient på 5600 M-1 cm-1 ved 275 nm19.
- Aliquots protein i 1,5 mL rør og opbevares ved-80 °C indtil brug.
- Kvæg insulin og HEWL:
- Give både kvæg insulin og HEWL.
- Hvert protein opløses i 50 mM glycin buffer (pH = 1,6; Justér pH-værdien med HCl).
- Bestem bovin insulin og hewl koncentration ved hjælp af en ekstinktionskoefficient på 1,0 og 2,63 for 1,0 mg/ml ved 276 nm og 280 Nm, henholdsvis20,21.
- α-synuclein:
- Induktion af amyloid-atrieflimren
- Fremstilling af opløsninger til amyloid-fibrillering:
- Du skal tilberede thioflavin T (ThT) buffer: veje 0,3 g af NaH2po4 og opløse det i 80 ml DW, justere pH til 6,5, og øge lydstyrken til 100 ml ved at tilføje DW.
- Opforbered stamopløsning (5 mM): vejer 1,6 mg ThT og opløses i 1 mL ThT buffer, passerer gennem et 0,22 μm filterpapir og holdes væk fra lys ved 4 °C indtil brug.
Bemærk: denne løsning kan opbevares ved 4 °C i op til 4 uger. - Tilberedning af ThT-opløsning (1 mM): Tilsæt 200 μL ThT stamopløsning (5 mM) til 800 μL ThT-buffer.
Bemærk: denne opløsning kan opbevares ved 4 °C i op til 1 uge.
- In vitro α-synuclein amyloid og dannelse:
- Tilsæt aliquoter (294 μL) proteinopløsning (200 μM) og 6 μL ThT-opløsning (1 mM) til 1,5 mL rør efterfulgt af omrøring.
- Rørene inkuberes i et termo ixer ved 37 °C under konstant omrøring ved 800 rpm i 4 dage.
- Tag aliquoter (10 μL) af inkuberet prøver efter regelmæssige tidsintervaller og tilsæt 490 μL ThT-buffer, blandet grundigt, og Inkuber i 5 minutter ved RT.
- Indstil excitation og emission spaltebredder som henholdsvis 5 nm og 10 nm, og mål ThT fluorescens ved excitation ved 440 nm og emission ved 485 nm ved hjælp af en fluorescens Spektrofotometer.
- In vitro-dannelse af bovine insulin amyloid og:
- Tilsæt 637 μL proteinopløsning (250 μM) til 1,5 mL tube. Tilsæt derefter 13 μL ThT-opløsning (1 mM) efterfulgt af omrøring.
- Der tilsættes aliquoter (200 μL) proteinopløsning (250 μM), som indeholder 20 μM ThT til hver brønd i en klar bunden 96 brønd plade og forsegler pladen med krystalklart tætnings tape.
- Læg pladen i en fluorescens plade læser og Inkuber ved 57 °C uden agitation.
- Mål ThT fluorescens med 30 min intervaller, med excitation på 440 nm og emission ved 485 nm, for 12 h.
Bemærk: ryst pladen i 5 s før hver måling.
- In vitro-hewl amyloid og dannelse:
- Der tilsættes aliquoter (200 μL) proteinopløsning) 1 mM), som indeholder 20 μM ThT til hver brønd af en klart bunden 96 brønd plade og forsegler pladen med krystalklart tætnings tape.
- Læg pladen i en fluorescens plade læser og Inkuber ved 57 °C uden agitation.
- Mål ThT fluorescens med 2 h intervaller, med excitation på 440 nm og emission ved 485 nm, i 4 dage.
Bemærk: for alle tre proteiner bekræftes amyloid og dannelse ved atomkraften mikroskopi (figur 2b).
- Fremstilling af opløsninger til amyloid-fibrillering:
6. behandling af mitokondrier med amyloid fibrils, MDH Release assay og ROS måling
- Inkubation af isolerede mitokondrier med amyloid fibriller
- Der tændes for centrifuge-og varmtvands badet og indstilles til henholdsvis 4 °C og 30 °C.
