Summary
이중 DNA 눈자 분석은 형성된 DNA-mRNA 이중의 해리력에 의존하는 리보솜 전좌 동안 mRNA 위치를 결정하기 위하여 개발됩니다. 단일 뉴클레오티드 분해능과 mRNA의 양 단에 도달하는 기능을 통해 리보솜 전좌에 대한 기계적 통찰력을 제공하고 다른 핵산 변위를 조사할 수 있습니다.
Abstract
리보솜 전좌는 단백질 합성에 있는 중앙 단계인 정확하게 3개의 뉴클레오티드 (nt)에 의해 mRNA에 리보솜 운동을 나타납니다. 메커니즘을 조사하기 위해 두 가지 필수 기술 요구 사항이 있습니다. 첫 번째는 리보솜이 3 nt 를 제외한 다른 것으로 이동하는 동안 프레임 변속에서 정상적인 전좌를 해결할 수있는 단일 nt 해상도입니다. 두 번째는 전좌의 전체 그림을 해명하기 위해 mRNA의 입구와 출구 측면을 모두 조사 할 수있는 기능입니다. 우리는 힘 유도된 잔재 자화 분광학에 의해 장악된 DNA-mRNA 이중의 중요한 해리력에 근거를 둔 이중 DNA 통치자 분석법을 보고합니다 (FIRMS). 2-4 pN 힘 분해능을 사용하면 이중 눈자압 분석이 서로 다른 전좌 단계를 구별하기에 충분합니다. 프로빙 DRNA에 긴 링커를 구현함으로써, 그들은 리보솜의 반대편에 있는 mRNA에 도달할 수 있고, 그래서 mRNA 위치는 양측을 위해 결정될 수 있다. 따라서, 이중 눈금자 분석은 리보솜 전좌 및 일반적으로 핵산 운동을 조사하는 데 유일하게 적합하다. 우리는 루프 mRNA 형태와 프레임 변속에서 정상 전좌를 해결 한 대표적인 결과를 보여줍니다.
Introduction
생체 분자 변위는 관련 생물학적 기능의 메커니즘을 연구하는 근본적인 매개 변수입니다. 한 가지 특별한 예는 리보솜 전좌1,2,리보솜이 메신저 RNA(mRNA)에 대해 정확히 3개의 뉴클레오티드(nt)에 의해 정상적으로 이동하는 동안, 그리고 3개를 제외한 1, 2, 또는 다른 수의 nt가 프레임 변속. 따라서, 분자 눈금자 시스템 단일-nt 해상도는 상이한 단계 크기를 구별하는 데 필요하다. 더 큰 과제는 입구와 출구 양쪽 모두에서 리보솜 움직임을 조사하는 것입니다. 즉, 이중 눈금자 시스템으로만 mRNA가 리보솜을 통해 원활하게 스레드되는지, 또는 양측이 서로 다른 단계 크기를 가지는 중간 단계가 있는지 여부를 밝힐 수 있을 것입니다. 리보솜.
리보솜의 출구 측에 있는 다른 단계를 해결하는 첫번째 도전을 해결하기 위하여 몇몇 방법 (mRNA의 3' 끝)를 해결하기 위하여 개발되었습니다. 이중 루시퍼라제 분석기는 생성된 상이한 단백질의 비율을 측정하여상이한 판독 프레임을 3,4로해결한다. 그것은 단지 mRNA의 3' 끝에 적용 하 고 따라서 전좌의 전체 그림을 제공 하기 위해 부족. 질량 분석법은 대응하는 코드 재배열의 결과로 상이한 펩티드단편을 분석할 수 있다 5. 그러나 mRNA에 리보솜이 얼마나 많은 nt 이동하는지 정확히 파악할 수 없습니다. 발가락 프린팅 분석법은 리보솜 6을 향해 mRNA를 전사하기 위해 3'-말단에서 프라이밍된 역전사를사용하는 또 다른 일반적인 방법이다. 그러나 리보솜에 들어가는 mRNA의 5' 말단에는 적용되지 않는다. 단일 분자 접근법 및 형광 방법 7을포함하는 다른 기술은 단일 nt 분해능을 달성하기 어렵다.
