Summary
Двойной анализ линейки ДНК разработан для определения положения мРНК во время транслокации рибосомы, которая опирается на силы разобщенности сформированных дуплексов ДНК-мРНК. С разрешением одного нуклеотида и возможностью достижения обоих концов мРНК, он может обеспечить механистические идеи для транслокации рибосомы и зондирования других смещений нуклеиновой кислоты.
Abstract
Рибосома транслокации относится к рибосомным движением на мРНК ровно тремя нуклеотидами (nt), который является центральным шагом в синтезе белка. Для изучения его механизма существуют два основных технических требования. Во-первых, это одно-nt резолюции, которые могут решить нормальные транслокации от frameshifting, во время которого рибосома движется по мимо 3 nt. Во-вторых, возможность зондирования как входной, так и выездной стороны мРНК, с тем чтобы выяснить всю картину транслокации. Мы сообщаем о двойном анализе линейки ДНК, который основан на критических силах диссоциации дуплексов ДНК-мРНК, полученных с помощью принудительной спектроскопии намагниченности (FIRMS). С разрешением силы 2-4 pN, двойной ассеид правителя достаточно, чтобы различать различные шаги транслокации. Реализуя длинный связующий на зондирующих ДНА, они могут достичь мРНК на противоположной стороне рибосомы, так что позиция мРНК может быть определена для обеих сторон. Таким образом, двойной правитель асссе однозначно подходит для исследования рибосомы транслокации, и нуклеиновой кислоты движения в целом. Мы показываем репрезентативные результаты, которые указали циклический конформации мРНК и решить нормальную транслокацию от frameshifting.
Introduction
Биомолекулярное смещение является фундаментальным параметром при изучении механизма связанных с ними биологических функций. Одним из конкретных примеров является рибосома транслокации1,2, во время которого рибосома движется ровно на три нуклеотидов (nt) на посланника РНК (мРНК) обычно, и на один, два, или другие числа nt, за исключением трех в случае frameshifting. Таким образом, молекулярная система линейки одно-nt разрешение требуется, чтобы различать различные размеры шага. Более сложной задачей является зондирование рибосомного движения как на входной, так и с выездной сторон. Другими словами, только с двойной системой линейки мы сможем выявить, является ли мРНК плавно резьбой через рибосому, или есть промежуточные шаги, в которых обе стороны имеют различные размеры шагов, ведущих к изродоверженной или зацикленный мРНК конформации внутри Рибосома.
Было разработано несколько методов для решения первой задачи решения различных шагов на выходе из рибосомы (3' конец мРНК). Двойной анализ luciferase разрешает различные рамки чтения путем измерения соотношений в результате различных белков3,4. Она применима только для 3'конца мРНК и, следовательно, недостаточно, чтобы обеспечить полную картину транслокации. Масс-спектрометрия может анализировать различные фрагменты пептидав результате соответствующих перестановок кода 5. Но он не может точно определить, сколько NT рибосома движется на мРНК. Асса "Печатание на носе" является еще одним распространенным методом, который использует обратную транскрипцию, загрунтоваемую на 3'-дистальном конце, чтобы расшифровать мРНК к рибосоме6. Тем не менее, это не применимо для 5'конца мРНК, который входит в рибосому. Другие методы, в том числе одиночные подходы молекулы и методы флуоресценции7,трудно достичь одно-nt резолюции.