- Ved brug af IF fortyndes mitokondriel til en slutkoncentration på 1 mg/mL.
- Forbered to serier af 1,5 mL rør indeholdende mitokondrie homogenater (en serie for MDH frigivelse assay og en anden for mitokondrie ROS måling).
- Der tilsættes aliquoter af ferske eller amyloide fibrier af α-synuclein, bovin insulin eller HEWL (ved endelige koncentrationer på 5 μM, 10 μM, 20 μM og 25 μM; brug PBS eller glycin buffer som kontrol) til mitokondriel homogenat (endelig volumen = 200 μL) (Se tabel 1, tabel 2 og tabel 3) efterfulgt af forsigtigt omrøring af opløsningen med en pipette.
Bemærk: Brug Triton X-100 (ved en endelig koncentration på 0,5% [v/v]) som en positiv kontrol for maksimal enzym frigivelse for MDH-frigivelses testen. - Inkubér rør, der indeholder mitokondrielle suspensioner i 30 minutter i varmt vandbad indstillet til 30 °C.
- Mål mitokondriel MDH frigivelse og ROS indhold som beskrevet i afsnit 6,2 og 6,3.
- Mitokondriel MDH frigivelse assay
- Centrifuger de inkuberet mitokondrielle homogenater ved 16.000 x g i 15 min., og Indsaml forsigtigt de resulterende supernatanter for at assere MITOKONDRIE Mdhs aktivitet som beskrevet i afsnit 4.
- Udsætningen af MDH beregnes som en brøkdel af den maksimale effekt (Triton X-100) på følgende måde:
- Mitokondrie ROS måling
Bemærk: mitokondriel ROS indhold bestemmes med oxidations følsom fluorogen forløber dihydrodichlorocarboxyfluorescein diacetat (DCFDA)22.- Forbered løsninger til måling af mitokondrie ROS. Forbered en 50 μM DCFDA-opløsning ved at opløse i methanol (Forbered frisk) og en 200 mM succinatopløsning ved opløsning i DW.
- Der afpipetteres 191 μL inkuberet mitokondriel homogeni til hver brønd på en 96 brønd plade og tilsættes 4 μL 50 μM DCFDA (1 μM endelig koncentration) og 5 μL 200 mM succinat (5 mM slutkoncentration).
- Pladen inkubates i 30 minutter i et varmt vandbad, der er sat til 30 °C under forsigtigt omrøring.
- Læg pladen i en fluorescens plade læser, og mål fluorescens intensitet med excitation ved 485 nm og emission ved 530 nm.
7. statistisk analyse
- Udfør alle eksperimenter mindst 2x eller 3x med tre eksemplarer assays og foretag passende statistiske tests. Her præsenteres resultaterne som Mean ± SD, og en elevs parrede t-test blev udnyttet til at beregne Statistisk signifikans. P-værdier mindre end 0,01 og 0,05 blev anset for at være statistisk signifikante (* p < 0,05; * * p < 0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskriver en model til at studere interaktioner af amyloid og med rotte hjernen mitokondrier som en in vitro biologisk model. For mitokondriel præparat, 15% (v/v) tæthed gradient medium blev brugt til at fjerne myelin som større forurening af hjernevæv14. Som vist i figur 1aproducerede centrifugering ved 30.700 x g to særskilte materiale bånd, myelin (som den vigtigste bestanddel af band 1) og band 2, som indeholder beriget mitokondriel fraktion.
Ved at ændre den protokol, der er beskrevet af Sims og Anderson14, blev der udarbejdet en mitokondriel suspension indeholdende både synaptisk og ikke-synaptisk mitochondrier. Til fremstilling af ren ikke-synaptisk mitochondrier, Sims og Anderson tidligere detaljeret protokol14. Ved Centrifugerings trinnet blev der tilsat 10 mg/mL fedtsyrefri BSA for at opnå en fast mitokondriel pellet (figur 1a). Mitokondriel membran integritet blev vurderet ved at måle MDH aktivitet i isolerede mitokondrier før og efter membran afbrydelse og enzym frigivelse af Triton X-100, som beskrevet i protokollen.
