Summary
Çift DNA cetvel tahlil ribozom translocation sırasında mRNA konumunu belirlemek için geliştirilmiştir, hangi oluşmuş DNA-mRNA dubliklerin ayrışma güçleri dayanır. Tek nükle çözünürlüğü ve mRNA 'nın her iki ucunda ulaşmanın yeteneği ile, ribozom translokasyon ve prob diğer nüklik asit yerleşimleri için mekanik öngörüler sağlayabilir.
Abstract
Ribozom translokasyon tam olarak üç nükleotid (NT) tarafından mRNA üzerinde ribozomal hareket anlamına gelir, hangi protein sentezi merkezi adımdır. Mekanizmasını araştırmak için iki temel teknik şart vardır. İlki, ribozom 'ın 3 NT 'den başka tarafından hareket ettiği frameshifting 'den normal translokasyon çözümünü çözebilecek tek NT çözünürlüğüyle olur. İkincisi, translocation tüm resmi aydınlatmak için mRNA giriş ve çıkış kenarlarını prob yeteneğine sahiptir. Biz DNA-mRNA duplexes kritik ayrışma güçleri dayanmaktadır çift DNA cetvel tahlil rapor, kuvvet kaynaklı kalıntı magnetizasyon spektroskopisi (firmalar) ile elde. 2-4 PN kuvvet çözünürlüğü ile çift cetvel tahlil farklı translokasyon adımlarını ayırt etmek için yeterlidir. Uzun bir bağlayıcı yoklama DNAs üzerinde uygulayarak, mRNA pozisyonu her iki taraf için belirlenecek şekilde ribosome karşı tarafında mRNA ulaşabilir. Bu nedenle, Çift cetvel tahlil benzersiz ribozom translocation araştırmak için uygundur, ve genel olarak nüklik asit hareketi. Biz bir ilmekledi mRNA konformasyonu ve frameshifting normal translokasyon çözüldü belirtilen temsili sonuçlar gösterir.
Introduction
Biomoleküler deplasman, ilgili biyolojik fonksiyonların mekanizmasını inceleyerek temel bir parametredir. Belirli bir örnek, ribozom 'in haberci RNA(mRNA) üzerinde tam olarak üç nükleotides (NT) ile hareket ettiği, normal olarak ve bir, iki ya da diğer NT numaralarıyla üç hariç, bir,2, ribozom geçiş konumdur. frameshifting. Bu nedenle, farklı adım boyutlarını ayırt etmek için bir moleküler cetvel sistemi tek NT çözünürlüğü gereklidir. Daha büyük bir zorluk hem giriş hem de çıkış taraflarında ribozom hareketini araştırmanız. Başka bir deyişle, sadece bir çift cetvel sistemi ile biz mRNA düzgün ribosome üzerinden dişli olup olmadığını ortaya çıkarmak mümkün olacak, ya da iki tarafın farklı adım boyutları içinde bir bükülen veya ilmekledi mRNA konformasyon yol olan ara adımlar vardır ribozom.
Ribozom (mRNA 3 ' sonu) çıkış tarafında farklı adımlar çözme ilk zorluk gidermek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Çift Lusiferaz tahlil farklı okuma çerçeveleri ortaya çıkan farklı proteinlerin oranlarını ölçmek tarafından giderir3,4. Sadece mRNA 3 ' End için geçerlidir ve böylece translocation tam bir resim sağlamak için yetersiz. Kütle spektrometresi, ilgili kod yeniden düzenlemelerinin sonucu olarak farklı peptit parçalarını analiz edebilir5. Ama mRNA üzerinde ribozom hamle kaç NT için tespit edemez. Toe-baskı tahlil ribozom doğru mRNA dönüştürme 3 '-distal ucunda astar ters transkriptaz kullanan başka bir ortak yöntemdir6. Ancak, ribosome giren mRNA 5 ' End için geçerli değildir. Tek molekül yaklaşımlar ve floresan yöntemleri7de dahil olmak üzere diğer teknikler, tek NT çözünürlüğü elde etmek zordur.
