Summary
여기서, 우리는 스모 결합 엔티티(SUBEs)를 사용하여 인간 간종 세포및 간 종양으로부터 수득된 인간 간종 세포 및 간 종양모두에서 SUMO에 의해 변형된 단백질을 풍부하게 하고, 분리하고, 식별하고, 특성화하는 프로토콜을 제시한다.
Abstract
번역 후 수정은 진핵 세포에서 단백질 항상성과 기능을 조절하는 주요 메커니즘입니다. 간암에 있는 모든 유비퀴틴 같이 단백질 중, SUMO (작은 유비퀴틴 MOdifier)에 의하여 수정은 가장 주목을 받았습니다. 생체 내에서 내인성 SUMOylated 단백질의 분리는 활성 SUMO 특이적 프로테아제의 존재로 인해 도전적입니다. 생체 내에서 의 스모일화의 초기 연구는 특정 스모일화 단백질의 분자 검출에 기초하였다 (예를 들어, 서쪽 얼룩에 의해). 그러나, 많은 경우에, 항체는, 일반적으로 비변형 재조합 단백질로 만들어졌으며, 관심 있는 단백질의 스모예화된 형태를 면역침전시키지 않았다. 니켈 크로마토그래피는 스모 분자의 히스티딘 태그 버전을 포착하여 스모일화를 연구하는 또 다른 접근법이었습니다. 이 접근법은 주로 안정적으로 발현하거나 일시적으로 His-SUMO 분자로 형질감염된 세포에서 사용된다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 스모 결합 엔티티(SUBEs)는 내인성 스모일화 단백질을 분리하기 위해 개발되었습니다. 본 명세서에서, 우리는 SUBEs를 사용하여 간암 마우스 모델로부터 인간 간종 세포 및 간 조직으로부터 의 SOylated 기질의 농축, 격리 및 식별에 필요한 모든 단계를 설명한다. 첫째, 우리는 인간 간종 세포 및 간 종양 조직 샘플의 준비 및 분해에 관여하는 방법을 설명합니다. 이어서, SUBEs 및 대조물의 준비에 대한 철저한 설명은 단백질 풀다운 분석에 대한 프로토콜과 함께 상세히 설명된다. 마지막으로, 스모일화된 프로테오메의 식별 및 특성화, 즉 간 종양으로부터의 특정 스모일화된 기질의 검출을 위한 웨스턴 블롯 분석의 사용 또는 사용에 사용할 수 있는 옵션에 관한 몇 가지 예가 제공된다. 세포종 세포에서 스모일화된 프로테오메 및 상호작용의 고처리량 특성화를 위한 질량 분석법에 의한 프로테오믹스의.
Introduction
간암은 전 세계적으로 여섯 번째로 흔한 암이며 암 관련 사망의 두 번째 원인1. 간세포 암종 (HCC)은 1 차적인 간암의 가장 일반적인 양식입니다. 역사적으로, HCC의 발달을 위한 일반적인 위험 요소는 만성 B형 간염 또는 C형 간염 감염 및 학대적인 알콜 소비를 포함했습니다. 지난 수십 년 동안, 대사 증후군, 타입-2 당뇨병 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)은 HCC2의발달을 위한 위험 인자로 부상하였다. HCC는 매우 이질적이며, 전형적이고 유전적으로, 신호 경로의 복잡한 네트워크가 중단된다는 것을 항성으로 한다. 지난 몇 년 동안, HCC의 병인에 연루된 분자 경로에 대한 지식이 증가했음에도 불구하고 HCC 관리를 위한 효과적인 치료 접근법은 아직 없습니다. 많은 통로는 HCC에서 활성화되고 하나는 일반적으로 다른 통로3에의하여 보상을 구동합니다. 이것은 HCC를 취급할 때 주요 어려움의 한개이었습니다. 따라서, 보다 글로벌한 접근법은 다중 신호화 경로가 단백질의 PTM에 의해 동시에 조절될 수 있기 때문에, 예를 들어, 번역 후 변형(PTM)을 표적으로 하는 간암의 임상 관리를 위한 잠재적인 치료 접근법을 제공할 수 있다.
