Summary
Dubbele DNA-liniaal assay is ontwikkeld om de mRNA-positie tijdens ribosoom translocatie te bepalen, die afhankelijk is van de dissociatie krachten van de gevormde DNA-mRNA-duplexen. Met single-nucleotide resolutie en mogelijkheid van het bereiken van beide uiteinden van mRNA, het kan mechanistische inzichten bieden voor ribosoom translocatie en sonde andere nucleïnezuur verplaatsingen.
Abstract
De ribosoom translocatie verwijst naar de ribosomale beweging op de mRNA door exact drie nucleotiden (NT), wat de centrale stap is in de eiwitsynthese. Om het mechanisme te onderzoeken zijn er twee essentiële technische vereisten. Ten eerste is een single-NT-resolutie die normale translocatie van frameshifting kan oplossen, waarbij het ribosoom met andere dan 3 NT beweegt. De tweede is de mogelijkheid om te sonde zowel de ingang en de uitgang van de zijden van mRNA om het hele beeld van translocatie te verhelderdateren. We rapporteren de dubbele DNA-liniaal test die is gebaseerd op de kritische dissociatie krachten van DNA-mRNA-duplexen, verkregen door kracht-geïnduceerde overblijfsel magnetisatie spectroscopie (firma's). Met 2-4 pN Force Resolution is de dubbele liniaal test voldoende om verschillende translocatie stappen te onderscheiden. Door een lange linker op de indringende dna's te implementeren, kunnen ze de mRNA aan de andere kant van het ribosome bereiken, zodat de mRNA-positie voor beide zijden kan worden bepaald. Daarom is de dubbele liniaal test uniek geschikt om de ribosoom translocatie en nucleïnezuur beweging in het algemeen te onderzoeken. We tonen representatieve resultaten die een lus mRNA-conformatie en een opgeloste normale translocatie van frameshifting hebben aangegeven.
Introduction
Biomoleculaire verplaatsing is een fundamentele parameter bij het bestuderen van het mechanisme van de verwante biologische functies. Een specifiek voorbeeld is de ribosoom translocatie1,2, waarbij het ribosoom beweegt door exact drie nucleotiden (NT) op het boodschapper-RNA (mRNA) normaal, en door één, twee of andere nummers van NT behalve drie in het geval van frameshifting. Daarom is een moleculaire liniaal systeem single-NT-resolutie vereist om onderscheid te maken tussen de verschillende stapgroottes. Een grotere uitdaging is om de ribosoom beweging op zowel de ingangs-als de uitgangszijde te sonde. Met andere woorden, alleen met een dubbele liniaal systeem zullen we in staat zijn om te onthullen of de mRNA soepel door het ribosome is verbonden, of er zijn tussenliggende stappen waarbij de twee zijden verschillende stap maten hebben die leiden tot een knikte of lus mRNA-conformatie in de ribosoom.
Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om de eerste uitdaging aan te pakken bij het oplossen van verschillende stappen aan de uitgang van het ribosoom (het 3 ' uiteinde van de mRNA). De dubbele plaats-assay lost de verschillende Lees frames op door de verhoudingen van de resulterende verschillende eiwitten3,4te meten. Het is alleen van toepassing voor het 3 ' einde van de mRNA en dus onvoldoende om een volledig beeld van translocatie te bieden. Massaspectrometrie kan de verschillende peptide fragmenten analyseren als gevolg van de overeenkomstige code herschikkingen5. Maar het kan niet aangeven hoeveel NT het ribosoom beweegt op de mRNA. De toe-Printing test is een andere veelgebruikte methode die een reverse transcriptase gebruikt die op het 3 '-distale uiteinde wordt geprimeerd om de mRNA in de richting van het ribosoom6te transcriberen. Het is echter niet van toepassing op het 5 ' einde van mRNA dat het ribosome binnenkomt. Andere technieken, waaronder enkelvoudige molecuul benaderingen en fluorescentie methoden7, zijn moeilijk te bereiken met een enkele NT-resolutie.