Biz benzersiz ribosome-mRNA kompleksler içinde açılan mRNA giriş ve çıkış konumlarını hem de belirleyebilirsiniz çift DNA cetvel assay geliştirdik. Cetvel DNAS, mRNA 'nın hangi ucunda olursa olsun, ribosome tarafından ortaya çıkarılan mRNA ile belirli sayıda basepairs (BP) ' nin dubleksler formunu içeren DNA oligomerdir. BP numaraları daha sonra translocation sırasında mRNA üzerindeki ribozom konumunu kesin olarak ortaya çıkarır. Dubliklerin BP numaraları, kuvvet kaynaklı kalıntı magnetizasyon spektroskopisi (firmalar)8' den elde edilen kritik ayrışma güçleri tarafından belirlenir. 2-3 pN kuvvet belirsizlik ile, kritik güçler tek NT çözünürlük sunmak için yeterlidir. DNA cetvelleri üzerinde bir bağlayıcı molekül uygulayarak, ribozom tarafından mRNA sterollerdir engellenmiş yan probed olabilir. Farklı ribozomal kesimleri böylece doğru çözülebilir. Biz başarıyla translokasyon9sırasında antibiyotikler tarafından sıkışmış mRNA benzersiz bir ilmekledi uyum ortaya koymuştur ve bir kaygan mRNA sırası10üzerinde birlikte farklı okuma çerçeveleri çözüldü. Bu makalede, ribozom kompleksleri hazırlanması, cam slaytlar yüzey functionalization, ribozom kompleksleri immobilizasyonu ve manyetik etiketli DNA cetvel ile hibridizasyon dahil çift cetvel tahlil, ayrıntılarını açıklar moleküller, Manyetik algılama ve kuvvet spektrum analizi FIRMALARı tarafından.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ribozom kompleksleri hazırlanması
- TAM10 tampon, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM mg (OAc)2, 30 mm NH4CL, 70 mm KCL, 5 mm EDTA, 7 mm BME (2-mercaptoethanol) ve% 0,05 Tween20 oluşur. 1.000
- Tablo 1' de listelenen beş karışımlar hazırlayın.
Not: ribozom MRE600 gerinim11oldu. EF-tu: uzama faktörü termo kararsız. EF-TS: uzama faktörü termo istikrarlı. GTP: guanozin trifosfat. PEP: phospho (enol) pyruvate. - Ribozom kompleksler yapmadan önce 25 dakika için 37 °c ' de beş karışımını ayrı olarak kulbe etme. Tablo 2başına beş ribozom kompleksleri hazırlayın.
Not: Post: translocation sonrası; Pre: ön translocation. - Her beş ribozom kompleksleri bir 1,1 M sakaroz yastık üzerine ayrı olarak, hacim oranı 1:1 ile ekleyin. Her bir ultra-santrifüjde 2 h için 450.000 × g ile arındırın. Süpernatant kaldırmak ve TAM10 tampon ile Pelet Resuspension sonra-80 °c ' de ribozom kompleksleri geri yüklemek için bir boru kullanın.
2. biotin kaplı cam kaydırakların hazırlanması
- Cam kaydırakların ön temizliği
- Kısa ve geniş cam çanak 60,0 × 4,0 × 0,3 mm3 (L × W × T) boyutları ile 12 cam slaytlar yerleştirin.
- Cam tabağı aseton ile doldurun ve 5 dakika boyunca sonikat yapın. Sonra 5 kez ultra saf su ile slaytlar yıkayın ve su ile çanak 3/4 doldurun.
- Yemek doldurmak ve 20 dakika boyunca cam slaytları sonikat için 10 M KOH ekleyin. slaytları 5 kez suyla yıkayın.
- Etanol ekleyin ve 5 dakika için sonikat, etanol dışarı dökün ve sonra ayrı olarak kuru 300 ° c 3 h.
- Aminosilan kaplama
- 12 temizlenmiş slaytları metanol içeren cam çanağa geri yerleştirin. 5 dakika sonicating tarafından metanol ile bir PEGylation Flask temiz, sonra 25 mL metanol, 1,25 mL su, 0,125 mL HAc, 0,25 mL 3-aminopropyltriethoxysilane (AYEO) ile doldurun.
- Hemen cam çanak içinde metanol hazırlanmış AYEO çözeltisi ile değiştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküye yapın.
- Slaytlar su ile birkaç kez durulayın, sonra azot Temizleme ile kurutun. Kuru slaytları temiz cam yemeklerle yerleştirin.
