Summary
Her præsenterer vi en protokol til at berige, isolere, identificere og karakterisere proteiner modificeret af Sumo in vivo både fra humane hepatoma celler og levertumorer opnået fra musemodeller af hepatocellulært karcinom ved hjælp af Sumo-bindende enheder (subes).
Abstract
Post-translationel modifikation er en nøglemekanisme, der regulerer proteinhomeostase og funktion i eukaryote celler. Blandt alle ubiquitin-lignende proteiner i leverkræft, modifikationen af SUMO (lille Ubiquitin MOdifier) har fået mest opmærksomhed. Isolering af endogene Sumoylerede proteiner in vivo er udfordrende på grund af tilstedeværelsen af aktive SUMO-specifikke proteaser. De indledende undersøgelser af Sumoylering in vivo var baseret på molekylær påvisning af specifikke Sumoylerede proteiner (f. eks. af Western blot). Men i mange tilfælde, antistoffer, generelt lavet med ikke-modificeret rekombinant protein, ikke immunoprecipitate SUMOylated former af proteinet af interesse. Nikkel kromatografi har været den anden metode til at studere Sumoylering ved at opfange histidinmærkede versioner af SUMO-molekyler. Denne fremgangsmåde anvendes hovedsageligt i celler, der stabilt udtrykker eller transitivt transficeret med hans-Sumo molekyler. For at overvinde disse begrænsninger blev SUMO-bindende enheder (SUBEs) udviklet til at isolere endogene Sumoylerede proteiner. Heri beskriver vi alle de trin, der er nødvendige for berigelse, isolering og identifikation af Sumoylerede substrater fra humane hepatoma-celler og hepatisk væv fra en levercancer-musemodel ved hjælp af SUBEs. For det første beskriver vi metoder, der er involveret i forberedelsen og lysis af de humane hepatoma celler og leveren tumor vævsprøver. Derefter, en grundig forklaring af forberedelsen af SUBEs og kontroller er detaljeret sammen med protokollen for protein pull-down assays. Endelig gives der eksempler på mulighederne for identifikation og karakterisering af det Sumoylerede protein, nemlig anvendelse af Western-blot-analyse til påvisning af et specifikt Sumoyleret substrat fra levertumorer eller anvendelse af proteomics ved massespektrometri for høj gennemløb karakterisering af det Sumoylerede proteom og interactome i hepatoma celler.
Introduction
Leverkræft er den sjette mest almindeligt forekommende kræft på verdensplan og den anden årsag til kræft-associerede dødsfald1. Hepatocellulær carcinoma (HCC) er den mest fremherskende form for primær leverkræft. Historisk set omfattede almindeligt forekommende risikofaktorer for udvikling af HCC kronisk hepatitis B-eller C-infektion og misbrug af alkoholindtagelse. I de sidste årtier, den Metaboliske syndrom, type 2 diabetes ikke-alkoholiske fedt leversygdom (NAFLD) er opstået som risikofaktorer for udviklingen af HCC2. HCC er meget heterogene, både fænotypisk og genetisk, hvor et komplekst netværk af signalering veje er forstyrret. I de seneste år, selv om der har været en stigning i vores viden om de molekylære veje impliceret i patogenesen af HCC, der er stadig ingen effektive terapeutiske tilgange til HCC ledelse. Mange veje er aktiveret i HCC og hæmmer en generelt driver kompensationen ved andre veje3. Dette har været en af de største vanskeligheder ved behandling af HCC. En mere global tilgang kan således give en potentiel terapeutisk tilgang til klinisk behandling af leverkræft, f. eks., som er rettet mod post-translationelle modifikationer (PTMs), da flere signalveje kan reguleres samtidigt af Ptm'er af proteiner.
Post-translationelle modifikationer betragtes som nøglemekanismer, der regulerer proteinhomeostase og funktioner4. Der indføres strukturelle og funktionelle ændringer af PTMs, hvilket øger proteomet mangfoldighed. De mest almindelige PTMs omfatter fosforylering, methylering, acetylering, glykosylering, allestedsnærværende, og konjugering af ubiquitin-lignende proteiner (UbLs). Blandt alle Ubl'er, protein modifikation af SUMO (lille Ubiquitin MOdifier) har tiltrukket sig opmærksomhed i forbindelse med sin kritiske rolle i en række cellulære processer, herunder transkriptionen, cellulære lokalisering, DNA reparation, og celle cyklus progression 5. for nylig blev sumoylering påvist at være ændret i leverkræft6,7,8,9, og ændringer i sumoylering af specifikke proteiner er blevet beskrevet for at spille en rolle i progression af kræftrelaterede sygdomme9.
