Summary
שיטת ה-DNA כפול מפותחת כדי לקבוע את מיקום mRNA במהלך הריבוטרנסלוקציה, אשר נשענת על כוחות הדיסוציאציה של דופלקסים DNA-mRNA הנוצר. עם יחיד-נוקלאוטיד החלטה ויכולת להגיע שני הקצוות של mRNA, זה יכול לספק תובנות מכניסטיות עבור טרנסלוקציה ריבוכמה ולחקור אחרים חומצות גרעין displacements.
Abstract
הריבוכמה הטרנסלוקציה מתייחסת לתנועה הריבוזומלית ב-mRNA על-ידי שלושה נוקלאוטידים בדיוק (nt), שהוא השלב המרכזי בסינתזה של חלבונים. כדי לחקור את מנגנון המנגנון, קיימות שתי דרישות טכניות חיוניות. ראשית, רזולוציה בודדת של nt שיכולה לפתור טרנסלוקציה רגילה מ-frameshifting, שבמהלכה הריבוכמה נע על-ידי אחר מ-3 nt. השני הוא היכולת לחקור הן את צדי הכניסה והיציאה של mRNA כדי להבהיר את התמונה כולה של טרנסלוקציה. אנו מדווחים על שיטת ה-DNA הכפולה המבוססת על כוחות הדיסוציאציה הקריטיים של הדופלקסים של DNA-mRNA, המתקבל על ידי שריד מגנטיזציה מגנטית שארית (חברות). עם 2-4 ברזולוציה הכוח pN, הבחינה הסרגל כפול הוא מספיק כדי להבדיל בין שלבי הטרנסלוקציה שונים. על ידי יישום מקשר ארוך על DNAs בדיקה, הם יכולים להגיע mRNA בצד הנגדי של ריבוכמה, כך מיקום mRNA יכול להיקבע עבור שני הצדדים. לכן, השיטת הסרגל הכפולה מתאימה באופן ייחודי לחקירת הטרנסלוקציה הריבומוגית, ולתנועת חומצת גרעין באופן כללי. אנו מראים תוצאות הנציג אשר הצביעו על mRNA בלולאה היווצרות ונפתר טרנסלוקציה נורמלית מ frameshifting.
Introduction
עקירה ביוקולולקולרית היא פרמטר בסיסי בלימוד המנגנון של הפונקציות הביולוגיות הקשורות. דוגמה אחת היא הריבוכמה טרנסלוקציה1,2, שבמהלכה הריבוכמה נע על ידי שלושה נוקלאוטידים בדיוק (nt) על שליח RNA (mrna) בדרך כלל, ועל ידי אחד, שניים, או מספר אחר של nt מלבד שלושה במקרה של frameshifting. לפיכך, נדרשת רזולוציה יחידה של מערכת שליטה בסרגל מולקולרי כדי להבדיל בין גודלי השלבים השונים. אתגר גדול יותר הוא לחקור את התנועה הריבוחלק הן על הכניסה והן בצד היציאה. במילים אחרות, רק עם מערכת סרגל כפול נוכל לגלות אם mrna הוא משורשר בצורה חלקה דרך ריבוכמה, או יש שלבי ביניים שבו שני הצדדים יש גדלים צעד שונה המוביל לתוך מקוטע או בלולאה mrna היווצרות בפנים ה ריבוזום.
מספר שיטות פותחו כדי להתמודד עם האתגר הראשון של פתרון צעדים שונים בצד היציאה של ריבוחלק (3 ' הקצה של mRNA). השיטת לוציפראז כפולה פותרת את מסגרות הקריאה השונות על-ידי מדידת היחס בין החלבונים השונים הנובעים ממנה3,4. היא ישימה רק עבור 3 ' סוף mRNA ובכך מספיק כדי לספק תמונה מלאה של טרנסלוקציה. ספקטרומטר מסה יכול לנתח את שברי הפפטיד השונים כתוצאה מסידור הקוד המקביל5. אבל זה לא יכול להצביע על כמה nt הריבוכמה נע על mRNA. שיטת ההדפסה הבוהן היא שיטה נפוצה נוספת המשתמשת בטרנסקריפטאז הפוכה שהייתה מועלת ב -3 '-הסוף כדי לתעתור את ה-mRNA לקראת הריבוחלק6. עם זאת, היא אינה ישימה עבור 5 ' סוף mRNA כי הוא להזין את ריבוכמה. טכניקות אחרות, כולל גישות מולקולה יחידה ושיטות זריחה7, קשה להשיג רזולוציה בודדת-nt.
