Summary
El ensayo de la regla de ADN dual se desarrolla para determinar la posición del ARNm durante la translocación ribosoma, que se basa en las fuerzas de disociación de los dúplex de ARN-ADN formados. Con la resolución de un solo nucleótido y la capacidad de llegar a ambos extremos del ARNm, puede proporcionar información mecanicista para la translocación ribosoma y sondear otros desplazamientos de ácido nucleico.
Abstract
La translocación ribosoma se refiere al movimiento ribosomal en el ARNm por exactamente tres nucleótidos (nt), que es el paso central en la síntesis de proteínas. Para investigar su mecanismo, existen dos requisitos técnicos esenciales. En primer lugar es la resolución de un solo nt que puede resolver la translocación normal del cambio de cuadro, durante el cual el ribosoma se mueve por otros 3 nt. El segundo es la capacidad de sondear los lados de entrada y salida del ARNm con el fin de dilucidar toda la imagen de la translocación. Informamos del ensayo de la regla de ADN dual que se basa en las fuerzas de disociación críticas de los dúplex de ARN-ADN, obtenidos por espectroscopia de magnetización remanente inducida por la fuerza (FIRMS). Con una resolución de fuerza de 2-4 pN, el ensayo de regla dual es suficiente para distinguir diferentes pasos de translocación. Mediante la implementación de un vinculador largo en los DN de sondeo, pueden alcanzar el ARNm en el lado opuesto del ribosoma, de modo que la posición del ARNm se puede determinar para ambos lados. Por lo tanto, el ensayo de doble regla es especialmente adecuado para investigar la translocación ribosoma, y el movimiento del ácido nucleico en general. Mostramos resultados representativos que indicaban una conformación de ARNm en bucle y resolvieron la translocación normal del cambio de trama.
Introduction
El desplazamiento biomolecular es un parámetro fundamental en el estudio del mecanismo de las funciones biológicas relacionadas. Un ejemplo particular es la translocación ribosoma1,2, durante la cual el ribosoma se mueve exactamente por tres nucleótidos (nt) en el ARN mensajero (arNM) normalmente, y por uno, dos u otros números de nt excepto tres en el caso de cambio de marco. Por lo tanto, se requiere una resolución de un solo nt del sistema de reglas moleculares para distinguir los diferentes tamaños de paso. Un desafío mayor es sondear el movimiento ribosoma tanto en el lado de entrada como en el de salida. En otras palabras, sólo con un sistema de doble regla podremos revelar si el ARNm se enhebra suavemente a través del ribosoma, o hay pasos intermedios en los que los dos lados tienen diferentes tamaños de paso que conducen a una conformación de ARNm torcido o en bucle dentro de la Ribosoma.
Se han desarrollado varios métodos para abordar el primer reto de resolver diferentes pasos en el lado de salida del ribosoma (el extremo de 3' del ARNm). El ensayo de doble luciferasa resuelve los diferentes marcos de lectura midiendo las proporciones de las diferentes proteínas resultantes3,4. Sólo es aplicable para el extremo de 3' del ARNm y, por lo tanto, insuficiente para proporcionar una imagen completa de la translocación. La espectrometría de masas puede analizar los diferentes fragmentos de péptidos como consecuencia de los correspondientes reordenamientos de código5. Pero no puede identificar cuántos movimientos ribosomas en el ARNm. El ensayo de impresión de dedos de los dedos es otro método común que utiliza una transcriptasa inversa cebada en el extremo distal de 3'para transcribir el ARNm hacia el ribosoma6. Sin embargo, no es aplicable para el extremo de 5' de ARNm que está entrando en el ribosoma. Otras técnicas, incluyendo enfoques de molécula única y métodos de fluorescencia7, son difíciles de lograr una resolución de un solo nt.
