Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

حكام الحمض النووي المزدوج لدراسة آلية نقل ريبوسم مع قرار النيوكليوتيد واحد

Published: July 8, 2019 doi: 10.3791/59918
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Chemistry, University of Houston, 2Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

Summary

تم تطوير فحص حاكم الحمض النووي المزدوج لتحديد موقف mRNA أثناء نقل الريبوسوم، والذي يعتمد على قوى التفكك من الدوبلكس الحمض النووي-mRNA شكلت. مع قرار النيوكليوتيد واحد والقدرة على الوصول إلى طرفي mRNA، فإنه يمكن أن توفر رؤى ميكانيكية لنقل الريبوسوم والتحقيق في غيرها من الإزاحات حمض نووي.

Abstract

يشير النقل الريبوسوم إلى حركة ريبوسومال على الحمض النووي الريبي من قبل ثلاثة نيوكليوتيدات بالضبط (nt)، والتي هي الخطوة المركزية في تخليق البروتين. وللتحقيق في آليتها، هناك شرطان تقنيان أساسيان. الأول هو دقة واحدة nt التي يمكن حل النقل العادي من frameshifting، خلالها يتحرك ريبوسوم من قبل غير 3 nt. والثاني هو القدرة على التحقيق في كل من مدخل وخروج الجانبين من mRNA من أجل توضيح الصورة الكاملة للتبديل. نقوم بالإبلاغ عن فحص مسطرة الحمض النووي المزدوج الذي يقوم على قوى التفكك الحرجة للثنائيات الحمض النووي-mRNA، التي تم الحصول عليها عن طريق مطيافية مغنطة بقايا الناجمة عن القوة (FIRMS).  مع دقة قوة 2-4 pN، يكفي تحليل المسطرة المزدوجة للتمييز بين خطوات النقل المختلفة. من خلال تنفيذ رابط طويل على DNAs التحقيق، فإنها يمكن أن تصل إلى mRNA على الجانب الآخر من ريبوسم، بحيث يمكن تحديد موقف mRNA لكلا الجانبين. ولذلك، فإن اختبار المسطرة المزدوجة هو مناسبة بشكل فريد للتحقيق في نقل الريبوسوم، وحركة الحمض النووي بشكل عام. نعرض النتائج التمثيلية التي أشارت إلى مطابقة mRNA يحلق وحل النقل الطبيعي من frameshifting.

Introduction

الإزاحة الجزيئية الحيوية هي معلمة أساسية في دراسة آلية الوظائف البيولوجية ذات الصلة. مثال واحد معين هو نقل ريبوسوم1،2، خلالها يتحرك ريبوسوم من قبل بالضبط ثلاثة نيوكليوتيدات (NT) على الحمض النووي الريبي رسول (mRNA) عادة، وواحد، اثنين، أو أرقام أخرى من NT باستثناء ثلاثة في حالة تحول الإطار. لذلك، مطلوب نظام مسطرة جزيئية دقة واحدة nt التمييز بين أحجام خطوة مختلفة. والتحدي الأكبر هو التحقيق في حركة ريبوسوم على جانبي المدخل والخروج على حد سواء. وبعبارة أخرى، فقط مع نظام حاكم مزدوج سوف نكون قادرين على الكشف عما إذا كان يتم مترابطة بسلاسة من خلال الريبوسوم، أو هناك خطوات وسيطة فيها الجانبين لديهم أحجام خطوة مختلفة مما يؤدي إلى التشابك مع mRNA المتشابكة أو حلقات داخل الريبوسم.

وقد وضعت عدة طرق لمواجهة التحدي الأول المتمثل في حل خطوات مختلفة على جانب الخروج من الريبوسوم (نهاية 3' من mRNA). والقول المزدوج لوسيفيراز حل إطارات القراءة المختلفة عن طريق قياس نسب البروتينات المختلفة الناتجة3،4. هو فقط قابل للتطبيق ل ال 3' نهاية من ال [مرنا] ولذلك غير كاف أن يزوّد صورة كاملة من [ترنسّس]. قياس الطيف الكتلي يمكن تحليل شظايا الببتيد المختلفة نتيجة لإعادة ترتيب التعليمات البرمجية المقابلة5. ولكن لا يمكن تحديد عدد nt التحركات ريبوسيوم على mRNA. فحص الطباعة باصبع القدم هو طريقة شائعة أخرى تستخدم نسخة عكسية تستعد في نهاية 3'-القاصية لنسخ mRNA نحو ريبوسم6. ومع ذلك، فإنه لا ينطبق على نهاية 5 'من mRNA التي تدخل ريبوسوم. تقنيات أخرى, بما في ذلك نهج جزيءواحد وأساليب الفلورة 7, من الصعب تحقيق قرار واحد NT.