I pattedyr, der er fem SUMO paralogues, SUMO-1 til SUMO-5. Til dato, ingen eksperimentelle beviser er tilgængelige om eksistensen af endogene SUMO-4 og endogene SUMO-5 konjugering reaktioner på Proteinniveau10,11,12. Sumoylering i pattedyr udføres af en enzymatisk thiol-ester kaskade, der involverer tre enzymer, det heterodikemeje SUMO-aktiverings enzym (SAE1/SAE2) eller E1, det SUMO-konjugerende enzym (Ubc9) eller E2 og en SUMO-E3-Ligase-specifik for hvert målprotein. Virkningen af flere familier af SUMO E3s synes at være i en dynamisk ligevægt med SUMO-specifikke proteaser (SUSPs eller SENPs)13 gør SUMOylation reaktion meget reversibel. Desuden er kun en lille brøkdel af det Sumoylerede protein versus ikke-Sumoyleret total protein til stede. Derved er isolerende endogene Sumoylerede proteiner in vivo temmelig udfordrende13.
Sumoylering in vivo blev oprindelig undersøgt af Western blot ved hjælp af antistoffer mod proteinet af interesse14. Immunoprecipitation af proteinet blev udført med specifikke antistoffer, og derefter blev PAGE-Western blot udført med anti-SUMO-antistoffer. Det største problem med denne strategi er, at antistoffer genereret mod et ikke-modificeret rekombinant protein ikke altid er i stand til at immunoprecipitere den Sumoylerede form af et protein. Alternativt, nikkel kromatografi efter forbigående ekspression af histidin Tagged (His6) versioner af SUMO molekyler og protein af interesse er blevet brugt til at studere Sumoylering i celler. På dette grundlag vil det være mere bekvemt at opdage Sumo-modificerede former fra celler, der stabilt udtrykker His6-Sumo15. Til in vivo-undersøgelser blev det påvist, at tandem-SUMO-interagerende motiver (SIM)-baseret berigelse var til rensning af polySUMO-konjugater16. Andre grupper har brugt epitope-Tagged antistof Sumo tilgange giver et gennemførligt værktøj til at undersøge endogene sumoylering i primære celler, væv, og organer17,18. Og for nylig har Nielsen og kolleger brugt antistof-baseret berigelse til at identificere endogene og stedspecifikke SUMO i celler og væv19.
For at give supplerende oplysninger om SUMOylation in vivo blev der udviklet SUMO-bindende enheder (SUBEs), også kendt som SUMO-fælder,20. Af relevans betragtes tandem ubiquitin-bindende enheder (rør) som konceptuelle forløbere for SUBEs og er kommercielt tilgængelige værktøjer til påvisning og isolering af polyubiquitylerede proteiner21. SUBEs er rekombinante proteiner, der omfatter tandem gentagelser af simmere og derved genkender SUMO-molekyler på modificerede proteiner med en stigning i den samlede affinitet for SUMO-substrater. SUMO-fælder blev manipuleret ved at introducere en E3 ubiquitin-protein ubiquitinligase RNF4-afledte SIM2 og SIM3 motiver i tandem, i en vektor, der indeholder glutathion S-transferase (GST), et heterologt bære protein20. Selv om SUBEs ikke kan anvendes korrekt til at identificere mono-SUMOylated målproteiner, denne metode giver et værktøj til at lette rensning og identifikation af poly-SUMO Target proteiner in vivo. Heri beskriver vi anvendelsen af SUBEs for at isolere Sumoylerede proteiner både i humane hepatoma celler og i mus leverbiopsier, et vigtigt redskab til studiet af leverkræft. En overordnet ordning i den protokol, der er beskrevet i dette manuskript, er vist i figur 1.
Protocol
Alle eksperimenter blev godkendt af CIC bioGUNE institutionsudvalg for dyrepasning og-håndtering. Alle bestræbelser blev gjort for at minimere dyrenes lidelser og reducere antallet af anvendte dyr. 3-måneders gammel mandlig glycin N-methyltransferase (gnmt) mangelfuld (gnmt−/−) og dens vilde type littermates (gnmt+/+) blev anvendt.
1. klargøring og lyse af celler
Bemærk: heri blev huh-7 (Human hepatoma Cell Line) og THLE2 (humant hepatisk cellelinje) anvendt.