Det blev typisk konstateret, at mitokondrie præparater var omkring 93% intakt (figur 1b). En ThT fluorescens analyse blev udført for at overvåge væksten af amyloid fibrils. Som vist i figur 2aviste kurven for amyloid-fibrillering af tre proteiner et typisk sigmoidal mønster, som er i tråd med nukleations afhængige polymeriserings modeller af disse proteiner som tidligere rapporteret23,24 ,25. Den højeste ThT fluorescens emission for α-synuclein, kvæg insulin og HEWL blev observeret efter henholdsvis 96 h, 12 h og 96 h, hvilket tyder på dannelse af amyloid fibrier (figur 2a). Dette blev yderligere bekræftet af AFM-målingen.
Som illustreret i figur 2bblev veldefinerede modne fibrier med typisk amyloid morfologi observeret for tre proteiner inkuberet under monomer betingelser. Interaktioner og mulige skader og permeabilisering af mitokondrie membraner ved amyloid fibriller blev undersøgt. Dette blev opnået ved at overvåge frigivelsen af mitokondrie MDH og mitokondrie ros måling ved tilsætning af α-synuclein, kvæg insulin, eller hewl amyloid fibriller til mitokondrie suspensioner og efter de beskrevne procedurer. De indledende eksperimenter viste, at tilstedeværelsen af tht (op til 3 μM) ikke havde nogen effekt på MDH frigivelse og mitokondrie ros indhold (data ikke vist).
Som vist i figur 3blev der observeret en betydelig frigivelse af MDH ved tilsætning af α-synuclein amyloid fibriller til mitokondrier på en koncentrationsafhængig måde. Selv om der blev påvist en mindre frigivelse ved tilsætning af kvæg insulin amyloid fibriller, blev det konstateret, at hewfibrier var ineffektiv (figur 3). Selv om der ikke blev observeret nogen signifikant forbedring i mitokondrie ros-indhold ved tilsætning af kvæg insulin eller hewl amyloid fibriller, førte behandling med α-synuclein fibrier til en betydelig stigning i ros-indholdet i hjernens mitokondrier i en koncentrationsafhængig måde (figur 4).
Figur 1: bestemmelse af mitokondriel isolering og membran integritet. A) til venstre: typisk udseende af et centrifugeglas efter opsuspension af pellet i kold 15% tæthed gradient medium opløsning efter centrifugering. Myelin er den vigtigste bestanddel af bandet 1, som ophobes i toppen. Band 2 indeholder den meget berigede mitokondrie fraktion. Right: en fast pellet blev fremstillet efter tilsætning af 10 mg/mL fedtsyrefri BSA og centrifugering ved 6900 x g. B) mitokondriel membran integritet blev bestemt ved at måle MDH aktivitet i isolerede mitokondrier før og efter membran forstyrrelse af Triton X-100. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: amyloid-fibrillering af α-synuclein, bovin insulin og HEWL. A) kinetik af amyloid og dannelse indikeret ved stigende fluorescens intensitet af tht ved 485 nm. B) AFM-billeder af tre proteiner er vist, som blev inkuberet under monomer betingelser for regelmæssige tidspunkter. Skala søjler repræsenterer 500 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: mitokondrie MDH frigivelse ved interaktion med monomer og amyloid og af α-synuclein, kvæg insulin, og hewl. Frigivelse udtrykkes som den procentdel af det maksimum, der er observeret ved behandling med 0,5% (v/v) Triton X-100. Hver værdi repræsenterer middelværdien ± SD (n = 3; * p < 0,05, * * p < 0,01). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: mitokondriel ros indhold ved interaktion med monomer og amyloid og af α-synuclein, kvæg insulin og hewl. Dataene udtrykkes som procentdelen af værdier i kontrol mitochondrier. Hver værdi repræsenterer middelværdien ± SD (n = 3; * p < 0,05; * * p < 0,01). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Mitokondriel homogenat (1 mg/mL) | α-synuclein monomer (200 μM) | α-synuclein og (200 μM) | Isolations buffer | Pbs | Triton x-100 20% (v/v) | |
| Kontrol | 175 μL | 0 | 0 | 25 μL | 0 | 0 |
| Pbs | 175 μL | 0 | 0 | 0 | 25 μL | 0 |
| Monomer 25 μM | 175 μL | 25 μL | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Fibril 5 μM | 175 μL | 0 | 5 μL | 20 μL | 0 | 0 |
| Fibril 10 μM | 175 μL | 0 | 10 μL | 15 μL | 0 | 0 |
| Fibril 20 μM | 175 μL | 0 | 20 μL | 5 μL | 0 | 0 |
| Fibril 25 μM | 175 μL | 0 | 25 μL | 0 | 0 | 0 |
| Positiv kontrol | 175 μL | 0 | 0 | 20 μL | 0 | 5 μL |
Tabel 1: behandling af mitokondrier med forskellige koncentrationer af α-synuclein amyloid fibrils.
