Summary
Здесь мы представляем протокол для обогащения, изоляции, идентификации и характеристики белков, модифицированных SUMO in vivo как из клеток гепатомы человека, так и опухолей печени, полученных из моделей мыши гепатоцеллюлярной карциномы с помощью SUMO-связывающих сущностей (SUBEs).
Abstract
Постпереводная модификация является ключевым механизмом, регулирующим гомеостаз белка и функции в эукариотических клетках. Среди всех убиквитиноподобных белков при раке печени, модификация SUMO (Малый Убиквитин MOdifier) было уделено наибольшее внимание. Изоляция эндогенных SUMOylated белков in vivo является сложной задачей из-за наличия активных суМО-специфических протеаз. Первоначальные исследования SUMOylation in vivo были основаны на молекулярном обнаружении специфических sumOylated белков (например, западной пометкой). Однако во многих случаях антитела, обычно изготовленные из неизмененного рекомбинантного белка, не иммунопростимулировали сумойированные формы интересуемого белка. Хроматография никеля была другой подход к изучению SUMOylation путем захвата гистидин-тегами версии молекул SUMO. Этот подход в основном используется в клетках, устойчиво выражающих или преходящих с молекулами Его-СУМО. Для преодоления этих ограничений были разработаны суМО-обязательные образования (СУБЭ) для изоляции эндогенных sumOylate протеинов. В этом документе мы описываем все шаги, необходимые для обогащения, изоляции и идентификации субстратов SUMOylated из клеток гепатомы человека и печеночных тканей из модели мыши рака печени с помощью SUBEs. Во-первых, мы описываем методы, связанные с подготовкой и лизами клеток гепатомы человека и образцов опухолевых тканей печени. Затем подробно разъясняется подготовка SUBEs и контроля подробно вместе с протоколом для белка выдвижной анализы. Наконец, приводятся некоторые примеры, касающиеся вариантов идентификации и характеристики SUMOylated протеоме, а именно использования анализа западной помарки для обнаружения конкретного SUMOylated субстрата из опухолей печени или использования протеомики масс-спектрометрии для высокой пропускной характеристики SUMOylated протеома и interactome в клетках гепатомы.
Introduction
Рак печени является шестым наиболее распространенным раком во всем мире и второй причиной смерти, связанной с раком1. Гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) является наиболее распространенной формой первичного рака печени. Исторически общие факторы риска развития HCC включали хроническую инфекцию гепатита В или С и злоупотребление алкоголем. В последние десятилетия, метаболический синдром, тип 2 диабета безалкогольных жировых заболеваний печени (NAFLD) стала фактором риска для развития HCC2. HCC очень неоднороден, как фенотипически и генетически, в котором сложная сеть сигнальных путей нарушается. В последние годы, несмотря на увеличение наших знаний о молекулярных путей, причастных к патогенеза HCC, Есть еще нет эффективных терапевтических подходов для управления HCC. Многие пути активируются в HCC и ингибирование один обычно диски компенсации другими путями3. Это было одной из основных трудностей при лечении HCC. Таким образом, более глобальный подход может обеспечить потенциальный терапевтический подход к клиническому ведению рака печени, например, таргетинг посттрансляционных модификаций (ПТМ), поскольку несколько сигнальных путей могут одновременно регулироваться ПТМ белков.
Посттрансляционные модификации считаются ключевыми механизмами, регулирующими белок гомеостаза и функционируют4. Структурные и функциональные изменения вносятся ПТМ, тем самым увеличивая разнообразие протеом. Наиболее распространенные ПТМ включают фосфорилирование, метилирование, ацетилирование, гликозилирование, убиквитивирование и спряжение убиквитиноподобных белков (UbLs). Среди всех UbLs, изменение белка SUMO (Малый Ubiquitin MOdifier) привлекла внимание в связи с его решающей ролью в различных клеточных процессах, включая транскрипцию, клеточную локализацию, репарацию ДНК и прогрессирование клеточного цикла 5. Недавно было показано, что SUMOylation изменен при раке печени6,7,8,9, и изменения в SUMOylation специфических белков было описано, чтобы играть роль в прогрессировании онкологических заболеваний9.