- Vedligehold celler i P100 plader i standard vækstmedier ved 37 °C i en befuret atmosfære på 5% CO2-95% fugtighed.
- Vokse celler i P100 plader plating ved en tæthed på 1,2 – 1.5 × 106 celler per skål ved at tælle cellerne ved hjælp af en Neubauer haemocytometry tælle kammer.
- Kultur huh-7 i DMEM suppleret med 10% føtal kvægserum (FBS), 1% penicillin-streptomycin-amphotericin B (PSA) og 1% glutamin.
- Kultur THLE2 celler i kultur retter præ-belagt med 0,01 mg/mL fibronectin, 0,01 mg/mL bovint serumalbumin (BSA) og 0,03 mg/mL kollagen type I opløst i vækstmedium, som består af bronkial epitel cellevækst basal medium (BEGM) suppleret med vækstfaktorer (0,4% BPE, 0,1% insulin, 0,1% hydrocortison, 0,1% retinsyre, 0,1% transferrin, 0,1% triiodothyronin samt 10% FBS, 1% PSA, 5 ng/mL epidermal vækstfaktor (EGF) og 70 ng/mL phosphoethanolamin.
- Ved slutpunktet af forsøget, Aspirér mediet fra pladerne og vask cellerne med 5 mL steril 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS). Lyse celler direkte på pladen placeret på is med 500 μL lysis buffer (50 mM Tris pH 8,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% nonidet P-40 (NP40), suppleret med komplet EDTA-fri proteasehæmmer cocktail og 50 μM PR-619 for hver P100 skål. Brug en celle skraber, forsigtigt skrabe cellerne fra bunden af pladen ind i lyse mediet.
Bemærk: Kontroller, at alle cellerne er løsrevet fra pladen ved visuelt at inspicere plade basen efter behandlingen. - Alternativt høst celler ved trypsinisering ved at aspirere celle medier og tilsæt 1 mL 1x (0,05%) Trypsin-EDTA til pladen, nok til at dække cellerne og placere pladen i inkubator sat til 37 °C, 5% CO2, og 95% fugtighed for ~ 5 min sikre alle celler er løsrevet fra pladen. Tilsæt 2 mL forvarmet vækstmedium for at stoppe trypsinisering. Centrifugeres ved 150 g i 10 minutter og Aspirér supernatanten. Vask med 1x PBS og centrifuge ved 150 x g i 10 min. Efter aspirering af supernatanten tilsættes 500 μL lyse buffer (50 mM Tris pH 8,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40, suppleret med komplet EDTA-fri proteasehæmmer cocktail og 50 μM PR-619 for hver P100 skål.
Bemærk: tilføjelsen af PR-619 er kritisk. - Centrifugeres ved 15.500 x g og 4 °c i 10 min. Overfør supernatanten til et andet rør og kassér pellet.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her, og prøver opbevares ved-80 °C indtil yderligere analyse.
2. vævs tilberedning og lysis
- Ved dyr offer, indsamle mus lever, vask med kold PBS, og snap fryse straks i flydende nitrogen. Prøverne opbevares − 80 °C indtil yderligere analyse.
- Homogeniserer 75 mg fragmenter fra snap-frosne/eller friske lever i 1 mL iskold lyse buffer (50 mM Tris pH 8,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40, suppleret med komplet EDTA-fri proteasehæmmer cocktail og 50 μM PR-619). Kør homogenisator ved 6500 x rpm, 2 x 60 s hver, med en 30 s pause (Se tabel over materialer).
- Prøverne centrifugeres i en mikrofuge ved 15, 500 x g og 4 °c i 10 min. Overfør supernatanten til et andet rør og kassér pellet.
- Alternativt, udriv 75 mg frosset væv i flydende nitrogen. Derefter genvinde vævet i 1 mL lysis buffer.
- Prøven centrifugeres i en mikrofuge ved 15, 500 x g og 4 °c i 10 min. Overfør supernatanten til et andet rør og kassér pellet.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her, og prøver opbevares ved-80 °C indtil yderligere analyse.
3. binding af GST-SUBEs eller GST-kontrol til glutathion-Agopstået perler
Bemærk: syntesen af GST-SUBEs eller GST kontrol er uden for rammerne af dette manuskript og kan gennemgås i tidligere offentliggjort litteratur20. Alternativt er GST-og Control SUBEs kommercielt tilgængelige (f. eks SignalChem).