번역 후 수정은 단백질 항상성 및 기능을 조절하는 주요 메커니즘으로 간주됩니다4. 구조적 및 기능적 변화는 PTM에 의해 도입되어 프로테오메의 다양성을 증가시킵니다. 가장 일반적인 PTM은 인산화, 메틸화, 아세틸화, 글리코실화, 유비퀴틴화 및 유비퀴틴 유사 단백질(UbLs)의 컨쥬게이션을 포함한다. 모든 UbLs 중에서, SUMO (작은 유비퀴틴 MOdifier)에 의한 단백질 수정은 전사, 세포 국소화, DNA 복구 및 세포 주기 진행을 포함한 다양한 세포 과정에 중요한 역할과 관련하여 주목받고 있습니다. 5. 최근, 스모일화는 간암에서 변경되는 것으로 나타났다6,7,8,9,특정 단백질의 스모일화의 변화는 진행에 역할을 하는 것으로 설명되었다 암 관련 질환9.
포유류에는 스모-5까지 5개의 스모 파라로그가 있습니다. 현재까지단백질 수준10,11,12에서내인성 SUMO-4 및 내인성 SUMO-5 접합 반응의 존재에 대한 실험적 증거가 없습니다. 포유류에서의 스모일화는 3가지 효소, 이종성 스모 활성화 효소(SAE1/SAE2) 또는 E1, 스모 컨쥬게이팅 효소(Ubc9) 또는 E2 및 각 표적 단백질에 특이적인 SUMO-E3-리가제를 포함하는 효소 티올-에스테르 캐스케이드에 의해 수행된다. 스모 E3s의 여러 가족의 행동은 스모 특유의 프로테아제(SUSPs 또는 Senps)13과 의 다이내믹한 평형에 있는 것으로 보이며, 스모일레이션 반응을 매우 가역적입니다. 더욱이, 스모일화된 단백질의 극히 일부만 이스모일화된 총 단백질이 존재한다. 이에 따라, 생체 내에서 내인성 스모일화 단백질을 분리하는 것은 오히려13에도전적이다.
생체내에서의 스모일화는 관심있는 단백질에 대하여 항체를 사용하여 서양 얼룩에 의해 처음 연구되었다14. 단백질의 면역 침전은 특정 항체로 수행된 다음 PAGE-웨스턴 블롯을 항-SUMO 항체로 수행하였습니다. 이 전략의 주요 문제점은 비변형 재조합 단백질에 대하여 생성된 항체가 항상 단백질의 SUMOylated 형태를 면역침전할 수 없다는 것이다. 대안적으로, 히스티딘(His6) 버전의 스모 분자및 관심 있는 단백질의 일시적인 발현 후 니켈 크로마토그래피는 세포에서 스모일화를 연구하는데 사용되어 왔다. 이를 바탕으로 His6-SUMO15를안정적으로 발현하는 세포로부터 스모 변형 형태를 검출하는 것이 더 편리할 것이다. 생체내 연구를 위해, 탠덤-스모-상호작용 모티프(SIM) 기반 농축은 폴리스모 접합체16의정제를 입증하였다. 다른 그룹은 1차 세포, 조직 및장기17,18에서내인성 스모일화를 조사하는 실행 가능한 도구를 제공하는 에피토프 태그 항체 SUMO 접근법을 사용하고 있다. 그리고 최근에, Nielsen 및 동료는 세포 및 조직19에있는 내인성 및 사이트 특정 SUMO를 확인하기 위하여 항체 기지를 둔 농축을 이용했습니다.
생체 내에서 스모일레이션의 역할에 대한 보완적인 정보를 제공하기 위해 스모 트랩이라고도 하는 스모 바인딩 엔티티(SUBEs)가20개개발되었습니다. 관련성중, 탠덤 유비퀴틴 결합 엔티티(TUB)는 SUBEs의 개념적 전구체로 간주되며 폴리유비쿼터화단백질(21)의검출 및 격리를 위한 시판되는 도구이다. SUBEs는 SEM의 탠덤 반복을 포함하는 재조합 단백질로, SUMO 기질에 대한 전반적인 친화성의 증가와 함께 변형된 단백질에 대한 SUMO 분자를 인식합니다. 스모 트랩은 E3 유비퀴틴 단백질 리가제 RNF4 유래 SIM2 및 SIM3 모티프를 동시에 도입하여, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)를 함유하는 벡터로, 이종 담체 단백질20을도입하여 설계되었다. SUBEs는 모노 스모일화된 표적 단백질을 확인하기 위해 적절히 사용될 수 없지만, 이 방법은 생체 내에서 폴리-SUMO 표적 단백질의 정제 및 식별을 용이하게 하는 도구를 제공한다. 본 명세서에서, 우리는 인간 간종 세포와 마우스 간 생검에서 모두 스모일화된 단백질을 분리하는 SUBEs의 적용을 설명하며, 간암 연구를 위한 중요한 도구이다. 이 원고에 설명된 프로토콜의 전체 구성표는 그림 1에나와 있습니다.