لقد قمنا بتطوير اختبار مسطرة الحمض النووي المزدوج الذي يمكن أن يحدد بشكل فريد كل من مواقع المدخل والخروج من mRNA المكشوفة في مجمعات ريبوسوم-ميرنا.  المسطرة [دنس] [دنا] [دنا] [أوليتغورس] أنّ يشكّل [دوبلكسس] من أرقام مؤكّدة من أزواج أساسيّة ([بب]) مع ال [مرنا] يكشف ب ال [ريبوسم], [رغردلوف] أيّ نهاية من ال [مرنا]. ثم تكشف أرقام BP على وجه التحديد موقف ريبوسم على mRNA أثناء النقل. يتم تحديد أرقام BP من الدوبلكس من قبل قوى التفكك الحرجة التي تم الحصول عليها من مطيافية المغناطيسية بقايا الناجمة عن القوة (FIRMS)8. مع عدم اليقين قوة 2-3 pN، والقوى الحرجة كافية لتقديم قرار واحد NT. من خلال تنفيذ جزيء الرابط على حكام الحمض النووي، يمكن التحقيق في الجانب الذي يعوقه بشكل معقم من mRNA من قبل ريبوسم. وبالتالي يمكن حل الإزاحات الريبوسومية المختلفة بدقة. لقد كشفنا بنجاح عن مطابقة حلقات فريدة من نوعها من mRNA المحاصرين بالمضادات الحيوية خلال نقل9، وحل إطارات القراءة المختلفة التي تتعايش على تسلسل mRNA زلق10. يصف هذا مادة التفاصيل من المزدوجة مسطرة فحص, أيّ يتضمّن تحضير من المجمعات [ريبوسم], سطح وظيفيّة من الشرائح زجاجيّة, يشلّ من المجمعات [ريبوسم] وهبهادهم مع مسطرة [دنا] مسمى مغناطيسيّا الجزيئات، والكشف المغناطيسي، وتحليل الطيف القوة من قبل FIRMS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد المجمعات الريبوسم

  1. جعل 1000 مل من TAM10 العازلة، والتي تتكون من 20 مل تريس-حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة7.5)، 10 مليون متر ملغ (OAc) 2، 30 مليون متر NH4كل، 70 مل ككل، 5 MM EDTA، 7 MM BME (2-mercaptoethanol)، و 0.05٪ توين20.
  2. إعداد الخلائط الخمسة المدرجة في الجدول1.
    ملاحظة: كان ريبوسم من سلالة MRE60011. EF-Tu: عامل استطالة الحرارية غير مستقرة. EF-Ts: استطالة عامل استقرار حراري. GTP: الغوانوسين ثلاثي الفوسفات. PEP: فوسفو (إينول) بيروفات.
  3. حضانة يمزج الخمسة بشكل منفصل في 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة قبل إجراء المجمعات ريبوسوم. إعداد المجمعات الريبوسمة الخمسة وفقا للجدول 2.
    ملاحظة: آخر: ما بعد النقل؛ قبل: ما قبل نقل.
  4. أضف كل مركب من المجمعات الريبوسومية الخمسة على وسادة سكروز 1.1 متر بشكل منفصل، مع نسبة الحجم 1:1. تنقية كل مع 450،000 × ز لمدة 2 ساعة في جهاز طرد مركزي فائق. استخدام pipet لإزالة supernatant واستعادة المجمعات ريبوسوم في -80 درجة مئوية بعد إعادة تعليق بيليه مع TAM10 العازلة.

2. إعداد الشرائح الزجاجية المغلفة البيوتين

  1. التنظيف الأولي للشرائح الزجاجية
    1. ضع 12 منزلقات زجاجية ذات أبعاد 60.0 × 4.0 × 0.3 مم3 (L × W × T) في طبق زجاجي قصير وواسع.
    2. ملء الطبق الزجاجي مع الأسيتون وsonicate لمدة 5 دقائق. ثم غسل الشرائح بالماء النقي 5 مرات وملء 3/4 من الطبق بالماء.
    3. إضافة 10 M KOH لملء الطبق وsonicate الشرائح الزجاجية لمدة 20 دقيقة.
    4. إضافة الإيثانول وsonicate لمدة 5 دقائق، صب الإيثانول ومن ثم تجفيفها بشكل منفصل في 300 درجة مئوية لمدة 3 ساعة.
  2. طلاء أمينوسيلين
    1. ضع الشرائح الـ 12 التي تم تنظيفها مرة أخرى في الطبق الزجاجي الذي يحتوي على الميثانول. تنظيف قارورة PEGylation مع الميثانول عن طريق sonicating لمدة 5 دقائق، ثم ملء مع 25 مل الميثانول، 1.25 مل المياه، 0.125 مل HAc، 0.25 مل 3-أمينوبروبيلتريثوكسيلسيلين (AMEO).
    2. استبدال الميثانول على الفور في الطبق الزجاجي مع الحل AMEO أعدت. الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    3. شطف الشرائح بالماء عدة مرات، ثم تجفيفها عن طريق تطهير النيتروجين. ضع الشرائح المجففة في أطباق زجاجية نظيفة.
  3. PEGlation
    1. إعداد NaHCO3 الحل (8.4 ملغ / مل) وPEGylation العازلة (37.5 ملغ PEG، 6 ملغ بغ biotinylated، 150 ~L NaHCO3 الحل). اخلطها جيداً عن طريق الدوران بسرعة 6000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة.
    2. ضع 25 ميكرولتر من حل PEG على كل شريحة. قم بتغطيتها مع الشريحة الأخرى في الأعلى. تأكد من عدم وجود فقاعات بين الشرائح اثنين.  ضع الشرائح في مربع تلميح pipet فارغ. تأكد من أن يتم تسوية مربع ووضعها في درج مظلم لحوالي 3 ح.
    3. شطف الشرائح بالماء وتجف مرة أخرى. تخزين الشرائح المجففة في درجة حرارة الغرفة تحت فراغ لمدة تصل إلى 2 أسابيع.