- PEGlation için
- NaHCO3 solüsyonu (8,4 mg/ml) ve pegylation tampon (37,5 mg Peg, 6 mg biyotinlenmiş Peg, 150 μL NaHCO3 çözeltisi) hazırlayın. 1 dakika 6.000 rpm at iplik tarafından iyi karıştırın.
- Her slaytta 25 μL PEG çözeltisi yerleştirin. Üstte diğer slayt ile kapak. İki slayt arasında hiçbir kabarcıklar olduğundan emin olun. Slaytları boş bir pipet ucu kutusuna yerleştirin. Kutunun tesviye olduğundan emin olun ve yaklaşık 3 saat boyunca koyu bir çekmeceye yerleştirin.
- Slaytları su ile durulayın ve tekrar kurutun. Kuru slaytları, 2 haftaya kadar vakum altında oda sıcaklığında saklayın.
3. manyetik ve kuvvet ölçümlerinden önce numune hazırlama
- Makine bir plastik örnek iyi boyutlar 4 × 3 × 2 mm3 (L × W × D) ile. Tutkal bir parça biotin-kaplamalı cam (yaklaşık 5 mm uzunluğunda, kesme 60 mm uzunluğunda slaytlar Bölüm 2 hazırlanmış) alt yüzey üzerinde epoksi kullanarak.
- Numunenin içine 20 μL 0,25 mg/mL streptavidin sulu solüsyonu ekleyin ve 40 dakika boyunca oda sıcaklığında inküye yapın. Daha sonra TAM10 tampon ile örneği iyi iki kez durulayın.
- Ribozom kompleksler immobilize.
- Antibiyotikler olmadan: örnek iyi bir tampon kaldırmak için bir pipet kullanın, sonra 20 μl 0,1 μM ribozom kompleks ekleyin (MF-pre veya MF-post) örnek iyi. Ribozom kompleksi, mRNA üzerinde 5 '-End biotin ile yüzeyde streptavidin ile bağlayacaktır. 37 °C ' de 1 saat boyunca inküye yapın ve sonra TAM10 tampon ile bir kez durulayın.
- Hem neomisin hem de Fusidik asit kullanan deney için: 37 °c ' de neomisin ile MF öncesi kompleksi 10 dakika boyunca inkük; 37 °C ' de 20 dakika boyunca Fusidik asit ile EF-G ' i kulbin. Konsantrasyonları aşağıdaki gibidir: 0,1 μm ribozom Complex, 2 μm EF-G, 4 mm GTP, 4 mm Pep, 0,02 mg/ml piruvat kinaz, 0,2 mm neomisin, ve 0,25 mm Fusidik asit.
- Diğer antibiyotik deneylerini benzer şekilde gerçekleştirin. Konsantrasyonları aşağıdaki gibidir: 0,2 mM viomisin, 0,4 mM higromisin B, ve 0,25 mM Fusidik asit.
- Frameshifting çalışma için, MFNF-pre ve MFNF-Post kompleksler için yukarıdaki adımları tekrarlayın kaygan motif U6A. kullanım antibiyotikler Fusidik asit artı neomisin, ve tek başına Fusidik asit, sırasıyla.
- Arabellek örnek iyi çıkarın, sonra 20 μl 1 μM biyotinlenmiş yoklama DNA iplikçik ekleyin ve oda sıcaklığında bir gecede inkübe. TAM10 tampon Ile oluşturulmuş DNA-mRNA dubleks bir kez durulayın.
- Arabellek örnek iyi kaldırın. Ardından, numunenin içine 20 μL 0,5 mg/mL streptavidin kaplı manyetik boncuk ekleyin ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında inküye yapın.
- Numuneyi dikkatle bir tutucuya takın ve santrifüjün içine yerleştirin. 84 x g 'de 5 dakika santrifügleme yaparak yüzeyden ücretsiz manyetik parçacıkları çıkarın.
4. manyetik ve kuvvet ölçümleri
- Lazer açma
- Anahtarı kullanarak lazeri açın. Ardından güç düğmesine basın.
- Kilit amplifikatörünün hassasiyetini 1 (LIA1) mV 500 olarak ayarlayın ve yaklaşık 2 saat ısınma ve atomik magnetometre stabilize etmek için bekleyin.