Protocol
모든 실험은 동물 관리 및 취급을 위한 CIC bioGUNE 기관 위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 노력은 동물의 고통을 최소화하고 사용되는 동물의 수를 줄이기 위해 노력했다. 3개월 된 수컷 글리신 N-메틸트랜스퍼라제(Gnmt)가 결핍(Gnmt−/−) 및 그 야생형 쓰레기류(Gnmt+/+)를 사용하였다.
1. 세포 준비 및 Lysis
참고: 본명, Huh-7(인간 간세포주) 및 THLE2(인간 간 세포주)를 사용하였다.
- 5% CO2-95% 습도의 가습 분위기에서 표준 성장 매체에서 P100 플레이트에서 세포를 37°C로 유지합니다.
- Neubauer haemocytometometry 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수함으로써 접시당 1.2-1.5 × 106 세포의 밀도로 도금하는 P100 플레이트에서 세포를 성장시다.
- DMEM의 배양 Huh-7은 10% 태아 소 혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B(PSA) 및 1% 글루타민으로 보충되었습니다.
- 배양 THLE2 세포배양내 0.01 mg/mL 피브로넥틴, 0.01 mg/mL 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.03 mg/mL 콜라겐 타입 I을 성장 배지에 용해시킨 배양 요리에서 기관지 상피 세포 성장 기저 배지(BEGM)로 보충 성장 인자 (0.4 % BPE, 0.1 % 인슐린, 0.1 % 하이드로 코르티손, 0.1 % 레티노산, 0.1 % 트랜스 페이실로, 0.1 % 트리오도티로닌뿐만 아니라 10 % FBS, 1 % PSA, 5 ng / mL 표피 성장 인자 (EGF) 및 70 ng / mphosphoin.
- 실험의 종점에서, 멸균 1x 인산완충식염수(PBS)의 5 mL로 플레이트 및 세척 세포로부터 매질 방출한다. 용해 완충액 500 μL (50 mM Tris pH 8.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% nonidet P-40 (NP40)을 사용하여 얼음에 놓인 플레이트에 직접 놓은 용염 세포는 완전한 EDTA 프리 프로테아제 억제제 칵테일과 각 P10 접시에 50 μM PR-619로 보충됩니다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트 바닥에서 세포를 용해 배지로 부드럽게 긁어냅니다.
참고 : 모든 세포가 처리 후 플레이트 베이스를 육안으로 검사하여 플레이트에서 분리된지 확인하십시오. - 또는, 세포 매체를 흡입하여 트립시니화를 통해 세포를 수확하고 1x (0.05%)의 1 mL을 추가합니다. 트립신-EDTA를 플레이트에, 세포를 덮을 정도로 37°C, 5%CO2및 95% 습도를 ~5분 동안 인큐베이터세트에 배치하여 모든 세포가 플레이트로부터 분리되도록 한다. 트립시니화를 막기 위해 미리 데운 성장 배지 2 mL를 추가합니다. 원심분리기 는 150g에서 10 분 동안 하청을 흡인합니다. 1x PBS와 원심분리기를 150 x g으로 10분 동안 씻으소서. 상한제를 흡입한 후, 500 μL의 용해 완충액(50 mM Tris pH 8.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40)을 추가하고, 완전한 EDTA 프리 프로테아제 억제제 칵테일과 각 P100 접시에 50 μM PR-619를 보충합니다.
참고: PR-619의 추가는 매우 중요합니다. - 15,500 x g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리기를.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있으며 추가 분석이 있을 때까지 -80°C에 저장된 샘플입니다.