- Fremstilling af glutathion perler
- Tilsæt 1 mL afioniseret vand til 70 mg lyofiliseret glutathion-agerede perler. Rekonstruere perlerne natten over ved 4 °C (eller i mindst 30 minutter ved stuetemperatur).
- Vask perlerne grundigt efter hævelse (for at fjerne lactose og ethanol, der sædvanligvis forekommer i det frysetørede pulver, som er agantet perler). For at gøre dette skal du først vaske med 10 mL afioniseret vand eller PBS efterfulgt af centrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Udfør denne tre gange.
- Efter 3 skyller, resuspension perlerne i 1 mL PBS for at opnå en 50% (v/v) gylle.
Bemærk: denne volumen er egnet til analyse af 10 prøver.
- For hver prøve tilsættes 100 μg GST-SUBEs eller GST Control (Se reference20) til 100 μl af glutathion-perlerne gylle og 500 μl PBS.
Bemærk: den relative overflod af de Sumoylerede proteiner af interesse bestemmer mængden af GST-SUBEs, der anvendes til pull-Downs. For hver ny eksperimentel model, analysere betingelsen forud for den faktiske eksperiment ved Western blotting input, bundet, og gennemstrømnings-(FT) materiale ved hjælp af anti-SUMO2/3 antistoffer eller mod proteiner af interesse (leveren kinase B1 (LKB1). - Inkubér al GST-SUBEs eller GST-kontrol med perler fremstillet i 3,2., Roter langsomt i rotator eller mini rulle (Se tabel over materialer) ved 4 °c i mindst 2 timer (langsom bindings reaktion).
Bemærk: tilsætning af 1 mm ditiotreitol (DTT) forbedrer GST-binding til glutathion-perlerne. - Gendan de agopstået perler ved centrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. I slutningen, resuspenderet perlerne i PBS for at opnå 50% (v/v) gylle.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her, og prøver opbevares ved-80 °C indtil yderligere analyse.
4. GST-pull-down-analyse
- Efter trin 1,5, 2,3 eller 2,5 tages 1/10 af totalvolumenet (f. eks. 50 μl) og fortyndes i samme volumen af 3x koge buffer (250 mm Tris-HCL pH 6,8, 500 mm β-mercaptoethanol, 50% glycerol, 10% SDS, bromphenolblåt blå). Denne fraktion betragtes som INPUT.
- Tilsæt 450 μL præciseret lysat fra trin 1,5, 2,3 eller 2,5 til 100 μL glutathion perler gylle. Man inkubere lysatet med perler, som langsomt roterer ved 4 °C i mindst 2 timer.
Bemærk: Alternativt kan der anvendes 100-200 μg total protein fra trin 1,5, 2,3 eller 2,5 (kvantificeret med Bradford assay) i et samlet volumen på 450 μL. - Drej perlerne ned i en mikrofuge ved 300 x g i 5 minutter og saml supernatanten til analysen. Overføres 1/10 af det totale rumfang (f. eks. 50 μL) i et separat rør og fortyndes i et tilsvarende volumen på 3x koge buffer. Denne fraktion er gennemstrømnings brøken (ft).
- Den resterende prøve vaskes tre gange med 1 mL iskold PBS, 0,05% Tween 20, spin ned ved 4 °C og 300 x g i 1 min. forsigtigt aspirere, hvilket sikrer, at der ikke er væske tilbage. Perlerne svarer til SUBEs bundet (SB) fraktion.
- Prøven elueret med 15 μL 3x koge buffer og 15 μL af lyse bufferen. Dette kaldes den BUNDNE brøk.
5. identifikation og karakterisering af SUMO mål ved Western blot analyse
- Udføre Western blot-analyse ved hjælp af et anti-SUMO2/3-antistof eller andre specifikke antistof valg som beskrevet tidligere22.
6. identifikation og karakterisering af den Sumoylerede Proteome ved massespektrometri
Bemærk: i tilfælde af massespektrometri (MS) analyse blev prøverne behandlet ved hjælp af den filter støttede prøve forberedelsesmetode (FASP), der er beskrevet af Wisniewski et al.23.
- Dealt peptiderne ved hjælp af Stage-tip C18 mikrokolonner og resuspendere dem i 0,1% myresyre (FA) forud for MS-analyse.
- Læg prøverne på et LC-MS-system (Se tabel over materialer), og analysér dem i tre eksemplarer (tekniske replikater) (figur 2b).