פיתחנו את שיטת ה-DNA כפול שניתן לקבוע באופן ייחודי הן את מיקומי הכניסה והיציאה של mRNA החשופה ב-מכלולי הריבוכמה-mRNA. DNAs הסרגל הם ה-DNA oligomers שיוצרים דופלקסים של מספר מסוים של זוגות בסיס (bp) עם mRNA חשף על ידי הריבוכמה, ללא קשר לאיזה קצה של mRNA. מספרי bp ולאחר מכן בדיוק לחשוף את מיקום הריבוכמה על mRNA במהלך הטרנסלוקציה. מספרי הלחץ של הדופלקסים נקבעים על ידי כוחות הדיסוציאציה הקריטיים שלהם, שהתקבלו מהספקטרוסקופיית מגנטיזציה (חברות)8. עם 2-3 בחוסר ודאות כוח, הכוחות הקריטיים מספיקים כדי להציע רזולוציה בודדת nt. על-ידי יישום מולקולת מקשר על שליטי ה-DNA, הצד הפריע באופן שחור של mRNA על ידי הריבוכמה ניתן לנחקר. הריבוזומdisplacements שונים יכולים ובכך להיפתר במדויק. הצלחנו לחשוף בהצלחה היווצרות בלולאה ייחודית של mRNA לכוד על ידי אנטיביוטיקה במהלך הטרנסלוקציה9, ופתרו מסגרות קריאה שונות שנוצרו ברצף mrna חלקלק10. מאמר זה מתאר את הפרטים של מערך הסרגל הכפול, הכולל הכנת מכלולי ריבוכמה, הפונקציונליות של פני השטח של שקופיות הזכוכית, השתק של מכלולי ריבוכמה והכלאה שלהם עם השליט DNA מגנטית מתויג מולקולות, זיהוי מגנטי וניתוח ספקטרום הכוח של חברות משרדי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת הריבוכמה מתחמי
- להפוך 1,000 mL של TAM10 מאגר, אשר מורכב 20 מ"מ-HCl (pH 7.5), 10 מ"מ Mg (OAc)2, 30 מ"מ NH4Cl, 70 mm KCL, 5 מ"מ EDTA, 7 מ"מ bme (2-mercaptoethanol), ו 0.05% Tween20.
- הכינו את חמשת התערובות שמופיעות בטבלה 1.
הערה: הריבוחלק היה מהזן MRE60011. EF-Tu: גורם התארכות בלתי יציב. EF-Ts: גורם התארכות באורווה. GTP: guanosine triphosphate. פפ: פוספאו (enol) פירובט. - מודטה את חמשת מתערבב בנפרד ב 37 ° c עבור 25 דקות לפני ביצוע הריבוכמה תסביכים. הכן את חמשת הריבוכמה מתחמי לפי שולחן 2.
הערה: לאחר הטרנסלוקציה; מראש: טרום טרנסלוקציה. - הוסף כל אחד מחמשת הריבוכמה מתחמים על 1.1 M כרית סוכרוז בנפרד, עם יחס נפח 1:1. לטהר כל אחד עם 450,000 × g עבור 2 h ב במיוחד צנטריפוגה. השתמש בחיית מחמד כדי להסיר את supernatant ולשחזר את הריבוכמה מתחמי ב-80 ° צ' לאחר השעיית הגלולה עם מאגר TAM10.
2. הכנת מגלשות זכוכית מצופות בביוטין
- ניקוי ראשוני של מגלשות הזכוכית
- מקום 12 שקופיות זכוכית עם ממדים של 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 (L × W × T) בצלחת זכוכית קצרה ורחבה.
- ממלאים את צלחת הזכוכית עם אצטון ו sonicate עבור 5 דקות. ואז לשטוף את השקופיות עם מים באולטרסאונד 5 פעמים ולמלא 3/4 של המנה עם מים.
- הוסף 10 M KOH למלא את הצלחת ולsonicate את שקופיות זכוכית עבור 20 דקות. שטוף את השקופיות עם מים 5 פעמים.
- להוסיף אתנול ו sonicate עבור 5 דקות, לשפוך את האתנול ולאחר מכן לייבש אותם בנפרד ב 300 ° c עבור 3 h.
- מבנה עמינח
- הניחו את 12 השקופיות הנקיות בחזרה לצלוחית הזכוכית המכילה את מתנול. נקו את הבקבוקון במתנול באמצעות sonicating במשך 5 דקות, ולאחר מכן מלאו אותו במתנול מ ל, 1.25 מ ל, 0.125 mL, 0.25 mL 3-aminopropyltriethoxysilane (AMEO).