2. 조직 준비 및 Lysis
- 동물의 희생시, 마우스 간을 수집하고, 차가운 PBS로 씻고, 액체 질소로 즉시 얼어 붙습니다. 추가 분석이 될 때까지 샘플을 -80°C로 저장합니다.
- 얼음 차가운 용해 완충액 1 mL에서 스냅 냉동 / 또는 신선한 간에서 75 mg 의 조각을 균질화하십시오 (50 mM Tris pH 8.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 % NP40, 완전한 EDTA프리 프로테아제 억제제 칵테일 및 50 μM PR-619). 균질화기를 6500 x rpm, 2 x 60s각각에서 30s 일시 중지(재료 표참조)로 실행합니다.
- 15, 500 x g 및 4 °C에서 10 분 동안 마이크로 퍼지에서 샘플을 원심 분리합니다.
- 양자택일로, 액체 질소에 있는 동결된 조직의 75 mg을 삼중. 그런 다음 1 mL의 라시스 버퍼에서 조직을 회복하십시오.
- 15, 500 x g 및 4 °C에서 10 분 동안 마이크로 퍼지에서 샘플을 원심 분리합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있으며 추가 분석이 있을 때까지 -80°C에 저장된 샘플입니다.
3. 글루타티온-아가로즈 비즈에 GST-SUBEs 또는 GST 제어의 바인딩
참고: GST-SUBEs 또는 GST 제어의 합성은 이 원고의 범위를 벗어났으며 이전에 출판된 문헌20에서검토할 수 있습니다. 또는 GST- 및 제어 SUBE가 시판됩니다(예: SignalChem).
- 글루타티온 구슬의 준비
- 1 mL의 탈이온수를 70 mg의 용이성 글루타티온-아가로즈 비즈에 넣습니다. 4 °C (또는 실온에서 적어도 30 분 동안)에서 밤새 구슬을 재구성하십시오.
- 부종 후 비드를 철저히 세척하십시오 (일반적으로 유당과 에탄올을 제거하여 일반적으로 동약 분말 아가로즈 비드에 존재합니다). 이렇게하려면 먼저 탈 이온수 또는 PBS 10mL로 씻은 다음 실온에서 5 분 동안 300 x g에서 원심 분리하십시오. 이 세 번 을 수행합니다.
- 3번의 세안 후, 50%(v/v) 슬러리를 얻기 위해 PBS의 1 mL에서 구슬을 다시 중단한다.
참고: 이 부피는 10개의 샘플 분석에 적합합니다.
- 각 샘플에 대해, GST-SUBEs 또는 GST 대조군 100 μg를 글루타티온 비드 슬러리의 100 μL에 추가하고 PBS의 500 μL을 추가합니다.
참고: 관심 있는 스모일화된 단백질의 상대적 풍부도는 풀다운에 사용되는 GST-SUBEs의 양을 결정합니다. 각각의 새로운 실험 모델에 대해, 항-SUMO2/3 항체를 사용하거나 관심 있는 단백질에 대해 입력, 바운드 및 플로우스루(FT) 물질을 입력, 바운드 및 플로우스루(FT)를 입력하여 실제 실험 전에 상태를 분석합니다(간 키나제 B1(LKB1).. - 모든 GST-SUBEs 또는 GST 대조군을 3.2.로 제조된 구슬로 배양하고, 회전자 또는 미니 롤러에서 천천히 회전(재료 표참조)에서 적어도 2시간 동안 4°C(느린 결합 반응).
참고: 1 mM 디티오트레이톨(DTT)을 추가하면 글루타티온 구슬에 대한 GST 결합이 향상됩니다. - 아가로즈 구슬을 실온에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리하여 회수합니다. 결국, 50 %(v / v) 슬러리를 얻기 위해 PBS에서 구슬을 다시 중단했습니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있으며 추가 분석이 있을 때까지 -80°C에 저장된 샘플입니다.
4. GST 풀 다운 분석
- 단계 1.5, 2.3 또는 2.5 후, 총 부피의 1/10을 취하고 3x 끓는 완충제 (250 mM Tris-HCl pH 6.8, 500 mM β-메르카페에탄올, 50% 글리세롤, 10% SDS, 브로모펜 블루올)의 동일한 부피에서 희석한다. 이 분수는 INPUT로 간주됩니다.