3. إعداد عينة قبل القياسات المغناطيسية والقوة

  1. آلة عينة من البلاستيك بشكل جيد مع أبعاد 4 × 3 × 2 مم3 (L × W × D). الغراء قطعة من الزجاج المغلفة البيوتين (ما يقرب من 5 ملم طويلة، وقطع من الشرائح طويلة 60 ملم أعدت في القسم 2) على السطح السفلي باستخدام الايبوكسي.
  2. إضافة 20 درجة مئوية من 0.25 ملغ / مل streptavidin حل مائي في العينة جيدا وحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة. ثم شطف العينة جيدا مرتين مع TAM10 العازلة.
  3. تعطيل المجمعات الريبوسم.
    1. بدون مضادات حيوية: استخدم ماصة لإزالة المخزن المؤقت من العينة بشكل جيد، ثم أضف 20 ميكرولتر من مركب ريبوسوسوم 0.1 درجة مئوية (MF-Pre أو MF-Post) إلى العينة بشكل جيد. سوف يربط مجمع ريبوسوم مع streptavidin على السطح عن طريق البيوتين 5'-نهاية على mRNA. الحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم شطف مرة واحدة مع TAM10 العازلة.
    2. للتجربة باستخدام كل من النيومايسين وحمض الفوسيديك: احتضان مجمع MF-Pre مع النيومايسين في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. حضانة EF-G مع حمض الفوسيديك في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. التركيزات هي كما يلي: 0.1 ميكرومتر مجمع ريبوسوم، 2 ميكرومتر EF-G، 4 م م م GTP، 4 MM PEP، 0.02 ملغ / مل بيروفات كيناز، 0.2 مليون متر نيوئيسين، و 0.25 م حمض الفوسيديك.
    3. إجراء تجارب المضادات الحيوية الأخرى بالمثل. التركيزات هي كما يلي: 0.2 m فيومايسين، 0.4 mM هيغرومايسين B، و 0.25 mحمض الفوسيديك.
    4. لدراسة frameshifting، كرر الخطوات المذكورة أعلاه لمجمعات MFNF-Pre وMFNF-Post التي تنطوي على عزر زلق U6A. استخدام المضادات الحيوية حمض الفوسيديك بالإضافة إلى النيوميسين، وحمض الفسيديك وحده، على التوالي.
  4. إزالة العازلة من العينة جيدا، ثم إضافة 20 درجة مئوية من 1 μtinylated biotinylated التحقيق حبلا الحمض النووي وحضانة في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. شطف شكل DNA-mRNA دوبلكس مرة واحدة مع TAM10 العازلة.
  5. إزالة المخزن المؤقت من العينة جيداً. ثم إضافة 20 درجة مئوية من 0.5 ملغ / مل streptavidin المغلفة الخرز المغناطيسي في العينة جيدا وحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
  6. إدراج بعناية العينة جيدا في حامل ووضعها في جهاز طرد مركزي. إزالة الجسيمات المغناطيسية الحرة من السطح عن طريق الطرد المركزي في 84 × ز لمدة 5 دقائق.