- מיד להחליף את מתנול בצלחת זכוכית עם פתרון AMEO מוכן. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות.
- לשטוף את השקופיות עם מים מספר פעמים, ואז לייבש אותם על ידי לטהר חנקן. מניחים את השקופיות מיובשות במנות זכוכית נקיות.
- הפגלוציה
- להכין נחקו3 פתרון (8.4 Mg/mL) ו PEGylation מאגר (37.5 mg פג, 6 מ"ג biotinylated פג, 150 Μl שיתוף3 פתרון). מערבבים היטב על ידי ספינינג 6,000 rpm עבור 1 דקות.
- מקם 25 μL של פתרון יתד על כל שקופית. . תכסה את זה עם המגלשה השנייה למעלה ודא שאין בועות בין שתי השקופיות. מניחים את השקופיות בתיבה ריקה של מלטף. ודא שהתיבה מוחלקה ומניחים אותה במגירה חשוכה במשך כ-3 שעות.
- שטפו את השקופיות במים והתייבשו שוב. לאחסן את השקופיות מיובש בטמפרטורת החדר תחת ואקום עד 2 שבועות.
3. הכנה לדוגמא לפני מדידות מגנטיות וכוח
- מכונת מדגם פלסטיק היטב עם ממדים 4 × 3 × 2 מ"מ3 (L × W × D). הדבק חתיכת זכוכית מצופה biotin (כ 5 מ"מ אורך, לגזור מ 60 מ"מ שקופיות ארוכות מוכן בסעיף 2) על המשטח התחתון באמצעות אפוקסי.
- הוסף 20 μL של 0.25 mg/mL streptavidin מימית הפתרון לתוך המדגם היטב מודקרת בטמפרטורת החדר עבור 40 דקות. לאחר מכן שטוף את המדגם היטב פעמיים עם מאגר TAM10 .
- . לשתק את הריבוכמה תסביכים
- ללא אנטיביוטיקה: להשתמש בצינורות כדי להסיר מאגר ממדגם היטב, ואז להוסיף 20 μL של 0.1 μM ריבוכמה מורכבים (MF-Pre או MF-Post) למדגם היטב. הריבוכמה מורכבים יהיה לאגד עם הstreptavidin על פני השטח דרך ביוטין 5-סוף על mrna. דגירה ב 37 ° צ' עבור 1 h ולאחר מכן לשטוף פעם אחת עם TAM10 מאגר.
- עבור הניסוי באמצעות שני neomycin ו חומצה fusidic: הדגירה של MF-Pre מורכבים עם neomycin ב 37 ° c עבור 10 דקות; דגירה EF-G עם חומצה fusidic ב 37 ° c עבור 20 דקות. ריכוזים הם כדלקמן: 0.1 μM ריבוכמה מורכבים, 2 μM EF-G, 4 מ"מ GTP, 4 מ"מ מילימטר, 0.02 mg/mL פירובט קינאז, 0.2 mM neomycin, ו 0.25 חומצה fusidic mM.
- ביצוע ניסויים אחרים אנטיביוטיקה באופן דומה. ריכוזים הם כדלקמן: 0.2 mM viomycin, 0.4 mM hygromycin B, ו 0.25 mM חומצה fusidic.
- למחקר frameshifting, לחזור על הצעדים לעיל עבור MFNF-Pre ו-MFNF-Post מתחמי מעורבים מוטיב חלקלק U6א. השתמש אנטיביוטיקה fusidic חומצה בתוספת neomycin, ו חומצה fusidic לבד, בהתאמה.
- הסרת מאגר ממדגם היטב, ולאחר מכן להוסיף 20 μL של 1 μM ביולוגית בדיקת ה-DNA לחטט ו דגירה בטמפרטורת החדר בלילה. לשטוף את ה-DNA-mRNA הנוצר דופלקס פעם עם מאגר TAM10 .
- הסר את המאגר מהדוגמה היטב. לאחר מכן להוסיף 20 μL של 0.5 mg/mL streptavidin-מצופה חרוזים מגנטיים לתוך המדגם גם בטמפרטורת החדר עבור 2 h.
- הכנס בזהירות את המדגם גם לתוך המחזיק ולמקם אותו בצנטריפוגה. הסר את החלקיקים המגנטיים חינם מן המשטח על ידי תפרידו ב 84 x g עבור 5 דקות.