- Fortsætte med protein identifikation og tæthed beregning ved hjælp af en tilhørende software.
- For statistisk analyse og heatmap generation, indlæse data på Perseus platform (http://www.perseus.tufts.edu/hopper/). Anvend en permutation-baseret falsk Discovery rate (FDR)-korrigeret t-test til sammenligning af mængder. Proteiner med en q < 0,05 og en SUBEs/GST ratio større end 2 blev betragtet som beriget24.
Bemærk: proteiner, der identificeres med mindst to forskellige peptider, tages i betragtning i den endelige analyse.
Representative Results
Identifikation af et specifikt Sumoylationsubstrat i lever tumor biopsier ved Western blot-analyse
Lever kinase B1 (LKB1) sumoylation er for nylig blevet vist sig at være en vigtig onkogene driver i leverkræft9,25. Mus mangelfuld i glycin N-methyltransferase (gnmt), ofte omtalt som gnmt−/−, er en model, der spontant udvikler hepatocellulært karcinom (HCC), den mest almindeligt forekommende form for primær leverkræft. Subes blev brugt til at berige og isolere de sumoylerede proteiner både i gnmt−/− mus med levercancer mus og dens vilde type littermates (gnmt+/+). I figur 2aindgår Ponceau S farvning af de tre forskellige fraktioner (input, ft og Bound), der er opnået i subes-pull-down-analysen. En Ponceau S bejdser er nyttig til at kontrollere en mulig skadelig virkning på lastning af slettet proteiner, der skal evalueres af vestlige blots. I figur 2b vises en Western blot-analyse af LKB1 ved anvendelse af subes til indfangning af endogene Sumoylerede LKB1. Niveauerne af LKB1 Sumoylering er forstærket i levertumorer. I tilfælde af Western blot-analyse blev der observeret lige belastninger og overførte proteiner ved Ponceau farvning af inputfraktionen og blev ikke signifikant ændret efter skylning (gennemstrømnings fraktion). Mængden af protein fanget med SUBEs var signifikant højere, især i tumorer. Alternativt kan farvning af en dublet gel med Coomassie Blue give lignende oplysninger. Klæbrige proteiner såsom P53 eller SUMOylated former af nogle proteiner kan binde sig til GST kontrol. For at fjerne baggrunden, skal du bruge lav-density agopstået perler, udføre en belægning med BSA, eller indarbejde yderligere skyller. Men, dette kan påvirke applikationer såsom massespektrometri og kan resultere i tab af lav affinitet interagere proteiner.
Karakterisering af SUMO Interactome i humane hepatoma celler ved massespektrometri analyse
For at undersøge kapaciteten af SUMO-Trap til at interagere med naturligt SUMOylated proteiner, huh-7 (humant hepatoma) og ikke-transformerede lever epiteliale humane THLE2 cellelinjer blev anvendt. Det første trin er visualisering af det samlede materiale, der er taget med SUBEs, og brug af GST som en negativ kontrol. Til dette formål kan vi bruge konventionelle protein farvning protokoller som vist i figur 3a. Derefter udførte vi massespektrometri analyse. I gennemsnit blev 2268 proteiner identificeret i Huh7 GST-prøverne (henholdsvis 2339, 2297 og 2168 for hver last), hvorimod der i gennemsnit blev identificeret 2812 proteiner i den Huh7 SUBEs-prøve (2815, 2817 og 2806). Efter subtraktionen blev 742 proteiner beriget i Suberne. På den anden side blev et gennemsnit på 2497 proteiner identificeret i THLE2 GST-prøverne (henholdsvis 2476, 2520 og 2495) og 2763 i SUBEs (2823, 2783 og 2684). Af disse blev 577 anset for at være beriget med SUBEs-prøverne. Analyse af tekniske replikater henter det heatmap, der er vist i figur 3b, som blev beregnet ved hjælp af de tilgængelige standardindstillinger (Euclidisk distance, gennemsnitlig sammenkædning og forbehandlet med k-midler). Heatmap skildrer fordelingen af de 100 mest markant og udelukkende berigede proteiner i hver cellelinje.
Figur 1: skematisk diagram over det protokol flowdiagram, der anvendes til berigelse, isolering og identifikation og karakterisering af det sumoylerede proteom in vivo til undersøgelse af leverkræft. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: modifikation af LKB1 af SUMO-2 i musemodeller af Hepatocellulær carcinoma.