| Mitokondriel homogenat (1 mg/mL) | Bovin insulin monomer (250 μM) | Kvæg insulin og (250 μM) | Isolations buffer | Glycin buffer | Triton x-100 20% (v/v) | |
| Kontrol | 175 μL | 0 | 0 | 25 μL | 0 | 0 |
| Glycin buffer | 175 μL | 0 | 0 | 0 | 25 μL | 0 |
| Monomer 25 μM | 175 μL | 20 μL | 0 | 5 μL | 0 | 0 |
| Fibril 5 μM | 175 μL | 0 | 4 μL | 21 μL | 0 | 0 |
| Fibril 10 μM | 175 μL | 0 | 8 μL | 17 μL | 0 | 0 |
| Fibril 20 μM | 175 μL | 0 | 16 μL | 9 μL | 0 | 0 |
| Fibril 25 μM | 175 μL | 0 | 20 μL | 5 μL | 0 | 0 |
| Positiv kontrol | 175 μL | 0 | 0 | 20 μL | 0 | 5 μL |
Tabel 2: behandling af mitokondrier med forskellige koncentrationer af bovin insulin amyloid fibriller.
| Mitokondriel homogenat (1 mg/mL) | HEWL monomer (1 mM) | Hewl og (1 mm) | Isolations buffer | Glycin buffer | Triton x-100 20% (v/v) | |
| Kontrol | 175 μL | 0 | 0 | 25 μL | 0 | 0 |
| Glycin buffer | 175 μL | 0 | 0 | 0 | 25 μL | 0 |
| Monomer 25 μM | 175 μL | 5 μL | 0 | 20 μL | 0 | 0 |
| Fibril 5 μM | 175 μL | 0 | 1 μL | 24 μL | 0 | 0 |
| Fibril 10 μM | 175 μL | 0 | 2 μL | 23 μL | 0 | 0 |
| Fibril 20 μM | 175 μL | 0 | 4 μL | 21 μL | 0 | 0 |
| Fibril 25 μM | 175 μL | 0 | 5 μL | 20 μL | 0 | 0 |
| Positiv kontrol | 175 μL | 0 | 0 | 20 μL | 0 | 5 μL |
Tabel 3: behandling af mitokondrier med forskellige koncentrationer af hewl amyloid fibriller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et væld af eksperimentelle resultater understøtter hypotesen om, at cytotoksicitet af fibrillar aggregater er væsentligt forbundet med deres evne til at interagere med og permeabilize biologiske membraner4,5. Men de fleste af dataene er baseret på kunstige lipid-dobbeltlag, der ikke nødvendigvis afspejler de iboende egenskaber af biologiske membraner, som er heterogene strukturer med en bred vifte af phospholipider og proteiner. Her, ved hjælp af hjernen mitochondrier som en in vitro biologisk membran, en model for at studere fibrillar aggregater cytotoksicitet på membranen niveau er beskrevet.
