Summary
現在の研究で開発された急性肝不全動物モデルは、潜在的な治療法の研究のための実行可能な代替手段を提示します。現在のモデルは物理的および薬物誘発性肝障害の結合効果を採用し、新しい療法の可能性を研究するために適切な時間枠を提供する。
Abstract
急性肝不全(ALF)は、代謝、生化学的、合成、および肝臓の解毒機能の喪失をもたらす様々な病因によって引き起こされる臨床状態である。ほとんどの不可逆的な肝臓障害の場合, 直交異方性肝移植 (OLT) 唯一の利用可能な治療法.ALFの治療の治療可能性を研究するには、ALFの動物モデルにおけるその以前の試験が不可欠である。現在の研究では、ラットのALFモデルは、70%の部分肝切除術(PHx)と48時間の治療ウィンドウを提供するアセトアミノフェン(APAP)の注射を組み合わせることによって開発されました。肝臓の中央および左横葉を除去して肝臓塊の70%を切除し、APAPは2日間手術後に24時間与えられた。ALF誘発動物の生存率は著しく低下することが分かった。ALFの発症は、酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、アルカリホスファターゼ(ALP)の血清レベルを変化させることによって確認された。プロトロンビン時間(PT)の変化;国際正規化比(INR)の評価。qPCRによる遺伝子発現プロファイルの研究は、アポトーシス、炎症、および肝障害の進行に関与する遺伝子の発現レベルの増加を明らかにした。肝細胞の拡散変性および免疫細胞の浸潤は、組織学的評価によって観察された。ALFの可逆性は、同系健康ラット肝細胞の脾臓内移植後のALT、AST、およびALPの生存および血清レベルの回復によって確認された。このモデルはALFの病態生理学を研究し、ALFのための新しい療法の可能性を評価するために利用できるALF動物モデルに信頼できる代わりを提示する。2つの異なるアプローチの使用はまた、物理的および薬物誘発性肝障害の組み合わせ効果を研究することを可能にする。現在のプロシージャの再現性と実現可能性は、モデルの追加の利点です。
Introduction
急性肝不全(ALF)は、米国肝疾患研究協会によって、損傷の事前徴候なしに急性肝障害の急速な発症として定義され、肝臓1の合成、代謝、および解毒機能の重度の障害によって特徴付される。ALFは、長期間にわたる肝障害の結果として障害が生じる慢性肝不全と、慢性肝疾患2、3、4の結果として突然の肝障害が起こる急性慢性肝不全(ACLF)とは異なる。ALFの唯一の治療法は、オルソトピック肝臓移植(OLT)であり、または死亡が起こる可能性がある。肝臓ドナーの不足のために、ALFに罹患している患者の死亡率は非常に高いです。
代替治療アプローチの可能性を研究し、ALFの病態生理学をよりよく理解するためには、ヒトで起こっているALFを反映できる動物モデルが必要である。すでに利用可能なALF動物モデルの多くには、いくつかの欠点があります。アセトアミノフェン(APAP)効果は再現が困難ですが、時間的、臨床的、生化学的、および病理学的パラメータの点で最も近い類似点を有する。APAP誘導動物モデルは、APAPおよびその中間体5、6、7によるヘモグロビンの酸化によって引き起こされるメトヘモグロビン血症の存在による問題にしばしば遭遇する。もう一つの問題は、予測不可能な用量応答と死亡時によって反映される再現性の欠如である。四塩化炭素(CCl4)を用いて製造されたALF動物モデルは、再現性が悪い8、9、10、11である。コンカバリンA(Con A)およびリポプリ糖(LPS)誘発ALF動物モデルは、自己免疫性肝疾患に関与する細胞機構の研究および敗血症の研究においてそれぞれ12、13、14、15に有利であるが、ヒト疾患の臨床パターンを反映していない。同様に、チオアセトアミド(TAA)はまた、活性代謝産物チオアセトアミドスルホキシドへの生体変換を必要とし、種変動16、17、18、19を示す。D-ガラクトサミン(D-Gal)は、ALFに類似した生化学的、代謝的、および生理学的変化を生じるが、ALF病理学的状態20、21、22、23全体を反映することができない。より良い方法でALF症候群を反映することができるALFモデルを開発するために、これらの方法の2つ以上を組み合わせる試みはほとんどありませんでした13.したがって、疾患パラメータを反映し、より良い再現性を有し、治療介入の効果を研究するのに十分な時間を提供するモデルを開発するためにさらなる研究が必要である。