우리는 리보솜-mRNA 복합체에 있는 밝혀진 mRNA의 입구 그리고 출구 위치를 둘 다 유일하게 결정할 수 있는 이중 DNA 통치자 분석약을 개발했습니다. 통치자 DNA는 mRNA의 어느 말단에 관계없이 리보솜에 의해 발견된 mRNA와 염기쌍 (bp)의 특정 수의 이중을 형성하는 DNA 올리고머입니다. bp 숫자는 전좌 도중 mRNA에 리보솜 위치를 정확하게 드러냅니다. 이중의 bp 수는 힘 유도 된 잔류 자화 분광기 (FIRMS) 8에서 얻은 임계 해리력에의해 결정됩니다. 2-3 pN 힘 불확도를 가진, 임계 힘은 단일 nt 분해능을 제공하기에 충분합니다. DNA 눈자에 링커 분자를 구현함으로써, 리보솜에 의해 mRNA의 스테리컬 방해 측을 조사할 수 있다. 따라서 다른 리보좀 변위를 정확하게 해결할 수 있습니다. 우리는 전좌9동안 항생제에 의해 갇혀 있는 mRNA의 독특한 고리 형태형성을 성공적으로 밝혀냈으며, 미끄러운 mRNA 서열10에공존하는 상이한 판독 프레임을 해결했다. 이 기사에서는 리보솜 복합체의 준비, 유리 슬라이드의 표면 기능화, 리보솜 복합체의 고정화 및 자기 표지된 DNA 눈금자와의 혼성화를 포함하는 이중 통치자 분석법의 세부 사항을 설명합니다. 분자, 자기 검출 및 기업에 의한 힘 스펙트럼 분석.
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Protocol
1. 리보솜 단지의 준비
- 20 mM 트라이-HCl (pH 7.5), 10 mM Mg (OAc) 2, 30 mMNH4Cl, 70 mM KCl, 5 mM EDTA, 7 mM BME (2-mercaptoethanol), 및 0.05 % Tween20으로 구성된 TAM10 버퍼의 1,000 mL을 확인하십시오.
- 표1에 열거된 5가지 혼합물을 준비한다.
참고 : 리보솜은 MRE600 균주11에서했다. EF-Tu: 연동성 열 불안정. EF-Ts: 연신계 열 안정. GTP: 구노신 삼인산염. PEP: 포스포(에놀) 피루바테. - 리보솜 복합체를 만들기 전에 37°C에서 25분 동안 5개의 혼합물을 따로 배양한다. 표2에 따라 5개의 리보솜 단지를 준비한다.
참고: 게시: 전좌 후; 사전: 전좌 전.. - 5개의 리보솜 복합체를 각각 1.1M 수크로오스 쿠션에 각각 추가하고 부피 비율은 1:1입니다. 초원심분리기에서 2시간 동안 450,000 × g로 각각 정화합니다. TAM10 버퍼로 펠렛을 재서스펜션한 후 피펫을 사용하여 상류물질을 제거하고 리보솜 복합체를 -80°C에서 복원합니다.
2. 비오틴 코팅 유리 슬라이드 준비
- 유리 슬라이드의 예비 청소
- 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 (L × W × T)의 치수로 12 개의 유리 슬라이드를 짧고 넓은 유리 접시에 놓습니다.
- 유리 접시에 아세톤과 초음파 처리하여 5분 동안 채웁니다. 그런 다음 슬라이드를 초순수로 5회 세척하고 접시의 3/4를 물로 채웁니다.
- 접시를 채우고 20 분 동안 유리 슬라이드를 초음파 처리하기 위해 10M KOH를 추가하십시오.
- 에탄올과 초음파 를 5 분 동안 넣고 에탄올을 부은 다음 3시간 동안 300 °C에서 별도로 건조시면 됩니다.
