Summary
Den akutte leversvikt dyr modell utviklet i dagens studie presenterer et gjennomførbart alternativ for studiet av potensielle terapier. Den nåværende modellen benytter den kombinerte effekten av fysisk og medikament indusert leverskade og gir et passende tidsvindu for å studere potensialet i romanen terapier.
Abstract
Akutt leversvikt (ALF) er en klinisk tilstand forårsaket av ulike årsaker resulterer i tap av metabolske, biokjemiske, syntetisere, og avgifte funksjoner i leveren. I de fleste irreversible leverskader tilfeller, lasteceller leveren transplantasjon (OLT) fortsatt den eneste tilgjengelige behandlingen. For å studere det terapeutiske potensialet av en behandling for ALF, er dens tidligere testing i en dyremodell av ALF viktig. I dagens studie, en ALF modell i rotter ble utviklet ved å kombinere 70% delvis hepatectomy (PHx) og injeksjoner av paracetamol (APAP) som gir en terapeutisk vindu på 48 h. Median og venstre lateral fliker av leveren ble fjernet til avgiftsdirektoratet 70% av leveren masse og APAP ble gitt 24 h postsurgically for 2 dager. Overlevelse i ALF-indusert dyr ble funnet å være sterkt redusert. Utviklingen av ALF ble bekreftet av endrede serum nivåer av enzymer alanin amino glutamyltransferase (ALAT), aspartate amino glutamyltransferase (AST), alkalisk fosfatase (ALP); endringer i internasjonalt normalisert ratio (PT); og vurdering av det internasjonale normalisert ratio (INR). Studier av gen uttrykks profilen ved qPCR avdekket en økning i uttrykket nivåer av gener involvert i apoptose, betennelser, og i progresjon av leverskade. Diffust degenerasjon av hepatocytter og infiltrasjon av immunceller ble observert ved histologiske evaluering. Reversibilitet av ALF ble bekreftet av restaurering av overlevelse og serum nivåer av ALAT, AST, og ALP etter intrasplenic transplantasjon av syngeneic sunn rotte hepatocytter. Denne modellen presenterer et pålitelig alternativ til de tilgjengelige ALF dyre modellene for å studere patofysiologi til ALF samt å evaluere potensialet til en roman terapi for ALF. Bruken av to ulike tilnærminger gjør det også mulig å studere den kombinerte effekten av fysisk og narkotikaindusert leverskade. Den reproduserbarhet og gjennomførbarhet av gjeldende prosedyre er en ekstra fordel av modellen.
Introduction
Akutt leversvikt (ALF) er definert av American Association for studier av leversykdommer som rask utvikling av akutt leverskade uten tidligere tegn på skade og er preget av alvorlig svekkelse av syntetiske, metabolske, og avgifte funksjoner av leveren1. Alf skiller seg fra kronisk leversvikt der feilen oppstår som følge av leverskade forårsaket over lang tid og fra akutt kronisk leversvikt (ACLF), hvor brå leverskader skjer som følge av kroniske leversykdommer2,3,4. Den eneste tilgjengelige kur for ALF er orthotopic leveren transplantasjon (OLT), eller død kan forekomme. På grunn av mangel på lever donorer er dødeligheten av dødelighet hos pasienter som lider av ALF svært høy.