Мы разработали двойной анализ линейки ДНК, который может однозначно определять как входные, так и выходные позиции нераскрытой мРНК в комплексах рибосомы-мРНК. Правитель ДНК-олигомеры ДНК, которые образуют дуплексы определенного количества базовых пар (bp) с мРНК обнаружили рибосомы, независимо от того, какой конец мРНК. Bp номера затем точно выявить рибосомы позиции на мРНК во время транслокации. Номера bp дуплексов определяются их критическими силами диссоциации, полученными от принудительной спектроскопии намагниченной намагниченности (FIRMS)8. При неопределенности сил 2-3 pN, критические силы достаточны для того чтобы предложить разрешение одиночной. Путем снабжать молекулу связующего на правителях дна, стерически препятствовала стороне mRNA ribosome можно прощупать. Таким образом, различные рибосомные перемещения могут быть точно разрешены. Мы успешно показали уникальную зацикленный конформации мРНК в ловушке антибиотиков во время транслокации9, и решены различные рамки чтения, которые сосуществовали на скользкой последовательности мРНК10. В этой статье описаны детали двойного анализа правителя, которые включают в себя подготовку рибосомных комплексов, функционализацию поверхности стеклянных горок, иммобилизацию рибосомных комплексов и их гибридизацию с магнитно помеченным линейкой ДНК молекулы, магнитное обнаружение и анализ силового спектра FIRMS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка рибосомных комплексов
- Сделать 1000 мл буфера TAM10, который состоит из 20 мм трис-HCl (pH 7.5), 10 мМ Мг (OAc)2, 30 мМ NH4Cl, 70 мм KCl, 5 мМ EDTA, 7 мМ BME (2-mercaptoethanol), и 0,05% Tween20.
- Подготовка пяти смесей, перечисленных в таблице 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рибосома была от штамма MRE60011. EF-Tu: фактор удлинения термонестабилен. EF-Ts: термостабильный фактор удлинения. GTP: гуанозин трифосфат. ПЭП: фосфо (энол)пирувате. - Инкубировать пять смесей отдельно при 37 градусах по Цельсию в течение 25 минут, прежде чем сделать рибосомные комплексы. Подготовьте пять рибосомных комплексов в таблице 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сообщение: пост-транслокация; Предварительная: предварительная транслокация. - Добавьте каждый из пяти рибосомных комплексов на подушку сахарозы 1,1 М отдельно, с коэффициентом громкости 1:1. Очистите каждый с 450000 г на 2 ч в ультра-центрифуги. Используйте трубку, чтобы удалить супернатант и восстановить рибосомные комплексы при -80 градусов по Цельсию после повторного приостановки гранул с буфером TAM10.
2. Подготовка стеклянных горок с покрытием с покрытием из биотина
- Предварительная очистка стеклянных горок
- Поместите 12 стеклянных слайдов с размерами 60,0 и 4,0 и 0,3 мм3 (L и W и T) в короткой и широкой стеклянной тарелке.
- Заполните стеклянную тарелку ацетоном и соните в течение 5 мин. Затем промойте горки ультрачистой водой 5 раз и заполните 3/4 блюда водой.
- Добавьте 10 М КНХ, чтобы заполнить блюдо и снести стеклянные горки в течение 20 минут. Вымойте горки водой 5 раз.
- Добавить этанол и соникате в течение 5 мин, вылить этанол, а затем высушить их отдельно при 300 градусах По цельсию в течение 3 ч.
- Аминозилановое покрытие
- Поместите 12 очищенных слайдов обратно в стеклянную тарелку, содержащую метанол. Очистите пехламядную колбу с метанолом, сотониваясь на 5 мин, затем заполните ее метанолом 25 мл, 1,25 мл воды, 0,125 мл, 0,25 мл 3-аминопропилтриттриэтитоксилан (АМЕО).
- Немедленно замените метанол в стеклянной тарелке готовым раствором AMEO. Инкубировать при комнатной температуре 30 мин.
- Промыть горки водой несколько раз, затем высушить их с помощью продувки азотом. Поместите сушеные горки в чистую стеклянную посуду.
- PEGlation
- Приготовьте решение NaHCO3 (8,4 мг/мл) и буфер PEGylation (37,5 мг ПЭГ, 6 мг биотинилапотированный ПЭГ, 150 л наХКО3 раствора). Смешайте их хорошо, вращаясь при 6000 об/мин в течение 1 мин.
- Поместите 25 зл и раствора PEG на каждый слайд. Обложка его с другим слайдом на вершине. Убедитесь, что между двумя слайдами нет пузырьков. Поместите слайды в пустую коробку наконечника трубы. Убедитесь, что коробка выравнивается и поместите его в темный ящик около 3 ч.
- Промыть горки водой и снова высушить. Храните сухие горки при комнатной температуре под вакуумом до 2 недель.