Hemos desarrollado el ensayo de la regla de ADN dual que puede determinar de manera única las posiciones de entrada y salida del ARNm descubierto en los complejos ribosoma-mRNA. Los DN a la regla son oligómeros de ADN que forman dúplex de ciertos números de pares de bases (bp) con el ARNm descubierto por el ribosoma, independientemente de qué extremo del ARNm. Los números bp revelan con precisión la posición ribosoma en el ARNm durante la translocación. Los números bp de los dúplex están determinados por sus fuerzas de disociación crítica obtenidas a partir de la espectroscopia de magnetización remanente inducida por la fuerza (FIRMS)8. Con una incertidumbre de fuerza de 2-3 pN, las fuerzas críticas son suficientes para ofrecer una resolución de un solo nt. Mediante la implementación de una molécula de vinculador en las reglas de ADN, el lado esterrámico obstaculizado del ARNm por el ribosoma puede ser sondeado. Por lo tanto, se pueden resolver con precisión los diferentes desplazamientos ribosomales. Hemos revelado con éxito una conformación única en bucle de ARNm atrapado por antibióticos durante la translocación9,y resuelto diferentes marcos de lectura que coexistían en una secuencia de ARNm resbaladizo10. Este artículo describe los detalles del ensayo de doble regla, que incluyen la preparación de los complejos ribosomas, la funcionalización superficial de los portaobjetos de vidrio, la inmovilización de los complejos ribosomas y su hibridación con la regla de ADN etiquetada magnéticamente moléculas, detección magnética y análisis del espectro de fuerza por PARTE de FIRMS.
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Protocol
1. Preparación de los complejos ribosomas
- Hacer 1.000 mL de tam10 buffer, que consiste en 20 mM tris-HCl (pH 7.5), 10 mM Mg (OAc)2, 30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 5 mM EDTA, 7 mM BME (2-mercaptoetanol), y 0.05% Tween20.
- Preparar las cinco mezclas enumeradas en la Tabla1.
NOTA: El ribosoma era de la cepa MRE60011. EF-Tu: factor de alargamiento termo inestable. EF-Ts: factor de alargamiento termo estable. GTP: trifosfato de guanosina. PEP: fosfo(enol)piruvato. - Incubar las cinco mezclas por separado a 37 oC durante 25 minutos antes de hacer los complejos ribosomas. Preparar los cinco complejos ribosomas según la Tabla2.
NOTA: Publicar: post-translocación; Pre: pre-translocación. - Añade cada uno de los cinco complejos ribosomas a un cojín de sacarosa de 1,1 M por separado, con una relación de volumen 1:1. Purificar cada uno con 450.000 g durante 2 h en una ultracentrífuga. Utilice un pipeta para eliminar el sobrenadante y restaurar los complejos ribosomas a -80 oC después de la resuspensión del pellet con tam10 buffer.
2. Preparación de portaobjetos de vidrio recubiertos de biotina
- Limpieza preliminar de los portaobjetos de vidrio
- Coloque 12 diapositivas de vidrio con dimensiones de 60,0 x 4,0 x 0,3 mm3 (L a W a T) en un plato de vidrio corto y ancho.
- Llene el plato de vidrio con acetona y sonicar durante 5 min. Luego lave los portaobjetos con agua ultrapura 5 veces y llene 3/4 del plato con agua.
- Añadir 10 M KOH para llenar el plato y sonicar los portaobjetos de vidrio durante 20 minutos.
- Añadir etanol y sonicar durante 5 min, verter el etanol y luego secarlos por separado a 300 oC durante 3 h.
- Recubrimiento aminosilano
- Coloque los 12 portaobjetos limpios de nuevo en el plato de vidrio que contiene metanol. Limpie un matraz de PEGylation con metanol sonicando durante 5 min, luego llénelo con 25 mL de metanol, 1,25 ml de agua, 0,125 ml de HAc, 0,25 ml 3-aminopropyltriethoxysilane (AMEO).
- Sustituya inmediatamente el metanol en la placa de vidrio por la solución AMEO preparada. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
- Enjuague los portaobjetos con agua varias veces y luego séquelos con purga de nitrógeno. Coloque los toboganes secos en platos de vidrio limpios.
- PEGlation
- Preparar la solución de NaHCO3 (8,4 mg/ml) y el tampón de PEGylation (37,5 mg de PEG, 6 mg de PEG biotinilado, solución de NaHCO3 de 150 l). Mezclar bien girando a 6.000 rpm durante 1 min.
- Coloque 25 sl de solución peg en cada diapositiva. Cúbralo con la otra diapositiva en la parte superior. Asegúrese de que no haya burbujas entre las dos diapositivas. Coloque las diapositivas en una caja de punta de pipeta vacía. Asegúrese de que la caja esté nivelada y colóquela en un cajón oscuro durante aproximadamente 3 h.