4. מדידות מגנטיות וכוח
- הפעלת הלייזר
- . תדליק את הלייזר בעזרת המפתח לאחר מכן לחץ על לחצן ההפעלה.
- להתאים את הרגישות של מגבר נעילה 1 (LIA1) כדי 500 mV ולחכות כ 2 h כדי לחמם ולייצב את המגנטומטר האטומי.
- הקמת מגנטומטר אטומי
- הפעל את תוכנת בקרת הכלי והגדר את פרמטרי המדידה. פרמטרים מסוימים עשויים להשתנות במקצת בכל מדידה.
הערה: מגנטומטר אטומי כולל לייזר (המתואר לעיל), מגבר SR830 lock-in (המכונה LIA1), מגבר נעילה SR530 (המכונה LIA2), DS345 (המכונה FG1) ו ATF20B (המכונה FG2) גנרטורים פונקציה, ברזולוציה גבוהה מנוע ומחשב. כל אלה צריכים להיות מופעלים בשלב זה של הפרוטוקול. - הגדר מצב מנוע נע למצב רעש וברירת מחדל ל- 0. הקש נעילת בלוח הקדמי, להתאים את הרגישות של LIA1 בחזרה ל 200 mV.
- התאימו את הזרם והמתח של הלייזר ותמצאו את פסגת התהודה המתאימה ואת רמת האות לרעש. לחצו על ' ניקוי ' בפנל הקדמי. שים לב היחס משרעת/רוחב צריך להיות מעל 0.5 וערך שלב צריך להיות פחות מ 5 מעלות. אם לא, בצע את הסריקה מחדש.
- הכנס את התפוקה של LIA2 למשוב של הלייזר כדי לנעול את התדר שלו. מגבר זה מודד את הסיבוב האופטי של תא צסיום עזר כדי לשמור על תדר לייזר על תהודה12. המדינה נותרה עד סוף המדידה.
- תוסף פונקציה Plug-in מחולל FG2 כדי להזין גל מרובע (500 וירטואלי, 100 mHz) כאות התייחסות. גל מרובע מתאים 100 pT והוא משמש כדי להמיר את הפלט הנוכחי של המגבר לאות מגנטי. נתק את גנרטור הפונקציה.
- הגדרת מצב הנעה מנוע למיקום דו כיוון וברירת מחדל ל 260 מ"מ. בדוק את מצב בקר הטמפרטורה כדי להבטיח את הטמפרטורה הנכונה (~ 37 ° c) של החיישן האטומי.
- בדוק את יציבות המערכת כולה על ידי מדידת האותות של מחזיק הדגימה הריקה פעמיים. הערכת יציבות ורמת רעש לאחר חיסור שני עקבות. רמת רעש אופייני תנודות צריך להיות ± 2 pT ב 30 ms זמן האינטגרציה.
- הפעל את תוכנת בקרת הכלי והגדר את פרמטרי המדידה. פרמטרים מסוימים עשויים להשתנות במקצת בכל מדידה.
- מגנטיזציה של המדגם
- מניחים בעדינות את המדגם על תחנת המגנטיזציה ומניחים לו להישאר למשך 2 דקות.
הערה: תחנת המגנטיזציה מורכבת ממגנט קבוע (~ 0.5 T) ומרווח פלסטיק. - . תחזיר את הדגימה למחזיק הדגימה השתמש בכוח צנטריפוגלי 335.4 × g כדי להסיר את החלקיקים המגנטיים שאינם מאוגדים במפורש.
- מניחים בעדינות את המדגם על תחנת המגנטיזציה ומניחים לו להישאר למשך 2 דקות.
- מדידות מגנטיות לאחר החלת כוחות
- השתמש בפינצטה כדי לטעון את המדגם על המנוע. לחץ על נעל בלוח הקדמי כדי להפעיל את התוכנית. בינתיים, להשתמש בפינצטה לטעון את המדגם השני במחזיק ולמקם אותו בצנטריפוגה. שימו לב שהצד הזכוכית המצופה צריך להתייצב במרכז הצנטריפוגה.
