Summary
Qui, presentiamo un protocollo per arricchire, isolare, identificare e caratterizzare le proteine modificate da SUMO in vivo sia da cellule umano di epatoma e tumori del fegato ottenuti da modelli murini di carcinoma epatocellulare utilizzando entità leganti SUMO (SUBE).
Abstract
La modificazione post-traduzionale è un meccanismo chiave che regola l'omeostasi proteica e la funzione nelle cellule eucariotiche. Tra tutte le proteine di ubiquitina-come nel cancro del fegato, la modifica da SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) è stata data la maggior attenzione. L'isolamento delle proteine endogene SUMOylated in vivo è impegnativo a causa della presenza di proteasi attive specifiche SUMO. I primi studi di SUMOylation in vivo si sono basati sul rilevamento molecolare di specifiche proteine SUMOylated (ad esempio, da macchie occidentali). Tuttavia, in molti casi, gli anticorpi, generalmente realizzati con proteine ricombinanti non modificate, non hanno immunoprecipitato le forme SUMOylated della proteina di interesse. La cromatografia del nichel è stata l'altro approccio per studiare la SUMOylation catturando versioni con tag istinaria delle molecole SUMO. Questo approccio viene utilizzato principalmente nelle cellule che esprimono stabilmente o trascate transitoriamente con molecole His-SUMO. Per superare questi limiti, sono state sviluppate entità di legame SUMO (SUBE) per isolare le proteine endogene SUMOylated. Qui, descriviamo tutti i passaggi necessari per l'arricchimento, l'isolamento e l'identificazione dei substrati SUMOylated dalle cellule dell'epatoma umano e dai tessuti epatici da un modello di topo di cancro al fegato utilizzando SUBE. In primo luogo, descriviamo i metodi coinvolti nella preparazione e nella lisi delle cellule dell'epatoma umano e dei campioni di tessuto tumorale del fegato. Quindi, una spiegazione approfondita della preparazione di SUBE e controlli è dettagliata insieme al protocollo per i saggi di etrazione delle proteine. Infine, vengono forniti alcuni esempi riguardanti le opzioni disponibili per l'identificazione e la caratterizzazione del proteoma SUMOylated, vale a dire l'uso dell'analisi western-blot per il rilevamento di uno specifico substrato SUMOylated dai tumori del fegato o l'uso di proteomica per spettrometria di massa per la caratterizzazione ad alta velocità del proteoma E dell'interstilità SUMOylated nelle cellule dell'epatoma.
Introduction
Il cancro al fegato è il sesto cancro più comune al mondo e la seconda causa di decessi associati al cancro1. Il carcinoma epatocellulare (HCC) è la forma più prevalente di cancro primario al fegato. Storicamente, i fattori di rischio comuni per lo sviluppo di HCC includevano l'infezione cronica da epatite B o C e il consumo abusivo di alcol. Negli ultimi decenni, la sindrome metabolica, Tipo 2 diabete non alcolico malattia del fegato grasso (NAFLD) è emerso come fattori di rischio per lo sviluppo di HCC2. L'HCC è molto eterogeneo, sia fenotipicamente che geneticamente, in cui una complessa rete di vie di segnalazione viene interrotta. Negli ultimi anni, anche se c'è stato un aumento delle nostre conoscenze sulle vie molecolari implicate nella patogenesi dell'HCC, non esistono ancora approcci terapeutici efficaci per la gestione dell'HCC. Molte vie sono attivate in HCC e inibendo si guida generalmente la compensazione da altre vie3. Questa è stata una delle principali difficoltà nel trattamento dell'HCC. Pertanto, un approccio più globale può fornire un potenziale approccio terapeutico per la gestione clinica del cancro del fegato, ad esempio, mirare alle modifiche post-traduzionali (PTM), poiché più vie di segnalazione possono essere regolate contemporaneamente da PTM di proteine.
