Summary
Le modèle animal aigu d'échec de foie développé dans l'étude actuelle présente une alternative faisable pour l'étude des thérapies potentielles. Le modèle actuel utilise l'effet combiné des lésions hépatiques physiques et induites par la drogue et offre une fenêtre de temps appropriée pour étudier le potentiel des nouvelles thérapies.
Abstract
L'insuffisance hépatique aigue (ALF) est une condition clinique provoquée par diverses étiologies ayant pour résultat la perte des fonctions métaboliques, biochimiques, de synthèse, et de détoxification du foie. Dans la plupart des cas irréversibles de dommages de foie, la greffe orthotropique de foie (OLT) demeure le seul traitement disponible. Pour étudier le potentiel thérapeutique d'un traitement pour ALF, ses essais préalables dans un modèle animal d'ALF est essentiel. Dans la présente étude, un modèle ALF chez les rats a été développé en combinant 70% d'hépatectomie partielle (PHx) et des injections d'acétaminophène (APAP) qui fournit une fenêtre thérapeutique de 48 h. Les lobes latéraux médians et gauches du foie ont été enlevés pour exciser 70% de la masse de foie et APAP a été donné 24 h postsurgically pendant 2 jours. La survie chez les animaux induits par l'ALF s'est avérée sévèrement diminuée. Le développement d'ALF a été confirmé par des niveaux altérés de sérum des enzymes alanine amino transferase (ALT), le transferase d'aminé d'aspartate (AST), la phosphatase alcaline (ALP); changements dans le temps de prothrombine (PT); et l'évaluation du ratio international normalisé (INR). L'étude du profil d'expression de gène par qPCR a indiqué une augmentation des niveaux d'expression des gènes impliqués dans l'apoptosis, l'inflammation, et dans la progression des dommages de foie. La dégénérescence diffuse des hépatocytes et l'infiltration des cellules immunitaires ont été observées par évaluation histologique. La réversibilité d'ALF a été confirmée par la restauration des niveaux de survie et de sérum de l'ALT, de l'AST, et de l'ALP après la transplantation intrasplégique des hépatocytes sains syngéniques de rat. Ce modèle présente une alternative fiable aux modèles animaux ALF disponibles pour étudier la physiopathologie de l'ALF ainsi que pour évaluer le potentiel d'une nouvelle thérapie pour ALF. L'utilisation de deux approches différentes permet également d'étudier l'effet combiné des lésions hépatiques physiques et médicamenteuses. La reproductibilité et la faisabilité de la procédure actuelle est un avantage supplémentaire du modèle.
Introduction
L'insuffisance hépatique aigue (ALF) est définie par l'association américaine pour l'étude des maladies de foie comme développement rapide des dommages aigus de foie sans n'importe quel signe antérieur des dommages et est caractérisée par l'affaiblissement grave des fonctions synthétiques, métaboliques, et détoxifiantes du foie1. ALF diffère de l'insuffisance hépatique chronique où l'échec se produit à la suite de lésions hépatiques causées sur une longue période de temps et d'insuffisance hépatique chronique aigue (ACLF), où des lésions hépatiques brusques a lieu à la suite de maladies chroniques du foie2,3,4. Le seul remède disponible pour ALF est la greffe orthotopic de foie (OLT), ou la mort peut se produire. En raison de la pénurie de donneurs de foie, le taux de mortalité chez les patients souffrant d'ALF est très élevé.