- Enjuague los portaobjetos con agua y vuelva a secarlos. Almacene los portaobjetos secos a temperatura ambiente al vacío durante un máximo de 2 semanas.
3. Preparación de muestras antes de las mediciones magnéticas y de fuerza
- Mecanizar un pozo de muestra de plástico con dimensiones de 4 x 3 x 2 mm3 (L a An. a D). Pegue una pieza de vidrio recubierto de biotina (aproximadamente 5 mm de largo, cortada de los portaobjetos de 60 mm de largo preparados en la sección 2) en la superficie inferior utilizando epoxi.
- Añadir 20 ml de solución acuosa de estreptavidina de 0,25 mg/ml en el pozo de la muestra e incubar a temperatura ambiente durante 40 min. A continuación, enjuague bien la muestra dos veces con tam10 buffer.
- Inmovilizar los complejos ribosomas.
- Sin antibióticos: Utilice una pipeta para extraer el tampón de la muestra bien, luego agregue 20 s de complejo ribosoma de 0,1 m (MF-Pre o MF-Post) en el pozo de la muestra. El complejo ribosoma se unirá con la estreptavidina en la superficie a través de la biotina de 5'-end en el ARNm. Incubar a 37oC durante 1 h y luego enjuagar una vez con TAM10 buffer.
- Para el experimento con neomicina y ácido fusídico: incubar el complejo MF-Pre con neomicina a 37 oC durante 10 min; incubar EF-G con ácido fusídico a 37oC durante 20 min. Las concentraciones son las siguientes: complejo ribosoma de 0,1 M, EF-G de 2 M, GTP de 4 mM, PEP de 4 mM, 0,02 mg/ml de piruvato quinuvato, 0,2 mM de neomicina y ácido fusídico de 0,25 mM.
- Llevar a cabo los otros experimentos de antibióticos de manera similar. Las concentraciones son las siguientes: 0,2 mM de viomicina, 0,4 mM de higromicina B y 0,25 mM de ácido fusídico.
- Para el estudio de cambio de cuadro, repita los pasos anteriores para los complejos MFNF-Pre y MFNF-Post que implican el motivo resbaladizo U6A. Use antibióticos ácido fusídico más neomicina, y ácido fusídico solo, respectivamente.
- Retire el tampón de la muestra bien, luego agregue 20 s l de cadena de ADN de sondeo biotintilado de 1 M e incubar a temperatura ambiente durante la noche. Enjuague el dúplex DNA-mRNA formado una vez con tam tampón TAM10.
- Quite el búfer del pozo de muestra. A continuación, añadir 20 sL de 0,5 mg/ml de perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina en el pozo de la muestra e incubar a temperatura ambiente durante 2 horas.
- Inserte cuidadosamente la muestra bien en un soporte y colóquela en una centrífuga. Retire las partículas magnéticas libres de la superficie centrifugando a 84 x g durante 5 min.
4. Mediciones magnéticas y de fuerza
- Encendiendo el láser
- Encienda el láser con la tecla . A continuación, pulse el botón de encendido.
- Ajuste la sensibilidad del amplificador de bloqueo 1 (LIA1) a 500 mV y espere aproximadamente 2 h para calentar y estabilizar el magnetómetro atómico.
- Configuración del magnetómetro atómico
- Ejecute el software de control de instrumentos y configure los parámetros de medición. Algunos parámetros pueden variar ligeramente en cada medición.
NOTA: El magnetómetro atómico comprende un láser (descrito anteriormente), un amplificador de bloqueo SR830 (denominado LIA1), un amplificador de bloqueo SR530 (denominado LIA2), DS345 (denominado FG1) y ATF20B (denominado FG2), un generador de funciones de alta resolución motor y una computadora. Todos estos deben estar activados en este paso del protocolo. - Configure el modo de movimiento del motor en Ruido y la posición predeterminada en 0. Pulse Bloquear en el panel frontal, ajuste la sensibilidad de LIA1 a 200 mV.
- Ajuste la corriente y el voltaje del láser y encuentre el pico de resonancia adecuado y el nivel de señal a ruido. Pulse Barrido en el panel frontal. Tenga en cuenta que la relación amplitud/ancho debe estar por encima de 0,5 y el valor de fase debe ser inferior a 5 grados. Si no es así, vuelva a realizar el paso de barrido.