現在の研究では、ラットの代替ALFモデルは、肝毒性試薬の部分肝切除術(PHx)と低用量の効果を組み合わせることによって作成されています。APAPは、肝臓の損傷を引き起こす上で確立された役割を持っています5,24,25.これは広く使用されている鎮痛薬であり、有毒な代謝産物を形成することによって、上剤用量で肝臓に有毒です.APAPは先進国で多くの死亡の原因です。部分肝切除術によって引き起こされる身体的傷害は、炎症および肝臓再生に関与する様々なプロセスの活性化を開始する。肝毒性剤APAPの注射は、肝臓に敵対的な環境を引き起こし、肝細胞の増殖を防ぐ。これは、ヘパトトキシンのより小さな用量と組み合わせると、手順のより良い再現性につながる動物のストレス期間を減少させます。そこで、このモデルを用いて、2種類の肝損傷の組み合わせ効果が検討されている。開発されたALF動物モデルを特徴付けるために、生理学的および生化学的パラメータが研究されている。ALFの可逆性の成功は、合成健康ラット肝細胞の移植によって確認された。
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Protocol
以下に説明する手順は、ニューデリー国立免疫学会の動物倫理委員会によって承認されています。承認のシリアル参照番号は IAEC#355/14 です。
1. 準備
- Das B et al.26によって前述したように外科的処置の準備をする。
- 体重が200~250gの6~8週齢の近親交配ウィスターラットを使用します。
- 標準的な動物のケア条件の下で動物を収容し、手順の前後にラットチョウと性欲でそれらを養います。
- 70%PHxを行う場合は、腹腔内注射されるケタミン塩酸塩(体重100mg/kg)とキシラジン(体重10mg/kg)の標準的なカクテルミックスを使用してください。
注:使用される麻酔薬の種類は、死亡率および罹患率に術後効果を有し得る。 - 細胞移植の間、吸入麻酔イソフルラン(2-クロロ-2-(ジフルオロメトキシ)-1,1,1,1-トリフルオロエタン)を使用して、移植手術後の動物の回復時間を短縮する。
- カスタマイズされた麻酔システムを使用して吸入麻酔を誘発し、維持する。酸素の流れを4L/分に保つ。誘導使用のために4%でイソフルラン、および手術の間に2-3%の維持使用のために。
2. 術前手順
- ステップ3.1で説明したケタミン-キシラジン混合物を腹腔内に注入してラットを麻酔する。動物のつま先をつまんで完全な麻酔を確認します。さらなる手順は、ペダル反射がない場合にのみ行われます。
- 角膜乾燥を防ぐために、両方の眼にカルボキシメチルセルロースベースの眼滴を塗布する。
- 白いテープを使用して麻酔された動物を外科用板に拘束する。腹部を上に向けて動物を置き、手術を行う人から口が遠位側にあることを確認する。
- 電気バリカンを使用して、右上腹部の手術場から髪を取り除きます。
- ポビドネヨウ素の3つの交互のスクラブと70%エタノールを円形運動で殺菌された綿パッドを使用して手術部位を消毒する。
3. 肝肝切除術(PHx)を肝切除し、肝臓の質量の70%を除去する
メモ:層流フード内の滅菌環境下で外科的処置全体を実行します。手術後の感染リスクを最小限に抑えるために、無菌の手術器具のみを使用してください。肝臓量の70%の除去は、70%部分肝切除術(70%PHx)と名付けられ、C.ミッチェルおよびH.ウィレンブリング、200827によって記載されているように行われた。
- 手術を開始する前に、そのつま先をつまむことによって動物の完全な麻酔を確認します。さらなる手順は、ペダル反射がない場合にのみ行われます。
- 胸骨のすぐ下で切断し、xiphoidに垂直で、胸部に平行に切断する皮膚をマークします。
- マークされた皮膚の上に約3cm x 1cmの開口部を有する滅菌ドレープシートを置きます。
- メスでマークされたラインに沿って約2〜3cmの横方向の切開を行います。外科用ブレード22番を使用してください。無菌の湿った綿の先端を使用して、切開領域付近の下層に皮膚の付着を穏やかに取り除きます。
- 次に、xiphoidプロセスのすぐ下にある腹膜層を通して横切開を行います。
- 2つの生理線湿った綿の先端の助けを借りて、胸部に穏やかな圧力を加えることによって肝臓の左葉を露出させる。切開部の横隔膜領域に綿の先端を1つ置き、もう一方の綿の先端を切開領域の下に置き、肝臓の葉を持ち上げます。
- 露出した肝臓の葉の周りに8〜10cmの長い滅菌ナイロン糸ループ(サイズ4-0、0.15 mmの直径)を滑ります。マイクロディセプ鉗子や湿った綿の芽の助けを借りて、ヒラムに近いローブのベースにループを取ります。
- マイクロサージャリー針ホルダーとマイクロフォースプスの助けを借りて、ループの両端を結び、結び目を可能な限りローブの基部に近づけるので、血管を収縮させ、肝葉を取り除いた後の出血を減らします。反対側に2つの追加の結び目を結びます。