Pour étudier le potentiel des approches thérapeutiques alternatives et pour mieux comprendre la physiopathologie de l'ALF, des modèles animaux qui peuvent refléter l'ALF se produisant chez les êtres humains sont nécessaires. Bon nombre des modèles animaux ALF déjà disponibles présentent plusieurs lacunes. Les effets de l'acétaminophène (APAP) sont difficiles à reproduire mais présentent les similitudes les plus étroites en termes de paramètres temporels, cliniques, biochimiques et pathologiques. Les modèles animaux induits par l'APAP rencontrent fréquemment des problèmes dus à la présence de la méthémoglobinémie causée par l'oxydation de l'hémoglobine par l'APAP et ses intermédiaires5,6,7. Un autre problème est le manque de reproductibilité reflété par les réponses imprévisibles de dose et l'heure du décès. Les modèles animaux ALF produits à l'aide de chlorure de tétra de carbone (CCl4) ont une mauvaise reproductibilité8,9,10,11. Concavalin A (Con A) et lipoplysaccharide (LPS)-induit aLF modèles animaux ne reflètent pas le modèle clinique de la maladie humaine, mais ils ont des avantages dans l'étude des mécanismes cellulaires impliqués dans les maladies hépatiques auto-immunes et dans l'étude de la septicémie respectivement12,13,14,15. De même, le thioacetamide (TAA) nécessite également une biotransformation à un métabolite actif de sulfoxide de thioacétamide et montre la variation des espèces16,17,18,19. D-galactosamine (D-Gal) produit des changements biochimiques, métaboliques et physiologiques similaires à ALF, mais n'est pas en mesure de refléter l'ensemble de l'état pathologique ALF20,21,22,23. Il ya eu très peu de tentatives de combiner deux ou plusieurs de ces méthodes pour développer un modèle ALF qui est capable de refléter le syndrome d'ALF d'une meilleure manière13. Par conséquent, d'autres études sont nécessaires pour développer un modèle qui peut refléter les paramètres de la maladie, a une meilleure reproductibilité, et fournit assez de temps pour étudier les effets d'une intervention thérapeutique.
Dans la présente étude, un modèle alternatif d'ALF chez les rats a été créé en combinant les effets de l'hépatectomie partielle (PHx) et des doses plus faibles d'un réactif hépatotoxique. L'APAP a un rôle bien établi dans la cause des lésions hépatiques5,24,25. Il est un analgésique largement utilisé et est toxique pour le foie à des doses suprathérapeutiques en formant des métabolites toxiques. L'APAP est la cause de nombreux décès dans les pays développés. Les dommages physiques provoqués par l'hepatectomy partiel amorce l'activation de divers processus impliqués dans l'inflammation aussi bien que la régénération de foie. L'injection de l'agent hépatotoxique APAP provoque un environnement hostile dans le foie, empêchant la prolifération des hépatocytes. Cela réduit la période de stress sur l'animal, qui, lorsqu'il est combiné avec de plus petites doses d'hépatotoxine, conduit à une meilleure reproductibilité de la procédure. Par conséquent, à l'aide de ce modèle, un effet combinatoire de deux types de lésions hépatiques a été étudié. Pour caractériser le modèle animal Développé d'ALF, des paramètres physiologiques et biochimiques ont été étudiés. La réversibilité réussie d'ALF a été confirmée par la transplantation des hépatocytes sains syngéniques de rat.
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Protocol
La procédure décrite ci-dessous a été approuvée par le Comité d'éthique animale institutionnelle du National Institute of Immunology, New Delhi. Le numéro de référence en série de l'approbation est IAEC-355/14.
1. Préparation
- Préparez-vous pour l'intervention chirurgicale telle que décrite précédemment par Das B et coll.26.
- Utilisez des rats Wistar consanguins de 6 à 8 semaines d'un poids corporel de 200 à 250 g.
- Loger les animaux dans des conditions de soins aux animaux standard et les nourrir avec du rat chow et du libitum avant et après la procédure.
- Lors de l'exécution de 70% PHx, utilisez un mélange de cocktail standard d'hydrochlorure de kétamine (100 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (10 mg/kg de poids corporel), qui est injecté par voie intrapéritone.
REMARQUE : Le type d'anesthésique utilisé peut avoir des effets postopératoires sur la mortalité et la morbidité. - Pendant la greffe cellulaire, utilisez l'anesthésie inhalante Isoflurane (2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-éthane) pour réduire le temps de récupération de l'animal après la chirurgie de transplantation.
- Induire et maintenir l'anesthésie par inhalation à l'aide d'un système d'anesthésie personnalisé. Maintenir le débit d'oxygène à 4 L/min. Pour l'utilisation d'induction isoflurane à 4% et pour l'utilisation d'entretien 2-3% pendant l'intervention chirurgicale.
2. Procédures préopératoires
- Anesthésiez le rat en injectant le mélange kétamine-xylazine décrit à l'étape 3.1 intrapéritone. Confirmer l'anesthésie complète en pinçant l'orteil de l'animal. D'autres procédures ne sont effectuées que lorsqu'il n'y a pas de réflexe de pédale.
- Pour prévenir la dessiccation cornéenne, appliquez une goutte oculaire à base de méthyle-cellulose carboxy sur les deux yeux.