3. Подготовка образцов до магнитных и силовых измерений
- Машина пластиковый образец хорошо с размерами 4 и 3 и 2 мм3 (L и W d). Клей кусок биотина покрытием стекла (примерно 5 мм в длину, вырезать из 60 мм длинные слайды, подготовленные в разделе 2) на нижней поверхности с использованием эпоксидной смолы.
- Добавьте в образец 20 qL 0,25 мг/мл вавкового раствора и инкубировать при комнатной температуре 40 мин. Затем промыть образец хорошо дважды с БУФЕРом TAM10.
- Обездвижить рибосомные комплексы.
- Без антибиотиков: Используйте пипетку, чтобы удалить буфер из образца хорошо, а затем добавить 20 зл и 0,1 мМ рибосомного комплекса (MF-Pre или MF-Post) в образец хорошо. Рибосомный комплекс свяжется со стрептавидином на поверхности через 5'конец биотина на мРНК. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 1 ч, а затем промыть один раз с буфером TAM10.
- Для эксперимента с использованием как неомицина, так и фузидиновой кислоты: инкубировать комплекс MF-Pre с неомицином при 37 градусах По цельсии в течение 10 мин; инкубировать EF-G с фузидиновой кислотой при 37 градусах По Цельсию в течение 20 мин. Концентрации следующие: 0,1 мкм рибосомный комплекс, 2 ММ EF-G, 4 мМ ГТП, 4 мм ПЭП, 0,02 мг/мл пирувате киназы, 0,2 мм неомицина и 0,25 мм фузидиновой кислоты.
- Провести другие эксперименты антибиотиков аналогичным образом. Концентрации следующие: 0,2 мМ виомицин, 0,4 мм гигромицин В и 0,25 мМ фузидиевой кислоты.
- Для исследования сдвига кадров повторите вышеперечисленные шаги для комплексов MFNF-Pre и MFNF-Post, включающих скользкий мотив U6A. Используйте антибиотики фузидиевой кислотой плюс неомициновой кислотой и только фузидиновой кислотой, соответственно.
- Удалить буфер из образца хорошо, а затем добавить 20 зЛ 1 ММ биоинтиниляции зондирования ДНК прядь и инкубировать при комнатной температуре на ночь. Промыть сформированный ДУплекс ДНК-мРНК один раз с буфером TAM10.
- Удалите буфер из образца хорошо. Затем добавьте 20 л 0,5 мг/мл стрептавидина покрытием магнитных бусин в образец хорошо и инкубировать при комнатной температуре в течение 2 ч.
- Аккуратно вставьте образец хорошо в держатель и поместите его в центрифугу. Удалите свободные магнитные частицы с поверхности путем центрифугации на 84 х г в течение 5 мин.
4. Магнитные и силовые измерения
- Включение лазера
- Включите лазер, используя ключ. Затем нажмите кнопку питания.
- Отрегулируйте чувствительность усилителя блокировки 1 (LIA1) до 500 мВ и ждите около 2 ч, чтобы прогреться и стабилизировать атомный магнитометр.
- Настройка атомного магнитометра
- Запустите программное обеспечение для управления прибором и навяжните параметры измерения. Некоторые параметры могут немного отличаться в каждом измерении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Атомный магнитометр состоит из лазера (описанного выше), усилителя блокировки SR830 (именуемого LIA1), усилителя блокировки SR530 (именуемого LIA2), DS345 (именуемого FG1) и ATF20B (именуемого FG2) генераторов, функционеров высокого разрешения, генераторов высокого разрешения, функциора с высоким разрешением двигатель и компьютер. Все это должно быть включено на этом этапе протокола. - Настройка режима перемещения двигателя в шум и положение по умолчанию до 0. Нажмите блокировку на передней панели, отрегулируйте чувствительность LIA1 до 200 мВ.
- Отрегулируйте ток и напряжение лазера и найдите правильный пик резонанса и уровень сигнала к шуму. Нажмите Sweep на передней панели. Обратите внимание, что соотношение амплитуды и ширины должно быть выше 0,5, а значение фазы должно быть меньше 5 градусов. Если нет, повторно сделать развертки шаг.