- Atomik manyetometrenin ayarlanması
- Enstrüman kontrol yazılımını çalıştırın ve ölçüm parametrelerini ayarlayın. Bazı parametreler her ölçümde biraz farklılık gösterebilir.
Not: atomik magnetometre bir lazer (yukarıda açıklanan), bir SR830 kilit amplifikatörü (LIA1 olarak adlandırılır), SR530 kilit amplifikatörü (LIA2 olarak adlandırılır), DS345 (FG1 olarak adlandırılır) ve ATF20B (FG2 olarak adlandırılır) fonksiyon jeneratörleri, yüksek çözünürlüklü motor ve bilgisayar. Tüm bunlar protokolün Bu adımda açık olmalıdır. - Motor hareketli modunu gürültü ve varsayılan konuma 0olarak ayarlayın. Lock tuşuna basın ön PANELINDE, LIA1 için geri 200 MV hassasiyetini ayarlayın.
- Lazerin geçerli ve gerilimini ayarlayın ve uygun rezonans zirvesine ve sinyal-gürültü seviyesini bulun. Ön paneldeki Sweep tuşuna basın. Not genlik/genişlik oranı 0,5 üzerinde olmalıdır ve faz değeri 5 derecelik daha az olmalıdır. Değilse, süpürme adımını yeniden yapın.
- Plug-in LIA2 çıkışı lazer geri bildirim frekansını kilitlemek için. Bu amplifikatör, rezonans12' deki lazer frekansını korumak için yardımcı bir sezyum hücresinin optik rotasyonunu ölçer. Durum ölçüm sonuna kadar kalır.
- Plug-in fonksiyon jeneratör FG2 giriş bir kare dalga (500 mVpp, 100 mHz) Referans sinyali olarak. Kare dalgası 100 pT 'ye karşılık gelir ve amplifikatörün geçerli çıkışını manyetik sinyale dönüştürmek için kullanılır. Fonksiyon jeneratörü çıkarın.
- Motor hareketli modunu iki yönlü ve varsayılan konuma 260 mm 'ye ayarlayın. atom sensörünün uygun sıcaklığını (~ 37 °c) sağlamak için sıcaklık kumandasının durumunu kontrol edin.
- Boş numune tutucusunun sinyallerini iki kez ölçerek tüm sistemin kararlılığını kontrol edin. İki izleri çıkararak istikrar ve gürültü seviyesini değerlendir. Tipik gürültü seviyesi ve dalgalanma 30 MS entegrasyon zamanında ± 2 pT olmalıdır.
- Enstrüman kontrol yazılımını çalıştırın ve ölçüm parametrelerini ayarlayın. Bazı parametreler her ölçümde biraz farklılık gösterebilir.
- Numuneyi magnetizing
- Numuneyi magnetizasyon istasyonuna hafifçe yerleştirin ve 2 dakika kalalım.
Not: magnetizasyon İstasyonu kalıcı bir mıknatıs (~ 0,5 T) ve plastik bir spacer oluşur. - Numuneyi örnek tutucuya geri koyun. Özellikle bağlı olmayan manyetik parçacıkları kaldırmak için 335,4 × g santrifüj kuvveti kullanın.
- Numuneyi magnetizasyon istasyonuna hafifçe yerleştirin ve 2 dakika kalalım.
- Kuvvetler uygulandıktan sonra manyetik ölçümler
- Örnek motor üzerine yüklemek için cımbız kullanın. Programı çalıştırmak için ön panelde Kilitle 'yi tıklatın. Bu arada, diğer numuneyi tutucuya yüklemek ve santrifüje yerleştirmek için cımbız kullanın. Kaplanmış cam tarafı santrifüjün merkezine yüz gerektiğini unutmayın.