- 近くの血管に近すぎて結び目を結びすぎないように注意してください。
- マイクロサージャリーハサミを使用して結ばれたローブを結んだローブを結び目のすぐ上に切断し、ローブの代わりに虚血性切り株と呼ばれる組織の変色した塊を残します。
注:ラット肝臓は、マウスと同様に、中央葉、右横葉、左横葉、および全肝臓質量の約40%、20%、30%、および7%を表すコーデートローブの4つの異なる葉に分かれています。これらの葉の任意の組み合わせは、70%の肝臓の質量を切除するために除去することができます。現在の研究では、中央値ローブと左横葉が除去された。 - 左横葉の残りの切り株を損傷することなく、慎重に中央値ローブを見つけます。腹腔からそっと引き出し、ローブの基部で8〜10cmの長いナイロン糸(サイズ4-0)の結び目を結びます。反対側に2つの追加の結び目を結びます。慎重に物品を取り除き、記載されているすべての予防措置を取って結ばれた中央値ローブを取り除く。
- ローブを取り除いた後、吸収性の高いクロミック4~0の縫合糸を使用して腹腹を縫合し、続いて皮膚を中断した縫合を行います。
- 感染を防ぐために縫合糸を取り囲む皮膚にポビドンヨウ素を塗布する。
- ドレープシートを取り外し、手術板から動物を取り除きます。
4. 動物の術後ケア
- 腹腔内は、術後感染のリスクからそれを保護するために、1 mLの注射器で5%グルコース溶液の1 mLで12 mgのセフォタキシム抗生物質の用量で動物を注射する。
- 手術後の痛みの軽減のために鎮痛性メロキシカム(体重1mg/kg)の皮下注射を投与し、さらに2回の用量でフォローアップし、レジメンを1日1回の投与量として維持する。
- 12時間の光/暗いサイクルの標準条件の下で操作された動物を収容し、定期的に監視します。
5. 肝不全を誘発する部分的にヘパトクトム化動物における薬物の注射
- 24時間手術後、動物が70%PHxから正常に回復したら、その後注射を行う動物の体重を測定する。
- APAPの体重750mg/kgを、手術から正常に回復した動物の70%PHxの後に24時間、部分的に肝切除動物に腹腔内に注入する。24時間後に再度用量を繰り返す。
注:APAPの2回の用量は、動物に腹腔内に投与される(すなわち、24時間および48時間はそれぞれ70%PHx手順をポストする)。 - APAPの注入後の各時点で、回収動物の体重を測定する。
注:APAP(ビオセタモール)は、2%ベンジルアルコール中の150mg/mL溶液として動物に注入される。
6. ALF動物モデルにおける健康肝細胞の移植
注:ラットにおけるALFの可逆性を研究するために、APAPの1st用量と共にALF誘導動物に正常な同系ラット肝細胞を移植する。現在の研究では、ホーミングおよび生着のために移植された細胞に十分な時間を提供するために、移植はAPAPの1st用量を与えた直後に行われた。ラット肝細胞は、ベリーとフレンズら28によって最初に公開されたプロトコルによって単離され、その後、いくつかの改変を伴う様々な他の研究29、30、31に適応される。ALF動物モデルにおける細胞の脾臓内移植については、以下に示す手順に従う。
- ラットを250~350gのラットに対して4%のイソフルランと4 L/min酸素流量の麻酔誘導用のポリ(メチルメタクリレート)チャンバーに入れます。動物のつま先をつまむとき、ペダル反射の欠如によって麻酔の深さを確認してください。
- 麻酔されたラットを外科用板の上に置き、左側の部分が上を向いている。適切なマウスピースを介して2〜3%のアイソフルラン吸入で麻酔を維持する。
- 左の側面領域の皮膚を剃り、ポビドンヨウ素溶液によって殺菌します。
- 皮膚の剃った領域に横方向の切開を行います。
- 腹膜層で1~2cmのカットを行い、脾臓を露出させる。
- 腹膜腔の脾臓を穏やかに取り出し、2つの湿った綿の先端の助けを借りてそれを持ち上げます。
- 移植される細胞(通常は動物1匹につき107個)を、29G針で1mLインスリン注射器中の50μL IMDM媒体に懸濁して保管する。
- 脾臓皮質に針をそっと突き刺し、細胞懸濁液を2~3分以内に脾臓に放出する。
- 細胞移植が完了したら、針を慎重に取り出し、部位からの細胞懸濁液の漏れを避けるために、湿った綿の先端で針穿刺の領域をダブします。
- 腹腹と皮膚を4~0の吸収性縫合糸で閉じ、連続および不連続な縫合を行います。
- 手術部位の感染を防ぐために縫合糸の場所で皮膚にポビドンヨウ素溶液を塗布する。
- 腹腔内注射は、12mg/mLの抗生物質(例えば、セフォタキシム)溶液を注入し、術後ケアの一環として1mg/kg体重を動物に皮下注射する。暖かい回復ケージに動物を移動します。