Under eksperimentet er det vigtigt at arbejde hurtigt og holde alt på isen for at forberede funktionelt aktive mitokondrier med intakte membraner. Desuden er mitokondriel koncentration (baseret på total protein måling) en vigtig faktor, der påvirker membran-amyloid og interaktion; den skal således holdes konstant i hele protokollen. I denne undersøgelse, mitokondrie præparater indeholdt både synaptisk og ikke-synaptisk mitokondrier. For ren ikke-synaptisk mitokondriel forberedelse, 40%, 23%, og 15% (v/v) tæthed gradient medium bør anvendes, som beskrevet af Sims og Anderson14. Fordi mitokondrierne er en organelle med en velkarakteriseret membran, kan det tjene som en yderst nyttig biologisk model system i molekylære undersøgelser relateret til mekanismerne i amyloid cytotoksicitet på membran niveau (især i forbindelse med neurodegenerative sygdomme). Denne protokol tillader undersøgelse af interaktioner og omfanget af mitokondrie membraner permeabilization ved at kigge ind i frigivelsen af forskellige molekyler og enzymer placeret i forskellige rum (dvs. dem indlejret i de ydre og indre membraner og dem, der er placeret i intermembran rummet eller mitokondrie matrix).
Efter bekræftelse af mitokondriel membran integritet (figur 1b) og amyloid og dannelse (figur 2), interaktion, beskadigelse og permeabilisering af mitokondrielle membraner ved tilsætning af α-synuclein, bovin insulin og hewl amyloid fibriller blev undersøgt. Resultaterne viste klare forskelle i omfanget af membran permeabilisering og mitokondrie ros Enhancement induceret af amyloid fibriller (figur 3 og figur 4), tyder variationer i kapaciteten af forskellige amyloid fibriller at interagere med og beskadige mitokondrie membraner.
Ved initiering af membran permeabilisering skal amyloid fibriller nå mitokondrie overfladen. Det er blevet påvist, at sammenslutning, lokalisering og indsættelse af proteiner til ladede membraner er afhængig af uspecifikke elektrostatiske interaktioner og af proteiners hydrofobe karakter26,27,28. Med hensyn til amyloid toksicitet, en voksende mængde af beviser stærkt implicerer en central rolle af protein aggregat overflade hydrofobicitet i deres cytotoksicitet29,30. Selvom HEWL bærer en netto positiv ladning over en bred vifte af pH-niveauer og har en høj affinitet for anioniske og neutrale phospholipider31 (f. eks. mitokondriel membran23), ingen mitokondrie membran PERMEABILISERING og ros Enhancement blev observeret (figur 3 og figur 4). En forklaring på denne observation kan være relateret til en reduktion af overflade hydrofobicitet af hewl fibriller på grund af laterale fibril-fibril interaktioner23,32, hvilket fører til tab af evnen til at forårsage membran skader.
Til trods for en signifikant eksponering for kvæg insulin i forbindelse med og dannelse22blev der observeret en let enzym frigivelse ved tilsætning af 25 μM amyloid fibriller (figur 3) uden signifikant indvirkning på indhold af mitokondriel ROS (figur 4). Da både hjernen mitokondrier og kvæg insulin fibriller bærer en negativ zeta potentiale på deres overflader24, det foreslås, at frastødende kræfter mellem mitokondriel membran og kvæg insulin amyloid fibriller kan tage højde for deres manglende evne til at effektivt interagere med og beskadige mitokondrie membraner24. Den højeste permeabilisering og mitokondrie ros intervaller blev observeret ved tilsætning af α-synuclein fibriller (figur 3 og figur 4).
Denne observation kan tilskrives den høje kapacitet af α-synuclein for interaktion med biologiske membraner, der har negativt ladede overflader33,34, såsom mitochondrier. I den forbindelse har nogle undersøgelser vist, at der er specifik binding og import af α-synuclein til mitokondrier, hvor de fortrinsvis forbindes med den indre membran35. Interessant, Ghio et al. rapporterede, at binding, medieret af cardiolipin (en phospholipid unikt beriget i indre mitokondriel membran), af α-synuclein kan være en vigtig mekanisme for Association og afbrydelse af mitokondrie membraner36.