- 1.5단계, 2.3 단계 또는 2.5 μL 에서 100 μl 글루타티온 비드 슬러리에서 450 μL의 정제 된 용해염을 첨가하십시오. 용해물구슬을 구슬로 배양하고, 적어도 2 시간 동안 4 °C에서 천천히 회전합니다.
참고: 1.5단계, 2.3 또는 2.5단계(브래드포드 분석으로 정량화)로부터 총 단백질의 100-200 μg를 총 부피 450 μL로 사용할 수 있다. - 300 x g에서 5 분 동안 마이크로 퍼지에서 구슬을 스핀 다운하고 분석을 위해 상류를 수집합니다. 총 부피(예: 50 μL)의 1/10을 별도의 튜브에 옮기고 3배 의 동일한 부피로 희석한다. 이 분수는유동관통(FT)분수이다.
- 남은 시료를 1 mL 얼음 냉간 PBS, 0.05% 트웬 20으로 3회 세척하고 4°C에서 300 x g으로 1분 동안 스핀다운합니다. 비드는 SUBEs 바운드(SB) 분수에 해당합니다.
- 3x 비등 완충액의 15 μL 및 용해 완충액의 15 μL로 견본을 용해합니다. 이를 바운드 분수라고 합니다.
5. 웨스턴 블롯 분석에 의한 스모 표적의 식별 및 특성화
- 앞서22에기재된 바와 같이 항-SUMO2/3 항체 또는 임의의 다른 특정 항체를 사용하여 서방 얼룩 분석을 수행한다.
6. 질량 분광법에 의한 스모일화된 프로테오메의 식별 및 특성화
참고: MS(질량 분석) 분석의 경우, Wisniewski 외23에서설명한 필터 보조 시료 전조(FASP) 방법을 사용하여 샘플을 처리하였다.
- 단계 팁 C18 마이크로컬럼을 사용하여 펩티드를 탈염시키고 MS 분석 전에 0.1% 포름산(FA)으로 재중단하였다.
- 샘플을 LC-MS 시스템에 로드하고(재료 표참조) 삼중(기술 복제)(그림2b)으로분석합니다.
- 관련 소프트웨어를 사용하여 단백질 식별 및 풍부도 계산을 계속합니다.
- 통계 분석 및 히트맵 생성을 위해 데이터를 페르세우스 플랫폼(http://www.perseus.tufts.edu/hopper/)에 로드합니다. 순열 기반 의 거짓 발견 속도 (FDR) 풍부도의 비교를 위해 수정 된 t 테스트를 적용합니다. q< 0.05 및 SUBEs/GST 비율이 2보다 큰 단백질은농축된 24로간주되었다.
참고: 적어도 2개의 상이한 펩티드로 확인된 단백질은 최종 분석에서 고려됩니다.
Representative Results
웨스턴 블롯 분석에 의한 간 종양 생검에서 특정 스모일화 기판의 식별
간키나제 B1(LKB1) 스모일화는 최근 간암9,25에서중요한 항인성 동인으로 나타났다. 글리신 N-메틸 트랜스퍼라제(Gnmt)가결핍된 마우스는 종종 Gnmt-/−라고도불리며, 가장 일반적인 일차 간암 유형인 간세포암(HCC)을 자발적으로 개발하는 모델입니다. SUBEs는 간암 마우스와 그 야생 형 리터메이트(Gnmt+/+)와 Gnmt-/− 마우스모두에서 스모일화된 단백질을 풍부하게 하고 격리하는 데 사용되었습니다. 도 2a에서,SUBEs 풀다운 분석에서 얻어진 3개의 상이한 분획(입력, FT 및 BOUND)의 Ponceau S 염색이 포함된다. Ponceau S 얼룩은 서양 얼룩에 의해 평가되는 얼룩진 단백질의 로딩에 가능한 해로운 효과를 제어하는 데 유용합니다. 도 2b에서 SUBEs를 사용하여 내인성 스모일화된 LKB1을 포착하여 LKB1의 웨스턴 블롯 분석이 도시되어 있다. LKB1 SUMOylation의 수준은 간 종양에서 증강됩니다. 웨스턴 블롯 분석의 경우, 동일한 하중 및 전사된 단백질은 입력 분획의 Ponceau 염색에 의해 관찰되었고, 세안 후 유의한 변경되지 않았다(분획을 통한 흐름). SUBEs로 포획된 단백질의 양은 특히 종양에서 상당히 높았습니다. 또는, Coomassie 블루와 중복 젤 염색 비슷한 정보를 제공할 수 있습니다. 일부 단백질의 p53 또는 SUMOylated 형태와 같은 끈적 끈적한 단백질은 GST 통제에 묶일 지도 모릅니다. 배경을 제거하려면 저밀도 아가로즈 비즈를 사용하거나 BSA로 코팅을 수행하거나 추가 세서를 통합하십시오. 그러나, 이것은 질량 분광법과 같은 응용프로그램에 영향을 미칠 수 있고 낮은 선호도 상호 작용하는 단백질의 손실귀착될 수 있습니다.