- 手術中の創傷が完全に治癒するまで、12時間の光/暗いサイクルの正常な条件下で手術した動物を隔離しておいてください。これには 3 ~ 4 日かかる場合があります。
7. ALF開発の特徴付け
- APAP治療の2回目の用量後にケタミン-キシラジン溶液2時間の過剰摂取によって動物を安楽死させ、血液および組織サンプルを収集する。
- 生化学的研究のために血液から血清を収集する 32.
- 組織学的および遺伝子発現研究のための肝臓組織サンプルを処理する 33,34,35.
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Representative Results
ALFの動物モデルにおける生存率
70%PHxと組み合わせてALFを引き起こすAPAPの最適な用量は、750 mg/kgの体重として標準化された。治療レジメンは、動物が手術から完全に回復した70%PHxの後に24時間開始し、24時間間隔で2つのAPAP用量から構成された。死亡率は、APAPの2回目の投与後80%の割合で観察され、48時間後の手術後に観察された。生存率を分析し、カプランマイヤー法を使用してプロットした(図1)。このモデルによって提供される死亡および期間の再現性は、ALFに対する治療的介入を研究するための適切な候補となる。
研究のために考慮された動物の4つのグループ:グループ1(対照群、生理結度のみ)、グループ2(750 mg/kg体重でのAPAPのみ)、グループ3(70%PHxの生理行治療)およびグループ4(70%PHxの750 mg/kg体重でのAPAP)。3匹の動物が全ての群に含まれ、各群から2つの代表的な画像が含まれる。全4群の動物は、それぞれの治療の2回目の投与後に2時間安楽死させた。全4群から採取した肝臓サンプルは、互いに明確な形態を示した。グループ1は、健康なげっ歯類肝臓の赤褐色の形態を示した。第2族の肝臓サンプルは、形態学的レベルでの損傷の明らかな徴候を示さず、グループ1の健康な肝臓と同様の外観を示した。グループ3および4から採取された肝臓サンプルは健康に見え、変色と斑状の外観を持っていました。変色は肝臓組織の損傷に相当し、第4族でより明らかであった。代表的なデータを図2に示します。
肝障害の程度は、ALT、AST、およびALP酵素36、37、38の血清レベルをチェックすることによって決定された。ALT、AST、およびALPのレベルは、肝臓損傷の程度に対応する4つのグループ間で顕著な違いを示した。グループ4は、グループ1と比較してASTおよびALPレベルが有意に増加したことを示した(図3)。
対照基とALF誘導基における遺伝子発現プロファイルを比較するために、肝組織試料中の細胞死に関与する遺伝子のq-PCR解析(Bax2、Caspase3、Fas)を肝臓組織試料中で35、39を行った。これらは、グループ1と比較してグループ3でアップレギュレーションされていることが判明しましたが、グループ2とグループ4では違いは見られなかった。肝障害に反応して過剰発現することが知られている遺伝子(Mcp1およびMmp2)33、40は対照群1と比較して3群すべてでアップレギュレートされることがわかった。Mmp9はグループ3と4でアップレギュレーションされたが、グループ2はコントロールグループ1との差が顕著に示されなかった。Timp1およびTimp234の発現レベルはグループ3で高いことが判明したが、グループ4では顕著な過剰表現は示されなかった(図4)。
肝臓の炎症に関与する遺伝子(トンファ、IL1a、Tgfbr1、およびIL1b)41、42、43、44は対照群1と比較してグループ3で過剰発現していることが判明したが、その発現量はグループ4で減少した。 ALRは、肝臓損傷の誘導後に肝臓組織で過剰発現される。この遺伝子の下流カスケードは肝臓の再生に役立ちます.RIP1タンパク質は、APAP誘発毒性に必要である。ALRとRIP1は、対照グループ1と比較してグループ2と3でアップレギュレーションされていることが判明しましたが、グループ4ではレベルが同じか低いままです。α平滑筋アクチン(aSMA)は、さらに線維化につながる過剰なECM堆積のマーカーであり、対照群1と比較してグループ3および4においてアップレギュレートされることがわかった(図4)。遺伝子発現データは、肝障害時に過剰発現することが知られている炎症および細胞死の上記のバイオマーカーが、提案された方法によってALFが誘導された動物の肝臓組織サンプルにおいてアップレギュレーションされることを示唆し、したがって分子レベルでの肝障害の発生を確認する。
ヘマトキシリンとエオシン(H&E)染色
ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色は、肝細胞変性の程度を観察することによって肝障害の重症度を評価するために行われた。H&Eで染色された肝臓組織切片を、第三者によるブラインド分析を行った。70%の部分肝脂肪切除群では小胞脂肪変性症が観察され、アセトアミノフェン群の前庭周囲の炎症および壊死は軽度の横方向の拡張と共に見られた。小胞性脂肪変性は、主にALF群で観察された(図5)。
プロトロンビン時間と血糖値
プロトロンビン時間(PT)は、肝臓合成組織トロンボプラスチンの活性に依存するパラメータであり、血液凝固機構45の効率を特徴付けるために使用される。一般に、PTの増加は、肝臓関連疾患の状態で観察される。PTは、対照群と比較してALF誘導群において有意に高いことが判明した。国際正規化比(INR)45も高いことが判明し、非効率的な肝生理学の結果としての血液凝固機構の欠陥を表す(図6)。
細胞健康同系ラット肝細胞移植後の生存評価
ALFモデルの重要な基準は、治療介入の存在下での肝不全の可逆性である。現在の研究では、1,000万人の健康な同系ラット肝細胞を階層的に移植し、肝不全に対する細胞移植療法の効果を観察した。移植される適切な細胞数は、異なる細胞数の移植後の肝不全の可逆性を観察することによって決定した(データは示されていない)。細胞はAPAPの1st用量の投与後に移植され、細胞の移植後に動物で生存が回復することが分かった(図7)。酵素ALT、AST、およびALPの血清レベルは、細胞移植の10日後に正規化されることがわかりました(図8)。
図1:ALF誘発群の生存率70%PHxとAPAP用量(750mg/kg体重)の組み合わせでALFの誘導後の動物の生存率を示すカプランマイヤー生存曲線。時間0hは70%PHxの時間を示す。APAPの1回目および2回目の用量を、外科的に24および48h投与した(n=12、全動物)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:研究に含まれる4つの異なる群における肝形態の代表的な画像。画像パネルA-Dは、それぞれの治療の2回目の用量後に2時間安楽死させた後の異なる基の肝臓の形態を示す。(A) 生理リンのみが与えられた対照群1の肝形態。(B) APAPのみが750mg/kg体重の用量で与えられたグループ2の肝形態。(C)生理日系が70%PHx.(D)に続いて投与された第3族の肝形態(D)APAPがグループ3と同様の用量で70%PHxを投与したグループ4の肝形態(n=3群当たり3匹)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:異なる群における血清の生化学的プロファイルの比較。棒グラフは、研究に含まれる4つの群の血清サンプルにおけるALT、AST、およびALPの平均値を表す。血清は、それぞれの治療の2回目の投与後に2時間採取した。誤差範囲 = S.E.M;= p < 0.001;* = p < 0.05;n = 3。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:肝組織試料の遺伝子発現プロファイル棒グラフは、異なる治療を施した4群における炎症および細胞死に関与する種々の遺伝子のmRNA発現の相対定量を表す。すべての遺伝子は、対照Gapdhの発現に対して正規化された。誤差範囲 = 3 つの異なるサンプルの標準誤差平均 (n = 3)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:肝組織試料の組織学的研究研究に含まれる4群からの肝組織試料の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン染色画像は、明視野顕微鏡で200倍倍倍の倍率で観察された。軽度のペリポータル浸潤(緑色の矢印)を有する対照群1には、主に正常な肝細胞があった。第3群(70%部分肝切除術)では小胞性脂肪変性(白矢印)が認められ、アセトアミノフェン群2では、軽度の静脈軟弦拡張(黄色い矢印)と共に、網膜周囲の炎症(赤い矢印)および壊死が見られた。マクロ球状脂肪変性は、主にALFグループ4(オレンジ色の矢印)で観察された。スケール バー = 50 μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。