- Retenez l'animal anesthésié à un tableau chirurgical à l'aide de ruban adhésif blanc. Placez l'animal avec le côté abdominal vers le haut, en veillant à ce que la bouche soit sur le côté distal de la personne effectuant l'opération.
- Enlever les cheveux de la zone chirurgicale abdominale supérieure droite à l'aide d'une tondeuse électrique.
- Désinfecter le site chirurgical par trois gommages alternés d'iode de povidone et 70% d'éthanol à l'aide de tampons de coton stérilisés en mouvement circulaire.
3. Hepatectomy partiel (PHx) pour enlever 70% de la masse du foie
REMARQUE : Effectuez l'ensemble de l'intervention chirurgicale sous un environnement stérile dans une hotte à écoulement laminaire. Utilisez uniquement des instruments chirurgicaux stériles pour minimiser le risque d'infection post-chirurgicale. L'ablation de 70 % de la masse hépatique, appelée 70 % d'hépatectomie partielle (70 % de PHx), a été réalisée comme l'ont décrit C. Mitchell et H. Willenbring, 200827.
- Avant le début de la chirurgie, confirmer l'anesthésie complète de l'animal en pinçant son orteil. D'autres procédures ne sont effectuées que lorsqu'il n'y a pas de réflexe de pédale.
- Marquez la peau à couper juste sous le sternum, perpendiculaire à la xiphoïde, et parallèle à la cage thoracique.
- Placer une feuille de drapé stérile ayant une ouverture d'environ 3 cm x 1 cm sur la peau marquée.
- Effectuer une incision transversale d'environ 2 à 3 cm le long de la ligne marquée avec un scalpel. Utilisez la lame chirurgicale no 22. Retirez délicatement l'attachement de la peau à la couche musculaire sous-jacente à proximité de la zone incisée à l'aide de pointes de coton stériles humidifiées.
- Ensuite, faire une incision transversale à travers la couche péritonéale juste sous le processus xiphoïde.
- À l'aide de deux bouts de coton salins humidifiés, exposez le lobe gauche du foie en appliquant une pression douce sur le thorax. Placez une pointe de coton sur la région diaphragmatique de la partie incisée et l'autre pointe de coton en dessous de la région incisée pour soulever le lobe du foie.
- Glissez une boucle de fil de fil de nylon stérile de 8 à 10 cm de long (taille 4-0, 0,15 mm de diamètre) autour du lobe du foie exposé. Prenez la boucle jusqu'à la base du lobe près du hilum à l'aide de forceps microdissés ou de bourgeons de coton humidifiés.
- Avec l'aide du porte-aiguille de microchirurgie et des microforceps, attachez les deux extrémités de la boucle, en plaçant le noeud aussi près que possible de la base du lobe pour resserrer le vaisseau sanguin et réduire les saignements après l'enlèvement du lobe du foie. Attachez deux noeuds supplémentaires de l'autre côté.
- Prenez la précaution de ne pas attacher le noeud trop près des vaisseaux sanguins voisins, ce qui pourrait autrement causer une obstruction veineuse (sténose).
- Utilisez des ciseaux de microchirurgie pour couper le lobe attaché juste au-dessus du noeud, ce qui laisse une masse décolorée de tissu appelé souche ischémique à la place du lobe.
REMARQUE : Le foie de rat, comme ceux des souris, est divisé en quatre lobes distincts : le lobe médian, le lobe latéral droit, le lobe latéral gauche, et le lobe caudate, qui représentent environ 40%, 20%, 30%, et 7% de la masse totale de foie, respectivement. Toute combinaison de ces lobes peut être enlevée pour exciser 70% de masse hépatique. Dans la présente étude, le lobe médian et les lobes latéraux gauches ont été enlevés. - Localisez soigneusement le lobe médian sans endommager la souche restante du lobe latéral gauche. Retirez-le doucement de la cavité abdominale, et à la base du lobe attachez un fil de nylon de 8 à 10 cm de long (taille 4-0) noeud comme mentionné précédemment. Attachez deux noeuds supplémentaires de l'autre côté. Excisez soigneusement et retirez le lobe médian attaché en prenant toutes les précautions mentionnées.