- 아미노일란 코팅
- 12개의 청소된 슬라이드를 메탄올이 들어 있는 유리 접시에 다시 넣습니다. PEGylation 플라스크를 5분 동안 초음파 처리하여 메탄올로 세척한 다음 25 mL 메탄올, 1.25 mL 물, 0.125 mL HAc, 0.25 mL 3-아미노 프로필트리에톡실란(AMEO)으로 채웁니다.
- 유리 접시에 담긴 메탄올을 즉시 준비된 AMEO 용액으로 교체하십시오. 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- 슬라이드를 물로 여러 번 헹구고 질소 제거로 건조시십시오. 말린 슬라이드를 깨끗한 유리 접시에 놓습니다.
- 페글리션 (것)과 함께
- NaHCO3 용액 (8.4 mg / mL) 및 PEGylation 완충제 (37.5 mg PEG, 6 mg의 생체 체화 페그, 150 μL NaHCO3 용액)를 준비하십시오. 1 분 동안 6,000 rpm에서 회전하여 잘 섞어 보십시오.
- 각 슬라이드에 PEG 용액 25 μL을 놓습니다. 위에 다른 슬라이드로 덮습니다. 두 슬라이드 사이에 거품이 없는지 확인합니다. 슬라이드를 빈 파이펫 팁 상자에 넣습니다. 상자가 평평하고 약 3 시간 동안 어두운 서랍에 놓아 두십시오.
- 슬라이드를 물로 헹구고 다시 건조시십시오. 건조된 슬라이드를 최대 2주 동안 진공 상태의 실온에 보관하십시오.
3. 자기 및 힘 측정 전에 샘플 준비
- 치수 4 × 3 × 2mm3 (L × W × D)로 플라스틱 샘플을 잘 가공하십시오. 에폭시를 사용하여 바닥면에 비오틴 코팅 유리 조각 (약 5mm 길이, 섹션 2에서 제조 된 60mm 긴 슬라이드에서 잘라)을 붙입니다.
- 20 μL의 0.25 mg/mL 스트렙타비딘 수성 용액을 시료에 잘 넣고 실온에서 40분 동안 배양합니다. 그런 다음 TAM10 버퍼로 샘플을 두 번 잘 헹급시다.
- 리보솜 단지를 고정시.
- 항생제 없이: 파이펫을 사용하여 시료에서 완충호를 제거한 다음, 0.1 μM 리보솜 복합체(MF-Pre 또는 MF-Post)의 20 μL을 시료에 잘 추가합니다. 리보솜 복합체는 mRNA에 5'-끝 비오틴을 통해 표면에 스트렙타비딘과 결합할 것입니다. 37°C에서 1시간 동안 배양한 다음 TAM10 버퍼로 한 번 헹구어 내보입니다.
- 네오마이신과 푸시딕산을 모두 이용한 실험: MF-Pre 복합체를 37°C에서 10분 동안 네오마이신과 인큐베이팅; EF-G를 37°C에서 20분 동안 후시산으로 배양합니다. 농도는 다음과 같습니다: 0.1 μM 리보솜 복합체, 2 μM EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP, 0.02 mg/mL 피루바테 키나아제, 0.2 mM 네오마이신, 및 0.25 mM 후시산.
- 다른 항생제 실험을 유사하게 수행합니다. 농도는 다음과 같습니다: 0.2 mM 비오마이신, 0.4 mM 히그로마이신 B, 및 0.25 mM 퍼지산.
- 프레임 변속 연구의 경우, 미끄러운 모티프 U6A. 항생제 퍼지산 플러스 네오마이신, 그리고 퍼지산 단독을 포함하는 MFNF-Pre 및 MFNF-Post 복합체에 대해 위의 단계를 반복합니다.
- 시료에서 완충호를 잘 제거한 다음, 1 μM 의 20 μL의 생체 생리식 프로빙 DNA 가닥을 추가하고 밤새 실온에서 배양합니다. TAM10 완충액으로 형성된 DNA-mRNA 듀플렉스를 한 번 헹구는다.
- 샘플에서 버퍼를 잘 제거합니다. 그런 다음 0.5 mg/mL의 스트렙타비딘 코팅 된 자기 구슬을 시료에 잘 넣고 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.
