Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעשיר, לבודד, לזהות, ולאפיין חלבונים ששונו על-ידי סומו ב vivo הן של תאי hepatoma אנושיים וגידולים בכבד שהתקבלו מדגמי העכבר של קרצינומה hepatocתאיים באמצעות ישויות כריכת סומו (SUBEs).
Abstract
שינוי לאחר ההעברה הוא מנגנון מפתח המסדיר הומאוסטזיס חלבון ותפקוד בתאי איקריוטית. בין כל החלבונים אוביקוויב כמו בסרטן הכבד, השינוי על ידי סומו (משנה אוביקוויב קטן) ניתנה את תשומת הלב ביותר. בידוד של חלבונים SUMOylated vivo הוא מאתגר בשל נוכחותם של הפרוטסים ספציפיים סומו ספציפי. מחקרים ראשוניים של סומולציה בvivo התבססו על זיהוי מולקולרי של חלבונים מיוחדים (למשל, באבן חשופה מערבית). עם זאת, במקרים רבים, נוגדנים, שנעשו בדרך כלל עם חלבון רקומביננטי לא שונה, לא immunoprecipitate צורות SUMOylated של חלבון הריבית. כרומטוגרפיה ניקל כבר הגישה השנייה כדי ללמוד סומולציה על ידי לכידת histidine-מתויג גירסאות של מולקולות סומו. גישה זו משמשת בעיקר תאים ביטוי באופן מצער או מנוכר עם מולקולות שלו סומו. כדי להתגבר על מגבלות אלה, הגורמים לתיחום הסומו (SUBEs) פותחו כדי לבודד חלבונים מבוססי מסוגני SUMOylated. להלן, אנו מתארים את כל הצעדים הדרושים עבור העשרה, בידוד, וזיהוי של מצעים SUMOylated מתאי hepatoma אנושיים ורקמות הכבד ממודל העכבר של סרטן באמצעות SUBEs. ראשית, אנו מתארים שיטות מעורבות הכנת והליזה של תאים האדם hepatoma ודגימות רקמות הכבד הגידול. לאחר מכן, הסבר מעמיק של הכנת SUBEs ובקרות מפורט יחד עם הפרוטוקול עבור החלבון משוך למטה assays. לבסוף, כמה דוגמאות מסופקים לגבי האפשרויות הזמינות לזיהוי ואפיון של פרוטדום SUMOylated, כלומר השימוש בניתוח כתמי מערביות לאיתור מצע SUMOylated ספציפי מגידולים בכבד או השימוש של פרוטאוומיקס על ידי ספקטרומטר מסה עבור אפיון תפוקה גבוהה של הפרוטאום SUMOylated ו interactome בתאי hepatoma.
Introduction
סרטן הכבד הוא הסרטן השכיח ביותר ברחבי העולם ואת הגורם השני של מקרי מוות הקשורים לסרטן1. הפטאותאי קרצינומה (HCC) היא הצורה השכיחה ביותר של סרטן הכבד העיקרי. מבחינה היסטורית, גורמי סיכון משותפים לפיתוח HCC כללה דלקת כבד B או זיהום C וצריכת אלכוהול מתעלל. בעשורים האחרונים, תסמונת מטבולית, סוג 2 סוכרת שומן מחלת כבד שומני (NAFLD) התפתחה כגורמי סיכון להתפתחות של HCC2. HCC הוא הטרוגנית מאוד, גם פנופנבד וגנטית, שבו רשת מורכבת של מסלולים איתות מובהרים. בשנים האחרונות, למרות שחלה עלייה בידע שלנו על המסלולים המולקולריים המעורב בפתוגנזה של HCC, עדיין אין גישות טיפוליות יעילה עבור ההנהלה HCC. מסלולים רבים מופעלים HCC ו מעכב אחד בדרך כלל כוננים את הפיצוי על ידי מסלולים אחרים3. זה היה אחד הקשיים העיקריים בעת טיפול HCC. כך, גישה גלובלית יותר עשויה לספק גישה טיפולית פוטנציאלית לניהול קליני של סרטן הכבד למשל, מיקוד שינויים לאחר העברה (לפטין), כמו מסלולים איתות מרובים יכולים להיות מוסדר בו על ידי לפטין מספר החלבונים.
שינויים פוסט-טרנסלוניים נחשבים כמנגנוני מפתח ויסות הומאוסטזיס חלבון ופונקציות4. שינויים מבניים ופונקציונליים מוצגים על ידי פטין, ובכך, הגדלת גיוון פרוטדום. מערכת ההצטננות השכיחה ביותר כוללת זרחון, מתילציה, מרחלציה, גליקוזילציה, אוביקווינציה, והקמה של חלבונים מבוססי אוביקוויב (בעלי בולים). בין כל UbLs שינוי חלבון על ידי סומו (משנה אוביקוויב קטן) משכה תשומת לב בקשר עם תפקידה הקריטי במגוון של תהליכים סלולריים, כולל תמלול, לוקליזציה סלולרית, תיקון DNA, והתקדמות מחזור התא 5. לאחרונה, סומולציה הוכח להשתנות בסרטן הכבד6,7,8,9, ושינויים בסומולציה של חלבונים ספציפיים תוארה לשחק תפקיד בהתקדמות של מחלות הקשורות לסרטן9.