Le modifiche post-traduzionali sono considerate come meccanismi chiave che regolano l'omeostasi proteica e le funzioni4. I cambiamenti strutturali e funzionali sono introdotti dai PTM, aumentando così la diversità del proteoma. I PTM più comuni includono la fosforolalazione, la metilazione, l'acetilazione, la glicosilazione, l'ubiquitinazione e la coniugazione delle proteine simili all'ubiquitina (UbL). Tra tutti gli UbL, la modifica delle proteine da parte di SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) ha attirato l'attenzione in associazione con il suo ruolo critico in una varietà di processi cellulari, tra cui la trascrizione, la localizzazione cellulare, la riparazione del DNA e la progressione del ciclo cellulare 5.Recentemente, SUMOylation ha dimostrato di essere alterata nel cancro del fegato6,7,8,9, e le variazioni nella SOMMA di proteine specifiche è stato descritto per svolgere un ruolo nella progressione di malattie legate al cancro9.
Nei mammiferi, ci sono cinque paraloghi SUMO, da DA SUMO-1 a SUMO-5. Ad oggi, non sono disponibili prove sperimentali circa l'esistenza di reazioni endogene SUMO-4 e di coniugazione endogena SUMO-5 a livello proteico10,11,12. SUMOylation nei mammiferi è effettuata da una cascata di tiole-estere enzimatica che coinvolge tre enzimi, l'enzima eterodicume SUMO che attiva l'enzima di attivazione (SAE1/SAE2) o E1, l'enzima coniugale SUMO (Ubc9) o E2 e un SUMO-E3-ligase specifico per ogni proteina bersaglio. L'azione di diverse famiglie di SUMO E3 sembra essere in un equilibrio dinamico con protease specifiche SUMO (SUSP o SENP)13 rendendo la reazione SUMOylation altamente reversibile. Inoltre, è presente solo una piccola frazione della proteina SUMOylated rispetto alla proteina totale non SUMOylated. Di qui, isolare le proteine endogene SUMOylated in vivo è piuttosto impegnativo13.
SUMOylation in vivo è stato inizialmente studiato da macchia occidentale utilizzando anticorpi contro la proteina di interesse14. L'immunoprecipitazioni della proteina è stata eseguita con anticorpi specifici e quindi è stata effettuata una macchia PAGE-occidentale con anticorpi anti-SUMO. Il problema principale di questa strategia è che gli anticorpi generati contro una proteina ricombinante non modificata non sono sempre in grado di immunoprecipitare la forma SUMOylated di una proteina. In alternativa, la cromatografia del nichel dopo l'espressione transitoria delle versioni di istidina etichettata (His6) delle molecole SUMO e la proteina di interesse è stata utilizzata per studiare LA SUMOylation nelle cellule. Su questa base, sarà più conveniente rilevare forme modificate SUMO da cellule che esprimono stabilmente His6-SUMO15. Per gli studi in vivo, sono stati dimostrati motivi in tandem-SUMO (SIM) per la purificazione dei coniugi polySUMO16. Altri gruppi hanno utilizzato approcci SUMO anticorpo con etichettatura epitope che forniscono uno strumento fattibile per studiare la SUMOylation endogena in cellule primarie, tessuti e organi17,18. E più recentemente, Nielsen e colleghi hanno usato l'arricchimento basato su anticorpi per identificare SUMO endogeno e site-specific in cellule e tessuti19.
Al fine di fornire informazioni complementari sul ruolo di SUMOylation in vivo, sono state sviluppate20entità vincolanti SUMO (SUBE), note anche come trappole SUMO. Di rilevanza, le entità leganti tandem ubiquitina (TUBE) sono considerate i precursori concettuali delle SUBE e sono strumenti disponibili in commercio per il rilevamento e l'isolamento delle proteine polimbiquitizzate21. Le SUBE sono proteine ricombinanti che comprendono ripetizioni in tandem di SIMi, riconoscendo così le molecole SUMO sulle proteine modificate con un aumento dell'affinità complessiva per i substrati SUMO. Le trappole SUMO sono state progettate introducendo in tandem una proteina portante eterologa di SIM2 derivato da RNF4 e SIM3 in tandem, in un vettore contenente glutathione S-transferase (GST), una proteina portante eterologa20. Sebbene i SUBE non possano essere utilizzati correttamente per identificare le proteine bersaglio mono-SUMOylateted, questo metodo fornisce uno strumento per facilitare la purificazione e l'identificazione delle proteine bersaglio poli-SUMO in vivo. Qui, descriviamo l'applicazione dei SUBE per isolare le proteine SUMOylated sia nelle cellule dell'epatoma umano che nelle biopsie del fegato di topo, uno strumento importante per lo studio del cancro al fegato. Uno schema generale del protocollo descritto in questo manoscritto è mostrato nella Figura 1.
Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dai comitati istituzionali CIC bioGUNE per la cura e la movimentazione degli animali. Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza degli animali e per ridurre il numero di animali utilizzati. Sono stati utilizzati glicine n -metiltransferasi di 3 mesi(Gnmt) carenti (Gnmt) e le sue cucciolate di tipo selvatico (Gnmt).
1. Preparazione delle cellule e lisi
NOTA: Qui, sono stati utilizzati EH-7 (linea cellulare dell'epatoma umano) e THLE2 (linea cellulare epatica umana).
- Mantenere le cellule in placche P100 in supporti di crescita standard a 37 gradi centigradi in un'atmosfera umidizzata del 5% di CO2-95%.
- Coltiva le cellule in placchi P100 placcatura ad una densità di 1,2 –1,5 x 106 celle per piatto contando le cellule utilizzando una camera di conteggio dell'emocitometria di Neubauer.
- Cultura Huh-7 in DMEM integrato con 10% siero bovino fetale (FBS), 1% penicillina-streptomiacina-amphotericina B (PSA) e 1% glutammina.
- Coltura cellule THLE2 in piatti di coltura pre-rivestiti con 0.01 mg/mL fibronectin, 0.01 mg/mL bovine serum albumin (BSA) e 0.03 mg/mL di tipo di collagene Ho sciolto in mezzo di crescita che consiste di crescita delle cellule epiteliali basali medie (BEGM) integrato con fattori di crescita (0,4% BPE, 0,1% di insulina, 0,1% idrocortisone, 0,1% di acido retinoico, 0,1% transferrin, 0,1% triiodothyronine e 10% FBS, 1% PSA, 5 fattori di crescita epidermica ng/mLdermica (EGF) e 70 ng/mL fosfoetanomina.
- Nel punto finale dell'esperimento, aspirare il supporto dalle piastre e lavare le cellule con 5 mL di sterile 1x fosfato-buffered salina (PBS). Le cellule di lyse direttamente sulla piastra postate sul ghiaccio utilizzando 500 - L di tampone di lisi (50 mM PH 8,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% nonidet P-40 (NP40), completate con cocktail completo di inibizione protease senza EDTA e 50 M PR-619 per ogni piatto P100. Utilizzando un raschietto cellulare, raschiare delicatamente le cellule dal fondo della piastra nel mezzo di Lysis.
NOTA: Verificare che tutte le cellule si siano staccate dalla piastra ispezionando visivamente la base della piastra dopo il trattamento. - In alternativa, raccogliere le cellule aspirando i supporti cellulari e aggiungere 1 mL di 1x (0,05%) ortica-EDTA alla piastra, sufficiente a coprire le cellule e mettere la piastra nell'incubatrice impostata a 37 gradi centigradi, 5% CO2e 95% di umidità per 5 min assicurando che tutte le cellule si siano staccate dalla piastra. Aggiungere 2 mL di mezzo di crescita preriscaldato per fermare la ricrescita. Centrifuga a 150 g per 10 min e aspirare il supernatante. Lavare con 1x PBS e centrifugare a 150 x g per 10 min. Dopo aver aspirato il supernatante, aggiungere 500 l of lysis buffer (50 mM Tris pH 8,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40, integrato con cocktail completo di inibitore protease senza EDTA e 50 M PR-619 per ogni piatto P100.
NOTA: l'aggiunta del PR-619 è fondamentale. - Centrifuga a 15.500 x g e 4oC per 10 min. Trasferire il supernatante in un altro tubo e scartare il pellet.
NOTA: Il protocollo può essere sospeso qui, e i campioni memorizzati a -80 gradi centigradi fino a un'ulteriore analisi.