図6:プロトロンビン時間(PT)と国際正規化比(INR)の比較(A)対照群1(生理線注射ポスト70%PHx)とALF誘導群4(APAP注射ポスト70%PHx)とのPTの比較。フィブリン血栓形成に必要なそれぞれの治療および時間(秒単位)の2回目の投与後に2時間の血液を採取した血液は、Y軸上に示される(**** = p < 0.0001,n=5)。(B) ALF誘導群4のINRを対照群1と比較した。第4族におけるINRの平均値は2.28であり、ワルファリンによる抗凝固効果(n=5)に該当することが判明した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:細胞移植後のALF誘発群における生存率カプラン・マイヤー生存曲線は、対照群1と比較してALF誘導群4における健健康肝細胞移植後の生存率を示す(n=5)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:細胞移植後のALF誘導動物の血清生化学的プロファイル酵素ALT、AST、およびALPの血清レベルは、APAP投与の2回目の投与後に安楽死させたALF誘導動物の血清レベルと比較して、細胞移植後10日目である。誤差範囲 = 5つの異なるサンプルの平均の標準誤差。= p < 0.0001;** = p > 0.01;n = 5。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ALFのための適切な動物モデルの開発は、病因およびALFの進行のより良い理解のために最も重要である。よく特徴付けられたALF動物モデルはまたALFに対する新しい治療アプローチの開発および試用のための機会を提供する。ALF6,12,21,23,46,47,48の臨床的に関連するモデルを開発する試みが数多く行われています。これらの研究のほとんどは、外科的処置を利用するか、肝毒性化学物質による肝障害を誘発する。
PHxは壊死組織およびアポトーシス組織によって引き起こされる炎症の欠如のためにALFの病理を反映しないので、PHxだけでALFモデルを作成することは困難です。治療用量では、APAPはグルコロニ化および硫酸化のプロセスによって完全に代謝される。より高用量では、これらの経路が飽和すると、APAPは、主に肝細胞によって合成されるシトクロムp450酵素によって代謝され、その結果、有毒中間体、NAPQI(N-アセチル-p-ベンゾキノンイミン)の形成をもたらす。正常な条件下では、NAPQIは細胞のグルタチオン(GSH)埋蔵量によって中和されるが、超療法用量では肝細胞に酸化ストレスを引き起こし、肝細胞死を引き起こす4、24、25、46。したがって、70%PHxとAPAP誘発性肝障害の生理学的効果を組み合わせることにより、ALFラットモデルが現在の研究で作成された。治療ウィンドウが小さいほど、動物のストレス期間が減少します。APAPのより小さい用量と組み合わせると、これは手順のより良い再現性につながります。
APAPの用量は、治療介入を動物に与えることができる適切な治療ウィンドウを提供するために選択された(すなわち、1番目の用量の48時間以内および2番目の用量の24時間以内)。APAPの2回目の投与後24時間以内に、100%の死亡率が観察された。しかし、この期間内の死亡時間は、動物ごとに変動した。したがって、ALFの発症を研究する目的で、動物はAPAPの2回目の用量の後に2時間の標準的な時点で安楽死させた。
治療介入の時間は、個々の研究と研究されている治療の種類に応じて決定することができ、現在の研究では、APAPの1st用量の直後に同系ラット肝細胞の移植であり、細胞が家に帰って生着するのに十分な時間を与える。現在のモデルでは、ALFからの救助を成功させるためには、少なくとも1,000万個の細胞の移植が必要です。
外科的処置の成功を確実にするために、いくつかの重要な点を考慮する必要があります。異なる外科的処置で異なるタイプの麻酔薬を使用することをお勧めします。部分肝切除術を行うには、ケタミン-キシラジンのカクテルは、外科的処置を完了するのに十分な時間を与えるので、推奨用量で使用されるべきである。細胞移植中には、ALF誘発動物の身体的ストレスを軽減するので、吸入可能な麻酔イソフルランを使用する必要があります。
結論として、均一な死亡率と便利な治療ウィンドウのために、APAPおよび70%PHx結合モデルは、細胞移植によるALFの可逆性を研究するために使用された。ALFの可逆性を評価するために、1,000万個の健康な同系ラット肝細胞をALF誘導動物に皮内移植した。移植後、ALF誘発動物において生存率が増加することが分かった。ALT、AST、およびALPの血清レベルの改善は、細胞移植後の動物においても観察され、肝代謝の回復を示唆した。このALF動物モデルは、急性肝不全と肝移植との間のギャップを埋める細胞の治療可能性を評価する代替手段を提示する。また、物理的な傷害や肝毒性薬によって引き起こされる肝臓の損傷を研究する機会を提供します。.