ב יונקים, יש חמישה פראלוגוס סומו, סומו -1 כדי סומו-5. עד היום, אין ראיות נסיוניות זמין על קיומו של סומו אנדוגני-4 ואנדוגני סומו-5 תגובות הקונגניים ברמת החלבון10,11,12. סומולציה ביונקים מבוצע על ידי מדורגים מוגמטית אנזירול-אסתר מעורבים בשלושה אנזימים, האנזים הheterodimeric סומו הפועל (SAE1/SAE2) או E1, האנזים מצובת סומו (Ubc9) או E2 ו סומו-E3-ligase ספציפי עבור כל חלבון מטרה. הפעולה של כמה משפחות של סומו E3s נראה להיות בשיווי משקל דינמי עם החיידקים ספציפיים סומו (החשוד s או SENPs)13 מה שהופך את תגובת הסומולציה הפיכה מאוד. כמו-כן, קיים רק חלק קטן מחלבון ה-SUMOylated לעומת החלבון הכולל שאינו מואילל. ובכך, בידוד חלבונים בלתי מוגניים בvivo הוא מאתגר למדי13.
סומולציה בvivo למדה בתחילה על ידי אבן החשופה המערבית באמצעות נוגדנים נגד חלבון הריבית14. Immunoprecipitation של החלבון בוצע עם נוגדנים ספציפיים ואז הכתם המערבי העמוד בוצע עם נוגדנים אנטי סומו. הבעיה העיקרית עם אסטרטגיה זו היא כי נוגדנים שנוצרו נגד חלבון רקומביננטי לא שונה לא תמיד מסוגלים לimmunoprecipitate את הצורה SUMOylated של חלבון. לחילופין, כרומטוגרפיה ניקל לאחר הביטוי הארעי של היסטידין מתויג (His6) גירסאות של מולקולות סומו ואת החלבון של הריבית שימש לחקר סומולציה בתאים. על בסיס זה, זה יהיה יותר נוח לזהות טפסים ששונו סומו מתאים באופן בלתי נשכח His6-סומו15. עבור במחקרים vivo, מוטיבים לאינטראקציה עם הסומו (SIM) מבוסס על העשרה מבוססי הפגינו לטיהור של שערי מעלה פוליסומו16. קבוצות אחרות כבר באמצעות מתויג-מתויגים הנוגדן הגישות סומו מתן כלי אפשרי לחקור את סומולציה בתאי הראשי, רקמות, ואיברים17,18. ולאחרונה, נילסן ועמיתיו השתמשו העשרה נוגדן מבוסס לזהות אנדוגני ו סומו ספציפי לאתר בתאים ורקמות19.
על מנת לספק מידע משלים על התפקיד של סומולציה ב vivo, ישויות כריכת סומו (SUBEs), הידוע גם בשם מלכודות סומו, פותחו20. של רלוונטיות, ישויות כריכה של אוביקוויב (מנורות) נחשבות מקדימות רעיונית של SUBEs וכלים זמינים מסחרית לאיתור ובידוד של חלבונים polyubiquitylated21. SUBEs הם רקומביננטי חלבונים המרכיבים חוזר טנדם של סימס ובכך לזהות מולקולות סומו על חלבונים שהשתנו עם עלייה בזיקה הכוללת של מצעים סומו. מלכודות סומו הונדסו על ידי הצגת מוטיבים RNF4-הנגזרים ליגאז-SIM2 וSIM3 במקביל, לתוך וקטור המכיל גלוטתיון S-transferase (gt), מנשא חלבון הטרוולוגי20. למרות SUBEs לא ניתן להשתמש כראוי כדי לזהות מונו-SUMOylated חלבונים היעד, שיטה זו מספקת כלי כדי להקל על טיהור וזיהוי של חלבונים היעד פולי סומו ב vivo. להלן, אנו מתארים את היישום של SUBEs לבודד חלבונים SUMOylated הן בתאי hepatoma האדם ביופסיה של הכבד העכבר, כלי חשוב למחקר של סרטן הכבד. ערכה כוללת של הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מוצגת באיור 1.
Protocol
כל הניסויים אושרו על ידי ועדות מוסדית CIC bioGUNE עבור טיפול בעלי חיים וטיפול. כל המאמצים נעשו כדי למזער את הסבל בעלי חיים ולהקטין את מספר בעלי החיים ששימשו. השתמשו בשלושה חודשים גליצין N-מתילטרנספאז (gnmt) לקוי (gnmt-למעלה) וסוג הפראי שלה (gnmt+/+) שימשו.
1. תא הכנה והליזה
הערה: להלן, הא-7 (קו התאים האנושי hepatoma) ו THLE2 (קו התא של האדם הכבד) שימשו.