הערה: הטכניקה של שארית הנגרמת כתוצאה ממגנטיזציה ספקטרוסקופיה (חברות) משמש, אשר משתמשת מגנטומטר אטומי כדי למדוד את האות המגנטי של המדגם לאחר החלת כוח מכני על האינטראקציות המולקולריות במדגם. כאן, האינטראקציות המולקולריות הן בין מולקולות הסרגל DNA ו-mRNA בקומפלקס הריבוחלק. הכוח חורג מוגבר על ידי. הגברת המהירות הצנטריפוגלי לאחר החלת כל כוח, המנוע מתרגמת את המדגם לחיישן האטומי ולאחר מכן נעה חזרה. מכאן, שני פרופילי שדה מגנטי מתקבלים, אחד במהלך סריקה קדימה והשני במהלך סריקה לאחור13. אנו משתמשים רק האחרון כדי לחלץ את גובה השיא בשל היחס הטוב ביותר שלה האות לרעש. גובה השיא בנוכחי (nA) מומר לשרעת אות מגנטית (pT) בהתבסס על גל מרובע הכיול. - כל מדידה נמשכת כ-5 דקות. כאשר המנוע חוזר אל 0, לחץ על שמור בלוח הקדמי. השתמשו בפינצטה בקפידה כדי לקחת דגימות מהמנוע ומצנטריפוגה. השתמש במהירות הראשונית המתאימה 335.4 × g (2000 rpm, מהפכה לדקה עבור הצנטריפוגה המפורטים בטבלת החומרים).
- החלף את שתי הדגימות ויישם כוח חזק יותר על-ידי הגדלת המהירות הצנטריפוגלי באמצעות 100 rpm או גודל שלב דומה. עבד לסירוגין כדי להגביר בהדרגה את הכוח; ספקטרום כוח מלא מתקבל לאחר 10-12 נקודות נתונים.
- השתמש בפינצטה כדי לטעון את המדגם על המנוע. לחץ על נעל בלוח הקדמי כדי להפעיל את התוכנית. בינתיים, להשתמש בפינצטה לטעון את המדגם השני במחזיק ולמקם אותו בצנטריפוגה. שימו לב שהצד הזכוכית המצופה צריך להתייצב במרכז הצנטריפוגה.
- לסיים את הניסוי
- כאשר כל הניסויים המתוכננים גמורים, כבו את הציוד והמשיכו בסדר הנגדי כפי שהוא הופעל.
- הסר את הדגימות מן המחזיק ולטבול אותם באתנול לניקוי ושימוש עתידי. נקה את מחזיק הדגימה עם אצטון במקרה של זיהום חרוזים מגנטיים.
- ניתוח מידע
- פתח את קובץ ה-script לניתוח פייתון וקלט את כל הנתונים הניסיוניים. לחץ על טען ריבוע כדי להזין את גל הריבוע כהפניה. לאחר מכן לחץ על טען תוכנית בסיסית כדי להזין אות מגנטי שיורית כרקע.
- הגדירו את האות המגנטי הכולל הקטנה כ- B0. נרמול כל אות מגנטי מצמצם את b ל- b0 ומבטא אותו כאחוז. התווה את האחוז (B/B0) לעומת כוח צנטריפוגלי כדי להשיג את הספקטרום של המשרדים.
הערה: כוח צנטריפוגלי f מחושב מתוך מסה הפרוע של החרוזים מגנטי m (4.6 × 10 על15 ק ג), מהירות צנטריפוגלי w, ואת רדיוס של צנטריפוגה r (7.5 ס מ כאן) דרך המשוואה F = mw מיכל השני r. הרזולוציה כוח אופייני הוא 2-4 pn ו טווח כוח הוא 15-95 pN בעבודה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג את ערכת האיתור והתצלומים של הרכיבים המרכזיים. זיהוי מגנטי מושגת על ידי מגנטומטר אטומי באמצעות ערכת הסריקה (איור 1א)13. המדגם ממוקם על מוט רכוב על מנוע ליניארי. המנוע מסיע את הדגימה לחיישן האטומי בתוך מגן מגנטי, ואז בחזרה לאתר המקורי לפריקה. מגנטומטר אטומי מזהה את האות המגנטי במהלך סריקת לדוגמה והפיק מעקב איתות, עם האות המקסימלי כאשר המדגם הוא הקרוב ביותר לחיישן. איור 1 B מציג את התמונה של הכלי הכולל. דמויות 1C, D להראות את התמונות של תחנת המגנטיזציה ואת הצנטריפוגה המשמש ליישום כוח, בהתאמה.