질량 분석 분석에 의한 인간 간종 세포에서 의 스모 상호 작용의 특성 분석
스모트랩의 용량을 조사하기 위해 자연스모일화된 단백질과 상호작용하는, Huh-7(인간 간종) 및 비형질 성 인간 THLE2 세포주를 사용하였다. 첫 번째 단계는 SUBEs로 캡처한 총 자료를 시각화하고 GST를 음수 제어로 사용하는 것입니다. 이를 위해 도 3a에도시된 바와 같이 기존의 단백질 염색 프로토콜을 사용할 수 있다. 그런 다음 질량 분석 분석을 수행했습니다. Huh7 GST 샘플(각 하중당 2339, 2297 및 2168)에서 평균 2268개의 단백질이 확인된 반면, Huh7 SUBEs 샘플(2815, 2817 및 2806)에서는 평균 2812개의 단백질이 확인되었습니다. 빼기 후, 742개의 단백질을 SUBEs에서 농축시켰다. 한편, THLE2 GST 샘플(각각 2476, 2520 및 2495)과 SUBEs(2823, 2783 및 2684)에서 2763개의 단백질이 평균 2497개 규약으로 확인되었다. 이들 중, 577은 SUBEs 샘플에서 농축된 것으로 간주되었다. 기술 복제물의 분석은 사용 가능한 기본 설정(유클리드 거리, 평균 연결 및 k-평균으로 사전 처리됨)을 사용하여 계산된 그림 3b에표시된 히트맵을 검색합니다. 히트맵은 각 세포주에서 100개의 가장 유의하고 독점적으로 농축된 단백질의 분포를 묘사합니다.
도 1: 간암 연구를 위해 생체 내 의 스모일화된 프로테오메의 농축, 격리 및 식별 및 특성화에 사용되는 프로토콜 플로우도의 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 간세포 암종의 마우스 모델에서 SUMO-2에 의한 LKB1의 변형.
(a)SUBEs 풀다운 분석에서 얻어진 3개의 상이한 분획(입력, 유량통과(FT) 및 BOUND의 Ponceau S 염색. (b)내인성 스모일레이트 LKB1을 포획하기 위해 스모 바인딩 엔티티(SUBEs)를 이용하여 LKB1의 웨스턴 블롯 분석; GAPDH는 로딩 제어로 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 종양 Huh-7과 비형질간 상피 THLE2 인간 세포주 사이의 스모일화된 프로테오메 사이의 차이.
(a)캡처 된 단백질 물질의 Sypro 염색, GST (음성 대조군) 및 SUBEs. (c)Huh-7 및 THLE2 SUBE 샘플에서 차별화된 농축 단백질을 묘사한 히트맵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
본 명세서에서, 우리는 간암의 생체 내 모델에서 스모일화된 단백질의 농축, 격리 및 식별 및 특성화를 위한 SUBEs의 사용을 보고하는 방법론에 대한 완전하고 상세한 설명을 제공하였다. 마우스 간 종양과 인간 간종 세포 에서 모두, 우리는 정확하게 관심있는 스모일화 단백질을 분리하고 식별하고 스모일화 된 프로테오메 및 상호 작용의 높은 처리량 특성을 수행 할 수있었습니다. SUBEs의 합성이 이 원고의 범위를 벗어났더라도 자세한 내용은26을참조해야 합니다. 기재된 프로토콜은 빠르고 매우 민감하며, 프로토콜의 중요한 단계는 SENPs 억제제(PR-619)의 사용을 포함한다. 대안적으로, 용해 완충제에서 NEM(N-에틸말레미드) 및 IAA(2-Iodoacetamide)와 같은 화학적 이소펩티다아제 억제제가 사용될 수 있지만, 이전 보고서는 SUBEs 프로토콜의 경우 PR-619의 사용이 다른 것으로 유리하다는 것을 보여주었습니다. 억제제는 글루타티온비드(20)에대한 GST 결합을 방해한다.