- לשמור על תאים בP100 לוחות במדיית הצמיחה הסטנדרטית ב 37 ° c בתוך האווירה מחולל לחות של 5% CO2-95% לחות.
- לגדול תאים בציפוי P100 לוחות בצפיפות של 1.2 – 1.5 × 106 תאים לכל מנה על ידי ספירת התאים באמצעות המוגלובין נויבאואר למדוד בחדר ספירת.
- תרבות הא-7 ב-DMEM שיושלם עם 10% סרום של שור עוברי (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוריטיצין B (PSA) ו 1% גלוטמין.
- תרבות THLE2 תאים במטבח התרבות מצופה מראש עם 0.01 mg/mL fibronectin, 0.01 mg/mL סרום הזרע אלבומין (BSA) ו 0.03 mg/mL סוג קולגן אני מומס בינונית צמיחה אשר מורכב ברונכיט הצמיחה תאים אפיתל בסיס בינונית (באג) שיושלם עם גורמי גדילה (0.4% bpe, 0.1% אינסולין, 0.1% הידרוקורטיזון, 0.1% retinoic חומצה, 0.1% transferrin, 0.1% תריודוטירונין, כמו גם 10% fbs, 1% PSA, 5 ng/ml מקדם גידול באפידרמיס (egf) ו-70 ng/ml פוספולאנאמין.
- בנקודת הסיום של הניסוי, מחית את המדיה מהלוחות ומכבסת תאים עם 5 מ ל של תמיסת מלח סטרילית באגירה של 1 x (PBS). Lyse תאים ישירות על הצלחת להציב על הקרח באמצעות 500 μL של מאגר לפירוק (50 mM Tris pH 8.5, 150 mM הנאקל, 5 מ"מ EDTA, 1% nonidet P-40 (NP40), שיושלם עם השלם EDTA ללא מעכב פרוטאז בחינם ו50 μM PR-619 עבור כל P100 מנה. באמצעות מגרד התא, בעדינות לגרד את התאים מהחלק התחתון של הצלחת לתוך המדיום לליזה.
הערה: בדוק כי כל התאים מנותקים מהצלחת על ידי בדיקה חזותית בסיס הצלחת לאחר הטיפול. - לחילופין, לקצור את התאים על ידי טריסיזציה על-ידי הוספת מדיית התאים ולהוסיף 1 מ ל של 1x (0.05%) טריפסין-אדטה לצלחת, מספיק כדי לכסות את התאים והצבת הצלחת בחממה להגדיר ב 37 ° c, 5% CO2, ו 95% לחות עבור ~ 5 דקות להבטיח את כל התאים התנתק מלוחית. להוסיף 2 מ ל של מדיום צמיחה מראש מחומם על מנת לעצור טריסיזציה. צנטריפוגה ב 150 g במשך 10 דקות. ומף את הסופרנטאנט לשטוף עם PBS 1x ו צנטריפוגה ב 150 x g עבור 10 דקות. לאחר משחת supernatant, להוסיף 500 μL של מאגר הליזה (50 mM Tris pH 8.5, 150 mM הנאקל, 5 מ"מ EDTA, 1% NP40, שיושלם עם השלם EDTA ללא מעכב פרוטאז בחינם ו50 μM PR-619 עבור כל מנה P100.
הערה: התוספת של PR-619 היא קריטית. - צנטריפוגה ב 15,500 x g ו 4 ° צ' עבור 10 דקות. להעביר את supernatant לצינור אחר ולהשליך את הגלולה.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ולקבל דגימות שאוחסנו ב-80 ° c עד לניתוח נוסף.
2. הכנת רקמה ולוליזיס
- על הקרבת בעלי חיים, לאסוף כבדי העכבר, לשטוף עם קר PBS, ו להצמיד להקפיא מיד בחנקן נוזלי. יש לאחסן את הדגימות-80 ° צ' עד לניתוח נוסף.
- הומוגון 75 mg שברים מתוך הצמד קפוא/או כבדים טריים ב 1 מ ל של מאגר לפירוק קרח קר (50 mM Tris pH 8.5, 150 מ"מ מילימטר, 5 מ"מ EDTA, 1% NP40, שיושלם עם השלם EDTA ללא מעכב פרוטאז מעכבי ו 50 μM PR-619). הפעל את ההומוגניצר ב 6500 x rpm, 2 x 60 s כל אחד, עם 30 s הפוגה (ראה לוח חומרים).
- צנטריפוגה את הדגימות microfuge בתוך 15, 500 x g ו 4 ° צ' עבור 10 דקות. להעביר את supernatant לצינור אחר ולמחוק את הגלולה.
- לחילופין, קצוצות 75 מ"ג של רקמות קפואות בחנקן נוזלי. ואז לשחזר את הרקמה 1 mL של מאגר לליזה.