העיקרון של שיטת ה-DNA הכפולה מוצג באיור 2. הריבוכמה מורכב הוא מקיבוע על פני השטח באמצעות 5 ' הקצה של mRNA. שני השליטים DNA נועדו לחקור את המיקום המדויק של ריבוחלק, אחד עבור כל צד של mRNA. סכימת השתק הנוכחית הופכת את שלושת הצדדים לנגישים בקלות עבור שליטי ה-DNA החוקרות. לכן, ה-DNA oligomers מצועם חרוזים מגנטיים יכולים ליצור דופלקסים עם mRNA החשופה. לעומת זאת, הריבוחלק והמשטח מפריע בצורה מאוד מאומצת. מולקולת מקשר צריך אפוא את ה-DNA כדי להגיע mRNA חשף בצד זה. על ידי שינוי אורך המקשר, קבענו כי כאשר המקשר ארוך יותר מ 50 T, אנו יכולים לזהות אות מגנטי חזק המציין היווצרות מוצלח של דופלקסים DNA-mRNA (איור 2ב). הקורלציה של כוח הדיסוציאציה לאורך דופלקס מושגת על ידי שינוי מספר הnt ב-DNA המשלים ל-mRNA. דמויות 2C,D הצג את הקורלציה עבור 3 '-ו-5 הצדדים, בהתאמה. בגלל ההבדל הכוח בין דופלקסים של אורכים רצופים הוא בדרך כלל 12-20 pN ואת ההחלטה הכוח הוא בדרך כלל 2-4 pN, אנחנו באופן קבוע להשיג בודד nt רזולוציה לאורך של דופלקסים DNA-mRNA מבוסס על כוחות הדיסוציאציה שלהם.
איור 3 מציג את התוצאות של טרנסלוקציה נורמלית בהעדר נוכחות של אנטיביוטיקה שונים. רוברטסונית היא מ MF-Pre כדי MF-Post (איור 3א). הכניסה מציינת כי MF-Pre מבצע הפנויה tRNAFmet ו MF -trna פה באתר P-and-A-אתרים, בהתאמה. MF-פוסט מבצע tRNAFmet ו-MF- trna שם באתרים E-ו-P, בהתאמה, עם אתר פנוי. איור 3 ב מראה כי ללא אנטיביוטיקה, הריבוכמה נע על ידי 3 nt משני הצדדים (נע לכיוון 3-end). זה בגלל הסיבות הבאות: (i) הדופלקסים ה-DNA-mRNA בנספח 5 ' התערוכה 12 bp ו 15 כוחות כריכה bp ב MF-Pre ו-MF-Post, בהתאמה. (ii) דופלקסים בתערוכת 3 ' end שינוי הפוך מ 15 עד 12 bp (איור 3ג). עם זאת, כאשר הן חומצה fusidic ו neomycin נמצאים, ספקטרום הכוח מראים כי ריבוכמה נע רק על ידי 1 nt ב 5 ' בצד אבל 2 nt ב 3 ' בצד (איור 3D, E). תוצאה זו מצביעה על כך הריבוכמה translocated מוקם באמצעות מנגנון החורגים, והתוצאה היא היווצרות mRNA בלולאה כי יש עוד nt בתוך הריבוכמה, אשר לא התגלה לפני. זה מתאים להדמיה התיאורטית. המדווחת14 לחילופין, הריבוכמה עשוי להיות נמתח כדי לכסות 28 nt של mRNA, במקום הרגיל 27 nt15. לאחר שטיפת האנטיביוטיקה, טרנסלוקציה נורמלית מתרחשת, כפי שמעידים על ידי 3 nt תנועות הן 5 ʹ ו 3 ʹ הצדדים (סימן סגול באיור 3D, E). הקונפורמציה בלולאה לא מיוצרים כאשר רק חומצה fusidic משמש. ספקטרום הכוח הם עקביים עם התנועה הריבוכמה של 3 nt בשני הצדדים, בדומה למצב של טרנסלוקציה נורמלית (איור 3F, G). מערך הסרגל הכפול מגלה גם כי הviomycin מעכבות לחלוטין, כפי שניתן לראות בתנועה של 0 nt משני הצדדים (איור 3H, I).