- Подключите выход LIA2 к обратной связи лазера, чтобы заблокировать его частоту. Этот усилитель измеряет оптическое вращение вспомогательной клетки цезия для поддержания лазерной частоты на резонанс12. Состояние остается до конца измерения.
- Генератор функций подключаемых внимателей FG2 для ввода квадратной волны (500 мВт, 100 мГц) в качестве эталонного сигнала. Квадратная волна соответствует 100 pT и используется для преобразования текущего вывода усилителя в магнитный сигнал. Отключите генератор функции.
- Настройка режима перемещения двигателя в двустороннее и по умолчанию положение до 260 мм. Проверьте состояние контроллера температуры, чтобы обеспечить правильную температуру (37 градусов по Цельсию) атомного датчика.
- Проверьте стабильность всей системы, измеряя сигналы пустого держателя образца дважды. Оцените стабильность и уровень шума после вычитания двух следов. Типичный уровень шума и колебания должны быть 2 pT на 30 мс время интеграции.
- Запустите программное обеспечение для управления прибором и навяжните параметры измерения. Некоторые параметры могут немного отличаться в каждом измерении.
- Намагничение образца
- Аккуратно поместите образец на станцию намагничивая и дайте ему остаться в течение 2 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Станция намагничивания состоит из постоянного магнита (0,5 Т) и пластикового прокладки. - Положите образец обратно в держатель образца. Используйте 335,4 г центробежной силы для удаления неспецифических связанных магнитных частиц.
- Аккуратно поместите образец на станцию намагничивая и дайте ему остаться в течение 2 минут.
- Магнитные измерения после применения сил
- Используйте пинцет для загрузки образца на двигатель. Нажмите Блокировка на передней панели для запуска программы. Между тем, используйте пинцет для загрузки другого образца в держатель и поместите его в центрифугу. Обратите внимание, что покрытая стеклянная сторона должна смотреть на центрифугу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используется техника принудительной спектроскопии намагнигения (FIRMS), которая использует атомный магнитометр для измерения магнитного сигнала образца после применения механической силы на молекулярных взаимодействиях в образце. Здесь молекулярные взаимодействия находятся между молекулами линейки ДНК и мРНК в рибосомном комплексе. Сила увеличивается поэтапно за счет увеличения центробежной скорости. После применения каждой силы, двигатель переводит образец на атомный датчик, а затем перемещается назад. Таким образом, два профиля магнитного поля получены, один во время сканирования вперед, а другой во время обратного сканирования13. Мы используем только последний для извлечения пиковой высоты из-за его лучшего соотношения сигнала к шуму. Пиковая высота в токе (nA) преобразуется в амплитуду магнитного сигнала (pT) на основе квадратной волны калибровки. - Каждое измерение длится около 5 мин. Когда двигатель возвращается к 0, нажмите Сохранить на передней панели. Тщательно используйте пинцет для брали пробы из мотора и центрифуги. Используйте начальную скорость, соответствующую 335,4 г (2000 об/мин, революция в минуту для центрифуги, перечисленных в таблицематериалов).
- Обмен двумя образцами и применять более сильную силу, увеличивая центробежную скорость на 100 об/мин или аналогичный размер шага. Процесс поочередно для постепенного увеличения силы; полный спектр силы получен после 10-12 точек данных.
- Используйте пинцет для загрузки образца на двигатель. Нажмите Блокировка на передней панели для запуска программы. Между тем, используйте пинцет для загрузки другого образца в держатель и поместите его в центрифугу. Обратите внимание, что покрытая стеклянная сторона должна смотреть на центрифугу.
- Завершение эксперимента
- Когда все запланированные эксперименты будут закончены, выключите оборудование, продолжая в обратном порядке, как это было включено.
- Удалите образцы из держателя и погрузите их в этанол для очистки и использования в будущем. Очистите держатель образца ацетоном в случае загрязнения магнитными бусинами.
- Анализ данных
- Откройте сценарий анализа Python и ввейте все экспериментальные данные. Нажмите квадрат загрузки для ввода квадратной волны в качестве ссылки. Затем нажмите Загрузить базовый для ввода остаточного магнитного сигнала в качестве фона.