(a) Ponceau S farvning af de tre forskellige fraktioner (input, flyde gennem (ft) og bundet) opnået i subes pull-down assay. (b) Western blot analyse af LKB1 ved hjælp af Sumo binding enheder (subes) til at fange endogene SUMOylated LKB1; GAPDH bruges som læsse kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: forskelle mellem den sumoylerede proteom mellem tumor huh-7 og ikke-transformeret lever epitelial THLE2 humane cellelinjer.
(a) sypro farvning af fanget proteinmateriale, med GST (negativ kontrol) og subes. c) heatmap, der skildrer de differentielt berigede proteiner i huh-7 og THLE2 sube prøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Heri har vi givet en fuldstændig og detaljeret beskrivelse af den metode, der rapporterer brugen af SUBEs til berigelse, isolering og identifikation og karakterisering af de Sumoylerede proteiner i in vivo-modeller af leverkræft. Både i mus levertumorer og humane hepatoma celler, vi var i stand til korrekt isolere og identificere sumoylated proteiner af interesse og til at udføre en høj gennemløb karakterisering af sumoylated proteom og interactome. Selv om syntesen af SUBEs er uden for rammerne af dette manuskript, for yderligere oplysninger følgende henvisninger bør ses på26. Den beskrevne protokol er hurtig og meget følsom, og det kritiske trin i protokollen omfatter brugen af SENPs-hæmmere (PR-619). Alternativt kan der anvendes kemiske isopeptidasehæmmere såsom NEM (N-ethylmaleimid) og IAS (2-Iodoacetamid) i lysis-bufferen, men tidligere rapporter har vist, at for subes-protokollen er brugen af PR-619 fordelagtig som den anden inhibitorer interfererer med GST binding til glutathionperler20.
SUBEs er rekombinante proteiner, der omfatter tandem gentagelser af simmere og derved genkender SUMO-molekyler på modificerede proteiner med en stigning i den samlede affinitet for SUMO-substrater. På grund af dets høje specificitet og følsomhed er brugen af subes til isolering af det sumoylerede proteom fordelagtigt i forhold til andre tilgange i litteraturen, såsom påvisning af Western-blot af specifikke sumoylerede proteiner ved hjælp af antistoffer mod det protein af interesse eller nikkel kromatografi ved hjælp af de forskellige histidin-mærkede versioner af SUMO molekyler. Det skal dog tages i betragtning, at da SUBEs-protokollen udføres under ikke-Denaturerings betingelser, opretholdes interaktionen mellem Sumoylerede proteiner og andre interagerende proteiner. Derfor får vi oplysninger om SUMO interactome i stedet for kun en liste over SUMOylated målproteiner. Der er således behov for yderligere eksperimenter for at bekræfte, om det identificerede protein er et SUMO-mål eller en interagerende faktor. Anden begrænsning af SUBEs er det faktum, at kontrol GST fælder bruges er i stand til at fange mange baggrunds proteiner relateret til oxidativt stress. Dette problem er især relevant i MS-analysen på grund af den høje følsomhed af teknikken. For at overvinde disse begrænsninger er der blevet udviklet biotinylerede SUMO-fælder (bioSUBEs)26. En anden begrænsning af SUBEs er bosat i det faktum, at vi kun er i stand til at fange proteiner modificeret af SUMO 2 og SUMO 3, hvorimod SUMO 1-modificerede proteiner ikke kan isoleres.
Andre betænkeligheder ved anvendelsen af SUBEs er relateret til mængden af udgangsmateriale, der er nødvendigt for proceduren. Udgangsmaterialet, der anvendes til at indfange Sumoylerede proteiner, bør tage hensyn til de forskellige eksperimentelle betingelser. Mens basal Sumoylering er blevet rapporteret i forskellige cellulære sammenhænge, SUMOylation er en proces, der er stærkt induceret efter flere stress betingelser/stimuli. Hvis man sammenligner ubehandlet versus behandlede prøver, skal man være sikker på, at kolonnen ikke er mættet, og forskelle kan observeres mellem disse betingelser. I tilfælde af mus fænotyper vi analyserer, ingen behandlinger er blevet brugt og basal Sumoylering niveauer er lave. Af denne grund, store mængder af proteiner blev brugt. Baggrundsniveauet skal styres ved hjælp af GST, og hvis den uspecifikke binding er høj, skal mængden af udgangsmateriale eller bindingstiden reduceres. Analysen af FT-fraktionen kan være en indikation af indfangningseffektiviteten, selv om disse fælder foretrækker poly-Sumoylerede proteiner, og en total nedbrydning ikke bør forventes, en reduktion af den totale Sumoylering er generelt godt observeret, når erobrings effektiviteten er Optimal.