4. القياسات المغناطيسية والقوة

  1. تشغيل الليزر
    1. قم بتشغيل الليزر باستخدام المفتاح. ثم اضغط على زر الطاقة.
    2. ضبط حساسية قفل في مكبر للصوت 1 (LIA1) إلى 500 مل فولت وانتظر حوالي 2 ساعة للاحماء وتثبيت مقياس المغناطيسية الذرية.
  2. إعداد مقياس المغنطيسية الذرية
    1. تشغيل برنامج التحكم في الأداة وإعداد معلمات القياس. قد تختلف بعض المعلمات قليلاً في كل قياس.
      ملاحظة: يتكون مقياس المغنطيسية الذرية من الليزر (الموضح أعلاه)، ومكبر للصوت SR830 قفل في (يشار إليها باسم LIA1)، وSR530 قفل في مكبر للصوت (يشار إليها باسم LIA2)، DS345 (يشار إليها باسم FG1) وATF20B (يشار إليها باسم FG2) مولدات وظيفة، وعالية الدقة المحرك والكمبيوتر. وينبغي تشغيل كل هذه في هذه الخطوة من البروتوكول.
    2. إعداد وضع تحريك المحرك إلى الضوضاء والموضع الافتراضي إلى 0. اضغط على قفل على اللوحة الأمامية، وضبط حساسية LIA1 مرة أخرى إلى 200 مل فولت.
    3. ضبط التيار والجهد من الليزر والعثور على ذروة الرنين السليم ومستوى الإشارة إلى الضوضاء. اضغط على الاجتياح على اللوحة الأمامية. لاحظ أن نسبة السعة/العرض يجب أن تكون أعلى من 0.5 ويجب أن تكون قيمة المرحلة أقل من 5 درجة. إذا لم يكن الأمر كذلك، قم بإعادة القيام بخطوة الاجتياح.
    4. المكونات في إخراج LIA2 إلى ردود الفعل من الليزر لقفل تردده. يقيس هذا مكبر للصوت الدوران البصري لخلية السيزيوم المساعدة للحفاظ على تردد الليزر على الرنين12. تبقى الدولة حتى نهاية القياس.
    5. مولد وظيفة المكونات في FG2 لإدخال موجة مربعة (500 mVpp، 100 ميغاهيرتز) كإشارة مرجعية. الموجة المربعة يتوافق مع 100 pT ويستخدم لتحويل الإخراج الحالي من مكبر للصوت إلى إشارة مغناطيسية. افصل مولد الدالة.
    6. إعداد وضع نقل المحرك إلى وضع ثنائي الاتجاه والافتراضي إلى 260 ملم.
    7. تحقق من استقرار النظام بأكمله عن طريق قياس إشارات حامل العينة الفارغة مرتين. تقييم الاستقرار ومستوى الضوضاء بعد طرح آثار اثنين. يجب أن يكون مستوى الضوضاء النموذجية والتقلبات ± 2 pT في 30 مللي ثانية وقت التكامل.
  3. مغنطة العينة
    1. وضع بلطف العينة على محطة المغناطيسية والسماح لها البقاء لمدة 2 دقيقة.
      ملاحظة: محطة المغنطة يتكون من مغناطيس دائم (~ 0.5 T) وفاصل البلاستيك.
    2. وضع العينة مرة أخرى في حامل العينة. استخدام 335.4 × ز قوة الطرد المركزي لإزالة الجسيمات المغناطيسية غير ملزمة على وجه التحديد.
  4. القياسات المغناطيسية بعد تطبيق القوى
    1. استخدام ملاقط لتحميل العينة على المحرك. انقر فوق قفل على اللوحة الأمامية لتشغيل البرنامج. وفي الوقت نفسه، استخدم ملاقط لتحميل العينة الأخرى في حامل ووضعها في الطرد المركزي. لاحظ أن الجانب الزجاجي المطلي يجب أن يواجه مركز الطرد المركزي.
      ملاحظة: تُستخدم تقنية مطياف مغنطة البقايا الناتجة عن القوة (FIRMS)، التي تستخدم مقياس مغناطيسي ذري لقياس الإشارة المغناطيسية للعينة بعد تطبيق القوة الميكانيكية على التفاعلات الجزيئية في العينة. هنا، التفاعلات الجزيئية هي بين جزيئات مسطرة الحمض النووي وmRNA في مجمع ريبوسوم. يتم زيادة القوة خطوة بخطوة عن طريق زيادة سرعة الطرد المركزي. بعد تطبيق كل قوة، والمحرك يترجم العينة إلى جهاز الاستشعار الذري ومن ثم يتحرك مرة أخرى. وبالتالي، يتم الحصول على اثنين من ملامح المجال المغناطيسي، واحد خلال المسح الضوئي إلى الأمام والآخر خلال المسح الضوئي إلى الوراء13. نحن نستخدم هذا الأخير فقط لاستخراج ذروة الارتفاع بسبب أفضل نسبة إشارة إلى الضوضاء. يتم تحويل ارتفاع الذروة في التيار (nA) إلى سعة إشارة مغناطيسية (pT) استناداً إلى موجة المعايرة المربعة.
    2. كل قياس يستمر حوالي 5 دقائق. عندما يعود المحرك إلى 0، انقر فوق حفظ على اللوحة الأمامية. استخدام ملاقط بعناية لأخذ عينات من المحرك والطرد المركزي. استخدام السرعة الأولية المقابلة ل335.4 × ز (2000 دورة في الدقيقة، ثورة في الدقيقة للطرد المركزي المدرجة في جدولالمواد).
    3. تبادل العينات اثنين وتطبيق قوة أقوى عن طريق زيادة سرعة الطرد المركزي من قبل 100 دورة في الدقيقة أو حجم خطوة مماثلة. عملية بالتناوب لزيادة القوة تدريجيا؛ يتم الحصول على طيف قوة كاملة بعد 10-12 نقطة بيانات.
  5. الانتهاء من التجربة
    1. عند الانتهاء من جميع التجارب المخطط لها، قم بإيقاف تشغيل المعدات، وتسير في الترتيب المعاكس كما تم تشغيلها.
    2. إزالة العينات من حامل وتزج بها في الإيثانول لتنظيف واستخدامها في المستقبل. تنظيف حامل العينة مع الأسيتون في حالة تلوث الخرز المغناطيسي.
  6. تحليل البيانات
    1. افتح البرنامج النصي لتحليل بيثون وأدخل جميع البيانات التجريبية. انقر فوق تحميل مربع لإدخال الموجة المربعة كمرجع. ثم انقر فوق تحميل خط الأساس لإدخال إشارة مغناطيسية متبقية كخلفية.
    2. تعريف انخفاض الإشارة المغناطيسية الكلي كـ B0. تطبيع كل إشارة مغناطيسية انخفاض B إلى B0 والتعبير عنها كنسبة مئوية. رسم النسبة المئوية(B / B 0) مقابل قوة الطرد المركزي للحصول على الطيف FIRMS.
      ملاحظة: يتم حساب قوة الطرد المركزي F من الكتلة المزدهرة للحبات المغناطيسية م (4.6 × 10−15 كجم)، وسرعة الطرد المركزي ث، ونصف قطر الطرد المركزي ص (7.5 سم هنا) عبر المعادلة F = مث 2 r.دقة القوة النموذجية هي 2-4 pN ونطاق القوة هو 15-95 pN في هذا العمل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1 مخطط الكشف والصور الفوتوغرافية للمكونات الرئيسية. يتم الكشف المغناطيسي عن طريق مقياس مغناطيسي ذري باستخدام نظام المسح الضوئي (الشكل1A)13. يتم وضع العينة على قضيب شنت على محرك خطي. ينقل المحرك العينة إلى جهاز الاستشعار الذري داخل درع مغناطيسي، ثم يعود إلى الموقع الأصلي للتفريغ. يكشف مقياس المغنطيسية الذرية الإشارة المغناطيسية أثناء فحص العينة وينتج تتبع إشارة، مع الإشارة القصوى عندما تكون العينة هي الأقرب إلى جهاز الاستشعار. الشكل 1 B يظهر صورة الصك العام. وتظهر الأرقام 1C,D صور محطة الممغنطة والطرد المركزي المستخدم لتطبيق القوة، على التوالي.