For å studere potensialet til alternative terapeutiske tilnærminger og for å bedre forstå patofysiologi av ALF, er det behov for dyremodeller som reflekterer ALF som forekommer hos mennesker. Mange av de allerede tilgjengelige ALF dyremodeller har flere svakheter. Paracetamol (APAP) effekter er vanskelig å reprodusere, men har de nærmeste likheter i form av timelige, kliniske, biokjemiske og patologiske parametre. Apap-indusert dyremodeller ofte støter på problemer på grunn av tilstedeværelsen av methemoglobinemi forårsaket av oksidasjon av hemoglobin ved Apap og dets mellom produkter5,6,7. Et annet problem er mangelen på reproduserbarhet reflektert av uforutsigbare dose svar og tidspunktet for dødsfallet. Den Alf Animal modeller produsert ved hjelp av Carbon Tetra klorid (CCl4) har dårlig reproduserbarhet8,9,10,11. Concavalin a (con a) og lipoplysaccharide (LPS)-indusert Alf dyremodeller reflekterer ikke det kliniske mønsteret av den menneskelige sykdommen, selv om de har fordeler i studiet av cellulære mekanismer involvert i autoimmune leversykdommer og i studiet av sepsis henholdsvis12,13,14,15. Tilsvarende, tioacetamid (TAA) krever også biotransformasjon til en aktiv metabolitten tioacetamid sulfoxide og viser arter variasjon16,17,18,19. D-galactosamine (d-gal) produserer noen biokjemiske, metabolske og fysiologiske endringer ligner Alf men er ikke i stand til å reflektere hele Alf patologisk tilstand20,21,22,23. Det har vært svært få forsøk på å kombinere to eller flere av disse metodene for å utvikle en ALF-modell som er i stand til å reflektere ALF-syndromet på en bedre måte13. Derfor er det nødvendig med ytterligere studier for å utvikle en modell som kan reflektere sykdoms parametrene, har bedre reproduserbarhet, og gir nok tid til å studere virkningene av en terapeutisk intervensjon.
I den aktuelle studien har en alternativ ALF-modell i rotter blitt skapt ved å kombinere virkningene av partiell hepatectomy (PHx) og lavere doser av en hepatotoxic reagens. Apap har en veletablert rolle i å forårsake leverskade5,24,25. Det er en mye brukt smertestillende og er giftig for leveren ved supratherapeutic doser ved forming giftige metabolitter. APAP er årsaken til mange dødsfall i utviklede land. Fysisk skade forårsaket av delvis hepatectomy initierer aktivering av ulike prosesser involvert i betennelse, samt lever regenerering. Injeksjon av hepatotoxic agent APAP forårsaker et fiendtlig miljø i leveren, hindrer spredning av hepatocytter. Dette reduserer stress perioden på dyret, som kombinert med mindre doser av hepatotoxin, fører til bedre reproduserbarhet av prosedyren. Derfor, ved hjelp av denne modellen, en Kombinatorisk effekt av to typer leverskader har blitt undersøkt. For å karakterisere den utviklede ALF dyre modellen har det blitt studert fysiologiske og biokjemiske parametre. Vellykket Reversibilitet av ALF ble bekreftet ved transplantasjon av syngeneic sunne rotte hepatocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fremgangsmåten som er beskrevet nedenfor er godkjent av institusjonelle Animal etikk komité for National Institute of immunologi, New Delhi. Det serielle referansenummeret til godkjenningen er IAEC # 355/14.
1. forberedelse
- Forbered deg på den kirurgiske prosedyren som beskrevet tidligere av Das B et al.26.
- Bruk 6 – 8 uker gamle innavlet Wistar rotter med en kroppsvekt på 200 – 250 g.
- Huset dyrene under målestokk dyr bekymre vilkårene og mate seg med rotten Chow og lib tidligere og etter fremgangsmåten.
- Når du utfører 70% PHx, bruk en standard cocktail blanding av ketamin hydrochloride (100 mg/kg kroppsvekt) og xylazine (10 mg/kg kroppsvekt), som injiseres intraperitonealt.
Merk: den typen bedøvelse som brukes kan ha postoperativ virkning på dødelighet og sykelighet. - Under celle transplantasjon, bruk inhalant anestesi isoflurane (2-klor-2-(difluoromethoxy)-1, 1, 1-trifluoro-etan) for å redusere tiden for utvinning av dyret etter transplantasjon kirurgi.
- Indusere og vedlikeholde inhalativ anestesi ved hjelp av en tilpasset anestesi system. Oppretthold oksygenstrømmen ved 4 L/min. For induksjon bruk isoflurane på 4% og for vedlikehold bruk 2-3% under den kirurgiske prosedyren.