- Après avoir enlevé les lobes, suturer le péritoine à l'aide d'une suture chromice absorbable 4-0 avec des points continus suivis d'une suture cutanée avec une suture interrompue.
- Appliquer de l'iode de povidone sur la peau entourant les sutures pour prévenir l'infection.
- Retirez la feuille de drapé et retirez l'animal du tableau de chirurgie.
4. Soins postopératoires chez les animaux
- Injecter intraperitoneally l'animal avec une dose de 12 mg d'antibiotique cefotaxime dans 1 ml de solution de glucose de 5% avec une seringue de 1 ml pour le protéger contre le risque d'infection postopératoire.
- Administrer une injection sous-cutanée de méloxicam analgésique (1 mg/kg de poids corporel) pour soulager la douleur après la chirurgie et le suivre par deux doses de plus, en gardant le régime comme une dose par jour.
- Loger les animaux exploités dans des conditions standard de cycle lumière/obscurité de 12 h et surveiller à intervalles réguliers.
5. Injection de drogue chez les animaux partiellement hépatectomisés pour induire une insuffisance hépatique
- Après 24 h de postchirurgie, lorsque les animaux ont récupéré avec succès de 70% PHx, mesurer le poids corporel de l'animal suivie par les injections.
- Injecter 750 mg/kg de poids corporel de l'APAP intrapéritonenellement chez les animaux partiellement hépatectomisés 24 h après le PHx de 70% suivant le rétablissement réussi des animaux de l'intervention chirurgicale. Répéter la dose après 24 h.
REMARQUE : Deux doses d'APAP sont administrées par voie intrapéritone à l'animal (c.-à-d. 24 h et 48 h après la procédure de 70 % de PHx, respectivement). - À chaque moment après l'injection de l'APAP, mesurer le poids corporel de l'animal en convalescence.
REMARQUE : L'APAP (biocétamol) est injecté chez les animaux sous forme de solution de 150 mg/mL dans 2 % d'alcool de benzyl.
6. Transplantation d'hépatocytes sains dans les modèles animaux ALF
REMARQUE : Pour étudier la réversibilité de l'ALF chez les rats, transplantez les hépatocytes syngénétiques sains de rat intrasplensiquement dans les animaux ALF-induits avec la1ère dose d'APAP. Dans la présente étude, pour donner suffisamment de temps aux cellules transplantées pour le homing et l'engraftment, la transplantation a été faite juste après avoir donné la1ère dose d'APAP. Les hépatocytes de rat sont isolés par un protocole d'abord édité par Berry and Friends et autres28 et plus tard adapté dans diverses autres études29,30,31avec quelques modifications. Pour la transplantation intrasplénique des cellules dans le modèle animal d'ALF, suivez les étapes mentionnées ci-dessous.
- Placez le rat dans une chambre poly (méthyle méthyllate) pour l'induction de l'anesthésie avec 4% d'isoflurane et 4 L/min flux d'oxygène pour un rat de 250-350 g de poids corporel. Vérifiez la profondeur de l'anesthésie par l'absence de réflexes de pédale lors du pincement de l'orteil de l'animal.
- Placez le rat anesthésié sur le panneau chirurgical de sorte que sa partie latérale gauche est orientée vers le haut. Maintenir l'anesthésie à 2-3% inhalation d'isoflurane par un embout buccal approprié.
- Raser la peau sur la région latérale gauche et la stériliser par solution d'iode de povidone.
- Faire une incision transversale sur la région rasée de la peau.
- Faire une coupe de 1 à 2 cm dans la couche péritonéale pour exposer la rate.
- Sortez délicatement la rate de la cavité péritonéale et soulevez-la à l'aide de deux bouts de coton humidifiés.
- Gardez les cellules (généralement 107 par animal) à transplanter suspendues dans un support IMDM de 50 l dans une seringue à insuline de 1 ml avec une aiguille de 29 G.
- Percer doucement l'aiguille dans le cortex de la rate et libérer la suspension cellulaire dans la rate dans un délai de 2 à 3 minutes.
- Une fois la transplantation cellulaire terminée, retirez soigneusement l'aiguille et tamponnez la zone de la ponction de l'aiguille avec une pointe de coton humidifiée pour éviter les fuites de la suspension cellulaire du site.
- Fermer le péritoine et la peau par une suture absorbable 4-0 avec suturing continu et discontinu respectivement.