У млекопитающих есть пять паралогов СУМО, СУМО-1 до СУМО-5. На сегодняшний день нет экспериментальных данных о существовании эндогенных СУМО-4 и эндогенных реакций спряжения СУМО-5 на уровне белка10,11,12. SUMOylation у млекопитающих осуществляется ферментативным тико-эфирным каскадом с участием трех ферментов, гетеродимерного фермента SUMO (SAE1/SAE2) или E1, съеживающегося фермента SUMO (Ubc9) или E2 и SUMO-E3-ligase, специфичных для каждого целевого белка. Действия нескольких семейств SUMO E3s, как представляется, в динамическом равновесии с SUMO-специфических протеаз (SUSPs или SENPs)13 делает реакцию SUMOylation весьма обратимой. Кроме того, присутствует лишь небольшая часть SUMOylated белка по сравнению с не-SUMOylated общего белка. Таким образом, изоляция эндогенных SUMOylated белков in vivo является довольно сложнойзадачей 13.
SUMOylation in vivo был первоначально изучен западным пятном с использованием антител против белка интереса14. Иммунопрецистации белка было выполнено с конкретными антителами, а затем PAGE-западный пятно было проведено с анти-SUMO антител. Основная проблема этой стратегии заключается в том, что антитела, вырабатываемые против немодифицированного рекомбинантного белка, не всегда способны иммунопрецитифицировать SUMOylated форму белка. Кроме того, хроматография никеля после преходящего выражения гистидина помеченных (His6) версий молекул СУМО и белка, интересующегося, была использована для изучения SUMOylation в клетках. Исходя из этого, будет удобнее обнаруживать сумо-модифицированные формы из клеток, устойчиво выражающих His6-SUMO15. Для исследований in vivo было продемонстрировано обогащение на основе тандем-СУМО(SIM) для очищения полисумов16. Другие группы используют эпитоп-тегами антитела SUMO подходы, обеспечивая возможный инструмент для исследования эндогенной СУМоилации в первичных клетках, тканях и органах17,18. А совсем недавно, Нильсен и его коллеги использовали антитела на основе обогащения для выявления эндогенных и сайта конкретных SUMO в клетках и тканях19.
Для того, чтобы предоставить дополнительную информацию о роли SUMOylation in vivo, суМО-обязательных образований (SUBEs), также известный как SUBO ловушки, были разработаны20. Актуальность, тандем убиквитин связующих субъектов (TUBEs) считаются концептуальными прекурсорами SUBEs и коммерчески доступны инструменты для обнаружения и изоляции полиубиквитивированных белков21. SUBEs являются рекомбинантными белками, которые составляют тандемные повторы SIMs, тем самым признавая молекулы СУМО на модифицированных белках с увеличением общего сродства к субстратам СУМО. SUMO-ловушки были разработаны путем введения E3 убиквитин-протеин лигаза RNF4 полученных SIM2 и SIM3 мотивы в тандеме, в вектор, содержащий глутатион S-трансферазы (GST), гетерологический белок перевозчика20. Хотя СУБНе не могут быть использованы должным образом для идентификации моно-SUMOylated целевых белков, этот метод предоставляет инструмент для облегчения очистки и идентификации поли-SUMO целевых белков in vivo. В этом мы описываем применение СУБЕ для изоляции SUMOylated белков как в клетках гепатомы человека, так и в биопсии печени мыши, важный инструмент для изучения рака печени. Общая схема протокола, описанная в данной рукописи, показана на рисунке 1.
Protocol
Все эксперименты были одобрены институциональными комитетами CIC bioGUNE по уходу за животными и обращению с ним. Были предприняты все усилия для сведения к минимуму страданий животных и сокращения числа животных, используемых. 3-месячный самец глицина N-метилтрансферазы(Gnmt) нехватает(Gnmt-/)и его дикий тип littermates (Gnmt/ )были использованы.
1. Подготовка клеток и лиза
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, Huh-7 (человеческая линия клетки гепатомы) и THLE2 (человеческая печеночная линия клетки) были использованы.
- Поддержание клеток в пластинах P100 в стандартных носителях роста при 37 градусах По Цельсию в увлажненной атмосфере 5%со-95%влажности.
- Выращивайте клетки в p100 пластинах, наклеивающихся при плотности 1,2-1,5 и 106 ячеек на блюдо, считая клетки с помощью камеры подсчета гемоцитометрии Нойбауэра.