- Plug-in de la salida de LIA2 a la retroalimentación del láser para bloquear su frecuencia. Este amplificador mide la rotación óptica de una célula de cesio auxiliar para mantener la frecuencia del láser en la resonancia12. El estado permanece hasta el final de la medición.
- Generador de función plug-in FG2 para introducir una onda cuadrada (500 mVpp, 100 mHz) como señal de referencia. La onda cuadrada corresponde a 100 pT y se utiliza para convertir la salida de corriente del amplificador en señal magnética. Desconecte el generador de funciones.
- Configure el modo de movimiento del motor en posición bidireccional y predeterminada a 260 mm. Compruebe el estado del controlador de temperatura para garantizar la temperatura adecuada (37 oC) del sensor atómico.
- Compruebe la estabilidad de todo el sistema midiendo las señales del portamuestras vacío dos veces. Evalúe la estabilidad y el nivel de ruido después de restar las dos trazas. El nivel de ruido y la fluctuación típicos deben ser de 2 pT a 30 ms de tiempo de integración.
- Ejecute el software de control de instrumentos y configure los parámetros de medición. Algunos parámetros pueden variar ligeramente en cada medición.
- Magnetización de la muestra
- Coloque suavemente la muestra en la estación de magnetización y déjela permanecer durante 2 minutos.
NOTA: La estación de magnetización consta de un imán permanente (0,5 T) y un espaciador de plástico. - Vuelva a colocar la muestra en el soporte de la muestra. Utilice una fuerza centrífuga de 335,4 g para eliminar las partículas magnéticas no específicamente unidas.
- Coloque suavemente la muestra en la estación de magnetización y déjela permanecer durante 2 minutos.
- Mediciones magnéticas después de aplicar fuerzas
- Utilice pinzas para cargar la muestra en el motor. Haga clic en Bloquear en el panel frontal para ejecutar el programa. Mientras tanto, utilice pinzas para cargar la otra muestra en el soporte y colóquela en la centrífuga. Tenga en cuenta que el lado de vidrio recubierto debe estar frente al centro de la centrífuga.
NOTA: Se utiliza la técnica de espectroscopia de magnetización remanente inducida por la fuerza (FIRMS), que utiliza un magnetómetro atómico para medir la señal magnética de la muestra después de aplicar la fuerza mecánica en las interacciones moleculares en la muestra. Aquí, las interacciones moleculares son entre las moléculas de la regla de ADN y el ARNm en el complejo ribosoma. La fuerza se incrementa escalonadamente aumentando la velocidad centrífuga. Después de aplicar cada fuerza, el motor traduce la muestra al sensor atómico y luego se mueve hacia atrás. Por lo tanto, se obtienen dos perfiles de campo magnético, uno durante la exploración hacia adelante y el otro durante la exploración hacia atrás13. Sólo usamos este último para extraer la altura máxima debido a su mejor relación señal-ruido. La altura máxima en corriente (nA) se convierte en amplitud de señal magnética (pT) basada en la onda cuadrada de calibración. - Cada medición dura aproximadamente 5 min. Cuando el motor vuelva a 0, haga clic en Guardar en el panel frontal. Utilice cuidadosamente pinzas para tomar muestras del motor y la centrífuga. Utilice la velocidad inicial correspondiente a 335,4 g (2000 rpm, revolución por minuto para la centrífuga enumerada en la Tabla de Materiales).
- Intercambie las dos muestras y aplique una fuerza más fuerte aumentando la velocidad centrífuga en 100 rpm o un tamaño de paso similar. Proceso alternativamente para aumentar gradualmente la fuerza; se obtiene un espectro de fuerza completo después de 10-12 puntos de datos.
- Utilice pinzas para cargar la muestra en el motor. Haga clic en Bloquear en el panel frontal para ejecutar el programa. Mientras tanto, utilice pinzas para cargar la otra muestra en el soporte y colóquela en la centrífuga. Tenga en cuenta que el lado de vidrio recubierto debe estar frente al centro de la centrífuga.
- Terminar el experimento
- Cuando se hayan terminado todos los experimentos planificados, apague el equipo, procediendo en el orden opuesto a medida que se activaba.