חקרנו גם אם מוטיבים מסוג זה יכולים להיווצר במוטיבים frameshifting. כאן, טרנסלוקציה מ MFNF-Pre ו-MFNF-Post מתחמי מתרחש על U6A ' מוטיב, אשר נמצא להיות חלק מוטיב '-1 ' frameshifting ב-HIV16. דמויות 4A, B להראות כי ב mfnf-Post, ה-DNA-mrna דופלקס הוא מקוצר על ידי או 2 או 3 nt ב 3-end; אורך הדופלקס גדל על-ידי 2 או 3 nt ב-5 ʹ-הקצוות. התוצאות מרמזות על דו-קיום של טרנסלוקציה רגילה ו-" -1" frameshifting, עם הקשר הקודם עם התנועה 3-nt והשני הקשורים בתנועה 2-nt. שיטת הסרגל הכפולה מסוגלת לפתור בבירור את שתי האוכלוסיות. עם neomycin וגם חומצה fusidic, אנו צופים כי ריבוכמה נע על ידי 2 nt ב 3 '-end אבל רק 1 nt ב 5 ʹ-end, בהתאמה (איור 4ג, ד). לכן, ה-mRNA הכרוך מתרחש גם ברצף החלקלק. כאשר רק חומצה fusidic נוכח MFNF-Pre (איור 4E, F), התוצאה היא זהה לזה עבור Mfnf-Post ב פאנלים A ו-B (עקבות כחולים), המציין כי חומצה fusidic לבד אינו מספיק כדי להשהות טרנסלוקציה או frameshift. לכן, היא מאשרת כי הן חומצה fusidic והן neomycin נדרשים עבור displacements שוויונית עבור שני הצדדים של mRNA.
איור 1 : מכשירי מבוססי משרדי מבוסס DNA כפול הסרגל. (א) סכמטי הזיהוי המגנטי. 1: לדוגמה הר שלו; 2: מנוע; 3: חיישן האטום ואת המגן המגנטי. (ב) צילום של המגנטוטר האטומי ומערכת הטיפול במדגם. המספרים מציינים את הרכיבים המתאימים בפועל המופיעים בתרשים הסכימטי. שימו לב שהמגן המגנטי נמצא בתוך קופסת קרטון ליציבות תרמית משופרת. (ג) תחנת מגנטיזציה. (ד) צנטריפוגה המשמשת לבקשת כוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : שיטת שליטה כפולה עם רזולוציה בודדת של nt ללימוד טרנסלוקציה ריבוכמה. (א) סכמטי של שיטת הסרגל כפול, שבה שני השליטים DNA מתוכננים בהתאמה לחקור את 5 ʹ-ו 3 ʹ-מסתיים. הקו האדום מצביע על. המקשר בין הפוליט (ב) אופטימיזציה של אורך המקשר עבור משרדי הסרגל (C) התוצאות כדי לקבוע את כוחות הדיסוציאציה של הדופלקסים בין סרגלים ו-mrna. (ד) כוחות הדיסוציאציה של הדופלקסים בין השליט ל-mrna. שורת השגיאה מוגדרת כיחס בין רעש המכשיר לבין האות המגנטי הכולל (B0), עם ערך אופייני של ± 3-5%. האיור שוחזר עם הרשאה9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : בודק את שלבי הטרנסלוקציה תחת השפעת אנטיביוטיקה שונים. (א) מערכת בדיקה למערכות מתחמי Mf-Pre ו-mf. הזחה מציינת את הריבוזומים הסכימטי בקדם ופוסט, המתאימים לאליפסות המוצק והמרופדת במקף, בהתאמה. (ב, ג) חברות המשרד תוצאות ללא אנטיביוטיקה. (ד, ה) תוצאות עם חומצה fusidic הן neomycin. (F, G) תוצאות עם חומצה fusidic בלבד. (H, I) תוצאות עם viomycin בלבד. חלוניות שמאל: שימוש בסרגל-In כדי לחקור את צד 5; חלוניות מימין: שימוש בסרגל הסימון כדי לחקור את צד 3. קווי השגיאה מחושבים באותו אופן כמו אלה שבאיור הקודם. האיור שוחזר עם הרשאה9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : משרדי התוצאות של שימוש בסרגלים כפולים כדי לחקור frameshifting. (א, ב) MFNF-Pre ו-MFNF-Post ללא אנטיביוטיקה. (ג, ד) תוצאות עם חומצה fusidic הן neomycin. (E, F) תוצאות עם חומצה fusidic בלבד. לוחות שמאל: באמצעות סרגל-In כדי לחקור את 5 ʹ בצד; לוחות ימינה: באמצעות הסרגל החוצה כדי לחקור את ʹ בצד 3. קווי השגיאה מחושבים באותו אופן כמו אלה שבאיור הקודם. האיור שוחזר עם הרשאה9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בתוך השליטה הכפולה שלנו, החרוזים המגנטיים לשחק שני תפקידים חיוניים. ראשית, הם משמשים ככוח התמרה כי הכוח הצנטריפוגלי הוא יחסי למסה הפרוע שלהם. שנית, החרוזים הם נושאות איתותים שזוהו על ידי מגנטומטר אטומי, שכרגע הוא החיישן המגנטי המדויק ביותר. שילוב מניפולציה מכנית וזיהוי מגנטי, שיטת המשרדים מסוגלת לפתור מספר רב של אינטראקציות מולקולריות המבוססות על כוחות הדיסוציאציה הקריטיים שלהם, שהוא הבסיס של שליטי ה-DNA. השיטת הסרגל כפול מתאימה באופן ייחודי לחקור את שני הצדדים של mRNA במהלך הטרנסלוקציה. מכיוון שזוהי גישה פיזית הנשענת רק על היווצרות הדופלקסים, היא אינה מוגבלת על ידי הצדדים של mRNA או מגביל ביולוגי אחר. זהו יתרון בהשוואה לטכניקות אחרות המבוססות על תגובות ביוכימיות. הצגנו כי על-ידי שימוש במולקולה של מקשר ארוך, הסרגלים יכולים להגיע לאתר האיגוד המיועד כדי לקבוע את מיקום ה-mRNA. במיוחד, עבור ריבוחלק, אורך המקשר הוא 50 T, אשר מתאים 17 ננומטר באורך. אורך זה קרוב מאוד לגודל של הריבוכמה17. ריכוזי האנטיביוטיקה הם ערכים טיפוסיים מהספרות. ניתן גם להשתמש בשיטה שלנו כדי לחשוף את ערכי התחלתה של הפונקציות שלהם.