Det er interessant, at der er klare beviser for binding og akkumulering af forskellige monomer peptider og proteiner, herunder amyloid β-peptid, α-synuclein, huntingtin og Als-linked mutant SOD1 til mitokondrier35,37, 38af39. Desuden tidligere undersøgelser har vist, at monomer samlinger af amyloid β (25 – 35)15 og sod 140 har evnen til at interagere med og forårsage mitokondrie membran permeabilization. Ifølge litteraturen, det foreslås, at amyloid fibriller er for store til at krydse membranen; Derfor bør den gennemsnitlige og-størrelse ikke være en faktor i den tilsyneladende mangel på virkninger induceret af bovin insulin og hewl amyloid fibrils. Selv om der er behov for yderligere undersøgelser for at belyse de detaljerede mekanismer, foreslås det, at de biofysiske egenskaber ved amyloid fibrier (dvs. overflade ladning, hydrophobicity, og besidder en specifik sekvens-målretning mitokondriel membran) kan spille en vigtig rolle i deres evne til at interagere med og beskadige biologiske membraner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Forskningsrådet under instituttet for avancerede studier i grundlæggende videnskaber (IASBS), Zanjan, Iran.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma | 35845 | |
| Ammonium sulfate | Merck | 1012171000 | |
| Black 96-well plate | Corning | ||
| Black Clear-bottomed 96-well plate | Corning | ||
| Bovine insulin | Sigma | I6634 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| BSA essentially fatty acid-free | Sigma | A6003 | |
| Centrifuge | Sigma | ||
| Crystal clear sealing tape | Corning | ||
| CuSO4 | Sigma | 451657 | |
| Dialysis bag (cut off 2 KDa) | Sigma | D2272 | |
| Dounce homogenizer | Potter Elvehjem | ||
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Fluorescence plate reader | BioTek | ||
| Fluorescence spectrophotometer | Cary Eclipse VARIAN | ||
| Folin | Merck | F9252 | |
| Glycine | Sigma | G7126 | |
| Guillotine | Made in Iran | ||
| HCl | Merck | H1758 | |
| Hen Egg White Lysozyme (HEWL) | Sigma | L6876 | |
| Na2CO3 | Sigma | S7795 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S7907 | |
| NaOH | Merck | S8045 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126 | |
| Percoll | GE Healthcare | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | CS0030 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Potassium sodium tartrate | Sigma | 217255 | |
| Quartz cuvette | Sigma | ||
| Spectrophotometer | analytik jena | SPEKOL 2000 model | |
| Succinate | Sigma | S2378 | |
| Sucrose | Merck | 1076871000 | |
| Thermomixer | Eppendorph | ||
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | |
| Tris-HCl | Merck | 1082191000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tryptone | QUELAB | ||
| Water bath | Memmert | ||
| Yeast Extract | QUELAB | ||
| β-NADH | Sigma | N8129 |
References
- Merlini, G., Bellotti, V.
- Berg, I. Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , Linköping University. Linköping Institute of Technology, Department of Physics, Chemistry and Biology (2010).
- Kagan, B. L. Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage. Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. Uversky, V. N., Fink, A. L. , Springer US. New York. 223-236 (2006).
- Demuro, A., et al. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers. The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).
- Kayed, R., et al. Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).
- Manczak, M., Park, B. S., Jung, Y., Reddy, P. H. Differential expression of oxidative phosphorylation genes in patients with Alzheimer's disease: implications for early mitochondrial dysfunction and oxidative damage. Neuromolecular Medicine. 5, 147-162 (2004).
- Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues. Journal of Neurochemistry. 107, 317-328 (2008).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B. M., Avadhani, N. G., Anandatheerthavarada, H. K. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Kagan, B. L., Azimov, R., Azimova, R.
- Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T., Lansbury, P. T. Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations. Nature. 418, 291 (2002).
- Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nature Protocols. 3, 1228-1239 (2008).