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この研究は、インド政府バイオテクノロジー省からニューデリー国立免疫学研究所に寄せられたコア補助金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet (Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Cefotaxime (Taxim®) | AlKem; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma; US | 6522 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet®) | Reckitt Benckiser, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD; US | REF 303060 | |
| Isoflurane (Forane®) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax®) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex®) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll® | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin®) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
References
- Polson, J., Lee, W. M. AASLD position paper: the management of acute liver failure. Hepatology. 41, 1179-1197 (2005).
- Chung, R. T., et al. Pathogenesis of liver injury in acute liver failure. Gastroenterology. 143, 1-7 (2012).
- Fyfe, B., Zaldana, F., Liu, C. The Pathology of Acute Liver Failure. Clinical Liver Disease. 22, 257-268 (2018).
- Lefkowitch, J. H. The Pathology of Acute Liver Failure. Advances in Anatomic Pathology. 23, 144-158 (2016).
- Mitchell, J. R., et al. Acetaminophen-induced hepatic necrosis. I. Role of drug metabolism. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187, 185-194 (1973).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 81, 145-157 (2000).
- Rahman, T. M., Selden, A. C., Hodgson, H. J. A novel model of acetaminophen-induced acute hepatic failure in rabbits. Journal of Surgical Research. 106, 264-272 (2002).
- Dashti, H., et al. Thioacetamide- and carbon tetrachloride-induced liver cirrhosis. European Surgical Research. 21, 83-91 (1989).
- Demirdag, K., et al. Role of L-carnitine in the prevention of acute liver damage-induced by carbon tetrachloride in rats. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 19, 333-338 (2004).
- Sheweita, S. A., Abd El-Gabar, M., Bastawy, M. Carbon tetrachloride-induced changes in the activity of phase II drug-metabolizing enzyme in the liver of male rats: role of antioxidants. Toxicology. 165, 217-224 (2001).
- Sinicrope, R. A., Gordon, J. A., Little, J. R., Schoolwerth, A. C. Carbon tetrachloride nephrotoxicity: a reassessment of pathophysiology based upon the urinary diagnostic indices. American Journal of Kidney Diseases. 3, 362-365 (1984).
- Takada, Y., Ishiguro, S., Fukunaga, K. Large-animal models of fulminant hepatic failure. Journal of Artificial Organs. 6, 9-13 (2003).
- Takada, Y., et al. Increased intracranial pressure in a porcine model of fulminant hepatic failure using amatoxin and endotoxin. Journal of Hepatology. 34, 825-831 (2001).
- Leist, M., Wendel, A. A novel mechanism of murine hepatocyte death inducible by concanavalin A. Journal of Hepatology. 25, 948-959 (1996).
- Mizuhara, H., et al. Strain difference in the induction of T-cell activation-associated, interferon gamma-dependent hepatic injury in mice. Hepatology. 27, 513-519 (1998).
- Bruck, R., et al. Hypothyroidism minimizes liver damage and improves survival in rats with thioacetamide-induced fulminant hepatic failure. Hepatology. 27, 1013-1020 (1998).
- Chieli, E., Malvaldi, G. Role of the microsomal FAD-containing monooxygenase in the liver toxicity of thioacetamide S-oxide. Toxicology. 31, 41-52 (1984).
- Fontana, L., et al. Serum amino acid changes in rats with thioacetamide-induced liver cirrhosis. Toxicology. 106, 197-206 (1996).
- Peeling, J., et al. Cerebral metabolic and histological effects of thioacetamide-induced liver failure. American Journal of Physiology. 265, 572-578 (1993).
- Blitzer, B. L., et al. A model of fulminant hepatic failure in the rabbit. Gastroenterology. 74, 664-671 (1978).
- Diaz-Buxo, J. A., Blumenthal, S., Hayes, D., Gores, P., Gordon, B. Galactosamine-induced fulminant hepatic necrosis in unanesthetized canines. Hepatology. 25, 950-957 (1997).