2. Preparazione dei tessuti e lisi
- Al sacrificio animale, raccogliere i fegati di topo, lavare con PBS freddo, e scattare congelare immediatamente in azoto liquido. Conservare i campioni di 80 gradi centigradi fino a un'ulteriore analisi.
- Omogeneizzare 75 mg frammenti da snap-congelato/ o fegato fresco in 1 mL di crema di lisi ghiacciata tampone (50 mM Tris pH 8,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40, integrato con completo EDTA-free protease inibire cocktail e 50M PR-619). Eseguire l'omogeneizzatore a 6500 x rpm, 2 x 60 s ciascuno, con una pausa di 30 s (vedere Tabella dei materiali).
- Centrifugare i campioni in un microfugo a 15, 500 x g e 4 gradi centigradi per 10 min. Trasferire il supernatante in un altro tubo e scartare il pellet.
- In alternativa, triturare 75 mg di tessuti congelati in azoto liquido. Quindi recuperare il tessuto in 1 mL di lisi tampone.
- Centrifugare il campione in un microfugo a 15, 500 x g e 4 gradi centigradi per 10 min. Trasferire il supernatante in un altro tubo e scartare il pellet.
NOTA: Il protocollo può essere sospeso qui, e i campioni memorizzati a -80 gradi centigradi fino a un'ulteriore analisi.
3. Associazione di GST-SUBEs o controllo GST a Perline Glutathione-Agarose
NOTA: la sintesi dei GST-SUBEos o del controllo GST esula dall'ambito di questo manoscritto e può essere rivista nella letteratura pubblicata in precedenza20. In alternativa, le SUBE GST e Control sono disponibili in commercio (ad esempio, SignalChem).
- Preparazione di perline glutathione
- Aggiungere 1 mL di acqua de-ionizzata a 70 mg di perline glutathione-agarose liofilizzate. Ricostituire le perline durante la notte a 4 gradi centigradi (o per almeno 30 min a temperatura ambiente).
- Lavare accuratamente le perline dopo il gonfiore (per rimuovere il lattosio e l'etanolo che di solito sono presenti nelle perle di agarose in polvere lyofilizzata). Per farlo, prima lavare con 10 mL di acqua de-ionizzata o PBS seguita da centrifugazione a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente. Esegui questo tre volte.
- Dopo 3 fumi, risospendere le perline in 1 mL di PBS per ottenere un liquame 50% (v/v).
NOTA: Questo volume è adatto per l'analisi di 10 campioni.
- Per ogni campione, aggiungere 100 g di GST-SUBEs o GST (vedere riferimento20) a 100 gradi di perline glutatione e 500 - L di PBS.
NOTA: l'abbondanza relativa delle proteine SUMOylated di interesse determina la quantità di GST-SUBE utilizzati per i pull-down. Per ogni nuovo modello sperimentale, analizzare la condizione prima dell'esperimento effettivo mediante l'umidità occidentale del materiale di input, rilegamento e flusso (FT) utilizzando anticorpi anti-SUMO2/3 o contro le proteine di interesse (Liver Kinase B1 (LKB1). - Incubare tutte le GST-SUBEs o il controllo GST con perline preparate in 3.2., ruotando lentamente in rotatori o mini rullo (vedi Tabella dei Materiali)a 4 gradi centigradi per almeno 2 h (reazione di rilegatura lenta).
NOTA: l'aggiunta di 1 mM dithiothreitol (DTT) migliora il legame GST alle perline glutathione. - Recuperare le perline di agarose con centrifugazione a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente. Alla fine, risospese le perline in PBS per ottenere il 50% (v/v) liquame.
NOTA: Il protocollo può essere sospeso qui, e i campioni memorizzati a -80 gradi centigradi fino a un'ulteriore analisi.
4. GST Tirare giù assay
- Dopo il passaggio 1.5, 2.3 o 2.5, prendere 1/10 del volume totale (ad es. 50 l) e diluire nello stesso volume di 3x tampone bollente (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 500 mMM-mercaptoethanol, 50% glicerolo, 10% SDS, bromofenoblu). Questa frazione è considerata come INPUT.