- Appliquer la solution d'iode de povidone sur la peau à la place des sutures pour prévenir l'infection sur le site opéré.
- Injectez par voie intrapéritone un volume de 1 ml de 12 mg/mL de solution antibiotique (p. ex., cefotaxime) et injectez sous-cutanée analgesic (par exemple, méloxicam) 1 mg/kg de poids corporel à l'animal dans le cadre de soins postopératoires. Déplacer l'animal dans une cage de récupération chaude.
- Gardez l'animal opéré en isolement dans des conditions normales de 12 h de lumière / cycle sombre jusqu'à ce que les plaies chirurgicales sont complètement guéris. Cela peut prendre de 3 à 4 jours.
7. Caractérisation du développement d'ALF
- Euthanasier les animaux par surdose de la solution de kétamine-xylazine 2 h après la 2nd dose de traitement APAP et de recueillir des échantillons de sang et de tissus.
- Recueillir le sérum du sang pour les études biochimiques32.
- Traiter les échantillons de tissus hépatiques pour les études d'expression histologique et génique33,34,35.
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Representative Results
Pourcentage de survie dans les modèles animaux d'ALF
La dose optimale d'APAP pour causer ALF en combinaison avec 70% PHx a été normalisée comme 750 mg/kg poids corporel. Le régime de traitement a commencé 24 h après 70% PHx, quand les animaux avaient complètement récupéré de la chirurgie, et s'est composé de deux doses d'APAP à des intervalles de 24 h. La mortalité a été observée au taux de 80% après l'administration de la deuxième dose d'APAP, 48 h post-chirurgie. Le pourcentage de survie a été analysé et tracé par la méthode Kaplan-Meier (figure 1). La reproductibilité en temps de décès et de période de temps fournie par ce modèle en fait un candidat approprié pour étudier une intervention thérapeutique contre ALF.
Quatre groupes d'animaux ont été considérés pour l'étude : Groupe 1 (groupe témoin, seul traitement salin), Groupe 2 (seulement APAP à 750 mg/kg de poids corporel), Groupe 3 (traitement salin avec 70 % de PHx) et Groupe 4 (APAP à 750 mg/kg de poids corporel avec 70 % de PHx). Trois animaux ont été inclus dans tous les groupes et deux images représentatives sont incluses dans chaque groupe. Les animaux des quatre groupes ont été euthanasiés 2 h après l'administration de la dose 2nd du traitement respectif. Des échantillons de foie prélevés sur les quatre groupes ont montré une morphologie distincte l'un de l'autre. Le groupe 1 a montré la morphologie rouge-brun d'un foie de rongeur sain. Les échantillons de foie du groupe 2 n'ont montré aucun signe apparent de dommages à un niveau morphologique et ont montré l'aspect semblable aux foies sains du groupe 1. Les échantillons de foie prélevés dans les groupes 3 et 4 ne semblaient pas sains et présentaient une décoloration et un aspect irrégulier. La décoloration correspond aux dommages dans le tissu de foie et était plus évidente dans le groupe 4. Les données représentatives sont présentées à la figure 2.
L'étendue des dommages de foie a été déterminée en vérifiant les niveaux de sérum des enzymes d'ALT, d'AST, etd'ALP 36,37,38. Les niveaux d'ALT, d'AST, et d'ALP ont montré des différences marquées entre les quatre groupes correspondant à l'ampleur des dommages de foie. Le groupe 4 a enregistré une augmentation significative des niveaux AST et ALP par rapport au groupe 1 (figure 3).
Pour comparer le profil d'expression de gène dans le contrôle et les groupes ALF-induits, l'analyse q-PCR des gènes impliqués dans la mort cellulaire (Bax2, Caspase3, Fas) dans des échantillons de tissu de foie a été exécutée35,39. Celles-ci se sont avérées régulées dans le groupe 3 par rapport au groupe de contrôle 1, alors qu'aucune différence n'a été observée dans les groupes 2 et 4. Les gènes qui sont connus pour être surexprimés en réponse à des dommages de foie (Mcp1 et Mmp2)33,40 se sont avérés pour être upregulated dans chacun des trois groupes par rapport au groupe témoin 1. Mmp9 a été reréglementé dans les groupes 3 et 4 tandis que le groupe 2 n'a montré aucune différence marquée par rapport au groupe de contrôle 1. Les niveaux d'expression de Timp1 et Timp234 se sont avérés plus élevés dans le groupe 3, mais n'ont montré aucune surexpression marquée dans le groupe 4 (figure 4).