- Maezono, K., Mawatari, K., Kajiwara, K., Shinkai, A., Maki, T. Effect of alanine on D-galactosamine-induced acute liver failure in rats. Hepatology. 24, 1211-1216 (1996).
- Patzer, J. F., et al. D-galactosamine based canine acute liver failure model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 1, 354-367 (2002).
- Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: a critical evaluation. Liver Transplantation. 6, 21-31 (2000).
- Yoon, E., Babar, A., Choudhary, M., Kutner, M., Pyrsopoulos, N. Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity: a Comprehensive Update. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 4, 131-142 (2016).
- Das, B., et al. Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3, 1167-1170 (2008).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Fry, J. R., Jones, C. A., Wiebkin, P., Bellemann, P., Bridges, J. W. The enzymic isolation of adult rat hepatocytes in a functional and viable state. Analytical Biochemistry. 71, 341-350 (1976).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell Tissue Bank. 18, 597-604 (2017).
- Ismail, T., et al. Growth of normal human hepatocytes in primary culture: effect of hormones and growth factors on DNA synthesis. Hepatology. 14, 1076-1082 (1991).
- Greenfield, E. A. Sampling and Preparation of Mouse and Rat Serum. Cold Spring Harbor Protocols. 11, (2017).
- Walsh, K. M., Timms, P., Campbell, S., MacSween, R. N., Morris, A. J. Plasma levels of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitors of metalloproteinases -1 and -2 (TIMP-1 and TIMP-2) as noninvasive markers of liver disease in chronic hepatitis C: comparison using ROC analysis. Digestive Diseases and Sciences. 44, 624-630 (1999).
- Thiele, N. D., et al. TIMP-1 is upregulated, but not essential in hepatic fibrogenesis and carcinogenesis in mice. Scientific Reports. 7, 714 (2017).
- Li, C. P., Li, J. H., He, S. Y., Li, P., Zhong, X. L. Roles of Fas/Fasl, Bcl-2/Bax, and Caspase-8 in rat nonalcoholic fatty liver disease pathogenesis. Genetics and Molecular Research. 13, 3991-3999 (2014).
- Kim, W. R., Flamm, S. L., Di Bisceglie, A. M., Bodenheimer, H. C. Serum activity of alanine aminotransferase (ALT) as an indicator of health and disease. Hepatology. 47, 1363-1370 (2008).
- Henry, L. Serum transaminase levels in liver disease. Journal of Clinical Pathology. 12, 131-137 (1959).
- Giannini, E. G., Testa, R., Savarino, V. Liver enzyme alteration: a guide for clinicians. Canadian Medical Association Journal. 172, 367-379 (2005).
- Hammam, O., et al. The role of fas/fas ligand system in the pathogenesis of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Hepatitis Monthly. 12, 6132 (2012).
- Prystupa, A., et al. Activity of MMP-2, MMP-8 and MMP-9 in serum as a marker of progression of alcoholic liver disease in people from Lublin Region, eastern Poland. The Annals of Agricultural and Environmental Medicine. 22, 325-328 (2015).
- Sekiyama, K. D., Yoshiba, M., Thomson, A. W. Circulating proinflammatory cytokines (IL-1 beta, TNF-alpha, and IL-6) and IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) in fulminant hepatic failure and acute hepatitis. Clinical and Experimental Immunology. 98, 71-77 (1994).
- Schwabe, R. F., Brenner, D. A. Mechanisms of Liver Injury. I. TNF-alpha-induced liver injury: role of IKK, JNK, and ROS pathways. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 583-589 (2006).
- Ataseven, H., et al. The levels of ghrelin, leptin, TNF-alpha, and IL-6 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma due to HBV and HDV infection. Mediators of Inflammation. 2006, 78380 (2006).
- Ambrosino, G., et al. Cytokines and liver failure: modification of TNF- and IL-6 in patients with acute on chronic liver decompensation treated with Molecular Adsorbent Recycling System (MARS). Acta Bio Medica Atenei Parmensis. 74, Suppl 2 7-9 (2003).
- Robert, A., Chazouilleres, O. Prothrombin time in liver failure: time, ratio, activity percentage, or international normalized ratio. Hepatology. 24, 1392-1394 (1996).
- Francavilla, A., et al. A dog model for acetaminophen-induced fulminant hepatic failure. Gastroenterology. 96, 470-478 (1989).
- Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36, 770-774 (1991).
- Tunon, M. J., et al. Rabbit hemorrhagic viral disease: characterization of a new animal model of fulminant liver failure. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141, 272-278 (2003).