We hebben de dubbele DNA-liniaal test ontwikkeld die op unieke wijze zowel de ingangs-als uitgangsposities van de ongedekte mRNA in ribosome-mRNA-complexen kan bepalen. De liniaal-Dna's zijn DNA-oligomeren die duplexen vormen van bepaalde aantallen baseparen (BP) met de mRNA die door het ribosome worden blootgelegd, ongeacht welk uiteinde van de mRNA. De BP-nummers onthullen dan precies de ribosoom positie op de mRNA tijdens translocatie. De BP-nummers van de Duplexen worden bepaald door hun kritische dissociatie krachten verkregen uit door kracht geïnduceerde overblijfsel magnetisatie spectroscopie (firma's)8. Met 2-3 pN-kracht onzekerheid zijn de kritische krachten voldoende om single-NT-resolutie aan te bieden. Door het implementeren van een linker molecuul op de DNA-linialen, kan de sterisch-belemmerde zijde van de mRNA door het ribosoom worden geprobed. Verschillende ribosomale verplaatsingen kunnen dus nauwkeurig worden opgelost. We hebben met succes onthuld een unieke lus conformatie van mRNA gevangen door antibiotica tijdens translocatie9, en opgelost verschillende Lees kaders die naast elkaar bestonden op een gladde mRNA sequentie10. Dit artikel beschrijft de details van de dubbele liniaal Assay, waaronder de voorbereiding van de ribosoom complexen, oppervlakte functionalisatie van de glasplaten, immobilisatie van de ribosoom complexen en hun hybridisatie met magnetisch gelabelde DNA-liniaal moleculen, magnetische detectie en kracht spectrum analyse door bedrijven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van de ribosoom complexen
- Maak 1.000 mL TAM10-buffer, die bestaat uit 20 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM mg (OAc)2, 30 mm NH4cl, 70 mm KCl, 5 mm EDTA, 7 mm BME (2-mercaptoethanol) en 0,05% Tween20.
- Bereid de vijf in tabel 1genoemde mengsels voor.
Opmerking: het ribosoom was van de MRE600 stam11. EF-TU: rek factor Thermo onstabiel. EF-TS: rek factor Thermo stabiel. GTP: calciumguanosine trifosfaat. PEP: fosho (ENOL) pyruvate. - Inbroed de vijf mengsels afzonderlijk bij 37 °c gedurende 25 minuten alvorens de ribosoom complexen te maken. Bereid de vijf ribosoom complexen voor volgens tabel 2.
Opmerking: post-translocatie; Pre: pre-translocatie. - Voeg elk van de vijf ribosoom complexen afzonderlijk toe op een 1,1 M sucrose-kussen, met volume ratio 1:1. Reinig elk met 450.000 × g voor 2 uur in een ultra-centrifuge. Gebruik een pipet om het supernatant te verwijderen en de ribosoom complexen te herstellen bij-80 °c na resuspensie van de pellet met TAM10 buffer.
2. bereiding van glazen glaasjes met biotine coating
- Voorlopige reiniging van de glaasjes
- Plaats 12 glazen glijbanen met afmetingen van 60,0 × 4,0 × 0,3 mm3 (L × b × T) in een korte en brede glazen schaal.
- Vul de glazen schaal met aceton en sonicaat gedurende 5 min. Was dan de glijbanen met ultrapuur water 5 keer en vul 3/4 van het gerecht met water.
- Voeg 10 M KOH toe om het gerecht te vullen en de glasplaten gedurende 20 minuten te soniceren. was de glijbanen 5 keer met water.
- Voeg gedurende 5 minuten ethanol en sonicaat toe, giet de ethanol uit en droog ze vervolgens apart bij 300 °C gedurende 3 uur.
- Aminosilaan coating
- Plaats de 12 gereinigde dia's terug in de glazen schaal met methanol. Reinig een PEGylation kolf met methanol door sonicatie gedurende 5 minuten, vul het vervolgens met 25 mL methanol, 1,25 mL water, 0,125 mL HAc, 0,25 mL 3-aminopropyltriethoxysilaan (AMEO).
