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Biochemistry

Interazioni con e Membrana Permeabilizzazione di mitocondri cerebrali di Amyloid Fibrils

Published: September 28, 2019 doi: 10.3791/59883
Automatic Translation
1, *1, *1, *1, *1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, 45137-66731, Iran
* These authors contributed equally

Summary

Fornito qui è un protocollo per studiare le interazioni tra forma nativa, prefibrillare, e fibrille amiloidi mature di diversi peptidi e proteine con mitocondri isolati da diversi tessuti e varie aree del cervello.

Abstract

Un numero crescente di prove indica che la permeabilizzazione della membrana, comprese le membrane interne come i mitocondri, è una caratteristica comune e un meccanismo primario della tossicità indotta dall'aggregazione amiloide nelle malattie neurodegenerative. Tuttavia, la maggior parte dei rapporti che descrivono i meccanismi di interruzione della membrana si basano su sistemi di modelli fosforidi, e gli studi che si rivolgono direttamente agli eventi che si verificano a livello di membrane biologiche sono rari. Descritto qui è un modello per studiare i meccanismi di tossicità amiloide a livello di membrana. Per l'isolamento mitocondriale, il mezzo di pendenza di densità viene utilizzato per ottenere preparati con contaminazione da mielina minima. Dopo la conferma dell'integrità della membrana mitocondriale, viene studiata l'interazione delle fibrille amiloidi derivanti da z-sinucleina, insulina bovina e lisozomina dell'uovo di gallina (HEWL) con mitocondri cerebrali, come modello biologico in vitro. I risultati dimostrano che il trattamento dei mitocondri cerebrali con gruppi di fibrillari può causare diversi gradi di permeabilizzazione della membrana e miglioramento del contenuto ROS. Ciò indica interazioni dipendenti dalla struttura tra fibrille amiloidi e membrana mitocondriale. Si suggerisce che le proprietà biofisiche delle fibrille amiloidi e il loro legame specifico alle membrane mitocondriali possono fornire spiegazioni per alcune di queste osservazioni.

Introduction

I disturbi correlati all'amiloide, noti come amiloidosi, costituiscono un grande gruppo di malattie definite dalla comparsa di depositi di proteine insolubili in diversi tessuti e organi1,2. Tra questi, i disturbi neurodegenerativi sono le forme più frequentemente in cui gli aggregati proteici compaiono nel sistema nervoso centrale o periferico2. Sebbene siano stati proposti diversi meccanismi coinvolti nella tossicità degli aggregati amiloidi3, un corpo crescente di prove indica l'interruzione della membrana cellulare e la permeabilizzazione come meccanismo primario della patologia amiloide4, 5. Oltre alla membrana plasmatica, possono essere colpiti anche organelli interni (cioè mitocondri).

È interessante notare che le evidenze emergenti suggeriscono che la disfunzione mitocondriale svolge un ruolo critico nella patogenesi dei disturbi neurodegenerativi, tra cui il morbo di Alzheimer e Parkinson6,7. In conformità con questo problema, numerose relazioni hanno indicato il legame e l'accumulo di proteine amiloidi di amiloide, di SOD1 mutanti amiloidi, di sinucleina, huntingtina e di SOD1 mutanti legati alla SLA alle proteine dei mitocondri8,9,10, 11.Si ritiene che il meccanismo della permeabilizzazione della membrana mediante aggregati amiloidi avvenga attraverso la formazione di canali discreti (pori) e/o attraverso un meccanismo non specifico simile al detergente5,12, 13. È interessante notare che la maggior parte di queste conclusioni si sono basate su relazioni che coinvolgono sistemi di modelli fosforidi, e gli studi che mirano direttamente agli eventi che si verificano nelle membrane biologiche sono rari. Chiaramente, questi bistrati lipidi artificiali non riflettono necessariamente le proprietà intrinseche delle membrane biologiche, comprese quelle dei mitocondri, che sono strutture eterogenee e composte da un'ampia varietà di fosfolipidi e proteine.

Nel presente studio, i mitocondri isolati dal cervello del ratto sono utilizzati come modello biologico in vitro per esaminare gli effetti distruttivi delle fibrille amiloidi derivanti da omologia strutturale significativa con insulina umana coinvolta nell'amiloidosi imdovelva-localizzata) e lisozima bianco d'uovo di gallina (HEWL; come proteina modello comune per lo studio dell'aggregazione di amiloide). Le interazioni e i possibili danni delle membrane mitocondriali indotte dalle fibrille amiloidi vengono quindi studiati osservando il rilascio di dihydrogenasi di malata malato mitocondriale (MDH) (situato nella matrice mitocondriale) e ossigeno reattivo mitocondriale (ROS).

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Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) di Scienze Mediche dell'Università di Teheran. Sono stati compiuti sforzi massimi per ridurre al minimo la sofferenza e gli effetti dannosi per i ratti affilando le lame della ghigliottina e applicando movimenti risoluti e rapidi della lama.

1. omogeneizzazione cerebrale e isolamento mitocondriale

NOTA: Tutti i reagenti per l'isolamento mitocondriale sono stati preparati secondo Sims e Anderson14.