- Культура Huh-7 в DMEM дополнена 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 1% пенициллина-стрептомицин-амфотерицин B (PSA) и 1% глутамина.
- Культура THLE2 клеток в культуре блюда предварительно покрытием с 0,01 мг/мЛ фибронектин, 0,01 мг/мл бычьей сыворотки альбумина (BSA) и 0,03 мг/мл коллагена типа I растворяется в среде роста, которая состоит из бронхиальной эпителиальной клеточной среды роста клеток базальной среды (BEGM) дополнено факторы роста (0,4% BPE, 0,1% инсулин, 0,1% гидрокортизон, 0,1% ретиноиновой кислоты, 0,1% трансферрин, 0,1% трийодтиронин, а также 10% FBS, 1% PSA, 5 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF) и 70 нг/мл фофоэтанмин.
- В конце эксперимента, аспирировать средства массовой информации из пластин и мыть клетки с 5 мл стерильных 1x фосфат-буфера солей (PBS). Лисы клетки непосредственно на пластине, размещенной на льду с использованием 500 qL буфера лиза (50 мм Tris pH 8.5, 150 mM NaCl, 5 мМ EDTA, 1% nonidet P-40 (NP40), дополненный полным edTA-free протеазным ингибитором коктейля и 50 ММ PR-619 для каждого p10 dish. Используя клеточный скребок, аккуратно соскребать клетки со дна пластины в среду Lysis.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все клетки отделились от пластины, визуально осматривая пластину базы после лечения. - Кроме того, урожай клетки путем trypsinization путем аспирации клеточного носителя и добавить 1 мл 1x (0.05%) trypsin-EDTA к пластине, достаточно, чтобы покрыть клетки и размещения пластины в инкубатор установлен на 37 градусов по Цельсию, 5% CO2, и 95% влажности в течение 5 мин обеспечения всех клеток отделились от пластины. Добавьте 2 мл предварительно разогретого медиума роста, чтобы остановить трипсинизацию. Центрифуга на 150 г в течение 10 минут и аспирируй супернатант. Вымойте 1x PBS и центрифугу при 150 х г в течение 10 мин. После аспирации супернатанта, добавить 500 л буфера лиза (50 мм Tris pH 8,5, 150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 1% NP40, дополненный полным EDTA-бесплатный коктейль ингибитор протеазы и 50 мкм PR-619 для каждого блюда P100.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление PR-619 имеет решающее значение. - Центрифуга при 15500 х г и 4 градусах в течение 10 мин. Перенесите супернатант в другую трубку и отбросьте гранулы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь, и образцы хранятся при -80 градусов по Цельсию до дальнейшего анализа.
2. Подготовка тканей и лиза
- После жертвоприношения животных, собирать печень мыши, мыть с холодной PBS, и оснастки заморозить сразу же в жидком азоте. Храните образцы 80 градусов по Цельсию до дальнейшего анализа.
- Гомогенизировать 75 мг фрагментов из оснастки замороженных / или свежей печени в 1 мл ледяного лиза буфера (50 мм Tris pH 8,5, 150 мм NaCl, 5 мм EDTA, 1% NP40, дополнены полным EDTA-бесплатный коктейль ингибитор протеазы и 50 ММ PR-619). Выполнить гомогенизатор на 6500 х об /1/ с, 2 х 60 с каждый, с паузой 30 с (см. Таблица материалов).
- Centrifuge образцы в микрофуге на 15, 500 х г и 4 кв 10 мин. Перенесите супернатант в другую трубку и отбросьте гранулы.
- Кроме того, тритуруировать 75 мг замороженных тканей в жидком азоте. Затем восстановить ткани в 1 мл буфера лиза.
- Centrifuge образец в микрофуге на 15, 500 х г и 4 кв 10 мин. Перенесите супернатант в другую трубку и отбросьте гранулы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь, и образцы хранятся при -80 градусов по Цельсию до дальнейшего анализа.
3. Привязка GST-SUBEs или GST Control к бисеру Глутатион-Агароз
ПРИМЕЧАНИЕ: Синтез GST-SUBEs или GST управления выходят за рамки данной рукописи и могут быть рассмотрены в ранее опубликованной литературе20. Кроме того, GST- и Control SUBE доступны на коммерческой основе (например, SignalChem).