Les gènes impliqués dans l'inflammation du foie (Tnfa, IL1a, Tgfbr1, et IL1b)41,42,43,44 se sont avérés surexprimés dans le groupe 3 par rapport au groupe témoin 1, mais leur niveau d'expression a diminué dans le groupe 4. L'ALR est surexprimé dans le tissu hépatique après l'induction des dommages de foie. Les cascades en aval de ce gène aident à la régénération du foie. La protéine RIP1 est nécessaire dans la toxicité induite par l'APAP. ALR et RIP1 se sont avérés être reréglementés dans les groupes 2 et 3 par rapport au groupe de contrôle 1, tandis que leurs niveaux demeurent similaires ou inférieurs dans le groupe 4. Alpha smooth muscle actin (aSMA), un marqueur de dépôt excessif d'ECM qui conduit davantage à la fibrose, s'est avéré être upregulated dans le groupe 3 et 4 par rapport au groupe témoin 1 (Figure 4). Les données d'expression de gène suggèrent que les biomarqueurs mentionnés ci-dessus de l'inflammation et de la mort cellulaire qui sont connus pour être surexprimés pendant des dommages de foie soient upregulated dans des échantillons de tissu de foie des animaux dans lesquels ALF a été-induit par la méthode proposée, confirmant de ce fait l'occurrence des dommages de foie au niveau moléculaire.
Coloration de l'hématoxylin et de l'éosine (H et E)
La coloration de l'hématoxylin et de l'éosine (H et E) a été faite pour évaluer la sévérité des dommages de foie en observant l'ampleur de la dégénérescence d'hépatocyte. Les sections de tissu de foie souillées avec H et E ont été soumises à l'analyse aveugle par un tiers. Dans la dégénérescence de la vesicule de groupe partielle de 70% d'hépatectomy a été observée et dans le groupe d'acétaminophène l'inflammation periportal et la nécrose a été vue avec la dilatation sinusoïdale douce. La dégénérescence graisseuse vésiculaire a été observée principalement dans le groupe ALF (figure 5).
Temps de prothrombine et niveaux de glucose sanguin
Prothrombin Time (PT) est un paramètre qui dépend de l'activité de la thromboplastine tissulaire synthétisée par le foie et est utilisé pour caractériser l'efficacité du mécanisme de coagulation du sang45. En général, une augmentation de pt est observée dans les conditions des maladies liées au foie. Le PT s'est avéré sensiblement plus haut dans le groupe ALF-induit par rapport au groupe témoin. Le ratio international normalisé (INR)45 s'est également avéré plus élevé, ce qui représente un défaut dans le mécanisme de la coagulation du sang en raison d'une physiologie hépatique inefficace (figure 6).
Évaluation de la survie après transplantation d'hépatocytes syngénétiques sains de cellules
Un critère important d'un modèle d'ALF est la réversibilité de l'échec de foie en présence d'une intervention thérapeutique. Dans la présente étude, 10 millions d'hépatocytes syngénéiques sains de rat ont été transplantés instrasplenically pour observer l'effet de la thérapie de greffe de cellules sur l'échec de foie. Le nombre approprié de cellules à transplanter a été déterminé en observant la réversibilité de l'insuffisance hépatique après la transplantation de différents nombres cellulaires (données non montrées). Des cellules ont été transplantées après administration de la1ère dose d'APAP, et la survie s'est avérée être rétablie chez les animaux après la transplantation des cellules (figure 7). Les niveaux sériques des enzymes ALT, AST, et ALP se sont avérés normalisés après 10 jours de transplantation cellulaire (figure 8).