يظهر مبدأ فحص مسطرة الحمض النووي المزدوج في الشكل 2. يتم تعطيل مجمع ريبوسوم على السطح عبر نهاية 5 'من mRNA. تم تصميم اثنين من حكام الحمض النووي للتحقيق في الموقف الدقيق للريبوسم، واحد لكل جانب من الحمض النووي الريبي. نظام الجمود الحالي يجعل الجانب 3 'يمكن الوصول إليها بسهولة لحكام الحمض النووي التحقيق. لذلك، يمكن أن تشكل oligomers الحمض النووي المترافقة مع الخرز المغناطيسي دوبلكس مع mRNA كشف. الجانب 5 '، ومع ذلك، يعوق sterically من قبل ريبوسوم والسطح. وبالتالي هناك حاجة إلى جزيء الرابط للحمض النووي للوصول إلى mRNA كشف على هذا الجانب. من خلال تغيير طول الرابط، قررنا أنه عندما يكون الرابط أطول من 50 T، يمكننا الكشف عن إشارة مغناطيسية قوية مما يشير إلى تشكيل ناجح من الحمض النووي-mRNA دوبلكس (الشكل2B). يتم تحقيق ارتباط قوة التفكك إلى طول مزدوج عن طريق تغيير عدد nt على الحمض النووي التي تكمل mRNA. الأرقام 2C،D تظهر الارتباط للجانبين 3 '- و 5 '- على التوالي. لأن الفرق القوة بين المزدوجة من أطوال متتالية هو عادة 12-20 pN ودقة القوة عادة 2-4 pN، ونحن بشكل روتيني تحقيق قرار واحد nt لطول الحمض النووي-mRNA دوبلكس استناداً إلى قوات التفكك الخاصة بهم.