Not: numunenin moleküler etkileşimlerinde mekanik kuvvet uygulandıktan sonra numunenin manyetik sinyalini ölçmek için bir atomik Manyetometre kullanan kuvvet kaynaklı kalıntı magnetizasyon spektroskopisi (fırmalar) tekniği kullanılır. Burada, moleküler etkileşimler, ribozom kompleksinde DNA cetvel molekülleri ve mRNA arasındadır. Santrifüj hızını artırarak kuvvet kademeli olarak artar. Her kuvvet uygulandıktan sonra, motor atom sensörüne örnek çevirir ve sonra geri hareket eder. Bu nedenle, iki manyetik alan profilleri elde edilir, bir ileri tarama sırasında ve geriye doğru tarama sırasında diğer13. Biz sadece daha iyi sinyal-gürültü oranı nedeniyle tepe yüksekliği ayıklamak için ikinci kullanın. Mevcut en yüksek yükseklik (nA), kalibrasyon kare dalgasına dayalı olarak manyetik sinyal genliğine (pT) dönüştürülür. - Her ölçüm yaklaşık 5 dakika sürmektedir. Motor 0 ' a döndüğünde ön panelde Kaydet 'i tıklayın. Dikkatle motor ve Santrifüjden örnekleri almak için cımbız kullanın. 335,4 ' e karşılık gelen başlangıç hızını kullanın × g (2000 rpm, malzeme tablosundalistelenen santrifüjün dakika başına devrim).
- İki numuneyi değiş tokuş ederek santrifüj hızını 100 rpm veya benzer adım boyutuna artırarak daha güçlü bir kuvvet uygulayın. Süreci dönüşümlü olarak kademeli kuvvet artırmak için; 10-12 veri noktalarının ardından tam bir kuvvet spektrum elde edilir.
- Örnek motor üzerine yüklemek için cımbız kullanın. Programı çalıştırmak için ön panelde Kilitle 'yi tıklatın. Bu arada, diğer numuneyi tutucuya yüklemek ve santrifüje yerleştirmek için cımbız kullanın. Kaplanmış cam tarafı santrifüjün merkezine yüz gerektiğini unutmayın.
- Deneyi bitirme
- Planlanan tüm deneyler tamamlandığında, donanımı kapatın ve açık olduğu gibi ters düzende devam etme.
- Tutucunun örneklerini çıkarın ve temizlik ve gelecekteki kullanım için etanol içine batırın. Manyetik boncuk kontaminasyonu durumunda aseton ile örnek tutucuyu temizleyin.
- Veri Analizi
- Python çözümleme komut dosyasını açın ve tüm deneysel verileri girin. Referans olarak kare dalgayı girmek için Yük Meydanı 'nı tıklayın. Sonra arka plan olarak giriş kalan manyetik sinyali için temel Yükle 'yi tıklatın.
- Genel manyetik sinyal azalmayı B0olarak tanımlayın. Her manyetik sinyal azalma b b 0 ve yüzde olarak ifade normalleştirmek. FIRMALAR spektrumunu elde etmek için yüzde (B/B0) karşı santrifüj kuvveti çizin.
Not: santrifüj kuvvet f , manyetik boncuk m (4,6 × 10− 15 kg), santrifüjlü hız w ve radyal r (7,5 cm burada) denklemi ile f = mw batmaz kütlesinden hesaplanır 2 r. tipik kuvvet çözünürlüğü 2-4 PN ve kuvvet aralığı 15-95 PN bu iş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 , önemli bileşenlerin algılama düzenini ve fotoğraflarını gösterir. Manyetik algılama, tarama düzenini kullanarak atomik Manyetometre ile elde edilir (Şekil 1A)13. Numune, doğrusal bir motora monte edilmiş bir çubuk üzerine yerleştirilir. Motor, numuneyi Manyetik kalkan içindeki atomik sensörüne aktarır, sonra da boşaltılması için orijinal siteye geri döner. Atomik magnetometre, numune taraması sırasında manyetik sinyali algılar ve numune sensörüne en yakın olduğunda maksimum sinyal ile bir sinyal izi üretti. Şekil 1 B , genel aracın fotoğrafını gösterir. Rakamlar 1C, D magnetizasyon İstasyonu ve kuvvet uygulama için kullanılan santrifüjün fotoğrafları sırasıyla gösterir.
