Summary
Her presenterer vi en protokoll for å berike, isolere, identifisere og karakterisere proteiner modifisert av SUMO in vivo både fra humant hepatosarkom celler og leverskader svulster Hentet fra musemodeller av leverkreft ved hjelp av SUMO-bindende enheter (SUBEs).
Abstract
Post-translational modifikasjon er en viktig mekanisme som regulerer protein homeostase og funksjon i eukaryote celler. Blant alle ubiquitin proteiner i leverkreft, har endringen av SUMO (Small Ubiquitin spesial) fått mest oppmerksomhet. Isolering av endogene SUMOylated proteiner in vivo er utfordrende på grunn av tilstedeværelsen av aktive SUMO-spesifikke proteaser. Innledende studier av SUMOylation in vivo var basert på molekyl deteksjon av spesifikke SUMOylated-proteiner (f.eks. ved Western Blot). Men i mange tilfeller, antistoffer, vanligvis laget med ikke-modifisert rekombinant protein, ikke immunoprecipitate SUMOylated former av protein av interesse. Nikkel kromatografi har vært den andre tilnærmingen til å studere SUMOylation ved å fange histidin-kodede versjoner av SUMO molekyler. Denne tilnærmingen er i hovedsak brukt i celler stabilt uttrykker eller midlertidig transfekterte med hans-SUMO molekyler. For å overkomme disse begrensningene ble SUMO-bindende enheter (SUBEs) utviklet for å isolere endogene SUMOylated proteiner. Heri, beskriver vi alle trinnene som kreves for berikelse, isolasjon, og identifisering av SUMOylated underlag fra humant hepatosarkom celler og hepatic vev fra en leverkreft mus modell ved hjelp SUBEs. For det første beskriver vi metoder involvert i utarbeidelse og lyse av den menneskelige hepatosarkom celler og lever svulst vevsprøver. Deretter, en grundig forklaring av utarbeidelse av SUBEs og kontroller er detaljert sammen med protokollen for protein pull-Down analyser. Endelig, noen eksempler er gitt om de tilgjengelige alternativene for identifisering og karakterisering av SUMOylated proteom, nemlig bruk av Western-Blot analyse for påvisning av en bestemt SUMOylated substrat fra leverskader svulster eller bruk av Proteomikk av masse massespektrometri for høy gjennomstrømming karakterisering av SUMOylated proteom og interactome i hepatosarkom celler.
Introduction
Leverkreft er den sjette mest vanlige kreft i verden og den andre årsaken til kreft-assosiert dødsfall1. Leverkreft (HCC) er den mest rådende formen for primær leverkreft. Historisk felles risikofaktorer for utviklingen av HCC inkluderte kronisk hepatitt B eller C-smitte og støtende alkoholforbruk. I de siste ti årene, Metabolsk syndrom, type 2 diabetes alkoholfrie fatty leversykdom (NAFLD) har dukket opp som risikofaktorer for utvikling av HCC2. HCC er svært heterogen, både phenotypically og genetisk, karakterisert ved at et komplekst nettverk av signal veier blir forstyrret. I de siste årene, selv om det har vært en økning i vår kunnskap om den molekylære trasé innblandet i patogenesen av HCC, er det fortsatt ingen effektive terapeutiske tilnærminger for HCC ledelse. Mange trasé er aktivert i HCC og hemme en generelt kjører kompensasjon av andre trasé3. Dette har vært en av de viktigste vanskelighetene ved behandling av HCC. Således, en mer global tilnærming kan gi en potensiell terapeutisk tilnærming for klinisk forvaltning av leverkreft f. eks, målretting post-translational modifikasjoner (PTMs), som flere signalering trasé kan samtidig reguleres av PTMs av proteiner.
Post-translational modifikasjoner er ansett som viktige mekanismer som regulerer protein homeostase og funksjoner4. Strukturelle og funksjonelle endringer er innført av PTMs, og dermed øke proteom mangfold. De vanligste PTMs inkluderer fosforylering, metylering, acetylering, glykosylering, ubiqitinering og Bøyning av ubiquitin proteiner (UbLs). Blant alle UbLs, protein modifikasjon av SUMO (Small Ubiquitin spesial) har tiltrukket seg oppmerksomhet i samarbeid med sin kritiske rolle i en rekke cellulære prosesser, inkludert transkripsjon, mobilnettet lokalisering, DNA reparasjon, og celle syklus progresjon 5. nylig ble SUMOylation vist å være endret i leverkreft6,7,8,9, og endringer i SUMOylation av spesifikke proteiner har blitt beskrevet for å spille en rolle i utviklingen av kreft-relaterte sykdommer9.
I pattedyr, er det fem SUMO paralogues, SUMO-1 til SUMO-5. Hittil er ingen eksperimentelle bevis tilgjengelig om eksistensen av endogene SUMO-4 og endogene SUMO-5 Bøyning reaksjoner på protein nivå10,11,12. SUMOylation i pattedyr er utført av en enzymatisk tiolderivat-Ester kaskade med tre enzymer, den heterodimeric SUMO aktivering enzym (SAE1/SAE2) eller E1, det SUMO bøye enzymet (Ubc9) eller E2 og en SUMO-E3-ligase spesifikke for hvert mål protein. Handlingen av flere familier av SUMO E3s synes å være i en dynamisk likevekt med SUMO-spesifikke proteaser (SUSPs eller SENPs)13 gjør SUMOylation reaksjonen svært reversibel. Videre, bare en liten brøkdel av SUMOylated protein versus ikke-SUMOylated totalt protein er tilstede. Derved er isolere endogene SUMOylated proteiner in vivo ganske utfordrende13.
SUMOylation in vivo ble opprinnelig studert av Western Blot ved hjelp av antistoffer mot proteinet av interesse14. Immunutfelling av proteinet ble utført med spesifikke antistoffer og deretter PAGE-Western Blot ble utført med anti-SUMO antistoffer. Hovedproblemet med denne strategien er at antistoffer generert mot en ikke-modifisert rekombinant protein er ikke alltid i stand til å immunoprecipitate den SUMOylated form av et protein. Alternativt, nikkel kromatografi etter forbigående uttrykk for histidin tagget (His6) versjoner av SUMO molekyler og protein av interesse har blitt brukt til å studere SUMOylation i celler. På dette grunnlaget, vil det være mer praktisk å oppdage SUMO-modifiserte skjemaer fra celler stabilt uttrykker His6-SUMO15. For in vivo studier, tandem-SUMO-samspill motiver (SIM) basert berikelse ble demonstrert for rensing av polySUMO konjugater16. Andre grupper har brukt epitope-Tagged antistoff Sumo tilnærminger som gir et gjennomførbart verktøy for å undersøke endogene SUMOylation i primær celler, vev, og organer17,18. Og mer nylig, Nielsen og kolleger har brukt antistoff-baserte berikelse å identifisere endogene og områdespesifikke SUMO i celler og vev19.
For å gi utfyllende informasjon om rollen som SUMOylation in vivo, ble SUMO-bindende enheter (SUBEs), også kjent som SUMO feller, utviklet20. Av relevans, tandem ubiquitin bindende enheter (rør) anses konseptuelle forløpere for SUBEs og er kommersielt tilgjengelige verktøy for påvisning og isolering av polyubiquitylated proteiner21. SUBEs er rekombinant proteiner som utgjør tandem repetisjoner av Simmer som dermed erkjenner SUMO molekyler på modifiserte proteiner med en økning i den samlede affinitet for SUMO underlag. SUMO-feller ble utviklet ved å innføre en E3 ubiquitin-protein ligase RNF4-avledet SIM2 og SIM3 motiver i tandem, i en vektor som inneholder glutation S-glutamyltransferase (GST), en heterologous carrier protein20. Selv om SUBEs ikke kan brukes riktig for å identifisere mono-SUMOylated mål proteiner, gir denne metoden et verktøy for å lette rensing og identifisering av Poly-SUMO Target proteiner in vivo. Heri beskriver vi anvendelsen av SUBEs å isolere SUMOylated proteiner både i menneskelige hepatosarkom celler og i mus leveren biopsier, et viktig verktøy for studiet av leverkreft. En samlet ordning av protokollen som er beskrevet i dette manuskriptet er vist i figur 1.
Protocol
Alle eksperimenter ble godkjent av CIC bioGUNE institusjonelle komiteer for dyr omsorg og håndtering. Alle anstrengelser var innrettet til minimere dyr lider og å nedskrive antallet av dyrene anvendt. 3 måneder gammel mannlig Glycine N-methyltransferase (Gnmt) mangelfull (Gnmt−/−) og den ville typen littermates (Gnmt+/+) ble brukt.
1. celle forberedelse og lyse
Merk: heri, he-7 (humant hepatosarkom cellelinje) og THLE2 (Human hepatic cellelinje) ble brukt.
- Oppretthold celler i P100 plater i standard vekst medier ved 37 ° c i en fuktet atmosfære på 5% CO2-95% fuktighet.
- Vokse celler i P100 plater plating i en tetthet på 1,2-1.5 × 106 celler per tallerken ved å telle cellene ved hjelp av en Neubauer haemocytometry telling kammer.
- Kultur huh-7 i DMEM supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS), 1% penicillin-Streptomycin-amfotericin B (PSA) og 1% glutamin.
- Kultur THLE2 celler i kultur retter pre-belagt med 0,01 mg/mL fibronektin, 0,01 mg/mL storfe serum albumin (BSA) og 0,03 mg/mL kollagen type jeg oppløst i vekstmedium som består av bronkial epitel cellevekst basal medium (BEGM) supplert med vekstfaktorer (0,4% BPE, 0,1% insulin, 0,1% Hydrocortisone, 0,1% retinoic syre, 0,1% transferrin, 0,1% triiodothyronine i tillegg til 10% FBS, 1% PSA, 5 ng/mL epidermal vekstfaktor (EGF) og 70 ng/mL phosphoethanolamine.
- På slutten punktet av eksperimentet, aspirer mediene fra platene og vaske celler med 5 mL steril 1x fosfat-bufret saltvann (PBS). Lyse celler direkte på tallerkenen plassert på is med 500 μL av lyseringsbuffer (50 mM Tris pH 8,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% nonidet P-40 (NP40), supplert med komplett EDTA-fri protease inhibitor cocktail og 50 μM PR-619 for hver P100 parabolen. Bruk en celle skrape, forsiktig skrape cellene av bunnen av platen inn i lyse middel medium.
Merk: Kontroller at alle cellene har løsnet fra platen ved å visuelt inspisere plate basen etter behandlingen. - Alternativt kan du høste celler ved trypsinization av aspirating celle Media og tilsett 1 mL 1x (0,05%) Trypsin-EDTA til platen, nok til å dekke cellene og plassere platen i inkubator satt til 37 ° c, 5% CO2, og 95% fuktighet for ~ 5 min sikre at alle celler har løsrevet fra platen. Tilsett 2 mL pre-varmet vekstmedium for å stoppe trypsinization. Sentrifuger på 150 g i 10 min og aspirer supernatanten. Vask med 1x PBS og sentrifuger på 150 x g i 10 min. Etter aspirating av supernatanten, tilsett 500 μL av lyseringsbuffer (50 mM Tris pH 8,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40, supplert med komplett EDTA-fri protease inhibitor cocktail og 50 μM PR-619 for hver P100 parabolen.
Merk: tillegg av PR-619 er avgjørende. - Sentrifuger ved 15 500 x g og 4 ° c i 10 min. Overfør supernatanten til et annet rør og kast pellet.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her, og prøver lagret ved-80 ° c til videre analyse.
2. vevs forberedelser og lyse Rings
- Ved dyreofring, samle mus lever, vask med kaldt PBS, og smekk fryse umiddelbart i flytende nitrogen. Oppbevar prøvene − 80 ° c inntil videre analyse.
- Homogenisere 75 mg fragmenter fra snap-frosset/eller fersk lever i 1 mL iskald lyseringsbuffer (50 mM Tris pH 8,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40, supplert med komplett EDTA-fri protease inhibitor cocktail og 50 μM PR-619). Kjør homogenisator på 6500 x RPM, 2 x 60 s hver, med en 30 s pause (se tabell av materialer).
- Sentrifuger prøvene i en microfuge ved 15, 500 x g og 4 ° c i 10 min. Overfør supernatanten til et annet rør og kast pellet.
- Alternativt, triturate 75 mg av frosset vev i flytende nitrogen. Deretter gjenopprette vevet i 1 mL lyseringsbuffer.
- Sentrifuger prøven i en microfuge ved 15, 500 x g og 4 ° c i 10 min. Overfør supernatanten til et annet rør og kast pellet.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her, og prøver lagret ved-80 ° c til videre analyse.
3. binding av GST-SUBEs eller GST-kontroll til glutation-Agarose-perler
Merk: syntesen av GST-SUBEs eller GST-kontrollen er utenfor omfanget av dette manuskriptet og kan gjennomgås i tidligere publisert litteratur20. Alternativt, GST-og Control SUBEs er kommersielt tilgjengelig (for eksempel SignalChem).
- Utarbeidelse av glutation perler
- Tilsett 1 mL av de-ionisert vann til 70 mg lyofilisert glutation-agarose perler. Rekonstituer perlene over natten ved 4 ° c (eller i minst 30 min ved romtemperatur).
- Vask perlene grundig etter hevelse (for å fjerne laktose og etanol som vanligvis er til stede i lyofilisert pulver agarose perler). For å gjøre dette, vask først med 10 mL av de-ionisert vann eller PBS etterfulgt av sentrifugering ved 300 x g i 5 min ved romtemperatur. Utfør denne tre ganger.
- Etter 3 vasker, resuspend perlene i 1 mL PBS å få en 50% (v/v) slurry.
Merk: dette volumet er egnet for analyse av 10 prøver.
- For hver prøve legger du til 100 μg av GST-SUBEs eller GST-kontroll (se referanse20) til 100 μL av glutation-perler slurry og 500 ΜL av PBS.
Merk: den relative overflod av SUMOylated proteiner av interesse bestemmer hvor mye GST-SUBEs brukes for pull-Downs. For hver nye eksperimentelle modell, analysere tilstanden før selve eksperimentet av vestlige blotting input, bundet, og gjennomstrømning (FT) materiale ved hjelp av anti-SUMO2/3 antistoffer eller mot proteiner av interesse (Liver kinase B1 (LKB1). - Ruge alle GST-SUBEs eller GST kontroll med perler fremstilt i 3,2., sakte roterende i Rotator eller mini roller (se tabell av materialer) ved 4 ° c i minst 2 t (langsom bindende reaksjon).
Merk: Hvis du legger til 1 mM dithiotreitol (DTT), forbedres GST-bindingen til de glutation perlene. - Gjenopprette agarose perler ved sentrifugering på 300 x g i 5 min ved romtemperatur. På slutten, resuspendert perlene i PBS å få 50% (v/v) slurry.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her, og prøver lagret ved-80 ° c til videre analyse.
4. GST trekk ned analysen
- Etter trinn 1,5, 2,3 eller 2,5, ta 1/10 av total volum (f. eks 50 μL) og fortynne i samme volum av 3x kokende buffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 500 mM β-mercaptoethanol, 50% glyserol, 10% SDS, bromophenol blå). Denne fraksjonen regnes som INPUT.
- Tilsett 450 μL av avklart lysat fra trinn 1,5, 2,3 eller 2,5 til 100 μL glutation perler. Ruge lysat med perler, sakte roterende ved 4 ° c i minst 2 timer.
Merk: Alternativt kan 100-200 mikrogram totalt protein fra trinn 1,5, 2,3 eller 2,5 (kvantifisert med Bradford-analysen) i et samlet volum på 450 μL brukes. - Snurr ned perlene i en microfuge på 300 x g i 5 min og samle supernatanten for analysen. Overfør 1/10 av det totale volumet (f.eks. 50 μL) i et separat rør og fortynne i et likt volum på 3x koke buffer. Denne fraksjonen er Flow-through (ft) brøk.
- Vask den gjenværende prøven tre ganger med 1 mL iskald PBS, 0,05% mellom 20, spinn ned ved 4 ° c og 300 x g i 1 min. aspirer forsiktig for å sikre at det ikke finnes væske rester. Perlene tilsvarer SUBEs BOUND (SB) brøk.
- Eluere prøven med 15 μL 3x kokende buffer og 15 μL av lyseringsbufferen. Dette kalles den bundne fraksjonen.
5. identifisering og karakterisering av SUMO mål ved Western Blot analyse
- Utfør Western Blot-analyse ved hjelp av et anti-SUMO2/3-antistoff eller et annet spesifikt antistoff av valg som beskrevet tidligere22.
6. identifisering og karakterisering av SUMOylated proteom av Mass massespektrometri
Merk: i tilfelle av Mass-massespektrometri (MS) analyse, ble prøvene behandlet ved hjelp av den filter-hjulpet sample Preparation (FASP)-metoden beskrevet av Wisniewski et al.23.
- Avsalte peptider ved hjelp av scenen-tip C18 microcolumns og resuspend dem i 0,1% maursyre acid (FA) før MS analyse.
- Legg prøvene på et LC-MS-system (se tabell over materialer) og analyser dem i tre eksemplarer (tekniske replikeres) (figur 2b).
- Fortsett med protein identifisering og overflod beregning ved hjelp av en tilknyttet programvare.
- For statistisk analyse og heatmap generering, Last dataene inn på Perseus-plattformen (http://www.perseus.tufts.edu/hopper/). Bruke en Permutasjon-rettet USANN Discovery rate (FDR)-korrigert t-test for sammenligning av forekomster. Proteiner med q < 0,05 og en SUBEs/GST ratio større enn 2 ble ansett som beriket24.
Merk: proteiner som identifiseres med minst to forskjellige peptider er vurdert i den endelige analysen.
Representative Results
Identifisering av en bestemt SUMOylation substrat i Liver tumor biopsier av Western Blot analyse
Leveren kinase B1 (LKB1) SUMOylation har nylig blitt vist å være en viktig kreftfremkallende driver i leverkreft9,25. Mus mangelfull i Glycine N-methyltransferase (Gnmt), ofte referert til som Gnmt−/−, er en modell som spontant utvikler leverkreft (HCC), den vanligste typen primær leverkreft. SUBEs ble brukt til å berike og isolere SUMOylated proteiner både i Gnmt−/− mus med leverkreft mus og dens ville type littermates (Gnmt+/+). I figur 2a, Ponceau S farging av de tre forskjellige fraksjoner (input, ft og Bound) innhentet i SUBEs pull-Down analysen er inkludert. En Ponceau S flekk er nyttig å kontrollere en mulig skadelige effekt på lasting av blotted proteiner som skal evalueres av vestlig blots. I figur 2b en Western Blot analyse av LKB1 ved hjelp av SUBEs å fange ENDOGENE SUMOylated LKB1 vises. Nivåene av LKB1 SUMOylation er forsterket i leverskader svulster. Når det gjelder Western Blot analyse, lik belastning og overførte proteiner ble observert av Ponceau farging av input brøk og ble ikke signifikant endret etter vasker (flyt gjennom brøk). Mengden protein tatt med SUBEs var signifikant høyere, spesielt i svulster. Alternativt kan flekker en duplikat gel med Coomassie blå gi lignende informasjon. Sticky proteiner som p53 eller SUMOylated former av noen proteiner kan binde til GST kontrollen. For å fjerne bakgrunnen, bruk lav tetthet agarose perler, utføre et belegg med BSA, eller innlemme ekstra vasker. Dette kan imidlertid påvirke programmer som Mass massespektrometri og kan føre til tap av lav affinitet samspill proteiner.
Karakterisering av SUMO Interactome i Human Hepatosarkom Cells av Mass massespektrometri analyse
Å undersøke kapasiteten til SUMO-Trap å samhandle med naturlig SUMOylated proteiner, he-7 (humant hepatosarkom) og ikke-transformert leveren epitel menneskelige THLE2 cellelinjer ble brukt. Det første trinnet er visualisering av det totale materialet tatt med SUBEs og bruke GST som en negativ kontroll. For dette formålet, kan vi bruke konvensjonelle protein farging protokoller som vist i figur 3a. Deretter utførte vi masse massespektrometri analyse. Et gjennomsnitt på 2268 proteiner ble identifisert i Huh7 GST prøvene (2339, 2297 og 2168 for hver Last, henholdsvis), mens 2812 proteiner ble identifisert i gjennomsnitt i Huh7 SUBEs-prøven (2815, 2817 og 2806). Etter subtraksjon ble 742 proteiner beriket i SUBEs. På den annen side, var et gjennomsnitt på 2497 proteiner identifisert i THLE2 GST prøvene (2476, 2520 og 2495, henholdsvis) og 2763 i SUBEs (2823, 2783 og 2684). Av disse ble 577 betraktet som beriket i SUBEs prøvene. Analyse av tekniske replikerer henter heatmap vist i figur 3b, som ble beregnet ved hjelp av standardinnstillingene som er tilgjengelige (euklidsk avstand, gjennomsnittlig kobling og pre-behandlet med k-betyr). Heatmap avbilder fordelingen av 100 mest betydelig og utelukkende beriket proteiner i hver cellelinje.
Figur 1: skjematisk diagram av protokollen flyt diagram som brukes for berikelse, isolasjon og identifisering og karakterisering av SUMOylated proteom in vivo for studiet av leverkreft. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: modifisering av LKB1 av SUMO-2 i musemodeller av leverkreft.
(a) Ponceau S farging av de tre forskjellige fraksjoner (input, Flow gjennom (ft) og Bound) innhentet i SUBEs pull-Down analysen. (b) Western Blot analyse av LKB1 ved hjelp av Sumo bindende enheter (SUBEs) å fange ENDOGENE SUMOylated LKB1; GAPDH brukes som en laste kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: forskjeller mellom SUMOylated proteom mellom tumoral huh-7 og ikke-transformert leveren epitel THLE2 menneskelige cellelinjer.
(a) Sypro farging av tatt protein materiale, med GST (negativ kontroll) og SUBEs. (c) heatmap skildrer differensielt beriket proteiner i he-7 og THLE2 SUBE prøver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Heri har vi gitt en komplett og detaljert beskrivelse av metodikken rapporterer bruk av SUBEs for berikelse, isolering og identifisering og karakterisering av SUMOylated proteiner i in vivo modeller av leverkreft. Både i mus leversvulster og menneskelige hepatosarkom celler, var vi i stand til å riktig isolere og identifisere SUMOylated proteiner av interesse og til å utføre en høy gjennomstrømming karakterisering av SUMOylated proteom og interactome. Selv om syntese av SUBEs er utenfor omfanget av dette manuskriptet, for ytterligere informasjon følgende referanser bør bli sett på26. Protokollen som beskrives er rask og svært følsom, og det kritiske trinnet i protokollen inkluderer bruk av SENPs-hemmere (PR-619). I alternative, kjemiske isopeptidase hemmere som NEM (N-Ethylmaleimide) og IAA (2-Iodoacetamide) i lyseringsbuffer kan brukes, men tidligere rapporter har vist at for SUBEs protokollen, bruk av PR-619 er fordelaktig som den andre hemmere forstyrre GST binding til glutation perler20.
SUBEs er rekombinant proteiner som utgjør tandem repetisjoner av Simmer som dermed erkjenner SUMO molekyler på modifiserte proteiner med en økning i den samlede affinitet for SUMO underlag. På grunn av sin høye spesifisitet og følsomhet, er bruken av SUBEs for isolering av SUMOylated proteom fordelaktig i forhold til andre tilnærminger i litteraturen som deteksjon av Western-Blot spesifikke SUMOylated proteiner ved hjelp av antistoffer mot protein av interesse eller nikkel kromatografi ved hjelp av ulike histidin-kodede versjoner av SUMO molekyler. Det må imidlertid tas i betraktning at når SUBEs-protokollen utføres under ikke-denaturering forhold, opprettholdes samspillet mellom SUMOylated proteiner og andre samspill proteiner. Derfor får vi informasjon om SUMO-interactome i stedet for bare en liste over SUMOylated mål proteiner. Dermed ytterligere eksperimenter er nødvendig for å bekrefte om det identifiserte proteinet er et SUMO mål eller en samspill faktor. Andre begrensninger i SUBEs er det faktum at kontroll GST feller brukt er i stand til å fange opp mange bakgrunns proteiner relatert til oksidativt stress. Dette problemet er spesielt relevant under MS-analysen på grunn av høy følsomhet av teknikken. For å overkomme disse begrensningene har biotinylated SUMO-feller (bioSUBEs) blitt utviklet26. En annen begrensning av SUBEs ligger i det faktum at vi bare er i stand til å fange proteiner endret av SUMO 2 og SUMO 3 mens SUMO 1-modifiserte proteiner kan ikke isoleres.
Annen bekymring for bruken av SUBEs er relatert til mengden av Start materiale som er nødvendig for prosedyren. Start materialet som brukes til å fange SUMOylated proteiner bør vurdere de ulike eksperimentelle forholdene utforsket. Mens basal SUMOylation har blitt rapportert i ulike cellulære sammenhenger, er SUMOylation en prosess som er sterkt indusert etter flere stress forhold/stimuli. Hvis man sammenligner ubehandlede versus behandlede prøver, må man være sikker på at kolonnen ikke er mettet, og det kan observeres forskjeller mellom disse betingelsene. I tilfelle av musen fenotyper vi analyserer, ingen behandlinger har blitt brukt og basal SUMOylation nivåer er lave. Av denne grunn ble det brukt store mengder proteiner. Bakgrunns nivået bør kontrolleres ved hjelp av GST, og hvis den løs bindingen er høy, skal mengden Start materiale eller bindingstid reduseres. Analysen av FT brøk kan tyde på fangst effektivitet selv om disse fellene foretrekker Poly-SUMOylated proteiner og en total tømming bør ikke forventes, en reduksjon av totale SUMOylation er generelt godt observert når fangst effektivitet er Optimal.
Til slutt, andre anvendelsen av SUBEs teknologien inkluderer kombinasjonen av SUBEs teknologi med Real-Time Surface Plasmon resonans (SPR) slik at sanntids interaksjon med SUMOylated proteiner fra celle ekstrakter27. Også mer nylig, biotinylated SUMO-feller (bioSUBEs) har blitt utviklet med den fordel å redusere bakgrunnen knyttet til større koder, for eksempel under masse massespektrometri analyse26. I tillegg kan den bioSUBE versjonen brukes til å oppdage SUMOylated proteiner i levende celler ved fluorescens ved hjelp av streptavidin-merket med distinkte fluorescerende fargestoffer utnytter streptavidin binding til biotin. Også metoder for påvisning og kvantifisering av SUMOylated proteiner kan betraktes med både GST og bioSUBEs versjoner som det ble gjort med tandem ubiquitin bindende enheter (rør)21.
Samlet, bruk av SUBEs for isolering og karakterisering av SUMOylated proteom relevant i leverkreft er en rask og følsom metode som gir enorm informasjon om fortsatt ganske ukjent rolle SUMOylation veien i leverkreft.
Disclosures
Dr. Martínez-Chantar råder for Mitotherapeutix LLC.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Institut National du Cancer, Frankrike, INCa Grant PLBIO16-251 (PLBIO16-251), CONACyT-SRE (Mexico) Grant 0280365 og REPERE program for Occitanie, Frankrike (M.S.R.). Også NIH (US Department of Health and Human Services)-R01AR001576-11A1, Gobierno Vasco-Departamento de salud 2013111114 (til M.L.M.-C), ELKARTEK 2016, Departamento de Industria del Gobierno Vasco, MINECO: SAF2017-87301-R integrado en El plan Estatal de Investigación Cientifica y Técnica y Differensialaksen 2013-2016 cofinanciado con fondos FEDER, BIOEF (baskisk stiftelse for innovasjon og helse forskning): EITBS Maratoia BIO15/CA/014; Instituto de salud Carlos III: PIE14/00031, integrado en El plan Estatal de Investigación Cientifica y Técnica y Differensialaksen 2013-2016 cofinanciado con fondos FEDER (til M.L.M.-C), Asociación Española Contra el Cáncer (T. C. D, M. L. M-C), Daniel Alagille Award fra EASL (til T. C. D), Fundación Científica de la Asociación Española Contra el Cancer (AECC Scientific Foundation) sjelden tumor samtaler 2017 (til M. L. M), La Caixa Foundation program (til M. L. M). Vi takker MINECO for Severo Ochoa Excellence akkreditering til CIC bioGUNE (SEV-2016-0644).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Gnmt−/−)/ (Gnmt+/+) mice | CIC bioGUNE | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| BEBM | Lonza/Clonetics Corporation | cc-3171 | |
| BEGM Bullet Kit | Lonza/Clonetics Corporation | CC3170 | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| C18 microcolumns | Millipore | Z720070 | |
| Collagen type I | Santa Cruz Biotechnology | sc-136157 | |
| Complete tablets EDTA-free | Roche | 4693132001 | |
| DMEM | Life Technologies | A14431-01 | |
| DTT | Sigma | 43815 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EGF | Sigma | e9644 | |
| FBS | Life Technologies | 10270 | |
| Fibronectin | Life Technologies | 33010018 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma | G4510 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| GST-Control | SignalChem | G52-30H | |
| GST-SUBEs | SignalChem | S291-340G | |
| Huh7 | CLS (Cell Lines Service) | 300156 | https://clsgmbh.de/ |
| IAA (2-Iodoacetamide) | Merck | L58046844 | |
| LKB1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32245 | |
| Mini LabRoller Rotator | LABNET | H5500 | https://www.labnetinternational.com |
| NaCl | Merck | 106404041000 | |
| nanoElute | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
| NEM (N-Ethylmaleimide) | Sigma | E3876 | |
| NP40 | Fluka | 74385 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Peaks software | Bioinformatics Solutions Inc. | http://www.bioinfor.com/ | |
| Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
| Ponceau S solution | Sigma | P7170 | |
| PR-619 | Merck | 662141 | |
| Precellys 24 | Bertin Technologies | P000669-PR240-A | |
| PSA | Life Technologies | 151-40-122 | |
| PSG | Life Technologies | 10378-016 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| SUMO2/3 antibody | Abcam | Ab3742 | |
| THLE-2 | ATCC | ATCC CRL-2706 | http://www.lgcstandards-atcc.org |
| timsTOF Pro with PASEF mass spectrometer | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 60-24-2 |
References
- Forner, A., Llovet, J. M., Bruix, J.
- Gerbes, A., et al. Gut roundtable meeting paper: selected recent advances in hepatocellular carcinoma. Gut. , (2017).
- Avila, M. A., Berasain, C., Sangro, B., Prieto, J. New therapies for hepatocellular carcinoma. Oncogene. 25 (27), 3866-3884 (2006).
- Grotenbreg, G., Ploegh, H.
- Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 17 (9), 581-595 (2016).
- Seeler, J. S., Dejean, A.
- Tomasi, M. L., et al. S-adenosyl methionine regulates ubiquitin-conjugating enzyme 9 protein expression and sumoylation in murine liver and human cancers. Hepatology. 56 (3), 982-993 (2012).
- Li, J., et al. Cbx4 governs HIF-1alpha to potentiate angiogenesis of hepatocellular carcinoma by its SUMO E3 ligase activity. Cancer Cell. 25 (1), 118-131 (2014).
- Zubiete-Franco, I., et al. SUMOylation regulates LKB1 localization and its oncogenic activity in liver cancer. EBioMedicine. 40, 406-421 (2019).
- Sarge, K. D., Park-Sarge, O. K. SUMO and its role in human diseases. Internationa Review of Cell and Molecular Biology. 288, 167-183 (2011).
- Da Silva-Ferrada, E., Lopitz-Otsoa, F., Lang, V., Rodriguez, M. S., Matthiesen, R. Strategies to Identify Recognition Signals and Targets of SUMOylation. Biochemical Research International. , 875148 (2012).
- Liang, Y. C., et al. SUMO5, a Novel Poly-SUMO Isoform, Regulates PML Nuclear Bodies. Science Reports. 6, 26509 (2016).
- Mikolajczyk, J., et al. Small ubiquitin-related modifier (SUMO)-specific proteases: profiling the specificities and activities of human SENPs. Journal of Biologucal Chemistry. 282 (36), 26217-26224 (2007).
- Hilgarth, R. S., Sarge, K. D.
- Vertegaal, A. C., et al. A proteomic study of SUMO-2 target proteins. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33791-33798 (2004).
- Bruderer, R., et al. Purification and identification of endogenous polySUMO conjugates. EMBO Reports. 12 (2), 142-148 (2011).
- Becker, J., et al. Detecting endogenous SUMO targets in mammalian cells and tissues. Nature Structural Molecular Biology. 20 (4), 525-531 (2013).
- Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies. Nature Protocols. 9 (4), 896-909 (2014).
- Hendriks, I. A., et al. Site-specific characterization of endogenous SUMOylation across species and organs. Nature Communications. 9 (1), 2456 (2018).
- Da Silva-Ferrada, E., et al. Analysis of SUMOylated proteins using SUMO-traps. Science Reports. 3, 1690 (2013).
- Hjerpe, R., et al. Efficient protection and isolation of ubiquitylated proteins using tandem ubiquitin-binding entities. EMBO Reports. 10 (11), 1250-1258 (2009).
- Embade, N., et al. Murine double minute 2 regulates Hu antigen R stability in human liver and colon cancer through NEDDylation. Hepatology. 55 (4), 1237-1248 (2012).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Meier, F., et al. Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer. Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
- Ritho, J., Arold, S. T., Yeh, E. T. A Critical SUMO1 Modification of LKB1 Regulates AMPK Activity during Energy Stress. Cell Reports. 12 (5), 734-742 (2015).
- Lang, V., Da Silva-Ferrada, E., Barrio, R., Sutherland, J. D., Rodriguez, M. S. Using Biotinylated SUMO-Traps to Analyze SUMOylated Proteins. Methods in Molecular Biology. 1475, 109-121 (2016).
- Xolalpa, W., Rodriguez, M. S., England, P. Real-Time Surface Plasmon Resonance (SPR) for the Analysis of Interactions Between SUMO Traps and Mono- or PolySUMO Moieties. Methods in Molecular Biology. 1475, 99-107 (2016).