- Приготовление пролейкотионных бусин
- Добавьте 1 мл деионированной воды в 70 мг лиофилизированного глутатион-агарозного бисера. Восстановите бусы на ночь при температуре в 4 градуса Цельсия (или не менее 30 мин при комнатной температуре).
- Тщательно вымойте бисер после отеков (для удаления лактозы и этанола, которые обычно присутствуют в лиофилизированном порошке агарозных бусинок). Для этого сначала промойте 10 мл деионированной воды или PBS с последующим центрифугированием при температуре 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Выполните это трижды.
- После 3 стир, resuspend шарики в 1 мл PBS для получения 50% (v/v) шлам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот том подходит для анализа 10 образцов.
- Для каждого образца добавьте 100 мкг GST-SUBEs или GST управления (см. справку20) до 100 л из суспензии из бусины глутатиона и 500 л PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Относительное изобилие SUMOylated белков интереса определяет количество GST-SUBEs, используемых для вытягивания вниз. Для каждой новой экспериментальной модели, анализировать состояние до фактического эксперимента по западной blotting входного, связанного и проточного (FT) материала с использованием анти-SUMO2/3 антител или против белков, представляющих интерес (Liver Kinase B1 (LKB1). - Инкубировать все GST-SUBEs или GST управления с бисером подготовлен в 3.2., медленно вращаясь в ротаторе или мини-ролик (см. Таблица материалов) при 4 c для по крайней мере 2 ч (медленная связывающая реакция).
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление 1 мМ дитиотрейтол (DTT) улучшает привязку GST к бусинкам глутатиона. - Восстановить агарозные бусы центрифугированием при температуре 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. В конце, resuspended шарики в PBS для того чтобы получить 50% (v/v) суспензию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь, и образцы хранятся при -80 градусов по Цельсию до дальнейшего анализа.
4. GST Тянуть вниз Асссе
- После шага 1.5, 2.3 или 2.5, возьмите 1/10 от общего объема (например, 50 л) и разбавьте в том же объеме 3x кипящий буфер (250 мм Tris-HCl pH 6,8, 500 мМ-меркаптоэтанол, 50% глицерол, 10% SDS, бромоф blue). Эта фракция считается INPUT.
- Добавьте 450 л очищенного лисата со ступеней 1,5, 2,3 или 2,5 до 100 л глутатионов. Инкубировать лизат с бисером, медленно вращаясь при 4 градусах по Цельсию, по крайней мере 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, 100-200 мкг общего белка со ступеней 1,5, 2,3 или 2,5 (количественно с анализом Брэдфорда) в общем объеме 450 кл. - Спин вниз шарики в микрофуге на 300 х г в течение 5 минут и собирать супернатант для анализа. Перенесите 1/10 от общего объема (например, 50 л) в отдельную трубку и разбавьте в равном объеме 3x кипящий буфер. Эта фракция является поток через (FT) фракции.
- Вымойте оставшуюся выборку три раза с 1 мл ледяной PBS, 0,05% Tween 20, спина вниз при 4 КС и 300 х г в течение 1 мин. Тщательно аспирации обеспечения не жидкого остается. Бусы соответствуют фракции SUBEs BOUND (SB).
- Выясните образец с 15 злителю 3x кипящего буфера и 15 злиц буфера лисиса. Это называется фракция BOUND.
5. Выявление и характеристика целевых показателей СУМО с помощью анализа Western Blot
- Выполните западный анализ поблужки с помощью анти-SUMO2/3 антитела или любой другой конкретный антитела выбора, как описано ранее22.
6. Идентификация и характеристика SUMOylated Proteome масс-спектрометрией
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае анализа масс-спектрометрии (MS) образцы были обработаны с использованием метода подготовки к образцам фильтра (FASP), описанного Вишневский и др.23.
- Осальт пептиды с помощью стадии наконечникА C18 микроколонн и повторно их в 0,1% для фосовой кислоты (FA) до анализа MS.
- Загрузите образцы на систему LC-MS (см. Таблицу Материалов)и проанализируйте их в тройном (технические репликации)(рисунок 2b).
- Продолжайте идентификацию белка и расчет изобилия с помощью связанного с ним программного обеспечения.