- צנטריפוגה את המדגם microfuge בתוך 15, 500 x g ו 4 ° צ' עבור 10 דקות. להעביר את supernatant לצינור אחר ולמחוק את הגלולה.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ולקבל דגימות שאוחסנו ב-80 ° c עד לניתוח נוסף.
3. כריכת שליטת GT-מע או מג לתוך חרוזי גלוטתיון
הערה: סינתזה של השליטה GT-SUBEs או GT מחוץ לטווח של כתב יד זה ניתן לסקור בספרות שפורסמה בעבר20. לחילופין, רכיבי GT-ובקרה הם זמינים מסחרית (לדוגמה, סימן הכימיה).
- הכנת חרוזי גלוטתיון
- הוסיפו 1 מ ל של מים דה-מייהים ל-70 מ ג של ליאופהיסטד-חרוזים. מהווים מחדש את החרוזים לילה ב -4 ° צ' (או לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר).
- לשטוף את החרוזים ביסודיות לאחר נפיחות (כדי להסיר לקטוז ואתנול כי הם בדרך כלל נוכח בחרוזי אבקה ליאופהולן). כדי לעשות זאת, לשטוף תחילה עם 10 מ ל של מים דה מייהים או PBS ואחריו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. לבצע את זה שלוש פעמים.
- לאחר 3 שוטף, השהה מחדש את החרוזים ב 1 מ ל של PBS כדי לקבל 50% (v/v) להשתהות.
הערה: אמצעי אחסון זה מתאים לניתוח של 10 דגימות.
- עבור כל דוגמה, להוסיף 100 μg של בקרת GT או GT (ראה התייחסות20) כדי 100 μl של חרוזים גלוטתיון לצפות ו 500 ΜL של PBS.
הערה: השפע היחסי של החלבונים המומוסים המעניינים קובע את כמות ה-GT-SUBEs המשמשת לצורך משיכה. עבור כל מודל ניסיוני חדש, לנתח את המצב לפני הניסוי בפועל על ידי המערב לחסום את החומר קלט, כרוך, וזרימה (FT) חומרים באמצעות anti-SUMO2/3 נוגדנים או נגד חלבונים של עניין (הכבד קינאז B1 (LKB1). - מודלת את כל השליטה GT-SUBEs או GT עם חרוזים מוכן 3.2., באיטיות מסתובבת מסובבי או מיני רולר (ראה טבלת חומרים) ב 4 ° c עבור לפחות 2 h (תגובת קשירה איטית).
הערה: הוספת 1 מ"מ dithioitol (DTT) משפרת את כריכת ה-GT לחרוזי הגלוטתיון. - שחזר את חרוזי agarose על ידי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף, מושעה מחדש את החרוזים ב-PBS כדי להשיג 50% (v/v) להשתהות.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ולקבל דגימות שאוחסנו ב-80 ° c עד לניתוח נוסף.
4. משוך למטה שיטת המשך
- לאחר שלב 1.5, 2.3 או 2.5, לקחת 1/10 של נפח הכולל (למשל 50 μL) ולדלל באותו נפח של מאגר הרתיחה 3x (250 mM טריס-HCl pH 6.8, 500 mM β-mercaptoethanol, 50% גליצרול, 10% SDS, ברומאופנול כחול). שבר זה נחשב כקלט.
- הוסף 450 μL של מובהר לאחר משלבים 1.5, 2.3 או 2.5 ל-100 μL חרוזי גלוטתיון. מיכל הבית עם חרוזים, לאט לסובב ב 4 ° צ' עבור לפחות 2 h.
הערה: לחילופין, 100-200 μg של חלבון מוחלט משלבים 1.5, 2.3 או 2.5 (כולל עם שיטת ברדפורד) בנפח כולל של 450 μL ניתן להשתמש. - לסובב את החרוזים בmicrofuge ב 300 x g עבור 5 דקות ולאסוף את supernatant לניתוח. העבר 1/10 של הנפח הכולל (למשל, 50 μL) בצינור נפרד ולדלל בנפח שווה של מאגר הרתיחה 3x. שבר זה הוא השבר הזורם (FT).
- לשטוף את המדגם הנותרים שלוש פעמים עם 1 mL קרח קר PBS, 0.05% רצף 20, ספין למטה ב 4 ° צ' ו 300 x g עבור 1 דקות. בזהירות והוא מבטיח. שלא יישארו נוזלים החרוזים מתאימים לשבר של SUBEs BOUND (SB).
- Elute המדגם עם 15 μL של מאגר הרתיחה של 3x ו 15 μL של מאגר הליזה. פעולה זו נקראת שבר מאוגד.
5. זיהוי ואפיון של יעדי סומו על ידי ניתוח כתמי אבן מערבית
- בצע ניתוח כתמי מערבי באמצעות נוגדן anti-SUMO2/3 או כל נוגדן ספציפי אחר הבחירה כמתואר בעבר22.
6. זיהוי ואפיון של הפרוטאום הסומיתית על ידי ספקטרומטר המסה
הערה: במקרה של ניתוח מסה-ספקטרומוטוריקה (MS), הדגימות עובדו באמצעות שיטת ההכנה לדוגמה (FASP) המתוארת על-ידי ויזננייבסקי ואח '23.