- Vervang de methanol onmiddellijk in de glazen schaal door de bereide AMEO-oplossing. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Spoel de glijbanen meerdere malen met water en droog ze vervolgens door stikstof zuivering. Plaats de gedroogde glijbanen in schone glas gerechten.
- PEGlation
- Bereid de NaHCO3 -oplossing (8,4 mg/ml) en de pegylation-buffer (37,5 mg Peg, 6 mg biotinyleerd Peg, 150 μL NaHCO3 oplossing). Meng ze goed door te spinnen bij 6.000 rpm gedurende 1 minuut.
- Plaats 25 μL PEG-oplossing op elke dia. Dek het af met de andere Slide bovenop. Zorg ervoor dat er geen bellen tussen de twee dia's zitten. Plaats de dia's in een leeg vak met pipetpunt. Zorg ervoor dat de doos is genivelleerd en plaats het in een donkere lade voor ongeveer 3 uur.
- Spoel de dia's met water en weer droog. Bewaar de gedroogde glaasjes tot 2 weken bij kamertemperatuur onder vacuüm.
3. monstervoorbereiding voorafgaand aan magnetische en krachtmetingen
- Machine een kunststof monster goed met afmetingen 4 × 3 × 2 mm3 (L × W × D). Lijm een stuk biotinegecoat glas (ongeveer 5 mm lang, gesneden uit de 60 mm lange glaasjes bereid in rubriek 2) op het bodemoppervlak met behulp van epoxy.
- Voeg 20 μL 0,25 mg/mL streptavidine waterige oplossing in het monster goed toe en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 40 min. Spoel het monster vervolgens tweemaal met de TAM10 -buffer.
- Immobiliseer de ribosoom complexen.
- Zonder antibiotica: gebruik een pipet om de buffer uit het monster goed te verwijderen en voeg vervolgens 20 μL 0,1 μM ribosoom complex (MF-pre of MF-post) toe aan het monster goed. Het ribosoom complex zal binden met de streptavidine op het oppervlak via de 5 '-end Biotine op de mRNA. Inincuberen bij 37 °C gedurende 1 uur en vervolgens één keer spoelen met TAM10 -buffer.
- Voor het experiment met zowel neomycine als Fusidinezuur: incuberen het MF-pre complex met Neomycine bij 37 °C gedurende 10 minuten; inincuberen EF-G met Fusidinezuur bij 37 °C gedurende 20 min. De concentraties zijn als volgt: 0,1 μM ribosoom complex, 2 μM EF-G, 4 mm GTP, 4 mm Pep, 0,02 mg/ml pyruvaat kinase, 0,2 mm neomycine en 0,25 mm Fusidinezuur.
- Voer de andere antibiotica experimenten op dezelfde manier uit. De concentraties zijn als volgt: 0,2 mM viomycine, 0,4 mM hygromycine B, en 0,25 mM Fusidinezuur.
- Voor frameverschuivende studie herhaalt U de bovenstaande stappen voor de complexen MFNF-pre en MFNF-post met het gladde motief U6A. Gebruik antibiotica Fusidinezuur plus neomycine, en Fusidinezuur alleen, respectievelijk.
- Verwijder de buffer uit het monster goed, voeg vervolgens 20 μL van 1 μM biotinyated indringende DNA-streng toe en incuberen bij kamertemperatuur 's nachts. Spoel het gevormde DNA-mRNA duplex eenmaal af met TAM10 buffer.
- Verwijder de buffer uit het monster goed. Voeg vervolgens 20 μL van 0,5 mg/mL streptavidine gecoate magnetische parels in het monster goed en incuberen bij kamertemperatuur 2 uur.
- Steek het monster voorzichtig goed in een houder en plaats het in een centrifuge. Verwijder de vrije magnetische deeltjes van het oppervlak door gedurende 5 minuten te centrifugeren bij 84 x g .
4. magnetische en krachtmetingen
- De laser inschakelen
- Schakel de laser in met de toets. Druk vervolgens op de aan/uit-knop.