- Для статистического анализа и генерации тепловой карты загрузите данные на платформу Perseus (http://www.perseus.tufts.edu/hopper/). Примените частоту ложных обнаружений на основе перестановок (FDR) для сравнения изобилия. Белки с q q q lt; 0.05 и отношениеsub SUBEs/GST больше чем 2 были рассмотрены как обогащенные24.
ПРИМЕЧАНИЕ: Белки, идентифицированные по крайней мере с двумя различными пептидами, рассматриваются в конечном счете.
Representative Results
Идентификация специфического субстрата SUMOylation в биопсиях опухолей печени западным анализом поблуждения
Печень Kinase B1 (LKB1) SUMOylation недавно было показано, что важный онкогенный драйвер при раке печени9,25. Мыши с дефицитом глицина N-метилтрансферазы(Gnmt), часто называют Gnmt/,является моделью, которая спонтанно развиваетги гепатоцеллюлярной карциномы (HCC), наиболее распространенный тип первичного рака печени. SUBEs были использованы для обогащения и изоляции SUMOylated белков как в Gnmt/) мышей с мышами рака печени и его дикий тип littermates (Gnmt/ ). На рисунке 2a, Понсо S окрашивание трех различных фракций (ввод, FT и BOUND), полученных в SUBEs выдвижной асссс включены. Пятно Понсо S полезно для контроля возможного вредного влияния на нагрузку смытых белков, которые будут оцениваться западными помарки. На рисунке 2b показан западный анализ поблужки LKB1 с помощью СУБЕ для захвата эндогенных SUMOylated LKB1. Уровни СУМоилирования LKB1 увеличиваются при опухолях печени. В случае анализа западной пометной пометки, равные нагрузки и переносимые белки наблюдались при окрашивании входного фракции и не были существенно изменены после стиха (потока через фракцию). Количество белка, захваченного с помощью SUBEs, было значительно выше, особенно в опухолях. Кроме того, окрашивание дубликат геля с Coomassie синий может обеспечить аналогичную информацию. Липкие белки, такие как p53 или SUMOylated формы некоторых белков могут связываться с контролем GST. Чтобы удалить фон, используйте бусы агарозы низкой плотности, выполните покрытие с BSA или включите дополнительные моющие сявки. Тем не менее, это может повлиять на такие приложения, как масс-спектрометрия и может привести к потере низкой сродства взаимодействующих белков.
Характеристика SUMO Interactome в клетках гепатомы человека с помощью анализа масс-спектрометрии
Для исследования способности SUMO-ловушки взаимодействовать с естественными SUMOylated белков, Huh-7 (гепатома человека) и непреобразованной печени эпителиальных линий клеток THLE2. Первым шагом является визуализация общего материала, захваченного с помощью SUBEs, и использование GST в качестве отрицательного контроля. Для этой цели мы можем использовать обычные протоколы окрашивания белка, как показано на рисунке 3a. Затем мы провели анализ масс-спектрометрии. В пробах Huh7 GST было выявлено в среднем 2268 белков (2339, 2297 и 2168 на каждую нагрузку, соответственно), в то время как в образце Huh7 SUBEs было выявлено в среднем 2812 белков (2815, 2817 и 2806). После вычитания в СУБЭ обогащается 742 белка. С другой стороны, в образцах THLE2 GST было выявлено в среднем 2497 белков (2476, 2520 и 2495 соответственно) и 2763 белка в СУБ (2823, 2783 и 2684). Из них 577 были признаны обогащенными в образцах СубЕ. Анализ технических репликаций извлекает тепловую карту, показанную на рисунке 3b, которая была рассчитана с использованием доступных параметров по умолчанию (Евклидово расстояние, средняя связь и предварительно обработанные с k-средств). Тепловая карта изображает распределение 100 наиболее значительных и исключительно обогащенных белков в каждой клеточной линии.
Рисунок 1: Схематическая диаграмма потока протокола, используемая для обогащения, изоляции и идентификации и характеристики SUMOylated протеоме in vivo для изучения рака печени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Модификация LKB1 от SUMO-2 в мышиных моделях гепатоцеллюлярной карциномы.