Figure 1 : Pourcentage de survie dans le groupe induit par l'ALF. Courbe de survie Kaplan-Meier montrant le pourcentage de survie des animaux après l'induction de l'ALF avec la combinaison de 70% de PHx et de dose d'APAP (750 mg/kg de poids corporel). Le temps 0 h indique le temps de 70% PHx. Les doses de 1er et 2nd de L'APAP ont été administrées 24 et 48 h par chirurgie (n - 12, animaux totaux). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Images représentatives de la morphologie hépatique dans les quatre groupes différents inclus dans l'étude. Les panneaux d'image A-D montrent la morphologie des foies de différents groupes après avoir été euthanasiés 2 h après la 2nd dose du traitement respectif. (A) La morphologie hépatique du groupe témoin 1 dans lequel seule la saline a été donnée. (B) La morphologie hépatique du groupe 2 dans lequel seule l'APAP a été administrée à la dose de 750 mg/kg de poids corporel. (C) La morphologie hépatique du groupe 3 dans lequel la saline a été administrée après 70 % de PHx. (D) La morphologie hépatique dans le groupe 4 dans lequel l'APAP a été administrée après 70 % de PHx à la dose similaire au groupe 3 (n - 3 animaux par groupe). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Comparaison du profil biochimique du sérum dans les différents groupes. Les graphiques à barres représentent la valeur moyenne de l'ALT, de l'AST et de l'ALP dans les échantillons de sérum des quatre groupes inclus dans l'étude. Le sérum a été recueilli 2 h après la dose de 2nd du traitement respectif. Barres d'erreur ' S.E.M; p 'lt; 0.001; p 'lt; 0.05; n 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Profil d'expression génique des échantillons de tissus hépatiques. Les graphiques à barres représentent la quantification relative de l'expression de l'ARNm de divers gènes impliqués dans l'inflammation et la mort cellulaire dans les quatre groupes soumis à des traitements différents. Tous les gènes ont été normalisés contre l'expression du contrôle Gapdh. Barre d'erreur - moyenne d'erreur standard des trois échantillons différents (n ' 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Étude histologique des échantillons de tissus hépatiques. Des images représentatives de l'hématoxylin et de l'éosine des échantillons de tissus hépatiques des quatre groupes inclus dans l'étude, comme on l'a observé sous le grossissement de 200x dans la microscopie de champ lumineux. Il y avait surtout des hépatocytes normaux dans le groupe de contrôle 1 avec l'infiltration periportale douce (flèches vertes). Dans le groupe 3 (70% d'hépatectomy partiel) la dégénérescence graisseuse vésiculaire a été observée (flèches blanches) et dans l'inflammation periportale du groupe 2 d'acétaminophène (flèches rouges) et la nécrose ont été vues avec la dilatation sinusoïdale douce (flèches jaunes). La dégénérescence graisseuse macrovésiculaire a été la plupart du temps observée dans le groupe aLF 4 (flèches orange). Barre d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Comparaison du temps de prothrombine (PT) et du ratio normalisé international (INR). (A) Comparaison du PT entre le groupe témoin 1 (post d'injection saline 70% PHx) et le groupe ALF-induit 4 (APAP injection post 70% PHx). Le sang a été recueilli 2 h après que la dose de 2nd du traitement respectif et le temps (en secondes) requis pour la formation de caillot de fibrine soit montré sur l'axe Y (md p 'lt; 0.0001, n '5). (B) L'INR du groupe 4 induit par l'ALF par rapport au groupe de contrôle 1. La valeur moyenne de l'INR dans le groupe 4 s'est avérée être de 2,28, ce qui se situe dans l'effet anticoagulant induit par la warfarine (n 5). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Pourcentage de survie dans le groupe induit par le FLA après greffe cellulaire. Courbe de survie de Kaplan-Meier montrant le pourcentage de survie après la transplantation saine d'hépatocyte dans le groupe ALF-induit 4 par rapport au groupe témoin 1 (n - 5). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8 : Profil biochimique de sérum des animaux ALF-induits après greffe de cellules. Niveaux de sérum des enzymes ALT, AST, et ALP 10 jours après transplantation cellulaire en comparaison avec les niveaux de sérum des animaux ALF-induits euthanasiés après une dose de 2nd de l'administration d'APAP. Barre d'erreur - erreur standard de moyenne de cinq échantillons différents; p 'lt; 0.0001; p 'gt; 0.01; n 5. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le développement d'un modèle animal approprié pour ALF est primordial pour une meilleure compréhension de la pathogénie et de la progression de l'ALF. Un modèle animal ALF bien caractérisé offre également l'occasion de développer et d'essai de nouvelles approches thérapeutiques contre ALF. De nombreuses tentatives ont été faites pour développer un modèle cliniquement pertinent de ALF6,12,21,23,46,47,48. La plupart de ces études utilisent des procédures chirurgicales ou induisedes des lésions hépatiques par des produits chimiques hépatotoxiques.
Il est difficile de créer un modèle ALF par PHx seul parce que PHx ne refléterait pas la pathologie de l'ALF en raison de l'absence d'inflammation causée par les tissus nécrotiques et apoptotiques. À des doses thérapeutiques, l'APAP est métabolisé complètement par les processus de glucoronidation et de sulphation. À des doses plus élevées, lorsque ces voies sont saturées, l'APAP est métabolisé par des enzymes cytochromes p450 qui sont principalement synthétisées par des hépatocytes, ce qui entraîne la formation d'un intermédiaire toxique, NAPQI (N-acetyl-p-benzoquinone imine). Dans des conditions normales NAPQI est neutralisé par les réserves de glutathion (GSH) des cellules, tandis qu'à des doses suprathérapeutiques, il provoque un stress oxydatif dans les hépatocytes, entraînant la mort hépatocyte4,24,25,46. Par conséquent, en combinant les effets physiologiques de 70% de PHx et de dommages au foie induits par l'APAP, un modèle de rat ALF a été créé dans la présente étude. Une fenêtre thérapeutique plus petite réduit la période de stress sur l'animal. Lorsqu'il est combiné avec de plus petites doses d'APAP, cela conduit à une meilleure reproductibilité de la procédure.
La dose d'APAP a été sélectionnée pour fournir une fenêtre thérapeutique appropriée au cours de laquelle une intervention thérapeutique peut être donnée à l'animal (c.-à-d., dans un délai de 48 h de la1ère dose et 24 h de 2nd dose). Dans les 24 h après la dose de 2nd de l'APAP, 100% de mortalité a été observée. Cependant, l'heure de la mort au cours de cette période était variable pour chaque animal. Ainsi, dans le but d'étudier le développement de l'ALF, les animaux ont été euthanasiés à un moment standard de 2 h après la 2nd dose d'APAP.
Le temps de l'intervention thérapeutique peut être décidé en fonction de l'étude individuelle et du type de thérapie à l'étude, qui dans l'étude actuelle était la transplantation d'hépatocytes syngénéiques de rat juste après la1ère dose d'APAP, permettant aux cellules assez de temps à la maison et à l'engraft. Dans le modèle actuel, la transplantation d'au moins 10 millions de cellules est nécessaire pour un sauvetage réussi de l'ALF.
Pour assurer le succès de l'intervention chirurgicale, quelques points importants doivent être pris en considération. Il est recommandé d'utiliser différents types d'anesthésiques dans différentes interventions chirurgicales. Pour effectuer l'hépatectomy partiel, un cocktail de kétamine-xylazine devrait être employé dans les doses recommandées parce qu'il donne amplement le temps de terminer l'intervention chirurgicale. Pendant la greffe de cellules, l'anesthésie inhalable isoflurane devrait être employée parce qu'elle réduit le stress physique sur des animaux ALF-induits.
En conclusion, en raison d'un taux de mortalité uniforme et d'une fenêtre thérapeutique pratique, un modèle combiné APAP et 70% De PHx a été utilisé pour étudier la réversibilité de l'ALF par transplantation cellulaire. Pour évaluer la réversibilité de L'ALF, 10 millions d'hépatocytes syngénéiques sains de rat ont été transplantés intrasplensiquement dans les animaux ALF-induits. Après la transplantation, le pourcentage de survie s'est avéré être augmenté chez les animaux induits par aLF. L'amélioration des niveaux de sérum de L'ALT, de l'AST, et de l'ALP a été également observée chez les animaux après la greffe de cellules, suggérant la restauration du métabolisme de foie. Ce modèle animal d'ALF présente une alternative pour évaluer le potentiel thérapeutique des cellules reliant l'écart entre l'échec aigu de foie et la transplantation de foie. Il offre également la possibilité d'étudier les dommages au foie causés par des blessures physiques et l'agent hépatotoxique.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention de base reçue du Département de la biotechnologie, gouvernement de l'Inde au National Institute of Immunology, New Delhi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet (Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Cefotaxime (Taxim®) | AlKem; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma; US | 6522 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet®) | Reckitt Benckiser, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD; US | REF 303060 | |
| Isoflurane (Forane®) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax®) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex®) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll® | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin®) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
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