- Определите общее снижение магнитного сигнала как B0. Нормализовать каждый магнитный сигнал уменьшить B до B0 и выразить его в процентах. Участок процент (B / B0) по сравнению с центробежной силой для получения спектра FIRMS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Центробежная сила F рассчитывается из плавучей массы магнитных бусин m (4,6 и 1015 кг), центробежной скорости w и радиуса центрифуги r (7,5 см здесь) через уравнение F и mw 2 r. Типичное разрешение силы 2-4 pN и диапазон силы 15-95 pN в этой работе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показана схема обнаружения и фотографии основных компонентов. Магнитное обнаружение достигается с помощью атомного магнитометра с помощью схемы сканирования(рисунок 1A)13. Образец помещается на стержень, установленный на линейном двигателе. Мотор транспортирует образец к атомному датчику внутри магнитного щита, а затем возвращается к исходному месту для разгрузки. Атомный магнитометр обнаруживает магнитный сигнал во время сканирования образца и производит сядь по сигналу, с максимальным сигналом, когда образец находится ближе всего к датчику. Рисунок 1 B показывает фотографию общего инструмента. На рисунках 1С, D показаны фотографии станции намагничивания и центрифуги, используемой для силового применения, соответственно.
Принцип двойного анализа ДНК показан на рисунке 2. Рибосомный комплекс обездвижен на поверхности через 5'конец мРНК. Два линейки ДНК предназначены для зондирования точного положения рибосомы, по одному для каждой стороны мРНК. Нынешняя схема иммобилизации делает сторону 3'легко доступной для зондирующих линейк ДНК. Поэтому ДНК-олигомеры, спряженные с магнитными бусинками, могут образовывать дуплексы с нераскрытой мРНК. 5' сторона, однако, стерически мешает рибосомы и поверхности. Молекула связующим звеном, таким образом, необходима для того, чтобы ДНК достигла нераскрытой мРНК на этой стороне. Изменяя длину связующих, мы определили, что, когда связующее больше, чем 50 T, мы можем обнаружить сильный магнитный сигнал, который указывает на успешное образование ДНК-мРНК дуплексы (Рисунок 2B). Корреляция силы диссоциации с дуплексной длиной достигается путем изменения количества NT на ДНК, которые дополняют мРНК. Цифры 2C,D показывают корреляцию для 3'- и 5'- сторон, соответственно. Поскольку разница сил между дуплексами последовательной длины, как правило, 12-20 pN и разрешение силы, как правило, 2-4 pN, мы обычно достижения одного nt резолюции для длины ДНК-мРНК дуплексов на основе их разъединения сил.
На рисунке 3 представлены результаты нормальной транслокации при отсутствии и наличии различных антибиотиков. Транслокация от MF-Pre до MF-Post(рисунок 3A). Врезка указывает на то, что MF-Pre несет вакантные tRNAfMet и MF-tRNAPhe на P- и A-сайтах, соответственно. MF-Post несет tRNAfMet и MF-tRNAPhe на E- и P-сайтах, соответственно, с вакантным a-site. Рисунок 3 B показывает, что без антибиотиков, рибосома движется на 3 nt с обеих сторон (движущийся к 3'-конец). Это объясняется следующими причинами: i) дуплексы ДНК-мРНК на 5'стороне выставки 12 bp и 15 bp связывающих сил в MF-Pre и MF-Post, соответственно. ii) Duplexes на 3' конце экспонат обратное изменение от 15 до 12 bp(рисунок 3C). Однако, когда оба фузидиевой кислоты и неомицина присутствуют, сила спектра показывают, что рибосома движется только на 1 nt на 5 'стороне, но 2 nt на 3' стороне (Рисунок 3D, E). Этот результат указывает на то, что рибосома трансумируется через пошаговый механизм, в результате чего зацикленный конформации мРНК, который имеет дополнительный nt внутри рибосомы, которая не была экспериментально выявлена ранее. Это согласуется с зарегистрированным теоретическим моделированием14. Кроме того, рибосома может быть растянута, чтобы покрыть 28 nt мРНК, вместо обычных 27 nt15. После смывания антибиотиков происходит нормальная транслокация, о чем свидетельствуют 3 nt движения как с 5,5-й, так и 3-й сторон (фиолетовый след на рисунке 3D,E). Циклкия конформация не образуется при использовании только фузидиевой кислоты. Спектрсилы согласуются с рибосомным движением 3 nt с обеих сторон, подобно ситуации для нормальной транслокации(рисунок 3F,G). Двойной правитель асссы также показывает, что виомицин полностью ингибирует транслокации, как показано на 0 nt движения с обеих сторон (Рисунок 3H, I).