- Retire las muestras del soporte y sumerjalas en etanol para su limpieza y uso futuro. Limpie el soporte de la muestra con acetona en caso de contaminación por perlas magnéticas.
- Análisis de datos
- Abra la secuencia de comandos de análisis de Python e introduzca todos los datos experimentales. Haga clic en Cargar cuadrado para introducir la onda cuadrada como referencia. A continuación, haga clic en Cargar línea base para introducir la señal magnética residual como fondo.
- Defina la disminución general de la señal magnética como B0. Normalizar cada señal magnética disminuir B a B0 y expresarla como un porcentaje. Trazar el porcentaje (B/B0)frente a la fuerza centrífuga para obtener el espectro FIRMS.
NOTA: La fuerza centrífuga F se calcula a partir de la masa boyante de las perlas magnéticas m (4,6 x 10x 15 kg), la velocidad centrífuga w, y el radio de la centrífuga r (7,5 cm aquí) a través de la ecuación F a mw 2 r. La resolución de fuerza típica es de 2-4 pN y el rango de fuerza es de 15-95 pN en este trabajo.
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Representative Results
La Figura 1 muestra el esquema de detección y las fotografías de los componentes principales. La detección magnética se logra mediante un magnetómetro atómico utilizando el esquema de escaneo (Figura1A)13. La muestra se coloca en una varilla montada en un motor lineal. El motor transporta la muestra al sensor atómico dentro de un escudo magnético, y luego de vuelta al sitio original para su descarga. El magnetómetro atómico detecta la señal magnética durante el escaneo de la muestra y produjo una traza de señal, con la señal máxima cuando la muestra es la más cercana al sensor. Figura 1 B muestra la foto del instrumento general. Las figuras 1C,D muestran las fotos de la estación de magnetización y la centrífuga utilizada para la aplicación de la fuerza, respectivamente.
El principio del ensayo de la regla de ADN dual se muestra en la Figura2. El complejo ribosoma se inmoviliza en la superficie a través del extremo de 5' del ARNm. Dos reglas de ADN están diseñadas para sondear la posición exacta del ribosoma, una para cada lado del ARNm. El esquema de inmovilización actual hace que el lado de 3' sea fácilmente accesible para las reglas de ADN sondeando. Por lo tanto, los oligómeros de ADN conjugados con cuentas magnéticas pueden formar dúplex con el ARNm descubierto. El lado 5', sin embargo, es obstaculizado sterically por el ribosoma y la superficie. Por lo tanto, se necesita una molécula de eslador para que el ADN llegue al ARNm descubierto en este lado. Al variar la longitud del vinculador, hemos determinado que cuando el vinculador es mayor que 50 T, podemos detectar una señal magnética fuerte que indica la formación exitosa de dúplex DE ARN-ADN (Figura2B). La correlación de la fuerza de disociación con la longitud dúplex se logra variando el número de nt en el ADN que son complementarios al ARNm. Las figuras 2C,D muestran la correlación para los lados 3'- y 5'-, respectivamente. Debido a que la diferencia de fuerza entre dúplex de longitudes consecutivas es típicamente 12-20 pN y la resolución de fuerza es típicamente 2-4 pN, logramos rutinariamente una resolución de un solo nt para la longitud de los dúplex DE ARN-ADN basado en sus fuerzas de disociación.