(a)Понсо S окрашивание трех различных фракций (вход, поток через (FT) и BOUND), полученные в SUBEs выдвижной асссе. b)Западный анализ поблужки LKB1 с помощью связывающих органов SUMO (SUBEs) для захвата эндогенных SUMOylated LKB1; GAPDH используется в качестве контроля нагрузки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Различия между SUMOylated протеоме между опухолевой Huh-7 и непреобразованной печени эпителиальных THLE2 человеческих клеточных линий.
()Sypro окрашивание захваченного белкового материала, с GST (Отрицательный контроль) и SUBEs. (c)Тепловая карта с изображением дифференциально обогащенных белков в образцах Huh-7 и THLE2 SUBE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
В этой области мы представили полное и подробное описание методологии, сообщая об использовании СУБЭ для обогащения, изоляции и идентификации, а также характеристику SUMOylated белков в in vivo моделях рака печени. Как в опухолях печени мыши и клетках гепатомы человека, мы смогли правильно изолировать и определить SUMOylated белки интереса и выполнить высокую пропускную характеристику SUMOylated протеоми и interactome. Несмотря на то, что синтез SUBEs выходит за рамки данной рукописи, для получения дополнительной информации следует изучить следующие ссылки на26. Описанный протокол является быстрым и очень чувствительным, и критический шаг протокола включает в себя использование ингибиторов SENPs (PR-619). В качестве альтернативы могут использоваться химические ингибиторыизопептидазы, такие как NEM (N-Этилмалеймид) и IAA (2-Иодоацетамид) в буфере лиза, однако предыдущие доклады показали, что для протокола SUBEs использование PR-619 выгодно, чем другие ингибиторы мешают гостеву связывания с бусинами глутатиона20.
SUBEs являются рекомбинантными белками, которые составляют тандемные повторы SIMs, тем самым признавая молекулы СУМО на модифицированных белках с увеличением общего сродства к субстратам СУМО. Из-за своей высокой специфичности и чувствительности, использование SUBEs для изоляции SUMOylated протеоме является выгодным по сравнению с другими подходами в литературе, таких как обнаружение западно-блот конкретных SUMOylated белков с использованием антител против белок интереса или хроматографии никеля с использованием различных гистидин-тегами версии молекул SUMO. Однако следует учитывать, что по мере того, как протокол SUBEs выполняется в условиях неденатурирования, поддерживается взаимодействие между SUMOylated протеинами и другими взаимодействующими белками. Таким образом, мы получаем информацию о SUMO interactome, а не только список SUMOylated целевых белков. Таким образом, необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы подтвердить, является ли идентифицированный белок целью СУМО или взаимодействующий фактор. Другим ограничением SUBEs является тот факт, что контроль GST ловушки используются способны захватить много фоновых белков, связанных с окислительным стрессом. Эта проблема особенно актуальна во время анализа MS из-за высокой чувствительности техники. Для преодоления этих ограничений было разработано26биотинилатированных СУМО-ловушек (биоСУБЕ). Еще одно ограничение SUBEs заключается в том, что мы можем улавливать только белки, модифицированные SUMO 2 и SUMO 3, в то время как 1-модифицированные белки SUMO не могут быть изолированы.
Другая озабоченность по поводу использования СУБЭ связана с количеством исходного материала, необходимого для проведения процедуры. Исходный материал, используемый для захвата SUMOylated белков следует рассмотреть различные экспериментальные условия изучены. В то время как базальная SUMOylation была зарегистрирована в различных клеточных контекстах, SUMOylation это процесс, который сильно индуцированных после нескольких стрессовых условиях / стимулов. При сравнении необработанных и обработанных образцов необходимо быть уверенным, что столбец не насыщен, и между этими условиями можно наблюдать различия. В случае с фенотипами мыши мы анализируем, никакие обработки не были использованы и базальные уровни SUMOylation низки. По этой причине было использовано большое количество белков. Фоновый уровень следует контролировать с помощью GST, и если неспецифическая привязка высока, то количество исходного материала или время связывания должно быть уменьшено. Анализ фракции FT может свидетельствовать об эффективности захвата, даже если эти ловушки предпочитают поли-SUMOylated белков и полное истощение не следует ожидать, сокращение общей SUMOylation в целом хорошо наблюдается, когда эффективность захвата Оптимальное.