Мы также исследовали, может ли эта зацикленная конформация образовываться на мотивах смены рамы "-1". Здесь перевод из mFNF-Pre и MFNF-Post комплексов происходит по мотивам "U6A", который, как было установлено, является частью "-1" кадр смещения мотив в ВИЧ16. Цифры 4A,B показывают, что в MFNF-Post дуплекс ДНК-мРНК сокращается либо на 2, либо на 3 nt в конце 3'; длина дуплекса увеличивается на 2 или 3 nt на 5-концах. Результаты свидетельствуют о сосуществовании как нормальной транслокации, так и "-1" смещения рамы, при этом первое соотносится с трех-нт-движением, а второе коррелирует с 2-nt-движением. Двойной контроль правителя способен четко решить двух популяций. С обеих неомицин и фузидиевой кислоты, мы наблюдаем, что рибосома движется на 2 nt на 3'-конец, но только 1 nt на 5 "конец, соответственно (Рисунок 4C,D). Таким образом, циклм мРНК конформации также происходит на скользкой последовательности. Когда только фузидиевая кислота присутствует для MFNF-Pre(Рисунок 4E,F), результат такой же, как для MFNF-Post в панелях A и B (синие следы), указывая, что фузидиевой кислоты только не достаточно, чтобы приостановить транслокации или кадрового смещения. Таким образом, он подтверждает, что для неравного перемещения по обеим сторонам мРНК необходимы как фузидиевая кислота, так и неомицин.
Рисунок 1 : Инструменты для ЛАРАД на основе двойного анализа ДНК. (A) Схема магнитного обнаружения. 1: образец и его крепление; 2: двигатель; 3: атомный датчик и магнитный щит. (B) Фото атомного магнитометра и системы обработки образцов. Цифры указывают на фактические соответствующие компоненты, показанные в схеме. Обратите внимание, магнитный щит находится внутри картонной коробки для улучшения тепловой устойчивости. (C) Станция намагничивая. (D) Центрифуга используется для силового применения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Двойной правитель асссес с одно-nt резолюции для изучения рибосомы транслокации. (A) Схема двойного исследования правителя, в котором два дипнатива предназначены для, соответственно, зондирования 5 " и 3 " - заканчивается. Красная линия указывает на полит-связующее звено. (B) Оптимизация длины связующим звеном для Ruler-In. (C) FIRMS результаты для определения сил диссоциации дуплексов между Ruler-Ins и mRNA. (D) Силы диссоциации дуплексов между Правителями-Аутами и мРНК. Бар ошибки определяется как соотношение между шумом прибораи общим уменьшением магнитного сигнала (B 0), с типичным значением 3-5%. Рисунок был воспроизведен с разрешения9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Прощупывание этапов транслокации под воздействием различных антибиотиков. (A) Схема зондирования для комплексов MF-Pre и MF-Post. Вперечня указывает на схематические рибосомы в Pre и Post, которые соответствуют твердым и тире подкладкой овалов, соответственно. (B, C) РЕЗУЛЬТАТы FIRMS без антибиотиков. (D, E) Результаты как с фузидиновой кислотой, так и с неомицином. (F, G) Результаты только с фузидиевой кислотой. (H, I) Результаты только с виомицином. Левые панели: использование Ruler-In для зондирования 5' стороны; правые панели: использование Ruler-Out для зондирования стороны 3'. Бары ошибок вычисляются так же, как и в предыдущем рисунке. Рисунок был воспроизведен с разрешения9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : FIRMS результаты использования двойных линейк для зондирования кадра. (A, B) MFNF-Pre и MFNF-Post без антибиотиков. (C, D) Результаты как с фузидиновой кислотой, так и с неомицином. (E, F) Результаты только с фузидиновой кислотой. Левые панели: с помощью Ruler-In для зондирования стороны 5 '; правые панели: с помощью Ruler-Out для зондирования стороны 3 ". Бары ошибок вычисляются так же, как и в предыдущем рисунке. Рисунок был воспроизведен с разрешения9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В нашем двойном правителе, магнитные бусы играют две основные роли. Во-первых, они служат в качестве форс-мажоров, поскольку центробежная сила пропорциональна их плавучей массе. Во-вторых, бусы являются сигнальными носителями, обнаруженными атомным магнитометром, который в настоящее время является наиболее точным магнитным датчиком. Сочетая механические манипуляции и магнитное обнаружение, техника FIRMS способна разрешить большое количество молекулярных взаимодействий на основе их критических сил диссоциации, которая является