SUBEs는 SEM의 탠덤 반복을 포함하는 재조합 단백질로, SUMO 기질에 대한 전반적인 친화성의 증가와 함께 변형된 단백질에 대한 SUMO 분자를 인식합니다. 그것의 높은 특이성 및 감도 때문에, SUBEs의 사용은 에 대하여 항체를 사용하여 특정 SUMOylated 단백질의 서쪽 얼룩에 의하여 검출과 같은 문헌에 있는 그밖 접근에 대하여 유리합니다. 관심있는 단백질 또는 스모 분자의 다른 히스티딘 태그 버전을 사용하여 니켈 크로마토그래피. 그러나 SUBEs 프로토콜이 비 변성 조건하에서 수행됨에 따라 SUMOylated 단백질과 다른 상호 작용 단백질 간의 상호 작용이 유지된다는 점을 고려해야 합니다. 따라서, 우리는 스모일화 표적 단백질의 목록이 아니라 스모 상호 작용에 대한 정보를 얻습니다. 따라서, 확인된 단백질이 SUMO 표적 또는 상호 작용 인자인지 확인하기 위해 추가적인 실험이 필요하다. SUBEs의 그밖 제한은 사용된 통제 GST 트랩이 산화 긴장과 관련있는 많은 배경 단백질을 붙잡을 수 있다는 사실입니다. 이 문제는 기술의 높은 감도로 인해 MS 분석 중에 특히 관련이 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 바이오티니티스스포트랩(bioSUBEs)이26개개발되었다. SUBEs의 또 다른 한계는 우리가 SUMO 2와 SUMO 3에 의해 수정된 단백질만포획할 수 있는 반면, SUMO 1-modified 단백질은 분리될 수 없다는 사실에 있습니다.
SUBEs의 사용에 대한 다른 관심사는 절차에 필요한 시작 재료의 양과 관련이 있습니다. SUMOylated 단백질을 포획하는 데 사용되는 시작 물질은 탐구된 다른 실험 조건을 고려해야 합니다. 기저 스모일화는 다양한 세포 문맥에서 보고되었지만, 스모일화는 여러 스트레스 조건/자극 후에 강하게 유도되는 과정입니다. 처리되지 않은 샘플과 처리된 샘플을 비교하는 경우 열이 포화되지 않았는지 확인해야 하며 이러한 조건 간에 차이를 관찰할 수 있습니다. 우리가 분석하고 있는 마우스 표현형의 경우에, 아무 처리도 이용되지 않으며 기초 스모일화 수준은 낮습니다. 이러한 이유로, 단백질의 높은 금액을 사용 했다. 배경 수준은 GST를 사용하여 제어해야 하며 비특이적 바인딩이 높으면 시작 재질의 양이나 바인딩 시간을 줄여야 합니다. FT 분획의 분석은 이러한 트랩이 폴리 스모일화 단백질을 선호하더라도 캡처 효율을 나타낼 수 있으며 총 고갈을 예상해서는 안되며, 캡처 효율이 높을 때 총 스모일화의 감소가 일반적으로 잘 관찰됩니다. 최적의.
마지막으로, SUBEs 기술의 다른 응용 분야에는 SUBEs 기술과 실시간 표면 플라스몬 공명(SPR)의 조합이 포함되어 있어 세포추출물(27)에서스모일화된 단백질과 실시간 상호작용을 가능하게 한다. 또한, 최근에는질량분석분석(26)동안, 예를 들어 더 큰 태그와 관련된 배경을 감소시키는 이점을 가지고 생체생리화된 스모 트랩(bioSUBEs)이 개발되었다. 또한, 바이오수브 버전은 비오틴에 결합하는 스트렙타비딘을 이용하여 뚜렷한 형광 염료로 표지된 스트렙타비딘을 사용하여 살아있는 세포에서 스모일화된 단백질을 검출하는데 사용될 수 있다. 또한, 스모일화된 단백질의 검출 및 정량화를 위한 방법은 탠덤 유비퀴틴 결합 엔티티(TUBEs)21과함께 행해진 것과 같은 GST 및 바이오서브스 버전 모두로 고려될 수 있다.