- Desalt הפפטידים באמצעות שלב-עצה סי18 microcolumns ולהשעות אותם מחדש ב 0.1% החומצה פורמית (הפא) לפני ניתוח MS.
- העמיסו את הדגימות על מערכת LC-MS (ראה טבלת חומרים) ולנתח אותם מטריפליאט (משכפל טכני) (איור 2b).
- המשיכו בזיהוי חלבונים ובחישוב שפע באמצעות תוכנה משויכת.
- לניתוח סטטיסטי והפקת מפת החום, טענו את הנתונים על פלטפורמת פרסאוס (http://www.perseus.tufts.edu/hopper/). החל שיעור גילוי שווא המבוסס על תמורה (רוזוולט)-מבחן t מתוקן להשוואת הריקודים. חלבונים עם q < 0.05 ויחס SUBEs/GT גדול מ-2 נחשבו כמועשרת24.
הערה: חלבונים המזוהים עם לפחות שני פפטידים שונים נחשבים בניתוח הסופי.
Representative Results
זיהוי של המצע הסומולציה המסוים בביופסיה של גידול בכבד על ידי ניתוח כתמי אבן מערבית
הכבד קינאז B1 (LKB1) סומולציה הוכח לאחרונה כנהג אונגניים חשוב בסרטן הכבד9,25. עכברים חסרים בגליצין N-מmethyltransferase (gnmt), המכונה לעתים קרובות כ- gnmt-היום,הוא מודל שמתפתח באופן ספונטני קרצינומה של hepatocellular (HCC), הסוג הנפוץ ביותר של סרטן הכבד העיקרי. Subes שימשו כדי להעשיר ולבודד את החלבונים sumoylated הן ב- gnmt-/ -עכברים עם עכברים סרטן הכבד מסוג פראי שלה (gnmt+/+). באיור 2a, הנתונים של פוננסו מכילים שלושה שברים שונים (קלט, FT ו-BOUND) המתקבלים בתוך שיטת המשיכה הנפתחת subes כלולים. כתם של פוננסו שימושי לשליטה על השפעה מדלמת אפשרית על הטעינה של חלבונים שנמחקו להערכה על ידי blots מערביים. באיור 2b ניתוח כתמי אבן מערבית של LKB1 באמצעות subes ללכוד SUMOylated LKB1 מוצג. הרמות של LKB1 סומולציה מרושלות בגידולים בכבד. במקרה של ניתוח כתמים מערבי, המון שווה וחלבונים שהועברו נצפו על-ידי פוננסו כתמי משבר הקלט ולא שונו באופן משמעותי לאחר שוטף (זרימה דרך שבר). כמות החלבון שנתפסו עם SUBEs היה גבוה באופן משמעותי, במיוחד בגידולים. לחלופין, צביעת ג'ל כפול עם כחול Coomassie יכול לספק מידע דומה. חלבונים נדבקים כגון צורות p53 או SUMOylated של חלבונים מסוימים עשויים להיקשר לבקרת ה-GT. כדי להסיר את הרקע, השתמש חרוזים בצפיפות נמוכה, לבצע ציפוי עם BSA, או לשלב שוטף נוספים. עם זאת, הדבר עלול להשפיע על יישומים כגון מאסה ספקטרומטריה ועלול לגרום לאובדן של חלבונים בעלי זיקה נמוכה לאינטראקציה.
איפיון הסומו בתאי הגוף האנושי באמצעות ניתוח ספקטרומטר המסה
כדי לחקור את היכולת של המלכודת סומו לתקשר עם חלבונים SUMOylated באופן טבעי, הא-7 (hepatoma האדם) ו שאינם השתנה כבד אפיתל הTHLE2 קווי התאים האנושיים השתמשו. השלב הראשון הוא ההדמיה של החומר הכולל שנלכד עם SUBEs ושימוש ב-GT כפקד שלילי. למטרה זו, אנו יכולים להשתמש בפרוטוקולים קונבנציונליים הצביעת החלבון כפי שמוצג באיור 3a. לאחר מכן ביצעו ניתוח. ספקטרומטר מסה ממוצע של 2268 חלבונים זוהו Huh7 GT דגימות (2339, 2297 ו 2168 עבור כל טעינה, בהתאמה), בעוד ש2812 חלבונים זוהו בממוצע במדגם Huh7 SUBEs (2815, 2817 ו-2806). לאחר החיסור, 742 חלבונים העשירו ב-SUBEs. מצד שני, ממוצע של 2497 חלבונים זוהו בדגימות THLE2 GT (2476, 2520 ו 2495, בהתאמה) ו 2763 ב SUBEs (2823, 2783 ו-2684). מתוך אלה, 577 נחשבו למועשרת בדגימות SUBEs. ניתוח משכפל טכני מאחזר את מפת החום המוצגת באיור 3b, שחושבה באמצעות הגדרות ברירת המחדל הזמינות (מרחק אוקלידי, הצמדה ממוצעת ועיבוד מקדים באמצעות k-אמצעים). מפת החום מתארת את התפלגות 100 החלבונים המועשרת ביותר באופן משמעותי ובלעדי בכל קו תאים.