La Figura 3 presenta los resultados de la translocación normal en ausencia y presencia de diversos antibióticos. La translocación es de MF-Pre a MF-Post (Figura3A). El retén indica que MF-Pre lleva vacantet tRNAfMet y MF-tRNAPhe en los sitios P y A, respectivamente. MF-Post lleva tRNAfMet y MF-tRNAPhe en los sitios E y P, respectivamente, con un sitio A vacante. Figura 3 B muestra que sin antibióticos, el ribosoma se mueve en 3 nt en ambos lados (moviéndose hacia el extremo 3'). Esto se debe a las siguientes razones: (i) Los dúplex DNA-mRNA en el lado 5' exhiben fuerzas de unión de 12 bp y 15 bp en MF-Pre y MF-Post, respectivamente. (ii) Los dúplex en el extremo 3' presentan un cambio invertido de 15 a 12 bp (Figura3C). Sin embargo, cuando tanto el ácido fusídico como la neomicina están presentes, los espectros de fuerza muestran que el ribosoma se mueve sólo por 1 nt en el lado 5' pero 2 nt en el lado 3' (Figura3D,E). Este resultado indica que el ribosoma se transubicó a través de un mecanismo escalonado, resultando una conformación de ARNm en bucle que tiene un nt extra dentro del ribosoma, que no se ha revelado experimentalmente antes. Esto es coherente con la simulación teórica reportada14. Alternativamente, el ribosoma puede ser estirado para cubrir 28 n de ARNm, en lugar de los 27 nt15habituales. Después de lavar los antibióticos, se produce una translocación normal, como lo demuestran los movimientos de 3 nt de los lados de 5o y 3o (traza púrpura en la Figura 3D,E). La conformación en bucle no se forma cuando sólo se utiliza ácido fusídico. Los espectros de fuerza son consistentes con el movimiento ribosoma de 3 nt en ambos lados, similar a la situación de translocación normal (Figura3F, G). El ensayo de doble regla también revela que la viomicina inhibió completamente la translocación, como lo muestra el movimiento de 0 nt en ambos lados (Figura3H,I).
También hemos investigado si esta conformación en bucle se puede formar en motivos de cambio de marco "-1". Aquí, la translocación de los complejos MFNF-Pre y MFNF-Post tiene lugar en el motivo 'U6A', que se ha encontrado que forma parte del motivo de cambio de marco '-1' en HIV16. Las figuras 4A,B muestran que en el MFNF-Post, el dúplex ADN-mRNA es acortado por 2 o 3 nt en el 3'-end; la longitud dúplex aumenta en 2 o 3 nt en los extremos de 5o. Los resultados sugieren la coexistencia tanto de la translocación normal como del cambio de cuadro "-1", con el primero correlacionando con el movimiento de 3 nt y el segundo correlacionando con el movimiento de 2 ntes. El ensayo de doble regla es capaz de resolver claramente las dos poblaciones. Con la neomicina y el ácido fusídico, observamos que el ribosoma se mueve por 2 nt en el 3'-end pero sólo 1 nt en el extremo 5, respectivamente (Figura4C,D). Por lo tanto, la conformación de ARNm en bucle también tiene lugar en la secuencia resbaladiza. Cuando sólo el ácido fusídico está presente para el MFNF-Pre (Figura4E,F),el resultado es el mismo que el de MFNF-Post en los paneles A y B (trazas azules), lo que indica que el ácido fusídico por sí solo no es suficiente para pausar la translocación o el cambio de trama. Por lo tanto, confirma que tanto el ácido fusídico como la neomicina son necesarios para los desplazamientos desiguales para los dos lados del ARNm.
Figura 1 : Instrumentos para el ensayo de la regla de ADN dual basado en FIRMS. (A) Esquema de la detección magnética. 1: muestra y su montaje; 2: motor; 3: sensor atómico y escudo magnético. (B) Foto del magnetómetro atómico y del sistema de manipulación de muestras. Los números indican los componentes reales correspondientes que se muestran en el esquema. Tenga en cuenta que el escudo magnético está dentro de la caja de cartón para mejorar la estabilidad térmica. (C) Estación de magnetización. (D) Centrífuga utilizada para la aplicación de la fuerza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Ensayo de regla doble con resolución de un solo nt para el estudio de la translocación ribosoma. (A) Esquema del ensayo de doble regla, en el que dos reglas de ADN están diseñadas para sondear respectivamente los extremos de 5o y 3o. La línea roja indica el vinculador polyT. (B) Optimización de la longitud del vinculador para los resultados de La regla-in. (C) FIRMS para determinar las fuerzas de disociación de los dúplex entre Ruler-Ins y mRNA. (D) Fuerzas de disociación de los dúplex entre Ruler-Outs y mRNA. La barra de error se define como la relación entre el ruido del instrumento y la disminución general de la señal magnética (B0), con un valor típico de 3-5%. Figura se ha reproducido con permiso9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Sondear pasos de translocación bajo la influencia de varios antibióticos. (A) Esquema de