  1. Preparazione di buffer per l'isolamento mitocondriale
    1. Preparare una soluzione Tris-HCl da 100 mM: pesare 0,605 g di Tris-HCl e dissoluzione in circa 40 mL di acqua deionizzata (DW) in un becher. Trasferire la soluzione in un flacone volumetrico da 50 ml e aumentare il volume finale a 50 mL aggiungendo DW.
    2. Preparare una soluzione EDTA da 10 mM: pesare 0,202 g di EDTA e scioglierla in circa 40 mL di DW in un becher. Trasferire la soluzione in un flacone volumetrico da 50 ml e aumentare il volume finale a 50 mL aggiungendo DW.
      NOTA: Entrambe le soluzioni possono essere conservate a 4 gradi centigradi per almeno 4 settimane.
    3. Preparare una soluzione stock Tris-HCl/EDTA/sucrose: aggiungere 30 mL di 100 mM Tris-HCl e 30 mL di 10 mM EDTA in un bicchiere. Pesare 32,86 g di saccarosio e aggiungerlo al becher mescolando con un agitatore magnetico. Quando il saccarosio viene disciolto, trasferire la soluzione in un pallone volumetrico da 100 ml e aumentare il volume finale a 100 mL aggiungendo DW.
      NOTA: Questa soluzione può essere conservata a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 giorni.
    4. Preparare un buffer di isolamento (IB): aggiungere 100 mL di tris-HCl/EDTA/sucrose a circa 150 mL di DW. Regolare il pH a 7,4 aggiungendo 0,1 M HCl. Aumentare il volume finale a 300 mL aggiungendo DW.
    5. Preparare il mezzo di pendenza a 15% (v/v) con IB aggiungendo 1,5 mL di mezzo gradiente di densità a 8,5 mL di IB freddo.
    6. Preparare 10 mg/mL di installazione di un albumina di siero bovino (BSA): pesare 20 mg di BSA senza acidi grassi e dissolverlo in circa 1,5 mL DW in una fiala da 2 mL. Aumentare il volume finale a 2 mL aggiungendo DW e conservarlo sul ghiaccio fino all'uso.
      NOTA: Preparare le soluzioni dai passi 1.1.4–1.1.6 il giorno dell'isolamento mitocondriale e conservarle sul ghiaccio fino all'uso.
  2. Isolamento del cervello di ratto
    NOTA: La decapitazione e la rimozione del cervello di ratti maschi (150-200 g) sono state eseguite secondo Sims e Anderson14.
    1. Mettere un becher da 30 mL in un secchio di ghiaccio e aggiungere 10 mL di IB freddo al becher.
    2. Decapitare il ratto con una piccola ghigliottina animale e rimuovere il cervello dal cranio entro 1 min di decapitazione per limitare il deterioramento delle proprietà mitocondriali.
    3. Trasferisci rapidamente il cervello al becher contenente IB freddo.
  3. Omogeneizzazione cerebrale e preparazione dei mitocondri
    NOTA: le frazioni mitocondriali sono state isolate in base al protocollo descritto da Sims e Anderson14, con alcune modifiche come descritto in precedenza15. È importante lavorare rapidamente e mantenere tutto sul ghiaccio per tutta la procedura.
    1. Lavare il tessuto 2x con 30 mL di IB, trasferire in un becher contenente Freddo IB, e tritare finemente il cervello con le forbici.
    2. Aggiungere 10 volumi di IB pre-raffreddato (circa 10 mL di IB per cervello di ratto).
    3. Trasferire la sospensione del tessuto a un omogeneizzatore Dounce freddo da 20 mL.
    4. Omogeneizzare i pezzi di tessuto utilizzando nove colpi su e giù con un pestello motorizzato.
      NOTA: Lasciare il composto sul ghiaccio per circa 30 s dopo ogni serie di tre tratti di omogeneizzazione per garantire che l'omogenea rimanga fredda.
    5. Trasferire l'omogeneità in un tubo di centrifuga di 10 mL pre-raffreddato e centrifugare a 1.300 x g e 4 gradi centigradi per 3 min.
    6. Decant accuratamente il supernatore e trasferirlo in un tubo di centrifuga pre-raffreddato da 10 mL e centrifugarlo a 21.000 g a 4 gradi centigradi per 10 min.
    7. Scartare il supernatante e risospendere il pellet in una soluzione media a gradiente di densità fredda del 15% (5 mL per ogni cervello) mescolando delicatamente la miscela con una pipetta.
    8. Centrifuga in un rotore ad angolo fisso a 30.700 x g a 4 min per 5 min utilizzando un'accelerazione lenta (45 s da 0 rpm a 500 rpm seguita da un'accelerazione normale) e decelerazione (senza freni). Questo dovrebbe produrre due bande distinte di materiale (Figura 1A, a sinistra).
    9. Utilizzando una pipetta Pasteur, rimuovere la banda affilata di materiale accumulato nella parte superiore del gradiente, che contiene per lo più mielina. Quindi, rimuovere la soluzione media di pendenza densità sovrastante il materiale (nella banda 2) il più possibile senza perdere la frazione mitocondriale arricchita nella banda 2.
      NOTA: La banda 2 contiene sia i mitocondri sinaptici che quelli non sinaptici.
    10. Aggiungere 8 mL di IB alla frazione mitocondriale mescolando delicatamente il composto con una pipetta.
    11. Centrifuga a 16.700 x g a 4 gradi centigradi per 10 min e rimuovere con cura il supernatante, lasciando indisturbato il pellet sciolto inferiore.
    12. Aggiungere 1 mL di 10 mg/mL di bilogio grasso senza acidi BSA al tubo di centrifuga mentre mescolando delicatamente la miscela con la punta di una pipetta. Aumentare il volume finale a 5 mL per cervello aggiungendo IB.
    13. Centrifuga a 6.900x g a 4 gradi centigradi per 10 min, che dovrebbe produrre un pellet fermo (Figura 1A, destra).
    14. Decant il supernatante e resospendere delicatamente il pellet mitocondriale in IB, in loro aliquota 0,5 mL, e conservare in azoto liquido fino all'uso.

2. Determinazione della concentrazione proteica

NOTA: La concentrazione proteica viene misurata utilizzando il metodo di Lowry etal.

  1. Preparazione di soluzioni per Lowry assay
    1. Preparare la soluzione A: pesare 0,4 g di NaOH e 2 g di Na2CO3 e sciogliere in 80 mL di DW, quindi trasferire la soluzione a un pallone volumetrico da 100 ml e aumentare il volume a 100 mL aggiungendo DW.
    2. Preparare la soluzione B: pesare 0,1 g di crostata di sodio di potassio e 0,05 g di CuSO4 e sciogliere in 8 mL di DW, quindi trasferire la soluzione in un flacone volumetrico da 10 ml e aumentare il volume a 10 mL aggiungendo DW.
      NOTA: Entrambe le soluzioni A e B possono rimanere stabili a 4 gradi centigradi per un massimo di 6 mesi.
    3. Preparare la soluzione C: Aggiungere 0,5 mL di soluzione folina a 7,5 mL di DW.
      NOTA: Preparare la soluzione C fresco e tenere lontano dalla luce fino all'uso.
    4. Preparare gli standard BSA con concentrazioni finali di 0, 20, 40, 60, 80, 100 e 120 g/mL combinando rispettivamente 0, 20, 40, 60, 80, 100 e 120 , luna di 1 mg/mL BSA, con abbastanza DW per fare 1000 L di soluzione.
  2. Misurazione della concentrazione proteica
    NOTA: per una maggiore precisione, eseguire questo passaggio in triplice copia.
    1. Aggiungete 50 l di soluzioni standard e l'omogenea mitocondriale ad ogni pozzo di una piastra da 96 pozze, seguita dall'aggiunta di 45 l di soluzione A. Quindi, incubare la piastra per 10 min in un bagno d'acqua tiepida impostato a 50 gradi centigradi.
    2. Aggiungere 5 - L della soluzione B e incubare la piastra per 10 min al buio a temperatura ambiente (RT).
    3. Aggiungere 150 l di soluzione C e incubare la piastra per 10 min in un bagno d'acqua tiepida impostato a 50 gradi centigradi.
    4. Caricare la piastra in un lettore di piastre e registrare i valori di assorbimento per gli standard e le sospensioni mitocondriali a 650 nm. Quindi, utilizzando una curva di calibrazione, calcolare il contenuto proteico dei mitocondri.

3. Determinazione dell'integrità della membrana mitocondriale

NOTA: L'integrità della membrana mitocondriale è confermata misurando l'attività di dehydrogenasi di malata (MDH) nei mitocondri isolati prima e dopo la rottura della membrana da parte del Triton X-100.

  1. Diluire l'omogeneità mitocondriale a 1 mg/mL con IB freddo e collocato in due tubi da 1,5 mL (tipicamente 195 -L di mitocondri per tubo).
  2. Aggiungere 5 -L di 20% (v/v) Triton X-100 (diluito con DW) a un tubo (come controllo positivo per la massima attività enzimatica) e 5 -L di DW a un altro tubo (per il controllo) seguito dalla miscelazione con un agitatore.
  3. Incubare i tubi per 10 min in un bagno d'acqua tiepida impostato a 30 gradi centigradi.
  4. I mitocondri di Pellet per centrifugazione dei tubi in un rotore ad angolo fisso a 16.000 x g e 4 gradi centigradi per 15 min.
  5. Raccogliere attentamente i supernatanti risultanti per aver analizzato l'attività di MDH mitocondriale utilizzando un saggio spettrofotometrico standard descritto nella sezione seguente.
  6. Calcolare l'integrità della membrana mitocondriale come segue:
    Equation 1

4. Determinazione dell'attività MDH

NOTA: L'attività MDH è stata misurata in modo spettrofotometrico come descritto da Sottocasa etal.

  1. Preparazione di soluzioni per il saggio di attività MDH
    1. Preparare una soluzione Tris-HCl da 50 mM (pH - 7,5): preparare una soluzione da 7,9 mg/mL in DW utilizzando Tris-HCl e regolare il pH a 7,5 a 25 gradi centigradi con 1,0 M NaOH.
    2. Preparare una soluzione oxaloacetate da 50 mM: preparare una soluzione da 6,6 mg/mL utilizzando l'oxaloacetate in Tris-HCl.
      NOTA: questa soluzione non è stabile una volta nella soluzione e deve essere preparata immediatamente prima dell'uso.
    3. Preparare una soluzione da 10 mM: preparare una soluzione da 7,81 mg/mL utilizzando il sistema di
  2. Determinazione dell'attività MDH
    NOTA: le concentrazioni finali di analisi in una miscela di reazione di 1,0 mL sono 50 mM Tris-HCl, 5 mM di oxaloacetate e 0,1 mM-NADH.
    1. Impostare lo spettrofotometro su 25 e 340 nm. Pipetta 890 - Buffer Tris-HCl L, 100 -L di soluzione oxaloacetate e 10 l di soluzione NADH per una cuvette vuota e 880L Buffer Tris-HCl, 100 - L di soluzione oxaloacetate, e 10 L di soluzione NADH in una cuvette campione.
    2. Incuba le cuvette nello spettrometro per 3-4 min e fai riferimento a i vuoti.
    3. Quindi aggiungere 10 l di omogeneami mitocondriale (1 mg/mL) alla cuvette del campione, mescolare immediatamente per inversione, e registrare le diminuzioni di assorbimento dovute all'ossidazione NADH a 340 nm per 1 min.

5. In vitro- sinucleina, insulina bovina, e formazione di fibrille HEWL

  1. Preparazione delle proteine
    1. - sinucleina:
      NOTA: L'espressione e la purificazione della sintebina ricombinante viene eseguita come descritto da Hoyer et al.18 con alcune modifiche, e la purezza della sintassi a synucleina è confermata da SDS-PAGE.
      1. Dialyze purificato durante la notte contro la salina con buffer fosfato (PBS).
      2. Determinare la concentrazione proteica utilizzando un coefficiente di estinzione di 5600 M-1 cm-1 a 275 nm19.
      3. Proteine aliquote in tubi da 1,5 mL e conservare a -80 gradi centigradi fino all'uso.
    2. Insulina bovina e HEWL:
      1. Fornire insulina bovina e HEWL.
      2. Sciogliere ogni proteina in un buffer di glicina da 50 mM (pH - 1,6; regolare il pH con HCl).
      3. Determinare la concentrazione di insulina bovina e HEWL utilizzando un coefficiente di estinzione di 1,0 e 2,63 per 1,0 mg/mL a 276 nm e 280 nm, rispettivamente20,21.
  2. Induzione fibrillazione amiloide
    1. Preparazione di soluzioni per la fibrillazione amiloide:
      1. Preparare il buffer t.t. tramite thioflavin T (ThT): pesare 0,3 g di NaH2PO4 e scioglierlo in 80 mL di DW, regolare il pH a 6,5 e aumentare il volume a 100 mL aggiungendo DW.
      2. Preparare la soluzione di stock ThT (5 mM): pesare 1,6 mg di ThT e scioglierlo in 1 mL di tampone ThT, passare attraverso una carta da filtro da 0,22 m e tenere lontano dalla luce a 4 gradi centigradi fino all'uso.
        NOTA: Questa soluzione può essere conservata a 4 gradi centigradi per un massimo di 4 settimane.
      3. Preparare la soluzione ThT (1 mM): aggiungere 200 -L di soluzione di supporto ThT (5 mM) a 800 -L di buffer ThT.
        NOTA: Questa soluzione può essere conservata a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 settimana.
    2. Formazione di fibrilla amiloidi in vitro:
      1. Aggiungere l'aliquota della soluzione proteica (200 m) e di 6 -L di soluzione ThT (1 mM) a 1,5 mL, seguita da agitazione.
      2. Incubare i tubi in un termomixer a 37 gradi sotto agitazione costante a 800 giri/min per 4 giorni.
      3. Prendere le aliquote (10 gradi centigradi) di campioni incubati dopo intervalli di tempo regolari e aggiungere 490 l di tampone ThT, mescolato accuratamente, e incubare per 5 min a RT.
      4. Impostare le larghezze di slit di eccitazione ed emissione rispettivamente su 5 e 10 nm e misurare la fluorescenza ThT per eccitazione a 440 nm ed emissione a 485 nm utilizzando uno spettrometro a fluorescenza.
    3. Formazione di fibrilla di insulina amiloide in vitro:
      1. Aggiungete 637 ldi di soluzione proteica (250 m) a tubo da 1,5 mL. Quindi, aggiungere 13 l di soluzione ThT (1 mM) seguita da agitazione.
      2. Aggiungete le aliquote (200) di soluzione proteica (250 m) contenenti 20 M ThT ad ogni pozzo di una piastra trasparente di 96 pozzetti e sigillate la piastra con nastro di saltellazione cristallino.
      3. Caricare la piastra in un lettore di piastra di fluorescenza e incubare a 57 gradi centigradi senza agitazione.
      4. Misurare la fluorescenza ThT a intervalli di 30 minuti, con eccitazione a 440 nm ed emissione a 485 nm, per 12 h.
        NOTA: Agitare la piastra per 5 s prima di ogni misurazione.
    4. Formazione di fibrilla amiloide IN vitro HEWL:
      1. Aggiungere le aliquote (200) della soluzione proteica )1 mM) contenenti 20 M ThT ad ogni pozzo di una piastra trasparente 96 e sigillare la piastra con nastro di salazione cristallino.
      2. Caricare la piastra in un lettore di piastra di fluorescenza e incubare a 57 gradi centigradi senza agitazione.
      3. Misurare la fluorescenza ThT a intervalli di 2 h, con eccitazione a 440 nm ed emissione a 485 nm, per 4 giorni.
        NOTA: per tutte e tre le proteine, la formazione di fibrille amiloide è confermata dalla microscopia a forza atomica (Figura 2B).

6. Trattamento dei mitocondri con fibrille amiloidi, analisi del rilascio MDH e misurazione ROS

  1. Incubazione di mitocondri isolati con fibrille amiloidi
    1. Accendere la centrifuga e il bagno d'acqua calda e impostare rispettivamente a 4 e 30 gradi centigradi.
    2. Utilizzando IF, diluire l'omogeneami a una concentrazione finale di 1 mg/mL.
    3. Preparare due serie di tubi da 1,5 mL contenenti omogenei mitocondriali (una per l'analisi del rilascio MDH e un'altra per la misurazione del ROS mitocondriale).
    4. Aggiungere le fibrille fresche o amiloidi di sintetali, insulina bovina o HEWL (a concentrazioni finali di 5 M, 10 M, 20 M e 25 M; utilizzare il buffer PBS o glicina come controllo) per mitocondriale homogenate (volume finale di 200 gradi) (cfr. tabella 1, tabella 2) , e Tabella 3) seguiti da una delicata smuovere delicatamente la soluzione con una pipetta.
      NOTA: per il test di rilascio MDH, utilizzare Triton X-100 (a una concentrazione finale dello 0,5% [v/v]) come controllo positivo per il massimo rilascio dell'enzima.
    5. Tubi di incubatura contenenti sospensioni mitocondriali per 30 min in bagno d'acqua calda impostato a 30 gradi centigradi.
    6. Misurare la versione MDH mitocondriale e il contenuto ROS come descritto nelle sezioni 6.2 e 6.3.
  2. Assaggio di assaggio di rilascio MDH mitocondriale
    1. Centrifugare gli omogenati mitocondriali incubati a 16.000 x g per 15 min, quindi raccogliere con attenzione i supernatanti risultanti per annotare l'attività di MDH mitocondriale come descritto nella sezione 4.
    2. Calcolare il rilascio di MDH come frazione dell'effetto massimo (Triton X-100) come segue:

Equation 1

  1. Misurazione ROS mitocondriale
    NOTA: Il contenuto di ROS mitocondriale è determinato con il precursore fluorogenico sensibile all'ossidazione dihydrodichlorocarboxyfluorescein diacetate (DCFDA)22.
    1. Preparare soluzioni per la misurazione mitocondriale del ROS. Preparare una soluzione DCFDA da 50 M sciogliendosi nel metanolo (preparare fresco) e una soluzione succinata da 200 mM sciogliendosi in DW.
    2. Pipetta 191 - L di omogmina mitocondriale incubato ad ogni pozzo di una piastra da 96 pozze e aggiungere 4 M DCFDA (1 m di concentrazione finale) e 5 di 200 mM di succinazione (5 mM di concentrazione finale).
    3. Incubare la piastra per 30 min in un bagno d'acqua tiepida impostato a 30 gradi centigradi mescolando delicatamente.
    4. Caricare la piastra in un lettore di piastra di fluorescenza e misurare l'intensità della fluorescenza, con eccitazione a 485 nm ed emissione a 530 nm.

7. Analisi statistica

  1. Eseguire tutti gli esperimenti almeno 2x o 3x con saggi triplicati e condurre test statistici appropriati. In questo caso, i risultati sono presentati come media : SD, e un test taccoppiato di Student è stato utilizzato per calcolare la significatività statistica. I valori P inferiori a 0,01 e 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi (Sezione < 0,05; .p < 0,01).

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Representative Results

Il protocollo descrive un modello per studiare le interazioni della fibrilla amiloide con i mitocondri cerebrali di ratto come modello biologico in vitro. Per la preparazione mitocondriale, 15% (v/v) grado di gradiente di densità è stato utilizzato per rimuovere la mielina come contaminazione principale del tessuto cerebrale14. Come mostrato nella Figura 1A, la centrifugazione a 30.700 x g ha prodotto due bande distinte di materiale, la mielina (comecomponente principale della banda 1) e la banda 2, che contiene la frazione mitocondriale arricchita.