איור 1: תרשים סכמטי של תרשים זרימת הפרוטוקול המשמש להעשרה, בידוד וזיהוי ואפיון הפרוטדום הvivo לחקר סרטן הכבד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: השינוי של LKB1 על ידי סומו -2 בדגמי העכבר של הפטאותאי קרצינומה.
(א) פוננסו S כתמים של שלושה שברים שונים (קלט, זרימה דרך (FT) ו-BOUND) שהתקבלו בתוך שיטת משיכה למטה subes. (ב) ניתוח כתמי מערבי של LKB1 באמצעות ישויות איגוד סומו (subes) כדי ללכוד האנדודוגני SUMOylated LKB1; היחידה משמשת כבקרת טעינה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הבדלים בין הנצרות הסומולית בין האנטי-מוסרי או-7 לבין האפיתל הבלתי-משתנה של הכבד הTHLE2 לקווי התאים האנושיים.
(a) sypro כתמים של חומר חלבון שנתפסו, עם GT (שלילישליטה) ו-subes. (ג) החום מפה המתאר את החלבונים המועשרת באופן מועשר בדגימות הא -7 ו-THLE2 sube. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
להלן, סיפקנו תיאור מלא ומפורט של המתודולוגיה המדווחת על השימוש ב-SUBEs עבור העשרה, בידוד וזיהוי ואפיון של חלבונים SUMOylated ב vivo מודלים של סרטן הכבד. הן בכבד העכבר גידולים התאים האדם hepatoma, היינו מסוגלים לבודד ולזהות חלבונים SUMOylated של ריבית לבצע אפיון תפוקה גבוהה של הפרוטאום SUMOylated ו interactome. למרות שהסינתזה של SUBEs מחוץ לטווח של כתב יד זה, לקבלת מידע נוסף יש לבדוק את ההפניות הבאות ב-26. הפרוטוקול המתואר הוא מהיר ורגיש מאוד והצעד הקריטי של הפרוטוקול כולל את השימוש במעכבי SENPs (PR-619). באופן אלטרנטיבי, מעכבי כימיים isopeptidase כגון NEM (N-ethאילממיד) ו רשות העתיקות (2-Iodoamide) במאגר הליזה ניתן להשתמש, עם זאת, הדיווחים הקודמים הראו כי עבור פרוטוקול subes, השימוש PR-619 הוא יתרון כמו האחר מעכבי להפריע כריכת GT לחרוזי גלוטתיון20.
SUBEs הם רקומביננטי חלבונים המרכיבים חוזר טנדם של סימס ובכך לזהות מולקולות סומו על חלבונים שהשתנו עם עלייה בזיקה הכוללת של מצעים סומו. בשל היחס הגבוה והרגישות הגבוהה, השימוש בsubes לבידוד של הפרוטאום הסומואלי הינו יתרון ביחס לגישות אחרות בספרות, כגון איתור באמצעות הכתם המערבי של חלבונים מסוג SUMOylated באמצעות נוגדנים נגד את חלבון הריבית או כרומטוגרפיה ניקל באמצעות שונים histidine גירסאות מתויגות של מולקולות סומו. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי כאשר פרוטוקול SUBEs מבוצע תחת תנאים ללא התערבות, האינטראקציה בין חלבונים SUMOylated וחלבונים אינטראקציה אחרים נשמרת. לכן, אנו משיגים מידע על interactome סומו במקום רק רשימה של חלבונים יעד SUMOylated. לכן, ניסויים נוספים נחוצים כדי לאשר אם החלבון המזוהה הוא יעד סומו או גורם מאינטראקציה. מגבלה אחרת של SUBEs היא העובדה כי שליטה מלכודות GT בשימוש מסוגלים ללכוד חלבונים רקע רבים הקשורים ללחץ חמצוני. בעיה זו רלוונטית במיוחד במהלך ניתוח MS בשל הרגישות הגבוהה של הטכניקה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, מלכודות סומו biotinylated (bioSUBEs) פותחו26. מגבלה נוספת של SUBEs שוכנת בעובדה שאנחנו רק מסוגלים ללכוד חלבונים ששונו על ידי סומו 2 ו סומו 3 בעוד החלבון 1 שונה חלבונים לא יכול להיות מבודד.