İkili DNA cetvel tahlil prensibi Şekil 2' de gösterilir. Ribozom kompleksi, mRNA 'nın 5 ' ucunu kullanarak yüzeyde immobilize edilir. İki DNA cetvelleri, mRNA 'nın her tarafı için bir ribosome pozisyonunu tam olarak araştırmak için tasarlanmıştır. Geçerli immobilizasyon düzeni 3 ' tarafında kolayca yoklama DNA cetvelleri için erişilebilir hale getirir. Bu nedenle, manyetik boncuklar ile konjuge DNA oligomerler açığa mRNA ile Dublörler oluşturabilir. Ancak 5 ' yan, ribozom ve yüzey tarafından sterollerdir engellenmiştir. Bu nedenle, DNA 'nın bu tarafta bulunan mRNA 'ya ulaşması için bir bağlayıcı molekül gereklidir. Bağlayıcı uzunluğu değiştirerek, biz bağlayıcı daha uzun olduğunda tespit ettik 50 T, biz DNA-mRNA dubleksler başarılı oluşumunu gösteren güçlü bir manyetik sinyal algılayabilir (Şekil 2B). Çift taraflı uzunlukta ayrışma kuvvet korelasyon mRNA tamamlayıcı olan DNA NT sayısını değiştirerek elde edilir. Rakamlar 2C,D göstermek için korelasyon 3 '-ve 5 '-taraf, sırasıyla. Ardışık uzunlukları dubleksler arasındaki kuvvet farkı genellikle 12-20 PN ve kuvvet çözünürlüğü genellikle 2-4 PN, biz rutin kendi ayrışma güçleri dayalı DNA-mRNA dubleksler uzunluğu için tek NT çözünürlük elde.
Şekil 3 devamsızlık ve çeşitli antibiyotiklerin varlığı normal translokasyon sonuçlarını sunar. Translokasyon MF öncesi MF-post (Şekil 3A) ' dan. Inset, MF pre 'nin P-ve A-sitelerinde boş tRNAFmet ve MF-tRNAPhe 'i sırasıyla taşıdığını gösterir. MF-Post, sırasıyla E-ve P-sitelerinde, boş A-sitesi ile tRNAFmet ve MF-tRNAPhe taşır. Şekil 3 B gösterir antibiyotikler olmadan, ribozom hareket 3 NT tarafından her iki tarafta (3 '-End doğru hareket). Bunun nedeni aşağıdaki nedenlerden dolayı: (i) 5 ' Side sergisinde DNA-mRNA dubleksler 12 BP ve 15 BP bağlayıcı güçleri MF-pre ve MF-Post, sırasıyla. (ii) 3 ' End 'deki dubleksler, 15 ila 12 BP (Şekil 3C) tersine çevrilmiş bir değişiklik sergiler. Ancak, her iki Fusidik asit ve neomisin mevcut olduğunda, kuvvet Spectra ribozom sadece 5 ' Side ama 2 NT 3 ' tarafında (Şekil 3D, E) 1 NT hareket gösterir. Bu sonuç, ribozom bir step mekanizması ile transloke, daha önce deneysel olarak ortaya değil ribozom içinde fazladan bir NT olan bir ilmekledi mRNA konformasyon sonucu gösterir. Bu, bildirilen teorik simülasyon14ile uyumludur. Alternatif olarak, ribozom her zamanki 27 NT15yerine, mRNA 28 NT kapsayacak şekilde uzanmış olabilir. Antibiyotiklerin yıkandıktan sonra, normal translokasyon oluşur, her ikisi de 3 NT hareketler tarafından kanıtlandığı gibi 5 ın ve 3 \ tarafı (mor iz Şekil 3D, E). Sadece Fusidik asit kullanıldığında döngülü konformasyon oluşturmaz. Kuvvet spektrum her iki tarafta 3 NT ribozom hareketi ile tutarlı, normal translokasyon için duruma benzer (Şekil 3F, G). Çift cetvel tahlil de viomisin tamamen translocation, her iki tarafta 0 NT hareketi tarafından gösterildiği gibi engellenmiş ortaya çıkarır (Şekil 3H, ı).