ويعرض الشكل 3 نتائج النقل الطبيعي في غياب ووجود مختلف المضادات الحيوية. يتم النقل من MF-Pre إلى MF-Post (الشكل3A). وتشير المقدمة إلى أن MF-Pre تحمل fMet وMF-tRNAPhe الشاغرة في الموقعين P- وA على التوالي. ويحمل MF-Post TRNAfMet وMF-tRNAPhe في الموقعين E و P على التوالي، مع موقع A الشاغر. الشكل 3 B يظهر أنه بدون المضادات الحيوية، يتحرك ريبوسم بنسبة 3 nt على كلا الجانبين (تتحرك نحو 3'-نهاية). ويرجع ذلك إلى الأسباب التالية: '1' الدوبلكس الحمض النووي -mRNA في الجانب 5 'المعرض 12 bp و 15 bp قوات ملزمة في MF-Pre وMF-Post، على التوالي. '2' تعرض الدوبلكس في نهاية 3'نهاية تغيير عكسي من 15 إلى 12 نقطة أساس (الشكل3جيم). ومع ذلك، عندما يكون كل من حمض الفوسيديك والنيومايسين موجودين، تظهر أطياف القوة أن الريبوسوم يتحرك فقط بنسبة 1 nt في الجانب 5 'ولكن 2 NT في الجانب 3 ' (الشكل3D، E). وتشير هذه النتيجة إلى أن الريبوسوم المنقولة عن طريق آلية تدريجية، مما أدى إلى مطابقة mRNA يحلق التي لديها NT اضافية داخل ريبوسوم، والتي لم يتم الكشف عنها تجريبيا من قبل. وهذا يتسق مع المحاكاة النظرية المبلغ عنها14. بدلا من ذلك، قد تمتد ريبوسم لتغطية 28 NT من mRNA، بدلا من المعتاد 27 NT15. بعد غسل المضادات الحيوية ، يحدث النقل الطبيعي ، كما يتضح من 3 حركات NT من كل من الجانبين 5 و 3 ... (تتبع الأرجواني في الشكل 3D، E). لا تتشكل المطابقة الحلقي عند استخدام حمض الفوسيديك فقط. قوة أطياف متسقة مع حركة ريبوسوم من 3 nt في كلا الجانبين، على غرار الوضع لنقل العادي (الشكل3F،G). كما يكشف مسح الحاكم المزدوج أن فيومايسين تمنع تماما نقل، كما هو مبين من قبل حركة 0 NT على كلا الجانبين (الشكل 3H، I).

كما قمنا بالتحقيق فيما إذا كان يمكن لهذا التطابق الحلقي أن يتشكل على زخارف "-1" تحول الإطار. هنا، يتم النقل من مجمعات MFNF-Pre وMFNF-Post على عزر 'U6A'، الذي وجد أنه جزء من عزر "-1" في فيروس نقص المناعة البشرية16. ويبين الشكلان 4ألف وباء أنه في صندوق النقد الدولي، يتم تقصير الدوبلكس DNA-mRNA إما بمقدار 2 أو 3 nt في النهاية 3. يزيد طول الطباعة المزدوجة بنسبة 2 أو 3 nt في 5 - ينتهي. وتشير النتائج إلى التعايش بين كل من النقل الطبيعي و"-1" تحول الإطار، مع الأول يرتبط مع حركة 3-NT والثانية ترتبط مع حركة 2-nt. يمكن للحاكم المزدوج أن يحل بوضوح بين السكان. مع كل من النيوميسين وحمض الفوسيديك، نلاحظ أن التحركات ريبوسوم من قبل 2 NT في 3'-نهاية ولكن فقط 1 NT في نهاية 5 ، على التوالي (الشكل 4C ، D). ولذلك، فإن التطابق mRNA يحلق أيضا يحدث على تسلسل زلق. عندما يكون حمض الفوسيديك فقط موجود ًا لـ MFNF-Pre (الشكل4E,F)،تكون النتيجة هي نفسها بالنسبة لـ MFNF-Post في اللوحتين A وB (الآثار الزرقاء)، مما يشير إلى أن حمض الفسسيديك وحده لا يكفي لإيقاف النقل أو التحول الإطاري. ولذلك، فإنه يؤكد أن كل من حمض الفوسيديك والنيومايسين مطلوبة للتشريد غير المتكافئ لجانبي mRNA.