Modificando il protocollo descritto da Sims e Anderson14, è stata preparata una sospensione mitocondriale contenente mitocondri sinaptici e non sinaptici. Per la preparazione di mitocondri puramente non sinaptici, Sims e Anderson hanno precedentemente dettagliato il protocollo14. Nella fase finale della centrifugazione,10 mg/mL senza acidi grassi BSA è stato aggiunto per ottenere un pellet mitocondriale aziendale (Figura 1A). L'integrità della membrana mitocondriale è stata valutata misurando l'attività MDH nei mitocondri isolati prima e dopo la interruzione della membrana e il rilascio di enzimi da parte del Triton X-100, come descritto nel protocollo.

In genere si è scoperto che i preparati mitocondriali erano circa il 93% intatti(Figura 1B). Un analisi della fluorescenza ThT è stato effettuato per monitorare la crescita delle fibrille amiloidi. Come mostrato nella Figura 2A, la curva per la fibrillazione amiloide di tre proteine ha mostrato un tipico modello sigmoidale, che è in linea con i modelli di polimerizzazione dipendenti dalla nucilizzazione di queste proteine come riportato in precedenza23,24 ,25. La più alta emissione di fluorescenza ThT per la sinucolo, l'insulina bovina e la HEWL è stata osservata dopo 96 h, 12 h e 96 h, rispettivamente, suggerendo la formazione di fibrille amiloidi (Figura 2A). Ciò è stato ulteriormente confermato dalla misurazione AFM.

Come illustrato nella Figura 2B, sono state osservate fibrille mature ben definite con la tipica morfologia amiloide per tre proteine incubate in condizioni amiloidogeniche. Sono state studiate le interazioni e i possibili danni e la permeabilizzazione delle membrane mitocondriali da fibrille amiloidi. Ciò è stato ottenuto monitorando il rilascio di MDH mitocondriale e la misurazione del ROS mitocondriale sull'aggiunta di fibrille amiloidi HEWL o a sospensioni mitocondriali e seguendo le procedure descritte. Gli esperimenti preliminari hanno mostrato che la presenza di ThT (fino a 3 M) non ha avuto alcun effetto sul rilascio di MDH e sul contenuto ROS mitocondriale (dati non mostrati).

Come mostrato nella Figura 3, è stato osservato un rilascio sostanziale di MDH con l'aggiunta di fibrille amiloidi z-synuclein ai mitocondri in modo dipendente dalla concentrazione. Sebbene sia stato rilevato un lieve rilascio con l'aggiunta di fibrille amiloidi insulina bovina, le fibrille HEWL sono risultate inefficaci (Figura 3). Sebbene non sia stato osservato alcun miglioramento significativo nel contenuto di ROS mitocondriale con l'aggiunta di insulina bovina o fibrille amiloidi HEWL, il trattamento con fibrille di modo dipendente dalla concentrazione (Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Isolamento mitocondriale e determinazione dell'integrità della membrana. (A) Sinistra: aspetto tipico di un tubo di centrifuga dopo aver riacceso il pellet a freddo 15% soluzione media grado densità dopo la centrifugazione. La mielina è la componente principale della banda 1, che si accumula nella parte superiore. La banda 2 contiene la frazione mitocondriale altamente arricchita. A destra: un pellet aziendale è stato prodotto dopo l'aggiunta di 10 mg/mL senza acido grasso BSA e centrifugazione a 6900 x g. (B) L'integrità della membrana mitocondriale è stata determinata misurando l'attività MDH in mitocondri isolati prima e dopo interruzione della membrana da parte del Triton X-100. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: fibrillazione amiloide di sicciani, insulina bovina e HEWL. (A) Cinetica della formazione di fibrille amiloide indicata dall'aumento dell'intensità di fluorescenza di ThT a 485 nm. (B) Vengono mostrate immagini AFM di tre proteine, che sono state incubate in condizioni amiloidogeniche per tempi regolari. Le barre della scala rappresentano 500 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Rilascio di MDH mitocondriale al momento dell'interazione con fibrilla monomero e amiloide di sivinucleina, insulina bovina e HEWL. Il rilascio è espresso come percentuale del massimo osservato dopo il trattamento con 0,5% (v/v) Triton X-100. Ogni valore rappresenta la media , SD (n : 3 ; p < 0,05, p < 0,01). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Contenuto di ROS mitocondriale al momento dell'interazione con fibrilla monomero e amiloide di sivinucleia, insulina bovina e HEWL. I dati sono espressi come percentuale di valori nei mitocondri di controllo. Ogni valore rappresenta la media ( n : 3 ; p < 0,05; .p < 0.01). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Omogenea mitocondriale (1 mg/mL) Momero di sinucleina (200 m) Fibrilla di sinucleina (200 M) Buffer di isolamento Pbs Triton x-100 20% (v/v)
controllo 175 lL 0 0 25 ll 0 0
Pbs 175 lL 0 0 0 25 ll 0
Momero 25 M 175 lL 25 ll 0 0 0 0
Fibrilla 5 M 175 lL 0 5 ll 20 l l 0 0
Fibril10 M 175 lL 0 10 ll 15 ll 0 0
Fibril lam 20 M 175 lL 0 20 l l 5 ll 0 0
Fibrilla 25 M 175 lL 0 25 ll 0 0 0
Controllo positivo 175 lL 0 0 20 l l 0 5 ll

Tabella 1: Trattamento dei mitocondri con varie concentrazioni di fibrille amiloidi di z-sinucleina.

  Omogenea mitocondriale (1 mg/mL) Momomero di insulina bovina (250 M) Fibrilla di insulina bovina (250 m) Buffer di isolamento Buffer di glicina Triton x-100 20% (v/v)
controllo 175 lL 0 0 25 ll 0 0
Buffer di glicina 175 lL 0 0 0 25 ll 0
Momero 25 M 175 lL 20 l l 0 5 ll 0 0
Fibrilla 5 M 175 lL 0 4 ll 21 ll 0 0
Fibril10 M 175 lL 0 8 ll 17 ll 0 0
Fibril lam 20 M 175 lL 0 16 ll 9 ll 0 0
Fibrilla 25 M 175 lL 0 20 l l 5 ll 0 0
Controllo positivo 175 lL 0 0 20 l l 0 5 ll

Tabella 2: Trattamento dei mitocondri con varie concentrazioni di insulina bovina fibrille amiloidi.

  Omogenea mitocondriale (1 mg/mL) Momero HEWL (1 mM) FIbrilla HEWL (1 mM) Buffer di isolamento Buffer di glicina Triton x-100 20% (v/v)
controllo 175 lL 0 0 25 ll 0 0
Buffer di glicina 175 lL 0 0 0 25 ll 0
Momero 25 M 175 lL 5 ll 0 20 l l 0 0
Fibrilla 5 M 175 lL 0 1 ll 24 ll 0 0
Fibril10 M 175 lL 0 2 ll 23 ll 0 0
Fibril lam 20 M 175 lL 0 4 ll 21 ll 0 0
Fibrilla 25 M 175 lL 0 5 ll 20 l l 0 0
Controllo positivo 175 lL 0 0 20 l l 0 5 ll

Tabella 3: Trattamento dei mitocondri con varie concentrazioni di fibrille amiloidi HEWL.

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Discussion

Una ricchezza di risultati sperimentali supporta l'ipotesi che la citotossicità degli aggregati fibrillare sia significativamente associata alla loro capacità di interagire con le membrane biologiche4,5. Tuttavia, la maggior parte dei dati si basa su bistrati lipidici artificiali che non riflettono necessariamente le proprietà intrinseche delle membrane biologiche, che sono strutture eterogenee con un'ampia varietà di fosfolipidi e proteine. Qui, usando i mitocondri cerebrali come membrana biologica in vitro, viene descritto un modello per lo studio del fibrillatore che aggrega la citotossicità a livello della membrana.

Durante l'esperimento, è importante lavorare rapidamente e mantenere tutto sul ghiaccio per preparare i mitocondri funzionalmente attivi con membrane intatte. Inoltre, la concentrazione mitocondriale (basata sulla misurazione totale delle proteine) è un fattore importante che influenza l'interazione tra membrana e amiloide fibrilla; pertanto, deve essere costante per tutto il protocollo. Nel presente studio, i preparati mitocondriali contenevano mitocondri sia sinaptici che non sinaptici. Per la preparazione mitocondriale pura non sinaptica, è necessario utilizzare il mezzo di gradiente di densità 40%, 23% e 15% (v/v), come descritto da Sims e Anderson14. Poiché i mitocondri sono organelli con una membrana ben caratterizzata, può servire come un sistema di modelli biologici estremamente utili negli studi molecolari relativi ai meccanismi di citotossicità citoloide a livello della membrana (in particolare malattie neurodegenerative). Questo protocollo consente di sforare le interazioni e l'estensione delle membrane mitocondriali permeabilizzazione esaminando il rilascio di varie molecole ed enzimi situati in diversi compartimenti (cioè quelli incorporati nelle membrane esterne e interne e quelli situati nello spazio intermembrano o matrice mitocondriale).

Dopo la conferma dell'integrità della membrana mitocondriale (Figura 1B) e la formazione di fibrillamento amiloide (Figura 2), l'interazione, il danno e la permeabilizzazione delle membrane mitocondriali sull'aggiunta di z-sinuclein, insulina bovina e HEWL fibrille amiloidi è stato studiato. I risultati hanno dimostrato chiare differenze nell'estensione della permeabilizzazione della membrana e del miglioramento mitocondriale del ROS indotto dalle fibrille amiloidi (Figura 3 e Figura 4), suggerendo variazioni nella capacità di varie fibrille amiloidi per interagire con e danneggiare le membrane mitocondriali.

Per l'avvio della permeabilizzazione della membrana, le fibrille amiloidi devono raggiungere la superficie mitocondriale. È stato dimostrato che l'associazione, la localizzazione e l'inserimento di proteine nelle membrane cariche dipendono dalle interazioni elettrostatiche non specifiche e dalla natura idrofobica delle proteine26,27,28. Per quanto riguarda la tossicità dell'amiloide, un corpo di prove in crescita implica fortemente un ruolo chiave dell'idrofobicità superficiale aggregata di proteine nella loro citotossicità29,30. Sebbene HEWL abbia una carica netta positiva su un'ampia gamma di livelli di pH e abbia un'elevata affinità per i fosfolipidi anionici e neutri31 (ad esempio, la membrana mitocondriale23),nessuna membrana mitocondriale permeabilizzazione e miglioramento del ROS sono stati osservati (Figura 3 e Figura 4). Una spiegazione di questa osservazione può essere correlata a una riduzione dell'idrofobicità superficiale delle fibrille HEWL a causa delle interazioni laterali fibrilla-fibrilla23,32, che porta alla perdita della capacità di causare danni alla membrana.

Per l'insulina bovina, nonostante una significativa esposizione delle regioni idrofobiche nel corso della formazione di fibrille22, è stato osservato un leggero rilascio di enzimi sull'aggiunta di 25 fibrille amiloidi (Figura 3) senza effetti significativi contenuto mitocondriale ROS (Figura 4). Poiché sia i mitocondri cerebrali che le fibrille dell'insulina bovina hanno un potenziale negativo di zeta sulle loro superfici24, si suggerisce che le forze repulsive tra la membrana mitocondriale e le fibrille amiloidi possono spiegare la loro incapacità di interagire efficacemente con e danneggiare le membrane mitocondriali24. I più alti incrementi di permeabilizzazione e ROS mitocondriale sono stati osservati dopo l'aggiunta di fibrille di sivinucleina (Figura 3 e Figura 4).

Questa osservazione può essere attribuita all'elevata capacità di sivinucleina di z-sinucleina per interagire con membrane biologiche che hanno superfici caricate negativamente33,34, come i mitocondri. A questo proposito, alcuni studi hanno dimostrato un legame specifico e l'importazione di sionucleina in mitocondri, dove diventano prevalentemente associati alla membrana interna35. È interessante notare che il Ghio et al. ha riferito che il legame, mediato dalla cardiolipina (un fosfolipide arricchito in modo univoco nella membrana mitocondriale interna), della sy-sinucleina può essere un meccanismo importante per l'associazione e l'interruzione delle membrane mitocondriali36.

È interessante notare che, ci sono prove evidenti per il legame e l'accumulo di vari peptidi amiloidogenici e proteine, tra cui amiloide - peptide, sinucleina, Huntingtina, e SLA-collegato SOD1 a mitocondri35,37, 38,39. Inoltre, studi precedenti hanno dimostrato che gli assiemi amiloigenici di amiloide15 e SOD 140 hanno la capacità di interagire e causare la permeabilizzazione della membrana mitocondriale. Secondo la letteratura, si suggerisce che le fibrille amiloidi siano troppo grandi per attraversare la membrana; pertanto, la dimensione media delle fibrille non dovrebbe essere un fattore nell'apparente mancanza di effetti indotti dall'insulina bovina e dalle fibrille amiloidi HEWL. Sebbene siano necessari ulteriori studi per chiarire i meccanismi dettagliati coinvolti, si propone che le caratteristiche biofisiche delle fibrille amiloidi (ad esempio, carica superficiale, idrofobicità e in possesso di una membrana mitocondriale specifica che punta alla sequenza) possono svolgere un ruolo importante nella loro capacità di interagire e danneggiare le membrane biologiche.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Consiglio di ricerca dell'Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), s.r.l.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma 35845
Ammonium sulfate Merck 1012171000
Black 96-well plate Corning
Black Clear-bottomed 96-well plate Corning
Bovine insulin Sigma I6634
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A2153
BSA essentially fatty acid-free Sigma A6003
Centrifuge Sigma
Crystal clear sealing tape Corning
CuSO4 Sigma 451657
Dialysis bag (cut off 2 KDa) Sigma D2272
Dounce homogenizer Potter Elvehjem
EDTA Sigma E9884
Fluorescence plate reader BioTek
Fluorescence spectrophotometer Cary Eclipse VARIAN
Folin Merck F9252
Glycine Sigma G7126
Guillotine Made in Iran
HCl Merck H1758
Hen Egg White Lysozyme (HEWL) Sigma L6876
Na2CO3 Sigma S7795
NaH2PO4 Sigma S7907
NaOH Merck S8045
Oxaloacetate Sigma O4126
Percoll GE Healthcare
Phosphate Buffer Saline (PBS) Sigma CS0030
PMSF Sigma P7626
Potassium sodium tartrate Sigma 217255
Quartz cuvette Sigma
Spectrophotometer analytik jena SPEKOL 2000 model
Succinate Sigma S2378
Sucrose Merck 1076871000
Thermomixer Eppendorph
Thioflavin T Sigma T3516
Tris-HCl Merck 1082191000
Triton X-100 Sigma T9284
Tryptone QUELAB
Water bath Memmert
Yeast Extract QUELAB
β-NADH Sigma N8129

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Zadali, R., Ghareghozloo, E. R., Ramezani, M., Hassani, V., Rafiei, Y., Chiyaneh, S. M., Meratan, A. A. Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils. J. Vis. Exp. (151), e59883, doi:10.3791/59883 (2019).

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