Biz de bu ilmekledi konformasyon "-1" frameshifting motifleri üzerinde olabilir olup olmadığını araştırdık. Burada, mfnf-pre ve mfnf-Post kompleksleri gelen translokasyon ' U6yer alır A ' motif, HIV16'-1 ' frameshifting motif bir parçası olarak bulunmuştur. Rakamlar 4A, B göstermek bu mfnf-Post, DNA-mRNA Dubleks ya 2 veya 3 NT tarafından kısaltılmış 3 '-End; Çift taraflı uzunluk 5 ' inde 2 veya 3 NT ile artar. Sonuçlar, her iki normal translokasyon ve "-1" frameshifting, eski 3-NT hareket ve ikinci 2-NT hareketi ile ilişkilendirerek ile korelasyon ile birlikte varlığını önerir. Çift cetvel tahlil açıkça iki nüfus çözmek mümkün. Hem neomisin hem de Fusidik asit ile, ribozom 'ın 3 '-End ama sadece 1 NT 'de 2 NT 'ye sırasıyla (Şekil 4C, D) 5 \ End 'de hareket ettiğini gözlemliyoruz. Bu nedenle, ilmekledi mRNA uyum da kaygan sırada yer alır. Sadece Fusidik asit mfnf için mevcut olduğunda-Pre (Şekil 4E, F), sonuç olarak aynı olan mfnf-Post paneller A ve B (mavi izleri), fusidik asit tek başına duraklatmak için yeterli olmadığını belirten translokasyon veya frameshift. Bu nedenle, hem Fusidik asit ve neomisin mRNA iki tarafı için eşit olmayan yerleşimler için gerekli olduğunu doğrular.
Şekil 1 : Firmalar-tabanlı ÇIFT DNA cetvel tahlil Için Araçlar. (A) manyetik algılama şematik. 1: numune ve montajı; 2: motor; 3: atomik sensör ve Manyetik kalkan. (B) atomik Manyetometre ve numune işleme sisteminin fotoğrafı. Sayılar şematik olarak gösterilen gerçek ilgili bileşenleri gösterir. Manyetik kalkan, geliştirilmiş termal stabilite için karton kutunun içinde olduğunu unutmayın. (C) magnetizasyon istasyonu. (D) kuvvet uygulaması için kullanılan Santrifüjü. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Ribozom translocation eğitim için tek NT çözünürlüğü ile çift cetvel assay. (A) iki DNA cetvelinin sırasıyla 5 \ ve 3 ' ü-bitleri araştırması için tasarlanmış çift cetvel tahlil şematik. Kırmızı çizgi polyT linker gösterir. (B) cetvel-in için bağlayıcı uzunluğunun optimizasyonu. (C) firmalar, cetvel-Ins ve mRNA arasındaki dubleklerin dağılma güçlerini belirlemektir. (D) cetvel-çıkışları ve mRNA arasındaki dubliklerin dissociation güçleri. Hata çubuğu, enstrüman gürültüsü ile genel manyetik sinyal azalması (B0) arasındaki oran olarak tanımlanır, tipik değeri ± 3-5%. Rakam9izni ile yeniden üretildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Çeşitli antibiyotiklerin etkisi altında translokasyon adımları probing. (A) MF pre ve MF Post kompleksler için yoklama şeması. Inset, pre ve post 'taki şematik ribosomları, sırasıyla katı ve tire ile astarlanmış oval panelleri gösterir. (B, C) FIRMALAR antibiyotiklerle sonuçlanır. (D, E) Fusidik asit ve neomisin ile sonuçlanır. (F, G) Sadece Fusidik asit ile sonuçlanır. (H, ı) Sadece viomisin sonuçları. Sol paneller: cetvel-ın 5 ' tarafı Probe kullanarak; sağ paneller: 3 ' tarafı araştırmak için cetvel-Out kullanarak. Hata çubukları, önceki şekilde aynı şekilde hesaplanır. Rakam9izni ile yeniden üretildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Şirketler, frameshifting araştırması için çift cetveller kullanarak sonuçlanır. (A, B) MFNF-pre ve MFNF-Post antibiyotik olmadan. (C, D) Fusidik asit ve neomisin ile sonuçlanır. (E, F) Sadece Fusidik asit ile sonuçlar. Sol paneller: cetvelin kullanarak 5 tarafında Probe; sağ paneller: cetvel-Out kullanarak 3 tarzı yan Probe. Hata çubukları, önceki şekilde aynı şekilde hesaplanır. Rakam9izni ile yeniden üretildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bizim çift cetvel tahlil, manyetik boncuklar iki temel roller oynar. İlk olarak, onlar güç dönüştürücülerinin olarak hizmet vermektedir, çünkü merkezkaç kuvveti onların batmaz kütle ile orantılı. İkincisi, boncuklar, şu anda en doğru manyetik sensör olan atomik Manyetometre ile algılanan sinyal taşıyıcılarıdır. Mekanik manipülasyon ve manyetik algılamayı birleştiren fırmalar tekniği, DNA cetvellerinin temeli olan kritik dağılma kuvvetlerine göre çok sayıda moleküler etkileşimi çözebilir. Çift cetvel tahlil benzersiz translocation sırasında mRNA her iki tarafını prob için uygundur. Sadece duplexes oluşumuna dayanan fiziksel bir yaklaşım olduğu için, mRNA yan veya diğer biyolojik sınırlar ile sınırlı değildir. Bu, biyokimyasal reaksiyonlara dayanan diğer tekniklere kıyasla bir avantajdır. Biz uzun bir bağlayıcı molekül kullanarak, cetveller mRNA konumunu belirlemek için hedeflenen bağlama sitesine ulaşabilir göstermiştir. Özellikle, ribosome için bağlayıcı uzunluğu 50 T, hangi karşılık gelen 17 nm uzunluğunda. Bu uzunluk ribozom17boyutuna çok yakındır. Antibiyotiklerin konsantrasyonları literatürden tipik değerlerdir. Fonksiyonlarımızın başlangıç değerlerini ortaya çıkarmak için yöntemimizi kullanmak da mümkündür.