קיימים שני היבטים קריטיים עבור שיטת הסרגל הכפולה. האחד הוא משטח הפונקציונל העדין לתגובה מולקולרית ולתגובות ביולוגיות עוקבות. כל צעד העמסה וכביסה צריך להתבצע עם הפרעה מינימלית לפני השטח, כך המולקולות מקיבוע על פני השטח יישארו ללא פגע. עבור תהליך ה-DNA-mRNA הכלאה, זמן מספיק נדרש כדי להבטיח את השלמת התהליך. מומלץ גם להשתמש ב-TAM10 מאגר עם תוספת 1 M הנאגל כדי לשמור על מערכת הומסטטית. ההיבט הקריטי השני הוא המגנטיזציה של החרוזים. מאחר שנעשה שימוש בחרוזים מוגזמים, יש הרבה חרוזים ללא קיבוע על פני השטח. לכן, כאשר מגנטיזציה את המדגם, המשטח מצופה צריך להתקרב ולהשאיר את המגנט אנכית. כל נדנדה משנית של המדגם עלולה לגרום נזק גירוד על פני השטח.
שלנו שליטה כפולה DNA הסרגל הוא כיום השיטה היחידה שיכולה באופן אובייקטיבי לחקור הן את הצדדים הכניסה ואת היציאה של mRNA ב ריבוכמה מתחמי עם רזולוציה יחיד nt. מידע מכניסטי הרומן לגבי הריבוחלק הטרנסלוקציה הושגה. השיטה ישימה בדרך כלל עבור עקירה מולקולרית של חומצות גרעין, אשר נתקל נרחב בביולוגיה מולקולרית.
לפיתוח עתידי ויישומים, הצגנו כי שימוש בכוח קרינה אקוסטי כדי להחליף את הכוח הצנטריפוגלי ישפר עוד יותר את הרזולוציה של הכוח, להגיע למשטר המשנה המשני18. אנחנו גם חוקרים זיהוי מרובב באמצעות מגנטומטרים אטומיים כדי לשפר את יעילות הזיהוי. עם שיפורים אלה, אנו מצפים השיטה שלנו מפורטת בעבודה זו תמצא יישומים נרחבים במחקר ביולוגי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא דווח על ניגוד אינטרסים פוטנציאלי על-ידי סופרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות (R01GM111452, י, S.X.). י. ו. מאשר תמיכה מקרן וולש (E-1721).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
References
- Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).
- Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science. 345, 1188-1191 (2014).
- Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4, 479-486 (1998).
- Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).
- Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160, 870-881 (2015).
- Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).
- Chen, J., et al. Dynamic pathways of -1 translational frameshifting. Nature. 512, 328-332 (2014).
- De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA. Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation. RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).
- Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).
- Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance. Optics Letters. 35, 661-663 (2010).
- Yao, L., Xu, S. Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).
- Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics. Physical Biology. 5, 046005 (2008).
- Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
- Jacks, T., et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. Nature. 331, 280-283 (1988).
- Schuwirth, B. S., et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution. Science. 310, 827-834 (2005).
- Jia, H., Wang, Y., Xu, S. Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps. Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).