Endelig, anden anvendelse af SUBEs teknologi omfatter kombinationen af SUBEs teknologi med real-time overflade Plasmon resonans (SPR) tillader real-time interaktioner med SUMOylated proteiner fra celleekstrakter27. Også, for nylig, biotinylated SUMO-fælder (bioSUBEs) er blevet udviklet med den fordel at reducere baggrunden i forbindelse med større Tags, f. eks, under massespektrometri analyse26. Desuden kan bioSUBE-versionen anvendes til at detektere Sumoylerede proteiner i levende celler ved fluorescens ved hjælp af streptavidin-mærket med særskilte fluorescerende farvestoffer, der udnytter streptavidin binding til biotin. Desuden kan metoder til påvisning og kvantificering af Sumoylerede proteiner overvejes med både GST og bioSUBEs versioner som det blev gjort med tandem ubiquitin bindende enheder (rør)21.
Samlet set er brugen af SUBEs til isolation og karakterisering af det Sumoylerede proteom relevant i leverkræft en hurtig og følsom metode, der giver store oplysninger om den stadig temmelig ukendte rolle af SUMOylation pathway i leverkræft.
Disclosures
Dr. Martínez-chantar rådgiver for Mitotherapeutix LLC.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Institut National du cancer, FRANCE, INCa Grant PLBIO16-251 (PLBIO16-251), CONACyT-SRE (Mexico) Grant 0280365 og REPERE-programmet for Occitanie, Frankrig (M.S.R.). Også NIH (US Department of Health and Human Services)-R01AR001576-11A1, Gobierno Vasco-Departamento de Salud 2013111114 (til M.L.M.-C), ELKARTEK 2016, Departamento de Industria del Gobierno Vasco, MINECO: SAF2017-87301-R integrado en el plan Estatal de Investigación cientifica y Técnica y Innovación 2013-2016 cofinanciado con fondos FEDER, BIOEF (det baskiske Institut for innovation og sundhedsforskning): EITB Maratoia BIO15/CA/014; Instituto de Salud Carlos III: PIE14/00031, integrado en el plan Estatal de Investigación cientifica y Técnica y Innovación 2013-2016 cofinanciado con fondos FEDER (til M.L.M.-C), Asociación Española contra El cáncer (T. C. D, M. L. M-C), Daniel Alagille Award fra EASL (til T. C. D), Fundación Científica de la Asociación Española contra El cancer (AECC Scientific Foundation) sjælden tumor opkald 2017 (til M. L. M), La Caixa Foundation program (til M. L. M). Vi takker MINECO for Severo Ochoa Excellence-akkrediteringen til CIC bioGUNE (SEV-2016-0644).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Gnmt−/−)/ (Gnmt+/+) mice | CIC bioGUNE | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| BEBM | Lonza/Clonetics Corporation | cc-3171 | |
| BEGM Bullet Kit | Lonza/Clonetics Corporation | CC3170 | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| C18 microcolumns | Millipore | Z720070 | |
| Collagen type I | Santa Cruz Biotechnology | sc-136157 | |
| Complete tablets EDTA-free | Roche | 4693132001 | |
| DMEM | Life Technologies | A14431-01 | |
| DTT | Sigma | 43815 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EGF | Sigma | e9644 | |
| FBS | Life Technologies | 10270 | |
| Fibronectin | Life Technologies | 33010018 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma | G4510 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| GST-Control | SignalChem | G52-30H | |
| GST-SUBEs | SignalChem | S291-340G | |
| Huh7 | CLS (Cell Lines Service) | 300156 | https://clsgmbh.de/ |
| IAA (2-Iodoacetamide) | Merck | L58046844 | |
| LKB1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32245 | |
| Mini LabRoller Rotator | LABNET | H5500 | https://www.labnetinternational.com |
| NaCl | Merck | 106404041000 | |
| nanoElute | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
| NEM (N-Ethylmaleimide) | Sigma | E3876 | |
| NP40 | Fluka | 74385 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Peaks software | Bioinformatics Solutions Inc. | http://www.bioinfor.com/ | |
| Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
| Ponceau S solution | Sigma | P7170 | |
| PR-619 | Merck | 662141 | |
| Precellys 24 | Bertin Technologies | P000669-PR240-A | |
| PSA | Life Technologies | 151-40-122 | |
| PSG | Life Technologies | 10378-016 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| SUMO2/3 antibody | Abcam | Ab3742 | |
| THLE-2 | ATCC | ATCC CRL-2706 | http://www.lgcstandards-atcc.org |
| timsTOF Pro with PASEF mass spectrometer | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 60-24-2 |
References
- Forner, A., Llovet, J. M., Bruix, J.