חשש אחר לשימוש ב-SUBEs קשור לכמות חומר ההתחלה הדרוש לפרוצדורה. החומר ההתחלתי המשמש ללכידת חלבונים SUMOylated צריך לשקול את התנאים הניסיוניים השונים שנחקרו. בעוד שסומולציה הבזסרחון מדווח בהקשרים סלולאריים שונים, סומולציה הוא תהליך שנגרם בחריפות לאחר מספר מצבי לחץ/גירוי. אם השוואת דגימות שאינן מטופלות לעומת מטופלים, יש לוודא שהעמודה אינה רוויה, וניתן לצפות בהבדלים בין תנאים אלה. במקרה של פנוטיפים העכבר אנחנו מנתחים, טיפולים לא שימשו בסיס רמות SUMOylation נמוך. מסיבה זו, כמויות גבוהות של חלבונים שימשו. יש לשלוט ברמת הרקע באמצעות GT ואם הכריכה הבלתי מוגדרת גבוהה, יש לצמצם את כמות חומר ההתחלה או את זמן הכריכה. ניתוח של שבר FT יכול להיות מעיד על יעילות לכידה גם אם מלכודות אלה מעדיפים חלבונים פולי SUMOylated ו דלדול הכולל לא צריך להיות צפוי, הפחתה של הכולל Sumoלציה הוא בכלל נצפתה כאשר היעילות לכידה היא אופטימלית.
לבסוף, יישום אחר של טכנולוגיית SUBEs כולל את השילוב של טכנולוגיית SUBEs עם המשטח בזמן אמת התהודה (SPR) המאפשר אינטראקציות בזמן אמת עם חלבונים SUMOylated מתוך תמציות התא27. גם, לאחרונה, מלכודות סומו biotinylated (bioSUBEs) פותחו עם היתרון כדי להפחית את הרקע המשויך תגים גדולים, למשל, במהלך ניתוח ספקטרומטר המסה26. בנוסף, הגירסה bioSUBE ניתן להשתמש כדי לזהות חלבונים SUMOylated בתאי החיים על ידי הניאון על ידי שימוש streptavidin-מתויג עם צבעי פלורסנט ברורים לנצל את הכריכה streptavidin כדי biotin. כמו כן, שיטות לאיתור וכימות של חלבונים SUMOylated ניתן לראות עם שתי הגרסאות GT ו bioSUBEs כגון זה נעשה עם הישויות הדו אוביקוויטים מחייב (צינורות)21.
בסך הכל, השימוש SUBEs עבור בידוד ואפיון של הפרוטדום SUMOylated רלוונטי לסרטן הכבד היא שיטה מהירה ורגישה המספקת מידע רב על התפקיד עדיין לא ידוע של מסלול Sumoלציה בסרטן הכבד.
Disclosures
ד ר מרטינו-חנאר מייעץ לגבי מיטותרפוטיקס LLC.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מכון לאומי du Cancer, צרפת, האינקה גרנט PLBIO16-251 (PLBIO16-251), CONACyT-SRE (מקסיקו) להעניק 0280365 ואת התוכנית REPERE של האוקיאני, צרפת (M.S.R.). כמו כן, NIH (מחלקת בריאות ושירותי האנוש)-R01AR001576-11A1, ביוארנו ואסקו 2013111114-מחלקה (לM.L.M.-C), ELKARTEK 2016, משרד התעשיות דה תעשייה ואסקו, MINECO: SAF2017-87301-R שילובים בתוכנית אסטאטדה החוקרת הלאומית לחדשנות 2013-2016 קופאננסיאדו קון פונדוס פדר, BIOEF (קרן בסקית לחידושים ומחקר בריאות): ייתב מאראטיה BIO15/CA/014; מוסדות דה סאלאר קרלוס השלישי: PIE14/00031, שילובים 2013-2016 בתכנית המכון לפיתוח מוסדות הפיתוח של הספרייה הלאומית (M.L.M.-c), Asociación אספניולה קונטרה-אל-מלצר (בג, מ. ל. מ-ג), פרס דניאל אלאלן מ EASL (ל-T. C. D), המודל הAsociación אספניולה קונטרה לסרטן (הקרן המדעית AECC) גידול נדיר שיחות 2017 (עד M. L. M), La Caixa התוכנית הקרן (כדי M. L. m). אנו מודים MINECO עבור הסמכה סאנוהו אוצ'ואה מצוינות CIC bioGUNE (צב-2016-0644).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Gnmt−/−)/ (Gnmt+/+) mice | CIC bioGUNE | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| BEBM | Lonza/Clonetics Corporation | cc-3171 | |
| BEGM Bullet Kit | Lonza/Clonetics Corporation | CC3170 | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| C18 microcolumns | Millipore | Z720070 | |
| Collagen type I | Santa Cruz Biotechnology | sc-136157 | |
| Complete tablets EDTA-free | Roche | 4693132001 | |
| DMEM | Life Technologies | A14431-01 | |
| DTT | Sigma | 43815 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EGF | Sigma | e9644 | |
| FBS | Life Technologies | 10270 | |
| Fibronectin | Life Technologies | 33010018 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma | G4510 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| GST-Control | SignalChem | G52-30H | |
| GST-SUBEs | SignalChem | S291-340G | |
| Huh7 | CLS (Cell Lines Service) | 300156 | https://clsgmbh.de/ |
| IAA (2-Iodoacetamide) | Merck | L58046844 | |
| LKB1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32245 | |
| Mini LabRoller Rotator | LABNET | H5500 | https://www.labnetinternational.com |
| NaCl | Merck | 106404041000 | |
| nanoElute | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
| NEM (N-Ethylmaleimide) | Sigma | E3876 | |
| NP40 | Fluka | 74385 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Peaks software | Bioinformatics Solutions Inc. | http://www.bioinfor.com/ | |
| Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
| Ponceau S solution | Sigma | P7170 | |
| PR-619 | Merck | 662141 | |
| Precellys 24 | Bertin Technologies | P000669-PR240-A | |
| PSA | Life Technologies | 151-40-122 | |
| PSG | Life Technologies | 10378-016 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| SUMO2/3 antibody | Abcam | Ab3742 | |
| THLE-2 | ATCC | ATCC CRL-2706 | http://www.lgcstandards-atcc.org |
| timsTOF Pro with PASEF mass spectrometer | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 60-24-2 |
References
- Forner, A., Llovet, J. M., Bruix, J.