- 조심스럽게 샘플을 홀더에 잘 넣고 원심 분리기에 넣습니다. 84 x g에서 5 분 동안 원심 분리하여 표면에서 자유 자기 입자를 제거하십시오.
4. 자기 및 힘 측정
- 레이저 켜기
- 키를 사용하여 레이저를 켭니다. 그런 다음 전원 버튼을 누릅니다.
- 잠금 증폭기 1(LIA1)의 감도를 500mV로 조정하고 원자 자력계를 따뜻하게 하고 안정화하기 위해 약 2시간 동안 기다립니다.
- 원자자력계 설정
- 계측기 제어 소프트웨어를 실행하고 측정 파라미터를 설정합니다. 일부 매개 변수는 각 측정에서 약간 다를 수 있습니다.
참고: 원자 자력계는 레이저(위에서 설명한), SR830 잠금 증폭기(LIA1라고 함), SR530 잠금 증폭기(LIA2라고 함), DS345(FG1라고 함) 및 ATF20B(FG2라고 함) 기능 발생기, 고해상도 를 포함합니다. 모터와 컴퓨터를 연결합니다. 이 모든 프로토콜의 이 단계에서 는 이 모든 것을 켜야 합니다. - 모터 이동 모드를 노이즈로 설정하고 기본 위치를 0으로 설정합니다. 전면 패널에서 잠금을 누르고 LIA1의 감도를 다시 200mV로 조정합니다.
- 레이저의 전류와 전압을 조정하고 적절한 공진 피크와 신호 대 잡음 수준을 찾습니다. 전면 패널에서 스윕을 누릅니다. 진폭/폭 비율이 0.5 이상이어야 하며 위상 값은 5도 미만이어야 합니다. 그렇지 않은 경우 스윕 단계를 다시 수행합니다.
- LIA2의 출력을 레이저의 피드백에 플러그인하여 주파수를 잠급합니다. 이 증폭기는 공진(12)에 대한 레이저 주파수를 유지하기 위해 보조세슘 셀의 광학 회전을 측정한다. 상태는 측정이 끝날 때까지 유지됩니다.
- 플러그인 함수 생성기 FG2는 기준 신호로서 사각파(500 mVpp, 100 mHz)를 입력한다. 사각파는 100 pT에 해당하며 증폭기의 전류 출력을 자기 신호로 변환하는 데 사용됩니다. 기능 생성기의 플러그를 뽑습니다.
- 모터 이동 모드를 양방향 및 기본 위치로 260mm로 설정합니다. 원자 센서의 적절한 온도(~37°C)를 보장하기 위해 온도 제어기의 상태를 확인합니다.
- 빈 샘플 홀더의 신호를 두 번 측정하여 전체 시스템의 안정성을 확인합니다. 두 추적을 빼낸 후 안정성과 노이즈 레벨을 평가합니다. 일반적인 노이즈 레벨 및 변동은 30ms 통합 시간에서 ±2 pT여야 합니다.
- 계측기 제어 소프트웨어를 실행하고 측정 파라미터를 설정합니다. 일부 매개 변수는 각 측정에서 약간 다를 수 있습니다.
- 샘플 자화
- 샘플을 자화 스테이션에 부드럽게 놓고 2분 동안 유지합니다.
참고 : 자화 스테이션은 영구 자석 (~ 0.5 T)과 플라스틱 스페이서로 구성됩니다. - 샘플을 다시 샘플 홀더에 넣습니다. 335.4 × g 원심력을 사용하여 비특이적으로 결합된 자기 입자를 제거합니다.
- 샘플을 자화 스테이션에 부드럽게 놓고 2분 동안 유지합니다.
- 힘을 가한 후 자기 측정
- 핀셋을 사용하여 샘플을 모터에 로드합니다. 프로그램을 실행하려면 전면 패널의 잠금을 클릭합니다. 한편 핀셋을 사용하여 다른 샘플을 홀더에 적재하고 원심 분리기에 놓습니다. 코팅 된 유리 면은 원심 분리기의 중심을 향해야합니다.