- Gerbes, A., et al. Gut roundtable meeting paper: selected recent advances in hepatocellular carcinoma. Gut. , (2017).
- Avila, M. A., Berasain, C., Sangro, B., Prieto, J. New therapies for hepatocellular carcinoma. Oncogene. 25 (27), 3866-3884 (2006).
- Grotenbreg, G., Ploegh, H.
- Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 17 (9), 581-595 (2016).
- Seeler, J. S., Dejean, A.
- Tomasi, M. L., et al. S-adenosyl methionine regulates ubiquitin-conjugating enzyme 9 protein expression and sumoylation in murine liver and human cancers. Hepatology. 56 (3), 982-993 (2012).
- Li, J., et al. Cbx4 governs HIF-1alpha to potentiate angiogenesis of hepatocellular carcinoma by its SUMO E3 ligase activity. Cancer Cell. 25 (1), 118-131 (2014).
- Zubiete-Franco, I., et al. SUMOylation regulates LKB1 localization and its oncogenic activity in liver cancer. EBioMedicine. 40, 406-421 (2019).
- Sarge, K. D., Park-Sarge, O. K. SUMO and its role in human diseases. Internationa Review of Cell and Molecular Biology. 288, 167-183 (2011).
- Da Silva-Ferrada, E., Lopitz-Otsoa, F., Lang, V., Rodriguez, M. S., Matthiesen, R. Strategies to Identify Recognition Signals and Targets of SUMOylation. Biochemical Research International. , 875148 (2012).
- Liang, Y. C., et al. SUMO5, a Novel Poly-SUMO Isoform, Regulates PML Nuclear Bodies. Science Reports. 6, 26509 (2016).
- Mikolajczyk, J., et al. Small ubiquitin-related modifier (SUMO)-specific proteases: profiling the specificities and activities of human SENPs. Journal of Biologucal Chemistry. 282 (36), 26217-26224 (2007).
- Hilgarth, R. S., Sarge, K. D.
- Vertegaal, A. C., et al. A proteomic study of SUMO-2 target proteins. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33791-33798 (2004).
- Bruderer, R., et al. Purification and identification of endogenous polySUMO conjugates. EMBO Reports. 12 (2), 142-148 (2011).
- Becker, J., et al. Detecting endogenous SUMO targets in mammalian cells and tissues. Nature Structural Molecular Biology. 20 (4), 525-531 (2013).
- Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies. Nature Protocols. 9 (4), 896-909 (2014).
- Hendriks, I. A., et al. Site-specific characterization of endogenous SUMOylation across species and organs. Nature Communications. 9 (1), 2456 (2018).
- Da Silva-Ferrada, E., et al. Analysis of SUMOylated proteins using SUMO-traps. Science Reports. 3, 1690 (2013).
- Hjerpe, R., et al. Efficient protection and isolation of ubiquitylated proteins using tandem ubiquitin-binding entities. EMBO Reports. 10 (11), 1250-1258 (2009).
- Embade, N., et al. Murine double minute 2 regulates Hu antigen R stability in human liver and colon cancer through NEDDylation. Hepatology. 55 (4), 1237-1248 (2012).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Meier, F., et al. Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer. Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
- Ritho, J., Arold, S. T., Yeh, E. T. A Critical SUMO1 Modification of LKB1 Regulates AMPK Activity during Energy Stress. Cell Reports. 12 (5), 734-742 (2015).
- Lang, V., Da Silva-Ferrada, E., Barrio, R., Sutherland, J. D., Rodriguez, M. S. Using Biotinylated SUMO-Traps to Analyze SUMOylated Proteins. Methods in Molecular Biology. 1475, 109-121 (2016).
- Xolalpa, W., Rodriguez, M. S., England, P. Real-Time Surface Plasmon Resonance (SPR) for the Analysis of Interactions Between SUMO Traps and Mono- or PolySUMO Moieties. Methods in Molecular Biology. 1475, 99-107 (2016).