- Gerbes, A., et al. Gut roundtable meeting paper: selected recent advances in hepatocellular carcinoma. Gut. , (2017).
- Avila, M. A., Berasain, C., Sangro, B., Prieto, J. New therapies for hepatocellular carcinoma. Oncogene. 25 (27), 3866-3884 (2006).
- Grotenbreg, G., Ploegh, H.
- Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 17 (9), 581-595 (2016).
- Seeler, J. S., Dejean, A.
- Tomasi, M. L., et al. S-adenosyl methionine regulates ubiquitin-conjugating enzyme 9 protein expression and sumoylation in murine liver and human cancers. Hepatology. 56 (3), 982-993 (2012).
- Li, J., et al. Cbx4 governs HIF-1alpha to potentiate angiogenesis of hepatocellular carcinoma by its SUMO E3 ligase activity. Cancer Cell. 25 (1), 118-131 (2014).
- Zubiete-Franco, I., et al. SUMOylation regulates LKB1 localization and its oncogenic activity in liver cancer. EBioMedicine. 40, 406-421 (2019).
- Sarge, K. D., Park-Sarge, O. K. SUMO and its role in human diseases. Internationa Review of Cell and Molecular Biology. 288, 167-183 (2011).
- Da Silva-Ferrada, E., Lopitz-Otsoa, F., Lang, V., Rodriguez, M. S., Matthiesen, R. Strategies to Identify Recognition Signals and Targets of SUMOylation. Biochemical Research International. , 875148 (2012).
- Liang, Y. C., et al. SUMO5, a Novel Poly-SUMO Isoform, Regulates PML Nuclear Bodies. Science Reports. 6, 26509 (2016).
- Mikolajczyk, J., et al. Small ubiquitin-related modifier (SUMO)-specific proteases: profiling the specificities and activities of human SENPs. Journal of Biologucal Chemistry. 282 (36), 26217-26224 (2007).
- Hilgarth, R. S., Sarge, K. D.
- Vertegaal, A. C., et al. A proteomic study of SUMO-2 target proteins. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33791-33798 (2004).
- Bruderer, R., et al. Purification and identification of endogenous polySUMO conjugates. EMBO Reports. 12 (2), 142-148 (2011).
- Becker, J., et al. Detecting endogenous SUMO targets in mammalian cells and tissues. Nature Structural Molecular Biology. 20 (4), 525-531 (2013).
- Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies. Nature Protocols. 9 (4), 896-909 (2014).
- Hendriks, I. A., et al. Site-specific characterization of endogenous SUMOylation across species and organs. Nature Communications. 9 (1), 2456 (2018).
- Da Silva-Ferrada, E., et al. Analysis of SUMOylated proteins using SUMO-traps. Science Reports. 3, 1690 (2013).
- Hjerpe, R., et al. Efficient protection and isolation of ubiquitylated proteins using tandem ubiquitin-binding entities. EMBO Reports. 10 (11), 1250-1258 (2009).
- Embade, N., et al. Murine double minute 2 regulates Hu antigen R stability in human liver and colon cancer through NEDDylation. Hepatology. 55 (4), 1237-1248 (2012).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Meier, F., et al. Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer. Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
- Ritho, J., Arold, S. T., Yeh, E. T. A Critical SUMO1 Modification of LKB1 Regulates AMPK Activity during Energy Stress. Cell Reports. 12 (5), 734-742 (2015).
- Lang, V., Da Silva-Ferrada, E., Barrio, R., Sutherland, J. D., Rodriguez, M. S. Using Biotinylated SUMO-Traps to Analyze SUMOylated Proteins. Methods in Molecular Biology. 1475, 109-121 (2016).
- Xolalpa, W., Rodriguez, M. S., England, P. Real-Time Surface Plasmon Resonance (SPR) for the Analysis of Interactions Between SUMO Traps and Mono- or PolySUMO Moieties. Methods in Molecular Biology. 1475, 99-107 (2016).