참고 : 힘 유발 잔재 자화 분광기 (FIRMS)의 기술은 샘플의 분자 상호 작용에 기계적 힘을 가한 후 샘플의 자기 신호를 측정하기 위해 원자 자력계를 사용하는 데 사용됩니다. 여기에서, 분자 상호작용은 리보솜 복합체에 있는 DNA 통치자 분자 와 mRNA 사이입니다. 힘은 원심 속도를 증가시킴으로써 단계적으로 증가된다. 각 힘을 가한 후 모터는 샘플을 원자 센서로 변환한 다음 다시 이동합니다. 따라서, 두 개의 자기장 프로파일이 얻어지며, 하나는 전진 스캔 동안, 다른 하나는 뒤로 스캔하는 동안13. 우리는 더 나은 신호 대 잡음 비율로 인해 피크 높이를 추출하기 위해 후자를 사용합니다. 전류(nA)의 피크 높이는 교정 사각형 파에 따라 자기 신호 진폭(pT)으로 변환됩니다. - 모든 측정은 약 5분 동안 지속됩니다. 모터가 0으로 돌아오면 전면 패널에서 저장을 클릭합니다. 조심스럽게 핀셋을 사용하여 모터와 원심 분리기에서 샘플을 채취하십시오. 335.4 × g (2000 rpm, 재료표에 나열된 원심 분리기의 분당 회전)에 해당하는 초기 속도를 사용합니다.
- 두 샘플을 교환하고 원심 속도를 100 rpm 또는 유사한 단계 크기로 증가시킴으로써 더 강한 힘을 가한다. 점차적으로 힘을 증가시키기 위해 교대로 처리; 완전한 힘 스펙트럼은 10-12개의 데이터 포인트 후에 얻어진다.
- 핀셋을 사용하여 샘플을 모터에 로드합니다. 프로그램을 실행하려면 전면 패널의 잠금을 클릭합니다. 한편 핀셋을 사용하여 다른 샘플을 홀더에 적재하고 원심 분리기에 놓습니다. 코팅 된 유리 면은 원심 분리기의 중심을 향해야합니다.
- 실험 완료
- 계획된 모든 실험이 완료되면 장비를 끄고 켜져 있는 순서대로 반대 순서로 진행합니다.
- 홀더에서 샘플을 제거하고 세척 및 향후 사용을 위해 에탄올에 담그십시오. 마그네틱 비드 오염 시 아세톤으로 샘플 홀더를 청소합니다.
- 데이터 분석
- 파이썬 분석 스크립트를 열고 모든 실험 데이터를 입력합니다. 사각형 로드를 클릭하여 사각형 파를 참조로 입력합니다. 그런 다음 로드 기준을 클릭하여 잔류 자기 신호를 배경으로 입력합니다.
- 전체 자기 신호 감소를 B0으로정의합니다. 각 자기 신호를 정규화하여 B를 B에서B0으로 감소시키고 백분율로 표현합니다. 회사 스펙트럼을 얻기위해 원심력 대 백분율(B/B 0)을 플로팅합니다.
참고 : 원심력 F는 방정식 F = mw를 통해 자기 비드 m (4.6 × 10-15kg), 원심 속도 w 및 원심 분리기 r (7.5 cm 여기)의 부력 질량에서 계산됩니다. 2개 r.일반적인 힘 분해능은 2-4 pN이고 힘 범위는 이 작업에서 15-95 pN입니다.
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Representative Results
도 1은 주요 구성요소의 검출 체계 및 사진을 나타낸다. 자기 검출은 스캐닝 방식(도1A)(도 1A)을 이용하여 원자자력계에 의해 달성된다(도 1A)13. 샘플은 선형 모터에 장착된 로드에 배치됩니다. 모터는 샘플을 자기 실드 내부의 원자 센서로 운반한 다음 하역을 위해 원래 사이트로 다시 이동합니다. 원자 자력계는 샘플 스캔 중에 자기 신호를 감지하고 시료가 센서에 가장 가까운 경우 최대 신호와 함께 신호 추적을 생성합니다. 그림 1 B는 전체 악기의 사진을 보여줍니다. 도 1C, D는 각각 힘 응용에 사용되는 자화 스테이션과 원심 분리기의 사진을 보여줍니다.