전반적으로, 간암에 관련된 스모일화 된 프로테오메의 격리 및 특성화를위한 SUBEs의 사용은 간암에서 스모일화 경로의 아직 알려지지 않은 역할에 대한 방대한 정보를 제공하는 빠르고 민감한 방법입니다.
Disclosures
마티네즈-찬타르 박사는 미토테라푸틱스 LLC에 대한 조언을 구합니다.
Acknowledgments
이 작품은 인스티투트 국립 두 암, 프랑스, INCa 교부금 PLBIO16-251 (PLBIO16-251), CONACyT-SRE (멕시코) 교부금 0280365 및 프랑스 옥시타니의 REPERE 프로그램 (M.S.R.)의 보조금에 의해 지원되었다. 또한, NIH (미국 보건 복지부)-R01AR001576-11A1, 고비에르노 바스코-디데아멘토 데 살루드 2013111114 (M.L.M.-C), ELKARTEK 2016, 디데리아 델 고비에르노 바스코, 마인코: SAF2017-87301-R 인테그라도 엔 엘 플랜 에스타탈 데 Investigación Cientifica y Técnica y Innovación 2013-2016 cofinanciado con Fondos FEDER, BIOEF (혁신 및 건강 연구를 위한 바스크 재단): EITB 마라토이아 BIO15/CA/014; 인스티투토 드 살루드 카를로스 III:PIE14/00031, integrado en el Plan Estatal de Investigación Cientifica y Técnica y Innovación 2013-2016 cofinanciado con Fondos FEDER (M.L.M.-C), 아소시아시온 에스파냐콘 콘타 엘 칸세르 (T.C.D, M.L.M.M.C.), 다니엘 알길라 EASL (T.C.D에), Fundación Científica 드 라 아소시아시온 에스파뇨라 콘트라 엘 암 (AECC 과학 재단) 희귀 종양 전화 2017 (M.L.M에), 라 카이사 재단 프로그램 (M.L.M에). CIC bioGUNE(SEV-2016-0644)에 대한 세베로 오초아 우수 인증에 대해 MINECO에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Gnmt−/−)/ (Gnmt+/+) mice | CIC bioGUNE | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| BEBM | Lonza/Clonetics Corporation | cc-3171 | |
| BEGM Bullet Kit | Lonza/Clonetics Corporation | CC3170 | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| C18 microcolumns | Millipore | Z720070 | |
| Collagen type I | Santa Cruz Biotechnology | sc-136157 | |
| Complete tablets EDTA-free | Roche | 4693132001 | |
| DMEM | Life Technologies | A14431-01 | |
| DTT | Sigma | 43815 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EGF | Sigma | e9644 | |
| FBS | Life Technologies | 10270 | |
| Fibronectin | Life Technologies | 33010018 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma | G4510 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| GST-Control | SignalChem | G52-30H | |
| GST-SUBEs | SignalChem | S291-340G | |
| Huh7 | CLS (Cell Lines Service) | 300156 | https://clsgmbh.de/ |
| IAA (2-Iodoacetamide) | Merck | L58046844 | |
| LKB1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32245 | |
| Mini LabRoller Rotator | LABNET | H5500 | https://www.labnetinternational.com |
| NaCl | Merck | 106404041000 | |
| nanoElute | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
| NEM (N-Ethylmaleimide) | Sigma | E3876 | |
| NP40 | Fluka | 74385 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Peaks software | Bioinformatics Solutions Inc. | http://www.bioinfor.com/ | |
| Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
| Ponceau S solution | Sigma | P7170 | |
| PR-619 | Merck | 662141 | |
| Precellys 24 | Bertin Technologies | P000669-PR240-A | |
| PSA | Life Technologies | 151-40-122 | |
| PSG | Life Technologies | 10378-016 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| SUMO2/3 antibody | Abcam | Ab3742 | |
| THLE-2 | ATCC | ATCC CRL-2706 | http://www.lgcstandards-atcc.org |
| timsTOF Pro with PASEF mass spectrometer | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 60-24-2 |
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