Наконец, другое применение технологии SUBEs включает в себя сочетание технологии SUBEs с в режиме реального времени Surface Plasmon Resonance (SPR), позволяющей в режиме реального времени взаимодействия с SUMOylated белков из клеточных экстрактов27. Кроме того, в последнее время, биоинтинилапотные SUMO-ловушки (биосубе) были разработаны с преимуществом, чтобы уменьшить фон, связанный с большими тегами, например, во время анализа масс-спектрометрии26. Кроме того, версия bioSUBE может быть использована для обнаружения SUMOylated белков в живых клетках с помощью стрептавидина помечены с различными флуоресцентными красителями, воспользовавшись стрептавидин связывания с биотином. Кроме того, методы обнаружения и количественной оценки SUMOylated белков могут быть рассмотрены как с GST и bioSUBEs версии, такие, как это было сделано с тандемом убиквитин связывающих лиц (TUBEs)21.
В целом, использование SUBEs для изоляции и характеристики SUMOylated протеома, имеющих отношение к раку печени является быстрым и чувствительным методом предоставления обширной информации о еще довольно неизвестной роли пути SUMOylation в раке печени.
Disclosures
Д-р Мартинес-Шантар консультирует для Mitotherapeutix ООО.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами От Национального института рака, ФРАНЦИЯ, INCa грант PLBIO16-251 (PLBIO16-251), CONACyT-SRE (Мексика) грант 0280365 и REPERE программы Occitanie, Франция (M.S.R.). Кроме того, NIH (Министерство здравоохранения и социальных служб США)-R01AR001576-11A1, Гобиерно Васко-Дефенсменто де Салуд 201311114 (м.Л.М.-С), ELKARTEK 2016, Departamento de Industria del Gobierno Vasco, MINECO: SAF2017-87301-R integrado en el Plan Estatal de Investigacion Cientifica y T'cnica y Innovacion 2013-2016 cofinanciado con Fondos FEDER, BIOEF (Баскский фонд инноваций и исследований в области здравоохранения): EITB Maratoia BIO15/CA/014; Институт Салуд Карлос III:PIE14/00031, integrado en el Plan Estatal de Investigacion Cientifica y T'cnica y Innovacion 2013-2016 cofinanciado con Fondos FEDER (до M.L.M.-C), Асоциасиан Эспаньола контра-эль-Кансер (T.C.D., Mgilll.L.M.) EASL (в T.C.D), Фонд Cient'fica де ла Асоциасион Испания Контра эль-Рак (Научный фонд AECC) Редкие опухоли звонки 2017 (к M.L.M), La Caixa Фонд Программы (м. Л.М.). Мы благодарим MINECO за аккредитацию Severo Ochoa Excellence в CIC bioGUNE (SEV-2016-0644).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Gnmt−/−)/ (Gnmt+/+) mice | CIC bioGUNE | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| BEBM | Lonza/Clonetics Corporation | cc-3171 | |
| BEGM Bullet Kit | Lonza/Clonetics Corporation | CC3170 | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| C18 microcolumns | Millipore | Z720070 | |
| Collagen type I | Santa Cruz Biotechnology | sc-136157 | |
| Complete tablets EDTA-free | Roche | 4693132001 | |
| DMEM | Life Technologies | A14431-01 | |
| DTT | Sigma | 43815 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EGF | Sigma | e9644 | |
| FBS | Life Technologies | 10270 | |
| Fibronectin | Life Technologies | 33010018 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma | G4510 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| GST-Control | SignalChem | G52-30H | |
| GST-SUBEs | SignalChem | S291-340G | |
| Huh7 | CLS (Cell Lines Service) | 300156 | https://clsgmbh.de/ |
| IAA (2-Iodoacetamide) | Merck | L58046844 | |
| LKB1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32245 | |
| Mini LabRoller Rotator | LABNET | H5500 | https://www.labnetinternational.com |
| NaCl | Merck | 106404041000 | |
| nanoElute | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
| NEM (N-Ethylmaleimide) | Sigma | E3876 | |
| NP40 | Fluka | 74385 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Peaks software | Bioinformatics Solutions Inc. | http://www.bioinfor.com/ | |
| Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
| Ponceau S solution | Sigma | P7170 | |
| PR-619 | Merck | 662141 | |
| Precellys 24 | Bertin Technologies | P000669-PR240-A | |
| PSA | Life Technologies | 151-40-122 | |
| PSG | Life Technologies | 10378-016 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| SUMO2/3 antibody | Abcam | Ab3742 | |
| THLE-2 | ATCC | ATCC CRL-2706 | http://www.lgcstandards-atcc.org |
| timsTOF Pro with PASEF mass spectrometer | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 60-24-2 |
References
- Forner, A., Llovet, J. M., Bruix, J.