이중 DNA 눈금자 분석법의 원리는 도2에 도시되어 있다. 리보솜 복합체는 mRNA의 5' 끝을 통해 표면에 고정됩니다. 2개의 DNA 통치자는 mRNA의 각 측을 위한 리보솜의 정확한 위치를 조사하기 위하여 디자인됩니다. 현재의 고정 계획은 3'측이 프로빙 DNA 통치자에 쉽게 접근 할 수 있게합니다. 따라서, 자기 비드와 결합된 DNA 올리고머는 발견되지 않은 mRNA로 이중을 형성할 수 있다. 그러나 5' 측은 리보솜과 표면에 의해 스테게적으로 방해를 받고 있습니다. 링커 분자는 이렇게 이 측에 드러나지 않은 mRNA에 도달하기 위하여 DNA를 위해 필요합니다. 링커 길이를 변화시킴으로써, 우리는 링커가 50 T보다 길때, DNA-mRNA 이중의 성공적인 형성을 나타내는 강한 자기 신호를 검출할 수 있다는 것을 결정하였다(그림2B). 이중 길이에 대한 해리력의 상관관계는 mRNA에 상보적인 DNA상수의 수에 의해 달성된다. 도 2C,D는 각각 3'-및 5'-측에 대한 상관관계를 나타낸다. 연속 길이의 이중 체사이의 힘 차이는 전형적으로 12-20 pN이고 힘 해결책은 전형적으로 2-4 pN이기 때문에, 우리는 일상적으로 그들의 해리력에 근거를 둔 DNA-mRNA 이중의 길이를 위한 단일 nt 해결책을 달성합니다.
그림 3은 다양한 항생제의 부재 및 존재시 정상 전좌의 결과를 제시한다. 전좌는 MF-Pre에서 MF-Post까지입니다(그림3A). 인세트는 MF-Pre가 각각 P-및 A-사이트에서 빈 tRNAfMet 및 MF-tRNAPhe를 운반한다는 것을 나타낸다. MF-포스트는 각각 E-및 P-사이트에서 tRNAfMet 및 MF-tRNAPhe를 운반하고, 빈 A-사이트를 가진. 그림 3 B는 항생제없이 리보솜이 양쪽에서 3 nt씩 움직인다는 것을 보여줍니다 (3'-끝쪽으로 이동). 이는 다음과 같은 이유 때문입니다: (i) 5' 측에서의 DNA-mRNA 듀플렉스는 각각 MF-Pre 및 MF-Post에서 12 bp 및 15 bp 결합력을 나타낸다. (ii) 3' 말단의 양면은 15 에서 12 bp(도3C)로부터 역전된 변화를 나타낸다. 그러나, 퍼지산과 네오마이신이 모두 존재할 때, 힘 스펙트럼은 리보솜이 5' 측에서 1 nt, 3'측에서 2 nt만 이동한다는 것을 보여준다(그림3D,E). 이 결과는 리보솜이 단계적 메커니즘을 통해 전이되어 리보솜 내부에 추가 nt가 있는 루프된 mRNA 형태가 생성되었음을 나타내며, 이는 이전에 실험적으로 밝혀지지 않았다. 이는 보고된 이론시뮬레이션(14)과일치한다. 대안적으로, 리보솜은 일반적인 27 nt15대신에 mRNA의 28 nt를 커버하기 위하여 뻗어있을 수 있습니다. 항생제를 씻어 낸 후, 5와 3의 측면 모두에서 3 nt 운동에 의해 입증 된 바와 같이 정상적인 전좌가 발생합니다 (도 3D,E의 보라색 흔적). 후시산만 사용할 때 고리 형태는 형성되지 않습니다. 힘 스펙트럼은 정상 전좌에 대한 상황과 유사하게 양쪽에서 3 nt의 리보솜 이동과 일치합니다(그림3F,G). 이중 눈자분석은 또한 비오마이신이 양측에 0 nt 운동에 의해 도시된 바와 같이 전좌를 완전히 억제한다는 것을 보여준다(도3H,I).
우리는 또한이 루프 형태가 "-1"프레임 변속 모티브에 형성 할 수 있는지 여부를 조사했다. 여기서 MFNF-Pre와 MFNF-Post 단지의 전좌는 HIV16의'-1' 프레임 시프팅 모티프의 일부인 'U6A' 모티프에서 진행됩니다. 도 4A,B는 MFNF-Post에서 DNA-mRNA 이중이 3'-엔드에서 2 또는 3 nt로 단축된다는 것을 보여준다. 이중 길이는 5x끝에서 2 또는 3 nt로 증가합니다. 결과는 3-nt 운동과 후자의 상관 관계와 2-nt 운동과 상관 관계와 함께, 정상적인 전좌와 "-1"프레임 이동 모두의 공존을 제안한다. 이중 통치자 분석은 명확하게 두 인구를 해결할 수 있습니다. 네오마이신과 퍼지산 모두 리보솜이 3'-엔드에서 2nt씩 움직이지만 5°C에서 1nt만 이동하는 것을 관찰합니다(그림4C,D). 따라서, 고리 mRNA 형태는 또한 미끄러운 서열상에서 일어난다. MFNF-Pre(그림4E,F)에대해서만 퍼지산이 존재하는 경우, 결과는 패널 A및 B(파란색 트레이스)의 MFNF-Post의 결과와 동일하며, 이는 퍼지산만으로는 전좌 또는 프레임 이동을 일시 중지하기에 충분하지 않음을 나타냅니다. 따라서, mRNA의 양측에 대한 불평등한 변위를 위해 푸시산과 네오마이신이 모두 요구된다는 것을 확인한다.
그림 1 : 기업 기반 의 이중 DNA 눈금자 분석 기도구. (A) 자기 검출의 회로도. 1: 견본 및 그것의 마운트; 2: 모터; 3 : 원자 센서 및 자기 방패. (B) 원자자력계 및 샘플 처리 시스템의 사진. 숫자는 회로도에 표시된 실제 해당 구성 요소를 나타냅니다. 마그네틱 쉴드는 열 안정성을 향상위해 골판지 상자 안에 있습니다. (C) 자화 스테이션. (D) 원심분리기는 힘 도포에 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 리보솜 전좌를 연구하기 위한 단일 nt 해상도의 이중 눈금자 분석. (A) 이중 통치자 분석의 회로도는, 두 개의 DNA 눈금자는 각각 5-와 3의 끝을 조사하도록 설계된다. 빨간색 선은 폴리T 링커를 나타냅니다. (B) Ruler-In에 대한 링커 길이의 최적화(C) 기업은 Ruler-Ins와 mRNA 사이의 이중의 해리력을 결정합니다. (D) 통치자-아웃과 mRNA 사이의 이중 분리력. 오차 막대는 계측기 노이즈와 전체 자기 신호 감소(B0)사이의 비율로 정의되며, 일반적인 값은 ±3-5%입니다. 그림은 권한 9로재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 다양한 항생제의 영향으로 전좌 단계를 조사합니다. (A) MF-Pre 및 MF-포스트 단지에 대한 검색 방식. Inset은 각각 솔리드 및 대시 라이닝 타원형에 해당하는 사전 및 포스트의 회로도 리보솜을 나타냅니다. (B,C) 기업은 항생제없이 결과를 초래합니다. (D,E) 푸시딕산과 네오마이신모두의 결과. (F,G) 퍼지산만을 가진 결과. (H,I) 비오마이신만으로 결과. 왼쪽 패널: 눈금자-인을 사용하여 5' 면을 프로브합니다. 오른쪽 패널: 눈금자-아웃을 사용하여 3' 쪽을 프로브합니다. 오류 막대는 이전 그림과 동일한 방식으로 계산됩니다. 그림은 권한 9로재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 이중 눈금자를 사용하여 프레임 변속을 프로브하는 결과를 제공합니다. (A,B) 항생제없이 MFNF-Pre 및 MFNF-포스트. (C,D) 푸시딕산과 네오마이신모두의 결과. (E,F) 퍼지산만을 가진 결과. 왼쪽 패널: 눈금자-인을 사용하여 5를 프로브합니다. 오른쪽 패널: 눈금자-아웃을 사용하여 3루 측을 프로브합니다. 오류 막대는 이전 그림과 동일한 방식으로 계산됩니다. 그림은 권한 9로재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리의 이중 통치자 분석에서, 자기 구슬은 두 가지 중요한 역할을한다. 첫째, 원심력이 부력 질량에 비례하기 때문에 힘 변환기 역할을합니다. 둘째, 비드는 현재 가장 정확한 자기 센서인 원자 자력계에 의해 감지되는 신호 캐리어입니다. 기계적 조작과 자기 검출을 결합한 FIRMS 기술은 DNA 통치자의 기초가 되는 중요한 해리력을 기반으로 많은 분자 상호 작용을 해결할 수 있습니다. 이중 눈자 분석은 전좌 동안 mRNA의 양면을 조사하는 데 유일하게 적합합니다. 이중의 형성에만 의존하는 물리적 접근법이기 때문에, mRNA 측 또는 다른 생물학적 제약에 의해 제한되지 않는다. 이것은 생화확적인 반응에 근거를 둔 그밖 기술에 비교된 이점입니다. 우리는 긴 링커 분자를 사용하여, 눈금자가 mRNA 위치를 결정하기 위해 표적 결합 부위에 도달 할 수 있음을 보여 주었다. 구체적으로 리보솜의 경우 링커 길이는 50T이며 길이는 17 nm에 해당합니다. 이 길이는 리보솜17의크기에 매우 가깝습니다. 항생제의 농도는 문헌의 전형적인 값입니다. 또한 우리의 메서드를 사용하여 함수에 대한 발병 값을 나타낼 수도 있습니다.
이중 눈금자 분석에는 두 가지 중요한 측면이 있습니다. 하나는 분자 고정 및 후속 생물학적 반응을위한 섬세한 기능화 표면입니다. 모든 로딩 및 세척 단계는 표면에 고정된 분자가 그대로 유지되도록 표면에 최소한의 방해로 수행되어야 합니다. DNA-mRNA 혼성화 과정의 경우, 공정의 완료를 보장하기 위해 충분한 시간이 필요하다. 또한 항상성 시스템을 유지하기 위해 추가 1 M NaCl과 TAM10 버퍼를 사용하는 것이 좋습니다. 다른 중요한 측면은 구슬의 자화입니다. 과도한 구슬이 사용되기 때문에 표면에 고정되지 않은 많은 무료 구슬이 있습니다. 따라서 샘플을 자화할 때 코팅된 표면이 접근하여 자석을 수직으로 남겨두어야 합니다. 샘플의 사소한 스윙은 표면에 긁힘 손상을 일으킬 수 있습니다.
우리의 이중 DNA 통치자 분석법은 현재 단일 nt 분해능으로 리보솜 복합체에서 mRNA의 입구와 출구 측면을 객관적으로 조사할 수 있는 유일한 방법입니다. 리보솜 전좌에 관한 새로운 기계론적 정보가 입수되었습니다. 이 방법은 일반적으로 분자 생물학에서 널리 발생하는 핵산의 분자 변위에도 적용됩니다.
향후 개발 및 응용을 위해, 우리는 원심력을 대체하기 위해 음향 방사선 력을 사용하여 더 하음관 에 도달, 힘 해상도를 향상시킬 것으로 나타났습니다18. 우리는 또한 검출 효율을 향상시키기 위해 원자 자력계를 사용하여 다중 검출을 조사하고 있습니다. 이러한 개선을 통해, 우리는 이 일에 상세한 우리의 방법이 생물학 연구에서 광범위한 응용을 찾아내줄 것으로 기대합니다.
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Disclosures
저자에 의해 잠재적 인 이해 상충이보고되지 않았습니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강의 미국 국립 연구소에 의해 지원됩니다 (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. 웰치 재단 (E-1721)의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
References
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