sondeo para los complejos MF-Pre y MF-Post. Inset indica los ribosomas esquemáticos en Pre y Post, que corresponden a los óvalos sólidos y forrados de guión, respectivamente. (B, C) RESULTADOS de FIRMS sin antibióticos. (D, E) Resultados con ácido fusídico y neomicina. (F, G) Resultados sólo con ácido fusídico. (H, I) Resultados solo con viomicina. Paneles izquierdos: usando Ruler-In para sondear el lado de 5'; paneles derecho: usando Ruler-Out para sondear el lado 3'. Las barras de error se calculan de la misma manera que las de la figura anterior. Figura se ha reproducido con permiso9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : FIRMS resultados del uso de reglas duales para sondear el cambio de fotogramas. (A, B) MFNF-Pre y MFNF-Post sin antibióticos. (C, D) Resultados con ácido fusídico y neomicina. (E, F) Resultados con sólo ácido fusídico. Paneles izquierdos: usando Ruler-In para sondear el lado de 5o; paneles derecho: usando Ruler-Out para sondear el lado 3. Las barras de error se calculan de la misma manera que las de la figura anterior. Figura se ha reproducido con permiso9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En nuestro ensayo de doble regla, las cuentas magnéticas desempeñan dos papeles esenciales. En primer lugar, sirven como transductores de fuerza porque la fuerza centrífuga es proporcional a su masa boyante. En segundo lugar, las perlas son portadoras de señal detectadas por un magnetómetro atómico, que actualmente es el sensor magnético más preciso. Combinando la manipulación mecánica y la detección magnética, la técnica FIRMS es capaz de resolver un gran número de interacciones moleculares basadas en sus fuerzas críticas de disociación, que es la base de las reglas de ADN. El ensayo de doble regla es especialmente adecuado para sondear ambos lados del ARNm durante la translocación. Debido a que es un enfoque físico que sólo se basa en la formación de los dúplex, no está limitado por los lados del ARNm u otras restricciones biológicas. Esta es una ventaja en comparación con otras técnicas que se basan en reacciones bioquímicas. Hemos demostrado que mediante el uso de una molécula de vinculador largo, las reglas pueden llegar al sitio de unión objetivo para determinar la posición del ARNm. Específicamente, para el ribosoma, la longitud del vinculador es de 50 T, que corresponde a 17 nm de longitud. Esta longitud es muy cercana al tamaño del ribosoma17. Las concentraciones de los antibióticos son valores típicos de la literatura. También es posible utilizar nuestro método para revelar los valores de inicio de sus funciones.
Hay dos aspectos críticos para el ensayo de doble regla. Una es la delicada superficie funcionalizada para la inmovilización molecular y las reacciones biológicas posteriores. Cada paso de carga y lavado debe realizarse con una perturbación mínima en la superficie, de modo que las moléculas inmovilizadas en la superficie permanezcan intactas. Para el proceso de hibridación ADN-MRNA, se necesita tiempo suficiente para asegurar la finalización del proceso. También se recomienda utilizar TAM10 buffer con 1 M NaCl extra para mantener un sistema homeostático. El otro aspecto crítico es la magnetización de las cuentas. Dado que se utilizan cuentas excesivas, hay un montón de cuentas libres no inmovilizadas en la superficie. Por lo tanto, al magnetizar la muestra, la superficie recubierta debe acercarse y dejar el imán verticalmente. Cualquier oscilación menor de la muestra puede causar daños por arañazos en la superficie.
Nuestro ensayo de regla de ADN dual es actualmente el único método que puede sondear objetivamente los lados de entrada y salida del ARNm en los complejos ribosomas con resolución de un solo nt. Se ha obtenido información mecanicista novedosa sobre la translocación ribosoma. El método es generalmente aplicable para el desplazamiento molecular de ácidos nucleicos, que se encuentra ampliamente en la biología molecular.
Para el desarrollo y las aplicaciones futuras, hemos demostrado que el uso de la fuerza de radiación acústica para reemplazar la fuerza centrífuga mejorará aún más la resolución de la fuerza, alcanzando el régimen sub-nt18. También estamos investigando la detección multiplexada utilizando magnetómetros atómicos para mejorar la eficiencia de detección. Con estas mejoras, esperamos que nuestro método detallado en este trabajo encuentre amplias aplicaciones en la investigación biológica.
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Disclosures
Los autores no informaron de ningún posible conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. reconoce el apoyo de la Fundación Welch (E-1721).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
References
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