Figure 1
الشكل 1 أدوات ل [ستّس-بسد] مزدوجة [دنا] مسطرة فحص. (أ) التخطيطي للكشف المغناطيسي. 1: عينة وجبل لها؛ 2: السيارات؛ 3: جهاز استشعار الذرية والدرع المغناطيسي. (ب) صورة من مقياس المغناطيسية الذرية ونظام التعامل مع العينة. تشير الأرقام إلى المكونات المقابلة الفعلية الموضحة في المخطط. لاحظ الدرع المغناطيسي داخل صندوق من الورق المقوى لتحسين الاستقرار الحراري. (C) محطة المغنطة. (D) الطرد المركزي المستخدمة لتطبيق القوة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 تحليل مسطرة مزدوجة مع قرار واحد NT لدراسة نقل الريبوسم. (أ) مخطط من فحص الحاكم المزدوج، الذي تم تصميم اثنين من حكام الحمض النووي للتحقيق على التوالي 5 - و 3 - ينتهي. يشير الخط الأحمر إلى رابط polyT. (ب) تحسين طول الرابط للحاكم في. (C) نتائج الشركات لتحديد قوى التفكك من الدوبلكس بين المسطرة-Ins وmRNA.  (د) قوات فك الإنفصال من الدوبلكس بين المسطرة وmRNA. يتم تعريف شريط الخطأ على أنه النسبة بين ضوضاء الأداة وانخفاض الإشارة المغناطيسية الإجمالية (B0)،مع قيمة نموذجية تبلغ ± 3-5٪. تم إعادة إنتاج الشكل بإذن9. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 سبر خطوات نقل تحت تأثير المضادات الحيوية المختلفة. (أ) نظام التحقيق لمجمعات MF-Pre و MF-Post. يشير الدخول إلى الريبوسوسوم التخطيطي في مرحلة ما قبل ومشاركة، والتي تتوافق مع الأشكال البيضاوية الصلبة ومبطنة باندفاعة، على التوالي. (باء،جيم) نتائج الشركات مع عدم وجود المضادات الحيوية. (د، هـ) النتائج مع كل من حمض الفوسيديك والنيومايسين. (واو،ز) النتائج مع حمض الفوسيديك فقط. (ح،أولا) النتائج مع فيومايسين فقط. الألواح اليسرى: استخدام المسطرة في للتحقيق في الجانب 5 '؛ الألواح اليمنى: استخدام المسطرة خارج للتحقيق في الجانب 3'. يتم حساب أشرطة الخطأ بنفس الطريقة التي تم حسابها في الشكل السابق. تم إعادة إنتاج الشكل بإذن9. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 نتائج الشركات من استخدام الحكام المزدوجة للتحقيق frameshifting. (ألف،باء) MFNF-Pre و MFNF-Post بدون مضادات حيوية. (جيم،دال) النتائج مع كل من حمض الفوسيديك والنيومايسين. (E,F) النتائج مع حمض الفوسيديك فقط. اللوحات اليسرى: استخدام المسطرة في للتحقيق في الجانب 5. اللوحات اليمنى: استخدام المسطرة خارج للتحقيق في الجانب 3.. يتم حساب أشرطة الخطأ بنفس الطريقة التي تم حسابها في الشكل السابق. تم إعادة إنتاج الشكل بإذن9. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في فحص الحاكم المزدوج لدينا، والخرز المغناطيسي تلعب دورين أساسيين. أولا، أنها تعمل بمثابة محولات القوة لأن قوة الطرد المركزي يتناسب مع كتلتهم المزدهرة. ثانيا، الخرز هي ناقلات الإشارات التي تم الكشف عنها بواسطة مقياس مغناطيسي ذري، والذي هو حاليا جهاز الاستشعار المغناطيسي الأكثر دقة. الجمع بين التلاعب الميكانيكية والكشف المغناطيسي، وتقنية FIRMS قادرة على حل عدد كبير من التفاعلات الجزيئية على أساس قوى التفكك الحرجة، والتي هي أساس حكام الحمض النووي. يتم تحديد نوع من فحص المسطرة المزدوجة بشكل فريد للتحقيق في كلا الجانبين من mRNA أثناء النقل. لأنه هو النهج المادي الذي يعتمد فقط على تشكيل الدوبلكس، فإنه لا يقتصر من قبل الجانبين mRNA أو القيود البيولوجية الأخرى. هذا هو ميزة بالمقارنة مع التقنيات الأخرى التي تقوم على التفاعلات البيوكيميائية. لقد أظهرنا أنه باستخدام جزيء رابط طويل، يمكن للحكام الوصول إلى موقع الربط المستهدف لتحديد موقف mRNA. على وجه التحديد، لريبوسم، طول الرابط هو 50 T، والذي يتوافق مع 17 نانومتر في الطول. هذا الطول هو قريب جدا من حجم ريبوسم17. تركيزات المضادات الحيوية هي قيم نموذجية من الأدب. ومن الممكن أيضا استخدام أسلوبنا للكشف عن القيم بداية لوظائفهم.

هناك جانبان حاسمان للحصول على حدّق المسطرة المزدوجة. واحد هو سطح وظيفي دقيق للجمود الجزيئي وردود الفعل البيولوجية اللاحقة. وينبغي تنفيذ كل خطوة التحميل والغسيل مع الحد الأدنى من الاضطراب على السطح، بحيث الجزيئات المعطلة على السطح سوف تبقى سليمة. بالنسبة لعملية التهجين الحمض النووي-mRNA، من الضروري توفير وقت كاف لضمان إكمال العملية. كما ينصح باستخدام TAM10 العازلة مع 1 M NaCl إضافية للحفاظ على نظام المثلية. الجانب الحاسم الآخر هو مغنطة الخرز. منذ يتم استخدام الخرز المفرط، وهناك الكثير من الخرز الحرة غير المعطلة على السطح. لذلك، عند مغنطة العينة، يجب أن يقترب السطح المطلي وترك المغناطيس عموديا. أي تأرجح طفيف للعينة يمكن أن يسبب ضرر خدش على السطح.