- Aggiungete 450 luna di lisa chiarificata dai passi 1,5, 2,3 o 2,5 a i 100 liad glutatoioni. Incubare il lisa con perline, ruotando lentamente a 4 gradi centigradi per almeno 2 h.
NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare 100-200 g di proteine totali dai passi 1,5, 2,3 o 2,5 (quantificati con il saggio Bradford) in un volume totale di 450 gradi centigradi. - Girare verso il basso le perline in un microfugo a 300 x g per 5 min e raccogliere il supernatante per l'analisi. Trasferire 1/10 del volume totale (ad es., 50 ) in un tubo separato e diluire in un volume uguale di 3 volte tampone di ebollizione. Questa frazione è la frazione flow-through (FT).
- Lavare il campione rimanente tre volte con PBS ghiacciato da 1 mL, 0,05% Tween 20, ruotare verso il basso a 4 e 300 x g per 1 min. Aspirare con attenzione senza liquido rimane. Le perline corrispondono alla frazione SUBEs BOUND (SB).
- Eluire il campione con 15 gradi luna di 3x tampone di ebollizione e 15 l of the lysis buffer. Questa è chiamata la frazione BOUND.
5. Identificazione e caratterizzazione degli obiettivi SUMO mediante l'analisi Western Blot
- Eseguire l'analisi western blot utilizzando un anticorpo anti-SUMO2/3 o qualsiasi altro anticorpo specifico di scelta come descritto in precedenza22.
6. Identificazione e caratterizzazione del proteoma SUMOylated dalla spettrometria di massa
NOTA: nel caso dell'analisi della spettrometria di massa (MS), i campioni sono stati elaborati utilizzando il metodo di preparazione dei campioni con assistita da filtri (FASP) descritto da Wisniewski et al.23.
- Disalare i peptidi utilizzando microcolonne C18 a punta di scena e revalutarle nello 0,1% dell'acido formico (FA) prima dell'analisi della SM.
- Caricare i campioni su un sistema LC-MS (vedere Tabella dei materiali) e analizzarli in triplice (repliche tecniche) ( Figura2b).
- Proseguire con l'identificazione delle proteine e il calcolo dell'abbondanza utilizzando un software associato.
- Per l'analisi statistica e la generazione della mappa termica, caricare i dati sulla piattaforma Perseus (http://www.perseus.tufts.edu/hopper/). Applicare un test T corretto per la percentuale di individuazione (FDR) per il confronto delle abbondanze. Le proteine con un rapporto q < 0,05 e un rapporto SUBEs/GST maggiore di 2 sono state considerate arricchitedi 24.
NOTA: Le proteine identificate con almeno due peptidi diversi sono considerate nell'analisi finale.
Representative Results
Identificazione di un substrato specifico SUMOylation nelle biopsie del tumore del fegato mediante l'analisi Western Blot
Fegato Kinase B1 (LKB1) SUMOylation ha recentemente dimostrato di essere un importante driver oncogenico nel cancro del fegato9,25. I topi carenti in glicina N-metiltransferasi (Gnmt), spesso indicati come Gnmt,è un modello che sviluppa spontaneamente il carcinoma epatocellulare (HCC), il tipo più comune di cancro primario al fegato. I SUBE sono stati utilizzati per arricchire e isolare le proteine SUMOylated sia nei topi Gnmt con topi affetti da cancro al fegato che nei suoi compagni di lettiera di tipo selvaggio (Gnmt. Nella figura 2a, Ponceau S colorazione delle tre diverse frazioni (input, FT e BOUND) ottenute nel saggio pull-down SUBEs sono inclusi. Una macchia Ponceau S è utile per controllare un possibile effetto deleterio sul caricamento delle proteine macchiate da valutare da macchie occidentali. Nella figura 2b viene illustrata un'analisi western blot di LKB1 utilizzando SUBEs per acquisire LKB1 endogeno. I livelli di LKB1 SUMOylation sono aumentati nei tumori del fegato. Nel caso dell'analisi delle macchie occidentali, carichi uguali e proteine trasferite sono stati osservati dalla colorazione Ponceau della frazione di ingresso e non sono stati alterati in modo significativo dopo i fusi (flusso attraverso la frazione). La quantità di proteine catturate con SUBE era significativamente più alta, in particolare nei tumori. In alternativa, colorare un gel duplicato con Coomassie blu può fornire informazioni simili. Proteine appiccicose come p53 o SUMOylated forme di alcune proteine potrebbero legarsi al controllo GST. Per rimuovere lo sfondo, utilizzare perline di agarose a bassa densità, eseguire un rivestimento con BSA, o incorporare lavamenti aggiuntivi. Tuttavia, ciò potrebbe influire su applicazioni come la spettrometria di massa e potrebbe causare la perdita di proteine interagenti a bassa affinità.