- Gerbes, A., et al. Gut roundtable meeting paper: selected recent advances in hepatocellular carcinoma. Gut. , (2017).
- Avila, M. A., Berasain, C., Sangro, B., Prieto, J. New therapies for hepatocellular carcinoma. Oncogene. 25 (27), 3866-3884 (2006).
- Grotenbreg, G., Ploegh, H.
- Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 17 (9), 581-595 (2016).
- Seeler, J. S., Dejean, A.
- Tomasi, M. L., et al. S-adenosyl methionine regulates ubiquitin-conjugating enzyme 9 protein expression and sumoylation in murine liver and human cancers. Hepatology. 56 (3), 982-993 (2012).
- Li, J., et al. Cbx4 governs HIF-1alpha to potentiate angiogenesis of hepatocellular carcinoma by its SUMO E3 ligase activity. Cancer Cell. 25 (1), 118-131 (2014).
- Zubiete-Franco, I., et al. SUMOylation regulates LKB1 localization and its oncogenic activity in liver cancer. EBioMedicine. 40, 406-421 (2019).
- Sarge, K. D., Park-Sarge, O. K. SUMO and its role in human diseases. Internationa Review of Cell and Molecular Biology. 288, 167-183 (2011).
- Da Silva-Ferrada, E., Lopitz-Otsoa, F., Lang, V., Rodriguez, M. S., Matthiesen, R. Strategies to Identify Recognition Signals and Targets of SUMOylation. Biochemical Research International. , 875148 (2012).
- Liang, Y. C., et al. SUMO5, a Novel Poly-SUMO Isoform, Regulates PML Nuclear Bodies. Science Reports. 6, 26509 (2016).
- Mikolajczyk, J., et al. Small ubiquitin-related modifier (SUMO)-specific proteases: profiling the specificities and activities of human SENPs. Journal of Biologucal Chemistry. 282 (36), 26217-26224 (2007).
- Hilgarth, R. S., Sarge, K. D.
- Vertegaal, A. C., et al. A proteomic study of SUMO-2 target proteins. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33791-33798 (2004).
- Bruderer, R., et al. Purification and identification of endogenous polySUMO conjugates. EMBO Reports. 12 (2), 142-148 (2011).
- Becker, J., et al. Detecting endogenous SUMO targets in mammalian cells and tissues. Nature Structural Molecular Biology. 20 (4), 525-531 (2013).
- Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies. Nature Protocols. 9 (4), 896-909 (2014).
- Hendriks, I. A., et al. Site-specific characterization of endogenous SUMOylation across species and organs. Nature Communications. 9 (1), 2456 (2018).
- Da Silva-Ferrada, E., et al. Analysis of SUMOylated proteins using SUMO-traps. Science Reports. 3, 1690 (2013).
- Hjerpe, R., et al. Efficient protection and isolation of ubiquitylated proteins using tandem ubiquitin-binding entities. EMBO Reports. 10 (11), 1250-1258 (2009).
- Embade, N., et al. Murine double minute 2 regulates Hu antigen R stability in human liver and colon cancer through NEDDylation. Hepatology. 55 (4), 1237-1248 (2012).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Meier, F., et al. Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer. Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
- Ritho, J., Arold, S. T., Yeh, E. T. A Critical SUMO1 Modification of LKB1 Regulates AMPK Activity during Energy Stress. Cell Reports. 12 (5), 734-742 (2015).
- Lang, V., Da Silva-Ferrada, E., Barrio, R., Sutherland, J. D., Rodriguez, M. S. Using Biotinylated SUMO-Traps to Analyze SUMOylated Proteins. Methods in Molecular Biology. 1475, 109-121 (2016).
- Xolalpa, W., Rodriguez, M. S., England, P. Real-Time Surface Plasmon Resonance (SPR) for the Analysis of Interactions Between SUMO Traps and Mono- or PolySUMO Moieties. Methods in Molecular Biology. 1475, 99-107 (2016).