- Ghobeh, M., et al. Interaction of Aβ (25-35) Fibrillation Products with Mitochondria: Effect of Small-Molecule Natural Products. Peptide Science. 102, 473-486 (2014).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Sottocasa, G. L., Kuylenstierna, B., Ernester, L., Bergstrand, A. Separation and some enzymatic properties of the inner and outer membrane of rat liver mitochondria. Methods in Enzymology. 10, 448-463 (1967).
- Hoyer, W., et al. Dependence of a-Synuclein Aggregate Morphology on Solution Conditions. Journal of Molecular Biology. 322, 383-393 (2002).
- Weinreb, P. H., et al. NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded. Biochemistry. 35, 13709-13715 (1996).
- Porter, R. R. Partition chromatography of insulin and other proteins. The Biochemical Journal. 53, 320-328 (1953).
- Goldberg, M. E., Rudolph, R., Jaenicke, R. A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured reduced egg white lysozyme. Biochemistry. 30, 2790-2797 (1991).
- Young, T. A., Cunningham, C. C., Bailey, S. M. Reactive oxygen species production by the mitochondrial respiratory chain in isolated rat hepatocytes and liver mitochondria: studies using myxothiazol. Archives of Biochemistry and Biophysics. 405, 65-72 (2002).
- Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Membrane integrity and amyloid cytotoxicity: a model study involving mitochondria and lysozyme fibrillation products. Journal of Molecular Biology. 409, 826-838 (2011).
- Katebi, B., Mahdavimehr, M., Meratan, A. A., Ghasemi, A., Nemat-Gorgani, M. Protective effects of silibinin on insulin amyloid fibrillation, cytotoxicity and mitochondrial membrane damage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 659, 22-32 (2018).
- Fink, A. L. The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. Accounts of Chemical Research. 39, 628-634 (2006).
- Diraviyam, K., Stahelin, R. V., Cho, W., Murray, D. Computer modeling of the membrane interaction of FYVE domains. Journal of Molecular Biology. 328, 721-736 (2003).
- Van Rooijen, B. D., Claessens, M., Subramaniam, V. Lipid bilayer disruption by oligomeric α-synuclein depends on bilayer charge and accessibility of the hydrophobic core. Biochimica et Biophysica Acta. 1788, 1271-1278 (2009).
- Kourie, J. I., Henry, C. L. Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 29, 741-753 (2002).
- Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
- Bolognesi, B., et al. ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species. ACS Chemical Biology. 5, 735-740 (2010).
- Posse, E., De Arcuri, B. F., Morero, R. D. Lysozyme interactions with phospholipid vesicles: relationships with fusion and release of aqueous content. Biochimica et Biophysica Acta. 1193, 101-106 (1994).
- Roqanian, S., et al. Polyphenols protect mitochondrial membrane against permeabilization induced by HEWL oligomers: possible mechanism of action. International Journal of Biological Macromolecules. 103, 709-720 (2017).
- Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human alphasynuclein. The Journal of Biological Chemistry. 280, 9595-9603 (2005).
- Stockl, M., Fischer, P., Wanker, E., Herrmann, A. Alpha-synuclein selectively binds to anionic phospholipids embedded in liquid-disordered domains. Journal of Molecular Biology. 375, 1394-1404 (2008).
- Devi, L., et al. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. The Journal of Biological Chemistry. 283, 9089-9100 (2008).
- Ghio, S., Kamp, F., Cauchi, R., Giese, A., Vassallo, N. Interaction of α-synuclein with biomembranes in Parkinson's disease-role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 61, 73-82 (2016).
- Petersen, C. A. H., et al. The amyloid β-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13145-13150 (2008).
- Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease. EMBO Journal. 31, 1853-1864 (2012).
- Vande Velde, C., Miller, T. M., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 4022-4027 (2008).
- Oladzad Abbasabadi, A., et al. Disruption of mitochondrial membrane integrity induced by amyloid aggregates arising from variants of SOD1. International Journal of Biological Macromolecules. 61, 212-217 (2013).