Caratterizzazione dell'Interactoma SUMO nelle cellule umane dell'epotoma dall'analisi della spettrometria di massa
Per studiare la capacità della trappola SUMO di interagire con proteine NATURALMENTE SUMOylated, sono stati utilizzati Huh-7 (epatoma umano) e linee cellulari epatiti epatiti epatili non trasformati. Il primo passo è la visualizzazione del materiale totale catturato con i SUBE e l'utilizzo dell'IVA come controllo negativo. A questo scopo, possiamo utilizzare i protocolli di colorazione delle proteine convenzionali come mostrato nella Figura 3a. Quindi, abbiamo eseguito l'analisi della spettrometria di massa. Una media di 2268 proteine sono state identificate nei campioni di EPST (2339, 2297 e 2168 per ogni carico, rispettivamente), mentre 2812 proteine sono state identificate in media nel campione di Epe 7 (2815, 2817 e 2806). Dopo la sottrazione, 742 proteine sono state arricchite nelle SUBE. D'altra parte, una media di 2497 proteine sono state identificate nei campioni THLE2 GST (2476, 2520 e 2495, rispettivamente) e 2763 nelle SUBE (2823, 2783 e 2684). Di questi, 577 sono stati considerati arricchiti nei campioni SUBEs. L'analisi delle repliche tecniche recupera la mappa termica illustrata nella figura 3b, calcolata utilizzando le impostazioni predefinite disponibili (distanza euclidea, collegamento medio e pre-elaborato con k-mezzi). La mappa di calore rappresenta la distribuzione delle 100 proteine arricchite in modo più significativo ed esclusivo in ogni linea cellulare.
Figura 1: Diagramma schematico del diagramma di flusso del protocollo utilizzato per l'arricchimento, l'isolamento e l'identificazione e la caratterizzazione del proteoma SUMOylated in vivo per lo studio del cancro al fegato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Modifica di LKB1 da PARTE di SUMO-2 nei modelli murini del carcinoma epatico.
(a) Colorazione Ponceau S delle tre diverse frazioni (input, Flow through (FT) e BOUND) ottenute nel saggio pull-down SUBEs. (b) Analisi western di LKB1 utilizzando entità di legame SUMO (SUBE) per acquisire LKB1 Endogene SUMOylated; GAPDH viene utilizzato come controllo di carico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Differenze tra il proteoma suoillato SUMOylated tra le linee tumorali delle cellule epatiche EH-7 e le linee delle cellule umane THLE2 epatiche non trasformate.
(a) Colorazione Sypro del materiale proteico catturato, con GST (controllo negativo) e SUBE. (c) Mappa di calore raffigurante le proteine differenzialmente arricchite in campioni di Huh-7 e THLE2 SUBE. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Qui, abbiamo fornito una descrizione completa e dettagliata della metodologia che riporta l'uso di SUBE per l'arricchimento, l'isolamento e l'identificazione e la caratterizzazione delle proteine SUMOylated in vivo modelli di cancro al fegato. Sia nei tumori del fegato di topo che nelle cellule umane dell'epatoma, siamo stati in grado di isolare e identificare correttamente le proteine di interesse SUMOylated e di eseguire una caratterizzazione ad alto rendimento del proteoma e dell'intertoma SUMOylated. Anche se la sintesi dei SUBE non rientra nell'ambito di questo manoscritto, per ulteriori informazioni i seguenti riferimenti dovrebbero essere esaminati a26. Il protocollo descritto è veloce e molto sensibile e la fase critica del protocollo include l'uso di inibitori SENP (PR-619). In alternativa, possono essere utilizzati inibitori chimici dell'isopeptidasi come NEM (N-Ethylmaleimide) e IAA (2-Iodoacetamide) nel buffer di lisi, tuttavia, rapporti precedenti hanno dimostrato che per il protocollo SUBEs, l'uso di PR-619 è vantaggioso come l'altro inibitori interferiscono con il legame GST alle perline glutathione20.