основой линейки ДНК. Двойной правитель асссе однозначно подходит для зондирования обеих сторон мРНК во время транслокации. Потому что это физический подход, который опирается только на формирование дуплексов, он не ограничивается мРНК сторон или других биологических ограничений. Это преимущество по сравнению с другими методами, которые основаны на биохимических реакциях. Мы показали, что с помощью длинной молекулы связующего, линейки могут достичь целевого места связывания, чтобы определить положение мРНК. В частности, для рибосомы длина связующее звено составляет 50 Т, что соответствует 17 нм в длину. Эта длина очень близка к размеру рибосомы17. Концентрации антибиотиков являются типичными значениями из литературы. Кроме того, можно использовать наш метод, чтобы выявить значения начала для своих функций.
Есть два критических аспекта для двойного правителя асссе. Одним из них является деликатная функционализованная поверхность для молекулярной иммобилизации и последующих биологических реакций. Каждая нагрузка и стиральная ступень должна выполняться с минимальным возмущением поверхности, так что молекулы, обездвиженные на поверхности, останутся нетронутыми. Для процесса гибридизации ДНК-мРНК необходимо достаточно времени для обеспечения завершения процесса. Также рекомендуется использовать буфер TAM10 с дополнительным 1 M NaCl для поддержания гомеостатичной системы. Другим важным аспектом является намагничение бисера. Так как используются чрезмерные бусы, есть много свободных бусин, не обездвижемых на поверхности. Поэтому при намагничивании образца поверхность с покрытием должна приближаться и покидать магнит вертикально. Любое незначительное колебание образца может привести к царапинам на поверхности.
Наш двойной ДНК правитель анализа в настоящее время является единственным методом, который может объективно зондировать как вход и выход стороны мРНК в рибосомных комплексов с одно-nt резолюции. Получена новая механистическая информация о транслокации рибосомы. Этот метод, как правило, применим для молекулярного смещения нуклеиевых кислот, что широко встречается в молекулярной биологии.
Для будущих разработок и применения, мы показали, что использование акустической радиационной силы для замены центробежной силы будет способствовать дальнейшему улучшению разрешения силы, достигнув суб-nt режима18. Мы также изучаем мультиплексное обнаружение с использованием атомных магнитометров для повышения эффективности обнаружения. С этими улучшениями, мы ожидаем, что наш метод подробно в этой работе найдет широкое применение в биологических исследованиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
О каком-либо потенциальном конфликте интересов авторы не сообщали.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается Национальными институтами здравоохранения США (R01GM111452, YW, S.X.). Y. W. признает поддержку фонда Уэлча (E-1721).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
References
- Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).
- Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science. 345, 1188-1191 (2014).
- Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4, 479-486 (1998).
- Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).
- Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160, 870-881 (2015).
- Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).
- Chen, J., et al. Dynamic pathways of -1 translational frameshifting. Nature. 512, 328-332 (2014).
- De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA. Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation. RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).
- Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).
- Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance. Optics Letters. 35, 661-663 (2010).
- Yao, L., Xu, S. Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).
- Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics. Physical Biology. 5, 046005 (2008).
- Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
- Jacks, T., et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. Nature. 331, 280-283 (1988).
- Schuwirth, B. S., et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution. Science. 310, 827-834 (2005).
- Jia, H., Wang, Y., Xu, S. Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps. Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).