Çift cetvel tahlil için iki kritik yönleri vardır. Biri moleküler immobilizasyon ve sonraki biyolojik reaksiyonlar için hassas functionalized yüzeydir. Her yükleme ve yıkama adımının yüzeye en az bozulma ile yapılmalıdır, böylece yüzeyde immobilize moleküller bozulmamış kalacaktır. DNA-mRNA hibridizasyon süreci için, işlemin tamamlanmasını sağlamak için yeterli zaman gereklidir. Ayrıca, homeostatik bir sistem korumak için ekstra 1 M NaCl ile TAM10 tampon kullanmak için tavsiye edilir. Diğer kritik yönü boncukların magnetizasyon olduğunu. Aşırı boncuklar kullanıldığı için, yüzeyde immobilize olmayan bol miktarda ücretsiz boncuk vardır. Bu nedenle, numunenin mıknatıslanırken, kaplanmış yüzey yaklaşmalı ve mıknatıslı dikey olarak bırakmalıdır. Numunenin herhangi bir küçük salıncak muhtemelen yüzeyde çizilmeye zarar neden olabilir.
Bizim çift DNA cetvel tahlil Şu anda objektif tek-NT çözünürlüğü ile ribozom kompleksleri mRNA giriş ve çıkış kenarlarını prob olabilir tek yöntemdir. Ribozom translokasyon ile ilgili yeni mekanik bilgiler elde edilmiştir. Yöntem genellikle moleküler biyolojide yaygın olarak karşılaşılan nükserik asitlerin moleküler deplasmanında uygulanabilir.
Gelecekteki gelişim ve uygulamalar için, biz radyal kuvvet değiştirmek için akustik radyasyon kuvveti kullanarak daha da kuvvet çözünürlüğü artıracak, Sub-NT rejimi18ulaşan göstermiştir. Biz de algılama verimliliğini artırmak için atomik magnetometre kullanarak Multiplexed algılama araştırıyoruz. Bu gelişmeler ile, bu çalışmanın ayrıntılı yöntemi biyolojik araştırma geniş uygulamalar bulacaksınız bekliyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar tarafından hiçbir potansiyel ilgi çatışması bildirildi.
Acknowledgments
Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01GM111452, Y.W., S.X.) tarafından desteklenmektedir. Y. W. Welch Vakfı (E-1721) desteğini onaylar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
References
- Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).
- Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science. 345, 1188-1191 (2014).
- Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4, 479-486 (1998).
- Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).
- Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160, 870-881 (2015).
- Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).
- Chen, J., et al. Dynamic pathways of -1 translational frameshifting. Nature. 512, 328-332 (2014).
- De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA. Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation. RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).
- Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).
- Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance. Optics Letters. 35, 661-663 (2010).
- Yao, L., Xu, S. Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).
- Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics. Physical Biology. 5, 046005 (2008).
- Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
- Jacks, T., et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. Nature. 331, 280-283 (1988).
- Schuwirth, B. S., et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution. Science. 310, 827-834 (2005).
- Jia, H., Wang, Y., Xu, S. Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps. Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).