Le SUBE sono proteine ricombinanti che comprendono ripetizioni in tandem di SIMi, riconoscendo così le molecole SUMO sulle proteine modificate con un aumento dell'affinità complessiva per i substrati SUMO. A causa della sua elevata specificità e sensibilità, l'uso di SUBE per l'isolamento del proteoma SUMOylated è vantaggioso rispetto ad altri approcci della letteratura, come il rilevamento da parte della macchia occidentale di specifiche proteine SUMOylated che utilizzano anticorpi contro la proteina di interesse o la cromatografia al nichel utilizzando le diverse versioni di immagini di molecole SUMO. Tuttavia, va preso in considerazione che, poiché il protocollo SUBEs viene eseguito in condizioni non di denatura, viene mantenuta l'interazione tra proteine SUMOylated e altre proteine interagenti. Pertanto, otteniamo informazioni sull'interazione SUMO piuttosto che solo un elenco di proteine bersaglio SUMOylated. Pertanto, sono necessari ulteriori esperimenti per confermare se la proteina identificata è un obiettivo SUMO o un fattore interagenti. Un'altra limitazione delle SUBE è il fatto che le trappole gST di controllo utilizzate sono in grado di catturare molte proteine di fondo legate allo stress ossidativo. Questo problema è particolarmente rilevante durante l'analisi MS a causa dell'elevata sensibilità della tecnica. Per superare questi limiti, sono state sviluppate26trappole SUMO biotinylate (bioSUBEs). Un'altra limitazione delle SUBE risiede nel fatto che siamo in grado di catturare solo proteine modificate da SUMO 2 e SUMO 3, mentre le proteine suMO 1-modificate non possono essere isolate.
Altre preoccupazioni dell'uso delle SUBE sono legate alla quantità di materiale di partenza necessaria per la procedura. Il materiale di partenza utilizzato per catturare le proteine SUMOylated dovrebbe considerare le diverse condizioni sperimentali esplorate. Mentre la SUMOylation basale è stata riportata in vari contesti cellulari, SUMOylation è un processo fortemente indotto dopo molteplici condizioni di stress/stimoli. Se si confrontano campioni non trattati con campioni trattati, è necessario essere sicuri che la colonna non sia satura e che si possano osservare differenze tra tali condizioni. Nel caso dei fenotipi murini che stiamo analizzando, non sono stati utilizzati trattamenti e i livelli basali di SUMOylation sono bassi. Per questo motivo, sono state utilizzate elevate quantità di proteine. Il livello di fondo deve essere controllato utilizzando l'IVA e se l'attacco non specifico è elevato, la quantità di materiale di partenza o il tempo di rilegatura devono essere ridotti. L'analisi della frazione FT può essere indicativa dell'efficienza di cattura anche se queste trappole preferiscono proteine poli-SUMOylated e non dovrebbe essere previsto un esaurimento totale, una riduzione della SOMMA totale è in generale ben osservata quando l'efficienza di cattura è Ottimale.
Infine, un'altra applicazione della tecnologia SUBEs include la combinazione della tecnologia SUBEs con Real-time Surface Plasmon Resonance (SPR) che consente le interazioni in tempo reale con le proteine SUMOylated da estratti cellulari27. Inoltre, più recentemente, sono state sviluppate trappole SUMO biotinylate (bioSUBE) con il vantaggio di ridurre lo sfondo associato a tag più grandi, ad esempio, durante l'analisi della spettrometria di massa26. Inoltre, la versione bioSUBE può essere utilizzata per rilevare le proteine SUMOylated nelle cellule viventi per fluorescenza utilizzando coloranti fluorescenti distinti sfruttando il legame della streptavidina alla biotina. Inoltre, i metodi per il rilevamento e la quantificazione delle proteine SUMOylated possono essere considerati sia con le versioni GST che con le versioni bioSUBEs come è stato fatto con le entità di legame dell'ubiquitina tandem (TUBEs)21.
Nel complesso, l'uso di SUBE per l'isolamento e la caratterizzazione del proteoma SUMOylated rilevante nel cancro del fegato è un metodo veloce e sensibile che fornisce vaste informazioni sul ruolo ancora piuttosto sconosciuto del percorso SUMOylation nel cancro del fegato.
Disclosures
Il Dr. Martènez-Chantar consiglia per Mitothetherapeutix LLC.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni dell'Institut National du Cancer, FRANCE, della sovvenzione INCa PLBIO16-251 (PLBIO16-251), della sovvenzione CONACyT-SRE (Messico) 0280365 e del programma REPERE di Occitanie, Francia (M.S.R.). Inoltre, NIH (US Department of Health and Human services)-R01AR001576-11A1, Gobierno Vasco-Departamento de Salud 2013111114 (a M.L.M.-C), ELKARTEK 2016, Departamento de Industria del Gobierno Vasco, MINECO: SAF2017-87301-R integrado en el Plan estatal de Estatal de Investigaciàn Cientifica y Técnica y Innovaciàn 2013-2016 cofinanciado cons FedeR, BIOEF (Basque Foundation for Innovation and Health Research): EITB Maratoia BIO15/CA/014; Instituto de Salud Carlos III:PIE14/00031, integrado en el Plan Estatal de Investigaciàn Cientifica y Técnica y Innovaciàn 2013-2016 cofinanciado con Fondos FEDER (a M.L.M.-C), Asociaciàn Espaàola contra el Càncer (T.C.D., M.L.M-C), Daniel Alagille), premio L'EASL (to T.C.D), Fundaciàn Cientàn Cientàn de la Asociaciàn Espa-ola Contra el Cancer (AECC Scientific Foundation) Rare Tumor Calls 2017 (a M.L.M), Programma della Fondazione La Caixa (a M.L.M). Ringraziamo MINECO per l'accreditamento di eccellenza Severo Ochoa a CIC bioGUNE (SEV-2016-0644).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Gnmt−/−)/ (Gnmt+/+) mice | CIC bioGUNE | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| BEBM | Lonza/Clonetics Corporation | cc-3171 | |
| BEGM Bullet Kit | Lonza/Clonetics Corporation | CC3170 | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| C18 microcolumns | Millipore | Z720070 | |
| Collagen type I | Santa Cruz Biotechnology | sc-136157 | |
| Complete tablets EDTA-free | Roche | 4693132001 | |
| DMEM | Life Technologies | A14431-01 | |
| DTT | Sigma | 43815 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EGF | Sigma | e9644 | |
| FBS | Life Technologies | 10270 | |
| Fibronectin | Life Technologies | 33010018 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma | G4510 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| GST-Control | SignalChem | G52-30H | |
| GST-SUBEs | SignalChem | S291-340G | |
| Huh7 | CLS (Cell Lines Service) | 300156 | https://clsgmbh.de/ |
| IAA (2-Iodoacetamide) | Merck | L58046844 | |
| LKB1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32245 | |
| Mini LabRoller Rotator | LABNET | H5500 | https://www.labnetinternational.com |
| NaCl | Merck | 106404041000 | |
| nanoElute | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
| NEM (N-Ethylmaleimide) | Sigma | E3876 | |
| NP40 | Fluka | 74385 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Peaks software | Bioinformatics Solutions Inc. | http://www.bioinfor.com/ | |
| Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
| Ponceau S solution | Sigma | P7170 | |
| PR-619 | Merck | 662141 | |
| Precellys 24 | Bertin Technologies | P000669-PR240-A | |
| PSA | Life Technologies | 151-40-122 | |
| PSG | Life Technologies | 10378-016 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| SUMO2/3 antibody | Abcam | Ab3742 | |
| THLE-2 | ATCC | ATCC CRL-2706 | http://www.lgcstandards-atcc.org |
| timsTOF Pro with PASEF mass spectrometer | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 60-24-2 |
References
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