- Pas de gevoeligheid van de lock-in versterker 1 (LIA1) aan op 500 mV en wacht ongeveer 2 uur om op te warmen en de atomaire magnetometer te stabiliseren.
- De atomische magnetometer instellen
- Voer de instrument Control software uit en stel de Meetparameters in. Sommige parameters kunnen in elke meting enigszins afwijken.
Opmerking: de atomische magnetometer bestaat uit een laser (hierboven beschreven), een SR830 lock-in versterker (aangeduid als LIA1), een SR530 lock-in versterker (aangeduid als LIA2), DS345 (aangeduid als FG1) en ATF20B (aangeduid als FG2) functie generatoren, een hoge-resolutie motor en een computer. Al deze moeten worden ingeschakeld bij deze stap van het protocol. - Stel de bewegende modus van de motor in op ruis en de standaardpositie op 0. Druk op slot op voorpaneel, stel de gevoeligheid van LIA1 terug naar 200 mV.
- Pas de stroom en spanning van de laser aan en vind de juiste resonantie piek en signaal-ruisniveau. Druk op sweep op het voorpaneel. Opmerking de verhouding amplitude/breedte moet hoger zijn dan 0,5 en de fase waarde moet lager zijn dan 5 graden. Zo niet, voer dan de sweep-stap opnieuw uit.
- Plug-in de uitgang van LIA2 naar de feedback van de laser om de frequentie te vergrendelen. Deze versterker meet de optische rotatie van een hulp cesium cel om de laser frequentie op resonantie12te behouden. De toestand blijft tot het einde van de meting.
- Plug-in functiegenerator FG2 voor het invoeren van een vierkante Golf (500 mVpp, 100 mHz) als het referentiesignaal. De vierkante golf komt overeen met 100 pT en wordt gebruikt om de huidige uitgang van de versterker te converteren naar een magnetisch signaal. Koppel de functiegenerator los.
- Stel de motor bewegende modus in op twee richtings- en standaardpositie tot 260 mm. Controleer de status van de temperatuurregelaar om de juiste temperatuur (~ 37 °c) van de atoom sensor te garanderen.
- Controleer de stabiliteit van het hele systeem door twee keer de signalen van de lege monsterhouder te meten. Evalueer de stabiliteit en het geluidsniveau na aftrek van de twee sporen. Typische geluidsniveau en fluctuatie moet ± 2 pT zijn bij 30 MS integratie tijd.
- Voer de instrument Control software uit en stel de Meetparameters in. Sommige parameters kunnen in elke meting enigszins afwijken.
- Het monster magnetiseren
- Plaats het monster voorzichtig op het magnetisatie station en laat het 2 minuten blijven.
Opmerking: het magnetisatie station bestaat uit een permanente magneet (~ 0,5 T) en een plastic afstandhouder. - Plaats het monster terug in de monsterhouder. Gebruik 335,4 × g centrifugale kracht om de niet specifiek gebonden magnetische deeltjes te verwijderen.
- Plaats het monster voorzichtig op het magnetisatie station en laat het 2 minuten blijven.
- Magnetische metingen na het aanbrengen van krachten
- Gebruik pincet om het monster op de motor te laden. Klik op vergrendelen op het voorpaneel om het programma uit te voeren. Gebruik ondertussen een pincet om het andere monster in de houder te laden en in de centrifuge te plaatsen. Houd er rekening mee dat de gecoate glazen zijde het midden van de centrifuge moet worden geconfronteerd.
Opmerking: de techniek van Force-geïnduceerde restant magnetisatie spectroscopie (FIRMA'S) wordt gebruikt, die een atomische magnetometer gebruikt om het magnetische signaal van het monster te meten na het aanbrengen van mechanische kracht op de moleculaire interacties in het monster. Hier zijn de moleculaire interacties tussen de DNA-liniaal moleculen en de mRNA in het ribosoom complex. De kracht wordt stapsgewijs verhoogd door de centrifugale snelheid te verhogen. Na het aanbrengen van elke kracht vertaalt de motor het monster naar de atoom sensor en gaat vervolgens terug. Vandaar dat er twee magnetische veld profielen worden verkregen, één tijdens de voorwaartse scan en de andere tijdens achterwaartse scan13. We gebruiken deze laatste alleen om de piekhoogte te extraheren vanwege de betere signaal-ruis verhouding. De piekhoogte in stroom (nA) wordt omgezet in magnetische signaalamplitude (pT) op basis van de kalibratie vierkante Golf. - Elke meting duurt ongeveer 5 min. Wanneer de motor weer op 0 komt, klikt u op Opslaan op het voorpaneel. Gebruik zorgvuldig pincet om monsters te nemen van motor en centrifuge. Gebruik de initiële snelheid overeenkomend met 335,4 × g (2000 rpm, omwenteling per minuut voor de centrifuge vermeld in de tabel van de materialen).
- Wissel de twee monsters uit en breng een sterkere kracht aan door de centrifugale snelheid te verhogen met 100 rpm of een vergelijkbare stapgrootte. Proces afwisselend om de kracht geleidelijk te verhogen; een volledig kracht spectrum wordt verkregen na 10-12 gegevenspunten.
- Gebruik pincet om het monster op de motor te laden. Klik op vergrendelen op het voorpaneel om het programma uit te voeren. Gebruik ondertussen een pincet om het andere monster in de houder te laden en in de centrifuge te plaatsen. Houd er rekening mee dat de gecoate glazen zijde het midden van de centrifuge moet worden geconfronteerd.
- Het experiment afronden
- Wanneer alle geplande experimenten zijn voltooid, schakelt u de apparatuur uit en gaat u verder in de tegenovergestelde volgorde zoals deze is ingeschakeld.
- Verwijder de monsters van de houder en dompel ze onder in ethanol voor reiniging en toekomstig gebruik. Reinig de monsterhouder met aceton in geval van verontreiniging van de magnetische kralen.
- Data-analyse
- Open het python Analysis script en voer alle experimentele gegevens in. Klik op vierkant laden om de vierkante Golf als referentie in te voeren. Dan klikken Load baseline om het resterende magnetische signaal als achtergrond in te voeren.
- Definieer het totale magnetische signaal afname als B0. Normaliseer elk magnetisch signaal Verlaag b naar b0 en druk het af als een percentage. Plot het percentage (B/B0) versus centrifugale kracht om het spectrum van de bedrijven te verkrijgen.
Opmerking: de centrifugale kracht F wordt berekend uit de drijvende massa van de magnetische kralen m (4,6 × 10− 15 kg), centrifugale snelheid w en straal van de centrifuge r (7,5 cm hier) via vergelijking F = mw 2 r. de typische kracht resolutie is 2-4 PN en Force range is 15-95 PN in dit werk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont het detectie schema en de foto's van de belangrijkste componenten. Magnetische detectie wordt bereikt door een atomische magnetometer met behulp van het scanschema (Figuur 1A)13. Het monster wordt geplaatst op een staaf gemonteerd op een lineaire motor. De motor vervoert het monster naar de atoom sensor in een magnetisch schild en vervolgens terug naar de oorspronkelijke locatie voor het lossen. De atomische magnetometer detecteert het magnetische signaal tijdens de monster scan en produceerde een signaal tracering, met het maximale signaal wanneer het monster het dichtst bij de sensor ligt. Figuur 1 B toont de foto van het totale instrument. Figuren 1C, D tonen de foto's van de magnetisatie station en de centrifuge gebruikt voor kracht toepassing, respectievelijk.
Het principe van de dubbele DNA-liniaal test wordt weergegeven in Figuur 2. Het ribosoom complex wordt geïmmobiliseerd op het oppervlak via de 5 ' einde van de mRNA. Twee DNA-heersers zijn ontworpen om de exacte positie van het ribosome te sonde, één voor elke kant van de mRNA. Het huidige immobilisatie schema maakt de 3 ' kant gemakkelijk toegankelijk voor de indringende DNA heersers. Daarom kunnen DNA-oligomeren, geconjugeerd met magnetische kralen, duplexen vormen met de ongedekte mRNA. De 5 ' kant, echter, wordt steraal gehinderd door het ribosoom en het oppervlak. Een linker molecuul is dus nodig voor het DNA om de ongedekte mRNA aan deze kant te bereiken. Door de linker lengte te variëren, hebben we vastgesteld dat wanneer de linker langer is dan 50 T, we een sterk magnetisch signaal kunnen detecteren dat een succesvolle vorming van DNA-mRNA-duplexen aangeeft (Figuur 2B). De correlatie van dissociatie kracht tot duplex lengte wordt bereikt door het aantal NT op het DNA dat complementair is aan de mRNA te variëren. Figuren 2c,D tonen de correlatie voor respectievelijk de 3 '-en 5 '-zijden. Omdat de kracht verschil tussen duplexen van opeenvolgende lengtes meestal 12-20 pN en de kracht resolutie is meestal 2-4 pN, we routinematig bereiken single-NT resolutie voor de lengte van DNA-mRNA duplexen op basis van hun dissociatie krachten.
Figuur 3 presenteert de resultaten van normale translocatie bij afwezigheid en aanwezigheid van verschillende antibiotica. De translocatie is van MF-pre naar MF-post (Figuur 3A). De inzet geeft aan dat MF-pre lege tRNAFmet en MF-tRNAPHE op de P-en A-locaties vervoert. MF-post draagt tRNAFmet en MF-tRNAPHE op respectievelijk de E-en P-sites, met een leegstaande a-site. Figuur 3 B toont aan dat zonder antibiotica, het ribosoom beweegt door 3 NT aan beide zijden (verplaatsen naar de 3 '-end). Dit is om de volgende redenen: (i) de DNA-mRNA duplexen bij de 5 ' kant vertonen 12 BP en 15 BP bindende krachten in MF-pre en MF-post, respectievelijk. II) duplexen bij de 3 '-eind vertonen een omgekeerde verandering van 15 naar 12 BP (Figuur 3C). Wanneer echter zowel Fusidinezuur als neomycine aanwezig zijn, toont de kracht Spectra aan dat het ribosoom slechts met 1 NT aan de 5 ' kant beweegt, maar 2 NT aan de 3 ' zijde (Figuur 3D, E). Dit resultaat geeft aan dat het ribosoom transgevestigd via een stapsgewijze mechanisme, resulterend in een lus mRNA conformatie die een extra NT in het ribosoom heeft, die niet experimenteel geopenbaard eerder is geweest. Dit is consistent met gerapporteerde theoretische simulatie14. Als alternatief kan het ribosoom worden uitgerekt om te dekken 28 NT van mRNA, in plaats van de gebruikelijke 27 NT15. Na het wegwassen van de antibiotica, treedt normale translocatie op, zoals blijkt uit 3 NT bewegingen van zowel de 5 'en 3 'En (paarse sporen in Figuur 3D, E). De lus conformatie vormt geen vorm wanneer alleen Fusidinezuur wordt gebruikt. De kracht Spectra zijn consistent met de ribosoom beweging van 3 NT aan beide zijden, vergelijkbaar met de situatie voor normale translocatie (Figuur 3F, G). De dubbele liniaal assay onthult ook dat viomycine volledig geremd translocatie, zoals blijkt uit 0 NT beweging aan beide zijden (Figuur 3H, I).
We hebben ook onderzocht of deze looploze conformatie kan vormen op "-1" frame shifting motieven. Hier vindt de translocatie van MFNF-pre-en MFNF-post-complexen plaats op het ' U6A '-motief, dat is gevonden om deel uit te maken van het '-1 ' frame shifting-motief in HIV16. Figuren 4a, B tonen dat in de Mfnf-post, de DNA-mRNA duplex wordt verkort door ofwel 2 of 3 NT aan de 3 '-end; de duplex lengte wordt verhoogd met 2 of 3 NT op de 5 '-ends. De resultaten suggereren de coëxistentie van zowel normale translocatie en "-1" frame shifting, met de voormalige correleren met de 3-NT beweging en de laatste correleren met de 2-NT beweging. De dubbele liniaal test is in staat om de twee populaties duidelijk op te lossen. Met zowel neomycine als Fusidinezuur, merken we op dat het ribosoom beweegt met 2 NT aan het 3 '-uiteinde, maar slechts 1 NT aan de 5 '-end, respectievelijk (Figuur 4C, D). Daarom vindt ook de lus mRNA-conformatie plaats op de gladde sequentie. Wanneer alleen Fusidinezuur aanwezig is voor de MFNF-pre (Figuur 4E, F), is het resultaat hetzelfde als dat voor mfnf-post in panelen A en B (blauwe sporen), wat aangeeft dat Fusidinezuur alleen niet volstaat om translocatie of frame SHIFT te onderbreken. Daarom bevestigt het dat zowel Fusidinezuur als neomycine nodig zijn voor de ongelijke verplaatsingen voor de twee zijden van mRNA.
Figuur 1 : Instrumenten voor de op bedrijven gebaseerde dubbele DNA-liniaal test. A) Schematische voorstelling van de magnetische detectie. 1: monster en de steun; 2: motor; 3: atoom sensor en magnetisch schild. B) foto van de atoom magnetometer en het monsterbehandelings systeem. De getallen geven de feitelijke corresponderende componenten aan die in het schematisch weergegeven worden. Opmerking het magnetische schild bevindt zich in de kartonnen doos voor verbeterde thermische stabiliteit. C) magnetisatie station. D) centrifuge gebruikt voor toepassing met kracht. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Dubbele liniaal assay met single-NT resolutie voor het bestuderen van ribosoom translocatie. A) Schematische voorstelling van de dubbele liniaal test, waarbij twee DNA-linialen zijn ontworpen om respectievelijk de 5-en 3-uiteinden te sonde. De rode lijn geeft de polyT linker aan. (B) optimalisatie van de linker lengte voor de liniaal-in. (C) de bedrijven resultaten om de dissociatie krachten van de Duplexen tussen de liniaal-ins en mRNA te bepalen. D) dissociatie krachten van de Duplexen tussen de liniaal-outs en de mRNA. De foutbalk wordt gedefinieerd als de verhouding tussen het geluid van het instrument en de totale afname van het magnetische signaal (B0), met een typische waarde van ± 3-5%. Cijfer is gereproduceerd met toestemming9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Probing trans location stappen onder invloed van verschillende antibiotica. A) de probing-regeling voor de complexen MF-pre en MF-post. Inset geeft de schematische ribosomen in pre en post, die corresponderen met de massieve en met streepjes beklede ovalen, respectievelijk. (B, C) BEDRIJVEN resultaten zonder antibiotica. (D, E) Resultaten met zowel Fusidinezuur als neomycine. (F, G) Resultaten met Fusidinezuur. (H, I) Alleen resultaten met viomycine. Linker panelen: met behulp van liniaal-in te sonde de 5 ' zijde; rechter panelen: met behulp van de liniaal-uit te sonde de 3 ' zijde. De foutbalken worden op dezelfde manier berekend als in de vorige afbeelding. Cijfer is gereproduceerd met toestemming9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Bedrijven resultaten van het gebruik van dubbele linialen te sonde frame verschuiving. (a, B) MFNF-pre en MFNF-post zonder antibiotica. (C, D) Resultaten met zowel Fusidinezuur als neomycine. (E, F) Resultaten met alleen Fusidinezuur. Linker panelen: met behulp van de liniaal-in te sonde de 5 'a; rechter panelen: met behulp van de liniaal-uit te sonde de 3 ''side. De foutbalken worden op dezelfde manier berekend als in de vorige afbeelding. Cijfer is gereproduceerd met toestemming9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In onze dubbele liniaal testspelen de magnetische kralen twee essentiële rollen. Ten eerste dienen ze als de kracht transducers omdat de centrifugale kracht evenredig is aan hun drijvende massa. Ten tweede, de parels zijn signaal dragers gedetecteerd door een atomaire magnetometer, die momenteel de meest nauwkeurige magnetische sensor. Door mechanische manipulatie en magnetische detectie te combineren, kan de techniek van de FIRMA'S een groot aantal moleculaire interacties oplossen op basis van hun kritische dissociatie krachten, die de basis vormen van de DNA-heersers. De dubbele liniaal test is uniek geschikt voor het testen van beide zijden van mRNA tijdens translocatie. Omdat het een fysieke benadering is die alleen afhankelijk is van de vorming van de Duplexen, wordt het niet beperkt door de mRNA-zijden of andere biologische beperkingen. Dit is een voordeel ten opzichte van andere technieken die gebaseerd zijn op biochemische reacties. We hebben aangetoond dat met behulp van een lange linker molecuul, de linialen kunnen bereiken de beoogde binding site om te bepalen van de mRNA positie. Specifiek, voor het ribosome, de linker lengte is 50 T, die overeenkomt met 17 nm in lengte. Deze lengte is zeer dicht bij de grootte van het ribosoom17. De concentraties van de antibiotica zijn typische waarden uit de literatuur. Het is ook mogelijk om onze methode te gebruiken om de beginwaarden voor hun functies te onthullen.
Er zijn twee kritische aspecten voor de dubbele liniaal test. Een daarvan is het delicate Gefunctionaliseerde oppervlak voor moleculaire immobilisatie en daaropvolgende biologische reacties. Elke laad-en wasstap moet worden uitgevoerd met minimale verstoring van het oppervlak, zodat de moleculen die op het oppervlak worden geïmmobiliseerd, intact blijven. Voor het DNA-mRNA hybridisatie proces is voldoende tijd nodig om de voltooiing van het proces te garanderen. Het is ook aangeraden om TAM10 buffer met extra 1 M NaCl te gebruiken om een homeostatisch systeem te onderhouden. Het andere kritische aspect is de magnetisatie van de kralen. Aangezien overmatige kralen worden gebruikt, zijn er tal van vrije kralen niet geïmmobiliseerd op het oppervlak. Daarom, bij het magnetiseren van het monster, het gecoate oppervlak moet benaderen en laat de magneet verticaal. Elke kleine swing van het monster kan eventueel krassen veroorzaken op het oppervlak.
Onze dubbele DNA-liniaal test is momenteel de enige methode die objectief zowel de ingangs-als de uitgangszijde van mRNA in de ribosoom complexen met single-NT-resolutie kan testen. Nieuwe mechanistische informatie over ribosoom translocatie is verkregen. De methode is algemeen toepasbaar voor moleculaire verplaatsing van nucleïnezuren, die op grote schaal wordt aangetroffen in de moleculaire biologie.
Voor toekomstige ontwikkeling en toepassingen hebben we laten zien dat het gebruik van akoestische stralings kracht ter vervanging van de centrifugale kracht de kracht resolutie verder zal verbeteren, waardoor sub-NT regime18wordt bereikt. We onderzoeken ook Multiplexed detectie met behulp van atomaire magnetometers om de detectie-efficiëntie te verbeteren. Met deze verbeteringen verwachten we dat onze methode die in dit werk wordt beschreven, brede toepassingen in biologisch onderzoek zal vinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er werd geen potentiële belangenverstrengeling gerapporteerd door auteurs.
Acknowledgments
Dit werk wordt gesteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. erkent de steun van de Welch Foundation (E-1721).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
References
- Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).
- Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science. 345, 1188-1191 (2014).
- Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4, 479-486 (1998).
- Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).
- Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160, 870-881 (2015).
- Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).
- Chen, J., et al. Dynamic pathways of -1 translational frameshifting. Nature. 512, 328-332 (2014).
- De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA. Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation. RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).
- Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).
- Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance. Optics Letters. 35, 661-663 (2010).
- Yao, L., Xu, S. Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).
- Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics. Physical Biology. 5, 046005 (2008).
- Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
- Jacks, T., et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. Nature. 331, 280-283 (1988).
- Schuwirth, B. S., et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution. Science. 310, 827-834 (2005).
- Jia, H., Wang, Y., Xu, S. Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps. Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).