لدينا اختبار حاكم الحمض النووي المزدوج هو حاليا الطريقة الوحيدة التي يمكن أن تحقق موضوعيا على حد سواء مدخل والخروج الجانبين من mRNA في المجمعات ريبوسوم مع قرار واحد NT. وقد تم الحصول على معلومات آلية جديدة فيما يتعلق بالنقل الريبوسم. وتنطبق هذه الطريقة عموما على الإزاحة الجزيئية للأحماض النووية، التي تواجه على نطاق واسع في البيولوجيا الجزيئية.

لتطوير والتطبيقات في المستقبل، وقد أظهرنا أن استخدام قوة الإشعاع الصوتي ة لتحل محل قوة الطرد المركزي سيزيد من تحسين قرار القوة، والوصول إلى نظام دون nt18. كما أننا نحقق في الكشف المتعدد المضاعفات باستخدام أجهزة قياس المغنطيسية الذرية لتحسين كفاءة الكشف. مع هذه التحسينات، ونحن نتوقع طريقتنا مفصلة في هذا العمل سوف تجد تطبيقات واسعة في البحوث البيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولم يبلغ المؤلفون عن أي تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgments

ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة (R01GM111452، Y.W.، S.X.). ي. و. تعترف بالدعم المقدم من مؤسسة ويلش (E-1721).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Styrene Strip City of Industry MS-861
Glass slides Evaporated Coatings 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3
Acetic acid Millipore Sigma A6283-500ML
3-Aminopropyltriethoxysilane UCT specialties 21400088
mPEG-SVA Laysan Bio 154-82
Biotin-PEG-SVA Laysan Bio 152-84
Sodium bicarbonate Millipore Sigma S5761-500G
Epoxy glue Devcon 31345
Streptavidin ThermoFisher 434301
Fusidic Acid Millipore Sigma F0756-1G
Neomycin Sulfate Millipore Sigma 1458009
Viomycin Sulfate Millipore Sigma 1715000
Hygromycin invitrogen 10687-010
Tris-HCl Millipore Sigma T5941-100G
Magnesium acetate Millipore Sigma M5661-50G
Ammonium chloride Millipore Sigma A9434-500G
Potassium chloride Millipore Sigma P9333-500G
EDTA GIBCO 774750
2-mercaptoethanol Millipore Sigma M6250-500ML
Tween20 Millipore Sigma P1379-250ML
GTP Millipore Sigma G8877-100MG
PEP Millipore Sigma P7127-100MG
Pyruvate Kinase Millipore Sigma P1506-5KU
Sucrose  Millipore Sigma S7903-5KG
Dynabeads M-280 Streptavidin ThermoFisher 11205D
mRNA Oligo Integrated DNA Technologies 133899727 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 157468630 3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 164845370 3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 157468628 3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 163472705 3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 138678130 3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 138678131 3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 138678132 3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 138678133 3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ 
Centrifuge Eppendorf 5427R
Micro Ultracentrifuge Hitachi CS150FNX
Vortex mixer VWR VM-3000
Lock-in Amplifier Stanford Research Systems SR530
Lock-in Amplifier Stanford Research Systems SR830
Laser Newport TLB-6918-D
Function generator Stanford Research Systems DS345
Photo detectors Thorlabs DET36A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).
  2. Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science. 345, 1188-1191 (2014).
  3. Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4, 479-486 (1998).
  4. Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).
  5. Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160, 870-881 (2015).
  6. Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).
  7. Chen, J., et al. Dynamic pathways of -1 translational frameshifting. Nature. 512, 328-332 (2014).
  8. De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA. Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).
  9. Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation. RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).
  10. Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).
  11. Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).
  12. Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance. Optics Letters. 35, 661-663 (2010).
  13. Yao, L., Xu, S. Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).
  14. Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics. Physical Biology. 5, 046005 (2008).
  15. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
  16. Jacks, T., et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. Nature. 331, 280-283 (1988).
  17. Schuwirth, B. S., et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution. Science. 310, 827-834 (2005).
  18. Jia, H., Wang, Y., Xu, S. Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps. Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 149، حكام الحمض النووي، نقل الريبوسوم، تحويل الإطار، مطياف القوة، وضع العلامات المغناطيسية، مطيافية مغنطة بقايا الناجمة عن القوة، حلقات MRNA، المضادات الحيوية، قياس المغنطيسية الذرية
حكام الحمض النووي المزدوج لدراسة آلية نقل ريبوسم مع قرار النيوكليوتيد واحد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA… More

Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution. J. Vis. Exp. (149), e59918, doi:10.3791/59918 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter