Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att berika, isolera, identifiera och karakterisera proteiner som modifierats av SUMO in vivo både från humana hepatomceller och levertumörer som erhålls från musmodeller av Hepatocellulär cancer genom att använda SUMO-bindande entiteter (SUBEs).
Abstract
Posttranslationell modifiering är en nyckelmekanism som reglerar protein homeostas och funktion i eukaryotiska celler. Bland alla ubiquitin-liknande proteiner i levercancer, modifiering av SUMO (liten ubiquitin modifierare) har fått mest uppmärksamhet. Isolering av endogena Sumoylerade proteiner in vivo är utmanande på grund av närvaron av aktiva SUMO-specifika proteaser. Initiala studier av Sumoylering in vivo baserades på molekylär detektion av specifika Sumoylerade proteiner (t. ex. genom Western blot). Emellertid, i många fall, antikroppar, vanligen tillverkade med icke-modifierat rekombinant protein, immunoprecitera inte Sumoylerade former av protein av intresse. Nickel kromatografi har varit den andra metoden för att studera SUMOylation genom att fånga Histidine-märkta versioner av SUMO molekyler. Detta tillvägagångssätt används främst i celler stabilt uttrycker eller transitivt transfekterade med hans-Sumo molekyler. För att övervinna dessa begränsningar utvecklades SUMO-bindande enheter (SUBEs) för att isolera endogena Sumoylerade proteiner. Häri beskriver vi alla de steg som krävs för berikning, isolering och identifiering av Sumoylerade substrat från humana hepatomceller och levervävnad från en levercancer musmodell med hjälp av SUBEs. För det första, vi beskriver metoder som är involverade i beredning och lys av mänskliga hepatom celler och lever tumör vävnadsprover. Sedan, en grundlig förklaring av utarbetandet av SUBEs och kontroller beskrivs tillsammans med protokollet för protein pull-down-analyser. Slutligen, några exempel ges om de alternativ som finns för identifiering och karakterisering av SUMOylated Proteome, nämligen användning av Western-blot analys för detektion av ett specifikt Sumoylerat substrat från levertumörer eller användning av proteomik genom masspektrometri för högt dataflöde karakterisering av sumoylated proteomet och interactome i hepatom celler.
Introduction
Levercancer är den sjätte vanligaste cancer världen och den andra orsaken till cancer-associerade dödsfall1. Hepatocellulär cancer (HCC) är den mest rådande formen av primär levercancer. Historiskt sett, gemensamma riskfaktorer för utveckling av HCC ingår kronisk hepatit B eller C infektion och missbruk alkoholkonsumtion. Under de senaste decennierna, det metabola syndromet, typ 2 diabetes alkoholfria fettlever (NAFLD) har vuxit fram som riskfaktorer för utvecklingen av HCC2. HCC är mycket heterogena, både fenotypiskt och genetiskt, vari ett komplext nätverk av signalering vägar störs. Under de senaste åren, även om det har skett en ökning av vår kunskap om molekylära vägar inblandade i patogenesen av HCC, det finns fortfarande inga effektiva terapeutiska metoder för HCC Management. Många vägar aktiveras i HCC och hämma en allmänt driver ersättningen av andra vägar3. Detta har varit en av de största svårigheterna vid behandling av HCC. Sålunda, en mer global metod kan ge en potentiell terapeutisk metod för klinisk behandling av levercancer t. ex., inriktning post-translationella modifieringar (PTMs), som flera signalering vägar kan samtidigt regleras av PTMs av proteiner.
Posttranslationella modifieringar betraktas som nyckelmekanismer som reglerar protein homeostas och funktioner4. Strukturella och funktionella förändringar införs genom PTMs, därmed ökar proteomet mångfald. De vanligaste PTMs inkluderar fosforylering, metylering, acetylering, glykosylering, ubiquitination, och konjugering av ubiquitin-liknande proteiner (UbLs). Bland alla UbLs, protein modifiering av SUMO (liten ubiquitin modifierare) har uppmärksammats i samband med dess kritiska roll i en mängd olika cellulära processer, inklusive transkription, cellulära lokalisering, DNA-reparation, och cell Cycle progression 5. nyligen, sumoylation visades att ändras i levercancer6,7,8,9, och förändringar i sumoylering av specifika proteiner har beskrivits för att spela en roll i utvecklingen av cancerrelaterade sjukdomar9.
Hos däggdjur finns fem sumoparaloger, SUMO-1 till SUMO-5. Hittills, inga experimentella bevis finns om förekomsten av endogena SUMO-4 och endogena SUMO-5 konjugation reaktioner på proteinnivå10,11,12. Sumoylation hos däggdjur utförs av en enzymatisk thiol-Ester kaskad med tre enzymer, den heterodimeriskt Sumo aktiverande enzym (SAE1/SAE2) eller E1, den Sumo konjugating enzym (Ubc9) eller E2 och en Sumo-E3-Ligase specifika för varje målprotein. Handlingen av flera familjer av SUMO E3s verkar vara i en dynamisk jämvikt med SUMO-specifika proteaser (SUSPs eller SENPs)13 gör SUMOylation reaktionen mycket reversibel. Dessutom är endast en liten del av det Sumoylerade proteinet kontra icke-Sumoylerat totalt protein närvarande. Därmed är isolering av endogena Sumoylerade proteiner i vivo ganska utmanande13.
SUMOylation in vivo studerades initialt av Western blot med antikroppar mot proteinet av intresse14. Immunoprecipitation av proteinet utfördes med specifika antikroppar och sedan utfördes PAGE-Western blot med anti-SUMO-antikroppar. Det största problemet med denna strategi är att antikroppar som genereras mot ett icke-modifierat rekombinant protein inte alltid kan immunoprecitera den Sumoylerade formen av ett protein. Alternativt, nickel kromatografi efter det övergående uttrycket av histidin Tagged (His6) versioner av SUMO molekyler och proteinet av intresse har använts för att studera Sumoylering i celler. På grundval av detta kommer det att vara mer praktiskt att upptäcka SUMO-modifierade former från celler stabilt uttrycker His6-SUMO15. För in vivo-studier visades tandem-SUMO-interagerande motiv (SIM) baserad berikning för rening av Polysumokonjugat16. Andra grupper har använt Epitope-märkta antikropp Sumo metoder som ger ett genomförbart verktyg för att undersöka endogena sumoylation i primära celler, vävnader, och organ17,18. Och på senare tid har Nielsen och kollegor använt antikroppsbaserad berikning för att identifiera endogena och platsspecifika SUMO i celler och vävnader19.
För att ge kompletterande information om vilken roll SUMOylation in vivo, SUMO-bindande enheter (SUBEs), även känd som SUMO fällor, utvecklades20. Av relevans, tandem ubiquitin bindande enheter (rör) anses konceptuella prekursorer till SUBEs och är kommersiellt tillgängliga verktyg för detektion och isolering av polyubiquitylated proteiner21. SUBEs är rekombinanta proteiner som består av tandem upprepningar av simmar som därigenom erkänner SUMO-molekyler på modifierade proteiner med en ökning av den totala affiniteten för SUMO-substrat. Sumo-traps var konstruerade genom att introducera en E3 ubiquitin-proteinligase RNF4-derived SIM2 och SIM3 motiv i tandem, till en vektor som innehåller glutation S-transferase (GST), ett heterologa bärare protein20. Även om SUBEs inte kan användas på rätt sätt för att identifiera mono-SUMOylated målproteiner, denna metod ger ett verktyg för att underlätta rening och identifiering av poly-SUMO Target proteiner in vivo. Häri beskriver vi tillämpningen av subes att isolera sumoylerade proteiner både i mänskliga hepatom celler och i mus leverbiopsier, ett viktigt verktyg för studier av levercancer. Ett övergripande system för det protokoll som beskrivs i detta manuskript visas i figur 1.
Protocol
Alla experiment godkändes av CIC bioGUNE institutionella kommittéer för djuromsorg och hantering. Alla ansträngningar gjordes för att minimera djurens lidande och minska antalet djur som används. 3 månader gammal manlig glycin N-metyltransferas (gnmt) bristfällig (gnmt−/−) och dess Wild typ littermates (gnmt+/+) användes.
1. cell beredning och Lys
Obs: häri, va-7 (Human hepatom cellinjer) och THLE2 (Human lever cells linje) användes.
- Behåll celler i P100-plattor i standard odlingsmedier vid 37 ° c i en Befuktad atmosfär av 5% CO2-95% luftfuktighet.
- Odla celler i P100 plattor plätering med en densitet av 1,2-1.5 × 106 celler per maträtt genom att räkna cellerna med hjälp av en Neubauer hemocytometry räknekammare.
- Kultur huh-7 i DMEM kompletteras med 10% foster bovint serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin-amfotericin B (PSA) och 1% glutamin.
- Kultur THLE2 celler i kultur rätter förbelagda med 0,01 mg/mL fibronectin, 0,01 mg/mL bovint serumalbumin (BSA) och 0,03 mg/mL kollagen typ I upplöst i odlingssubstrat som består av bronkiell epitelial celltillväxt basal medium (BEGM) kompletterat med tillväxtfaktorer (0,4% BPE, 0,1% insulin, 0,1% hydrokortison, 0,1% retinoinsyra, 0,1% transferrin, 0,1% trijodtyronin samt 10% FBS, 1% PSA, 5 ng/mL Epidermal tillväxtfaktor (EGF) och 70 ng/mL fosfoetanolamin.
- Vid slutpunkten av experimentet, aspirera media från plattorna och tvätta celler med 5 mL steril 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Lyse-celler direkt på plattan placerad på is med 500 μL lyseringsbuffert (50 mM Tris pH 8,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% nonidet P-40 (NP40), kompletterat med komplett EDTA-fri proteashämmare cocktail och 50 μM PR-619 för varje P100 skålen. Med hjälp av en cell skrapa, skrapa försiktigt cellerna från botten av plattan i Lys mediet.
Anmärkning: Kontrollera att alla celler har lossnat från plattan genom att visuellt inspektera plattbasen efter behandlingen. - Alternativt, skörd celler genom trypsinization av aspirera cell media och tillsätt 1 mL 1x (0,05%) trypsin-EDTA på plattan, tillräckligt för att täcka cellerna och placera plattan i inkubatorn inställd på 37 ° c, 5% CO2, och 95% luftfuktighet för ~ 5 min att alla celler har lossnat från plattan. Tillsätt 2 mL förvärmda odlingssubstrat för att stoppa trypsinization. Centrifugera vid 150 g i 10 min och aspirera på supernatanten. Tvätta med 1x PBS och centrifugera vid 150 x g i 10 min. Efter aspirera på supernatanten, tillsätt 500 μL lyseringsbuffert (50 mM Tris pH 8,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40, kompletterad med komplett EDTA-fri proteashämmare cocktail och 50 μM PR-619 för varje P100 skålen.
Anmärkning: tillägg av PR-619 är kritisk. - Centrifugera vid 15 500 x g och 4 ° c i 10 min. överför supernatanten till ett annat rör och kassera pelleten.
Obs: protokollet kan pausas här, och prover lagras vid-80 ° c tills ytterligare analys.
2. vävnads beredning och Lys
- Vid djuroffer, samla mus lever, tvätta med kallt PBS, och Snap frysa omedelbart i flytande kväve. Förvara proverna − 80 ° c tills ytterligare analys.
- Homogenisera 75 mg fragment från Snap-fryst/eller färsk lever i 1 mL iskall lysis buffert (50 mM Tris pH 8,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40, kompletterad med komplett EDTA-fri proteashämmare cocktail och 50 μM PR-619). Kör homogenisatorn vid 6500 x rpm, 2 x 60 s vardera, med en 30 s paus (se tabell över material).
- Centrifugera proverna i en mikrofuge vid 15, 500 x g och 4 ° c i 10 min. överför supernatanten till ett annat rör och kassera pelleten.
- Alternativt, hackad 75 mg frysta vävnader i flytande kväve. Återställ sedan vävnaden i 1 mL lyseringsbuffert.
- Centrifugera provet i en mikrofuge vid 15, 500 x g och 4 ° c i 10 min. överför supernatanten till ett annat rör och kassera pelleten.
Obs: protokollet kan pausas här, och prover lagras vid-80 ° c tills ytterligare analys.
3. bindning av GST-SUBEs eller GST kontroll till Glutathione-Aguppstod pärlor
Obs: syntesen av GST-SUBEs eller GST kontroll är utanför tillämpningsområdet för detta manuskript och kan granskas i tidigare publicerad litteratur20. GST-och Control-SUBEs är också kommersiellt tillgängliga (t. ex. SignalChem).
- Beredning av glutation pärlor
- Tillsätt 1 mL avjoniserat vatten till 70 mg frystorkade Glutathione-agaros pärlor. Bered pärlorna över natten vid 4 ° c (eller i minst 30 min vid rumstemperatur).
- Tvätta pärlorna noggrant efter svullnad (för att ta bort laktos och etanol som vanligtvis finns i den frystorkade pulver agaros pärlor). För att göra detta, tvätta först med 10 mL avjoniserat vatten eller PBS följt av centrifugering vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Utför detta tre gånger.
- Efter 3 tvättar, Omsuspendera pärlorna i 1 mL PBS för att få en 50% (v/v) slurry.
Obs: denna volym lämpar sig för analys av 10 prover.
- För varje prov, tillsätt 100 μg gst-subes eller gst kontroll (se referens20) till 100 μl av glutation pärlor flytgödsel och 500 μl av PBS.
Anmärkning: den relativa överflöd av Sumoylerade proteiner av intresse bestämmer mängden GST-SUBEs används för pull-downs. För varje ny experimentell modell, analysera villkoret före det faktiska experimentet genom Western blotting input, bunden, och genomflöde (FT) material med anti-SUMO2/3 antikroppar eller mot proteiner av intresse (Leverkinas B1 (LKB1). - Inkubera alla GST-SUBEs eller GST kontroll med pärlor beredda i 3,2., långsamt roterande i rotator eller minirulle (se tabell över material) vid 4 ° c i minst 2 h (långsam bindning reaktion).
Anmärkning: lägga till 1 mm Ditiotreitol (dTT) förbättrar gst bindning till glutation pärlor. - Återvinna agaros pärlor genom centrifugering vid 300 x g i 5 min vid rumstemperatur. I slutet, återsuspenderade pärlorna i PBS för att få 50% (v/v) flytgödsel.
Obs: protokollet kan pausas här, och prover lagras vid-80 ° c tills ytterligare analys.
4. GST pull down-analys
- Efter steg 1,5, 2,3 eller 2,5, ta 1/10 av total volym (t. ex. 50 μL) och späd i samma volym av 3x kokande buffert (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 500 mM β-merkaptoetanol, 50% glycerol, 10% SDS, bromfenolblått). Denna fraktion anses som indata.
- Tillsätt 450 μL klargjorda lysat från steg 1,5, 2,3 eller 2,5 till 100 μL glutation pärlor slurry. Inkubera lysatet med pärlor, långsamt roterande vid 4 ° c i minst 2 h.
Anmärkning: Alternativt kan 100-200 μg totalt protein från steg 1,5, 2,3 eller 2,5 (kvantifierad med Bradford-analysen) i en total volym på 450 μL användas. - Snurra ner pärlorna i en mikrofugrör på 300 x g i 5 min och samla supernatanten för analysen. Överför 1/10 av den totala volymen (t. ex. 50 μL) i ett separat rör och späd i en lika mängd 3x kokande buffert. Denna fraktion är flödet genom (ft) fraktion.
- Tvätta resterande prov tre gånger med 1 mL iskall PBS, 0,05% Tween 20, snurra ner vid 4 ° c och 300 x g under 1 min. försiktigt aspirera så att ingen vätska återstår. Pärlorna motsvarar den SUBEs-bundna (SB) fraktionen.
- Eluera provet med 15 μL 3x kokande buffert och 15 μL av lyseringsbufferten. Detta kallas den bundna fraktionen.
5. identifiering och karakterisering av SUMO mål genom Western blot analys
- Utför Western blot-analys med en anti-SUMO2/3-antikropp eller någon annan specifik antikropp som beskrivits tidigare22.
6. identifiering och karakterisering av den Sumoylerade Proteomen genom masspektrometri
Anmärkning: vid analys av masspektrometri (MS) behandlades proverna med hjälp av den Filterstödda metoden för provberedning (FASP) som beskrivs av Wisniewski et al.23.
- Desalt peptiderna genom att använda Stage-Tip C18 mikrokolonner och Omsuspendera dem i 0,1% myrsyra (FA) före MS-analys.
- Fyll på proverna på ett LC-MS-system (se tabell över material) och analysera dem i tre exemplar (tekniska replikat) (figur 2b).
- Fortsätt med beräkningen av protein identifieringen och förekomsten med hjälp av en tillhörande programvara.
- För statistisk analys och heatmap generation, Ladda data på Perseus plattform (http://www.perseus.tufts.edu/hopper/). Tillämpa en permutation-baserade false Discovery Rate (FDR)-korrigerade t-test för jämförelsen av abundans. Proteiner med en q < 0,05 och ett SUBEs/GST-förhållande större än 2 ansågs vara berikat24.
Anmärkning: proteiner som identifierats med minst två olika peptider beaktas i den slutliga analysen.
Representative Results
Identifiering av ett specifikt Sumoylationssubstrat i Levertumörbiopsier av Western blot-analys
Leverkinas B1 (LKB1) sumoylation har nyligen visat sig vara en viktig onkogena förare i levercancer9,25. Möss med brist på glycin N-metyltransferas (gnmt), ofta kallad gnmt−/−, är en modell som spontant utvecklar Hepatocellulär cancer (HCC), den vanligaste typen av primär levercancer. Subes användes för att berika och isolera sumoylerade proteiner både i gnmt−/− möss med levercancer möss och dess vildtyp littermates (gnmt+/+). I figur 2Aingår Ponceau-färgning av de tre olika fraktioner (input, ft och Bound) som erhålls i subes pull-down-analys. En Ponceau S fläcken är användbart för att kontrollera en möjlig skadlig effekt på lastning av blottade proteiner som skall utvärderas av västerländska blots. I figur 2b visas en Western blot-analys av LKB1 genom att använda subes för att fånga endogena Sumoylerade LKB1. Nivåerna av LKB1 SUMOylation förstärks i levertumörer. När det gäller analys av västerländsk blot observerades lika belastningar och överförda proteiner av Ponceau-färgning av ingångs fraktionen och påverkades inte signifikant efter tvättningar (flöde genom fraktion). Mängden protein som fångas med SUBEs var signifikant högre, särskilt i tumörerna. Alternativt, färgning en dubblett gel med Coomassie blå kan ge liknande information. Klibbiga proteiner som p53 eller Sumoylerade former av vissa proteiner kan binda till GST-kontrollen. För att ta bort bakgrunden, använda låg densitet aguppstod pärlor, utföra en beläggning med BSA, eller införliva ytterligare tvättar. Detta kan dock påverka tillämpningar som masspektrometri och kan resultera i förlust av proteiner med låg affinitetsinteraktion.
Karakterisering av SUMO Interactome i mänskliga Hepatoma celler av masspektrometri analys
För att undersöka kapaciteten hos SUMO-fällan att interagera med naturligt Sumoylerade proteiner, va-7 (Human hepatoma) och icke-omvandlad lever epitelial mänskliga THLE2 cellinjer användes. Det första steget är visualiseringen av det totala materialet som fångas med SUBEs och med GST som en negativ kontroll. För detta ändamål kan vi använda konventionella proteinfärgningsprotokoll som visas i figur 3a. Sedan utförde vi masspektrometrianalys. I genomsnitt identifierades 2268 proteiner i Huh7 GST-proverna (2339, 2297 respektive 2168 för varje last), medan 2812 proteiner identifierades i genomsnitt i Huh7 SUBEs-provet (2815, 2817 och 2806). Efter subtraktion, 742 proteiner anrikades i SUBEs. Å andra sidan, ett genomsnitt av 2497 proteiner identifierades i THLE2 GST prover (2476, 2520 och 2495, respektive) och 2763 i SUBEs (2823, 2783 och 2684). Av dessa ansågs 577 vara anrikad i SUBEs-proverna. Analys av tekniska replikat hämtar heatmap visas i figur 3b, som beräknades med hjälp av standardinställningarna tillgängliga (Euclidean avstånd, genomsnittlig länkning och förbehandlade med k-medel). Heatmap skildrar distributionen av de 100 mest signifikant och exklusivt berikade proteiner i varje cellinje.
Figur 1: Schematiskt diagram över protokollet flödesschema som används för berikning, isolering och identifiering och karakterisering av Sumoylerade proteomet in vivo för studiet av levercancer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: modifiering av LKB1 av SUMO-2 i musmodeller av Hepatocellulär cancer.
a) Ponceau S färgning av de tre olika fraktioner (input, Flow Through (ft) och Bound) som erhålls i subes pull-down-analys. (b) Western blot analys av LKB1 genom att använda Sumo bindande enheter (subes) för att fånga endogena SUMOylated LKB1; GAPDH används som lastnings kontroll. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: skillnader mellan den Sumoylerade proteomen mellan den tumoraliska huh-7 och icke-omvandlad leverepitelial THLE2 mänskliga cellinjer.
a) Sypro-färgning av fångat protein material, med gst (negativ kontroll) och subes. (c) heatmap som skildrar de differentially anrikade proteinerna i huh-7 och THLE2 Sube prover. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Häri har vi tillhandahållit en fullständig och detaljerad beskrivning av den metod som rapporterar användningen av SUBEs för berikning, isolering och identifiering och karakterisering av Sumoylerade proteiner i in vivo-modeller av levercancer. Både i mus levertumörer och mänskliga hepatom celler, vi kunde korrekt isolera och identifiera sumoylated proteiner av intresse och att utföra en hög genomströmning karakterisering av sumoylated proteomet och interactome. Även om syntesen av SUBEs ligger utanför tillämpningsområdet för detta manuskript, för ytterligare information bör följande hänvisningar ses över26. Det beskrivna protokollet är snabbt och mycket känsligt och det kritiska steget i protokollet omfattar användning av SENPs-hämmare (PR-619). I alternativa, kemiska isopeptidashämmare såsom NEM (N-etylmaleimid) och IAA (2-Iodoacetamid) i lysbufferten kan användas, men tidigare rapporter har visat att för subes protokollet, användning av PR-619 är fördelaktigt eftersom den andra hämmare störa gst bindning till glutation pärlor20.
SUBEs är rekombinanta proteiner som består av tandem upprepningar av simmar som därigenom erkänner SUMO-molekyler på modifierade proteiner med en ökning av den totala affiniteten för SUMO-substrat. På grund av dess höga specificitet och känslighet är användningen av SUBEs för isolering av den Sumoylerade proteomet fördelaktigt i förhållande till andra metoder i litteraturen, såsom detektion genom Western-blot av specifika Sumoylerade proteiner med hjälp av antikroppar mot proteinet av intresse eller nickelkromatografi med hjälp av de olika Histidine-märkta versionerna av SUMO molekyler. Man måste dock ta hänsyn till att eftersom SUBEs-protokollet utförs under icke-denatureringsförhållanden bibehålls samspelet mellan Sumoylerade proteiner och andra samverkande proteiner. Därför får vi information om SUMO interactome snarare än bara en lista över SUMOylated målproteiner. Således, ytterligare experiment är nödvändiga för att bekräfta om det identifierade proteinet är en SUMO mål eller en samverkande faktor. Annan begränsning av SUBEs är det faktum att kontroll GST fällor som används kan fånga många bakgrunds proteiner relaterade till oxidativ stress. Denna fråga är särskilt relevant under MS-analysen på grund av den höga känsligheten hos tekniken. För att övervinna dessa begränsningar, en Sumo-fällor (biosubes) har utvecklats26. En annan begränsning av SUBEs finns i det faktum att vi bara kan fånga proteiner som modifierats av SUMO 2 och SUMO 3 medan SUMO 1-modifierade proteiner inte kan isoleras.
Andra farhågor om användningen av SUBEs är relaterad till den mängd utgångsmaterial som krävs för förfarandet. Utgångsmaterialet som används för att fånga upp Sumoylerade proteiner bör beakta de olika försöksbetingelserna som utforskas. Medan basal SUMOylation har rapporterats i olika cellulära sammanhang, är SUMOylation en process som är starkt induceras efter flera stress villkor/stimuli. Om man jämför obehandlade kontra behandlade prover måste man vara säker på att kolonnen inte är mättad, och skillnader kan observeras mellan dessa villkor. När det gäller mus fenotyper vi analyserar, inga behandlingar har använts och basal SUMOylation nivåer är låga. Av denna anledning användes stora mängder proteiner. Bakgrundsnivån bör kontrolleras med hjälp av GST och om den ospecifika bindningen är hög, bör mängden startmaterial eller bindningstiden minskas. Analysen av FT-fraktionen kan tyda på fångst effektivitet även om dessa fällor föredrar Poly-SUMOylated proteiner och en total utarmning inte bör förväntas, en minskning av total SUMOylation är i allmänhet väl observeras när fångst effektiviteten är Optimal.
Slutligen, annan tillämpning av SUBEs tekniken omfattar kombinationen av SUBEs teknik med realtid yta Plasmon resonans (SPR) gör det möjligt att i realtid interaktioner med Sumoylerade proteiner från cell extrakt27. Också, på senare tid, en Sumo-fällor (biosubes) har utvecklats med fördel att minska bakgrunden i samband med större taggar, t. ex., under masspektrometri analys26. Dessutom kan biosube-versionen användas för att detektera sumoylerade proteiner i levande celler genom fluorescens genom att använda konjugerat-märkta med distinkta fluorescerande färgämnen som utnyttjar konjugerat-bindningen till biotin. Metoder för detektion och kvantifiering av Sumoylerade proteiner kan också övervägas med både GST-och bioSUBEs-versioner som det gjordes med de tandem-bindande ubiquitin-bindningsentiteterna (rören)21.
Övergripande, användning av SUBEs för isolering och karakterisering av SUMOylated proteomet relevanta i levercancer är en snabb och känslig metod som ger stor information om den fortfarande ganska okänd roll SUMOylation vägen i levercancer.
Disclosures
Dr. Martínez-Chantar rekommenderar för Mitotherapeutix LLC.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från Institut National du cancer, Frankrike, INCa Grant PLBIO16-251 (PLBIO16-251), CONACyT-SRE (Mexico) Grant 0280365 och REPERE-programmet för Occitanie, Frankrike (M.S.R.). Också, NIH (US Department of Health och Human Services)-R01AR001576-11A1, Gobierno Vasco-Departamento de Salud 2013111114 (till M.L.M.-C), ELKARTEK 2016, Departamento de Industria del Gobierno Vasco, MINECO: SAF2017-87301-R Integrado en El plan Estatal de Investigación cientifica y Técnica y innovación 2013-2016 cofinanciado con fondos FEDER, BIOEF (baskiska Stiftelsen för innovation och hälsoforskning): EITB Maratoia BIO15/CA/014; Instituto de Salud Carlos III: PIE14/00031, Integrado en El plan Estatal de Investigación cientifica y Técnica y innovación 2013-2016 cofinanciado con fondos FEDER (till M.L.M.-C), Asociación Española Contra El Cáncer (T. C. D, M. L. M-C), Daniel Alagille Award från EASL (to T. C. D), Fundación Científica de La Asociación Española Contra El cancer (AECC Scientific Foundation) sällsynta tumör samtal 2017 (till M. M), La Caixa Foundation program (till M. L. M). Vi tackar MINECO för Severo Ochoa Excellence ackreditering till CIC bioGUNE (SEV-2016-0644).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Gnmt−/−)/ (Gnmt+/+) mice | CIC bioGUNE | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| BEBM | Lonza/Clonetics Corporation | cc-3171 | |
| BEGM Bullet Kit | Lonza/Clonetics Corporation | CC3170 | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| C18 microcolumns | Millipore | Z720070 | |
| Collagen type I | Santa Cruz Biotechnology | sc-136157 | |
| Complete tablets EDTA-free | Roche | 4693132001 | |
| DMEM | Life Technologies | A14431-01 | |
| DTT | Sigma | 43815 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EGF | Sigma | e9644 | |
| FBS | Life Technologies | 10270 | |
| Fibronectin | Life Technologies | 33010018 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma | G4510 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| GST-Control | SignalChem | G52-30H | |
| GST-SUBEs | SignalChem | S291-340G | |
| Huh7 | CLS (Cell Lines Service) | 300156 | https://clsgmbh.de/ |
| IAA (2-Iodoacetamide) | Merck | L58046844 | |
| LKB1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32245 | |
| Mini LabRoller Rotator | LABNET | H5500 | https://www.labnetinternational.com |
| NaCl | Merck | 106404041000 | |
| nanoElute | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
| NEM (N-Ethylmaleimide) | Sigma | E3876 | |
| NP40 | Fluka | 74385 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Peaks software | Bioinformatics Solutions Inc. | http://www.bioinfor.com/ | |
| Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
| Ponceau S solution | Sigma | P7170 | |
| PR-619 | Merck | 662141 | |
| Precellys 24 | Bertin Technologies | P000669-PR240-A | |
| PSA | Life Technologies | 151-40-122 | |
| PSG | Life Technologies | 10378-016 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| SUMO2/3 antibody | Abcam | Ab3742 | |
| THLE-2 | ATCC | ATCC CRL-2706 | http://www.lgcstandards-atcc.org |
| timsTOF Pro with PASEF mass spectrometer | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 60-24-2 |
References
- Forner, A., Llovet, J. M., Bruix, J.
- Gerbes, A., et al. Gut roundtable meeting paper: selected recent advances in hepatocellular carcinoma. Gut. , (2017).
- Avila, M. A., Berasain, C., Sangro, B., Prieto, J. New therapies for hepatocellular carcinoma. Oncogene. 25 (27), 3866-3884 (2006).
- Grotenbreg, G., Ploegh, H.
- Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 17 (9), 581-595 (2016).
- Seeler, J. S., Dejean, A.
- Tomasi, M. L., et al. S-adenosyl methionine regulates ubiquitin-conjugating enzyme 9 protein expression and sumoylation in murine liver and human cancers. Hepatology. 56 (3), 982-993 (2012).
- Li, J., et al. Cbx4 governs HIF-1alpha to potentiate angiogenesis of hepatocellular carcinoma by its SUMO E3 ligase activity. Cancer Cell. 25 (1), 118-131 (2014).
- Zubiete-Franco, I., et al. SUMOylation regulates LKB1 localization and its oncogenic activity in liver cancer. EBioMedicine. 40, 406-421 (2019).
- Sarge, K. D., Park-Sarge, O. K. SUMO and its role in human diseases. Internationa Review of Cell and Molecular Biology. 288, 167-183 (2011).
- Da Silva-Ferrada, E., Lopitz-Otsoa, F., Lang, V., Rodriguez, M. S., Matthiesen, R. Strategies to Identify Recognition Signals and Targets of SUMOylation. Biochemical Research International. , 875148 (2012).
- Liang, Y. C., et al. SUMO5, a Novel Poly-SUMO Isoform, Regulates PML Nuclear Bodies. Science Reports. 6, 26509 (2016).
- Mikolajczyk, J., et al. Small ubiquitin-related modifier (SUMO)-specific proteases: profiling the specificities and activities of human SENPs. Journal of Biologucal Chemistry. 282 (36), 26217-26224 (2007).
- Hilgarth, R. S., Sarge, K. D.
- Vertegaal, A. C., et al. A proteomic study of SUMO-2 target proteins. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33791-33798 (2004).
- Bruderer, R., et al. Purification and identification of endogenous polySUMO conjugates. EMBO Reports. 12 (2), 142-148 (2011).
- Becker, J., et al. Detecting endogenous SUMO targets in mammalian cells and tissues. Nature Structural Molecular Biology. 20 (4), 525-531 (2013).
- Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies. Nature Protocols. 9 (4), 896-909 (2014).
- Hendriks, I. A., et al. Site-specific characterization of endogenous SUMOylation across species and organs. Nature Communications. 9 (1), 2456 (2018).
- Da Silva-Ferrada, E., et al. Analysis of SUMOylated proteins using SUMO-traps. Science Reports. 3, 1690 (2013).
- Hjerpe, R., et al. Efficient protection and isolation of ubiquitylated proteins using tandem ubiquitin-binding entities. EMBO Reports. 10 (11), 1250-1258 (2009).
- Embade, N., et al. Murine double minute 2 regulates Hu antigen R stability in human liver and colon cancer through NEDDylation. Hepatology. 55 (4), 1237-1248 (2012).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Meier, F., et al. Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer. Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
- Ritho, J., Arold, S. T., Yeh, E. T. A Critical SUMO1 Modification of LKB1 Regulates AMPK Activity during Energy Stress. Cell Reports. 12 (5), 734-742 (2015).
- Lang, V., Da Silva-Ferrada, E., Barrio, R., Sutherland, J. D., Rodriguez, M. S. Using Biotinylated SUMO-Traps to Analyze SUMOylated Proteins. Methods in Molecular Biology. 1475, 109-121 (2016).
- Xolalpa, W., Rodriguez, M. S., England, P. Real-Time Surface Plasmon Resonance (SPR) for the Analysis of Interactions Between SUMO Traps and Mono- or PolySUMO Moieties. Methods in Molecular Biology. 1475, 99-107 (2016).