2. preoperativ prosedyrer
- Bedøve rotta ved å injisere den ketamin-xylazine blandingen beskrevet i trinn 3,1 intraperitonealt. Bekreft den komplette bedøvelsen ved å klemme på dyrets tå. Videre prosedyrer utføres bare når det ikke er pedal refleks.
- For å hindre hornhinnen uttørking, Påfør en carboxy metyl-cellulose basert øye dråpe til begge øyne.
- Holde anesthetized dyret til et kirurgisk bord ved hjelp av hvit tape. Plasser dyret med mage siden vendt opp, slik at munnen er på den andre siden av personen som utfører operasjonen.
- Fjern hår fra øvre høyre abdominal kirurgisk område ved hjelp av en elektrisk Clipper.
- Desinfisere operasjonsstedet med tre vekslende Scrubs av povidon jod og 70% etanol ved hjelp av sterilisert bomull pads i sirkulær bevegelse.
3. delvis hepatectomy (PHx) for å fjerne 70% av massen av leveren
Merk: Utfør hele den kirurgiske prosedyren under et sterilt miljø i en laminær strømnings hette. Bruk bare sterile Kirurgiske instrumenter for å minimere risikoen for infeksjon postsurgically. Fjerning av 70% av leveren massen, oppkalt 70% delvis hepatectomy (70% PHx), ble utført som beskrevet av C. Mitchell og H. Willenbring, 200827.
- Før starten av operasjonen, bekrefter den komplette bedøvelsen av dyret ved å knipe sin tå. Videre prosedyrer utføres bare når det ikke er pedal refleks.
- Merk huden som skal kuttes like under brystbenet, vinkelrett på xiphoid, og parallelt med brystkasse.
- Legg et sterilt plate ark som har en åpning på rundt 3 cm x 1 cm over den markerte huden.
- Utfør en tverrgående snitt på rundt 2-3 cm langs den markerte linjen med en skalpell. Bruk kirurgisk blad nr 22. Fjern forsiktig feste av huden til den underliggende muskelen laget i nærheten av radert området ved hjelp av sterile fuktet bomull tips.
- Deretter lage en tverrgående snitt gjennom bukhulen like under xiphoid prosessen.
- Med hjelp av to saltvann fuktet bomull tips, utsett venstre flik av leveren ved å bruke forsiktig press på thorax. Plasser en bomulls spiss på den diafragma regionen i den radert delen og den andre bomulls spissen under radert regionen for å løfte lever fliken opp.
- Slip en 8-10 cm lang steril nylon tråd sløyfe (størrelse 4 – 0, 0,15 mm diameter) rundt eksponert lever flik. Ta sløyfen til bunnen av fliken nær hilum ved hjelp av microdissecting tang eller fuktet bomulls knopper.
- Med hjelp av mikrokirurgi nål holderen og microforceps, knyt de to endene av loopen, plassere knuten så nær bunnen av fliken som mulig for å constrict blodkar og redusere blødning etter at leveren flik er fjernet. Bind to ekstra knop på den andre siden.
- Ta forholdsregler for ikke å knytte knuten for nær de nærliggende blodkarene, som ellers kan forårsake venøs obstruksjon (stenose).
- Bruk mikrokirurgi saks for å kutte bundet flik like over knuten, som etterlater en misfarget masse av vev kalt en iskemiske stump i stedet for flik.
Merk: rotte leveren, som de av mus, er delt inn i fire distinkte fliker: median flik, høyre lateral flik, venstre lateral flik, og nucleus caudatus flik, som representerer ca 40%, 20%, 30%, og 7% av den totale lever massen, henholdsvis. Enhver kombinasjon av disse fliker kan fjernes til avgiftsdirektoratet 70% lever masse. I den nåværende studien ble median flik og venstre lateral fliker fjernet. - Nøye finne median flik uten å skade de resterende stump av venstre lateral flik. Trekk den forsiktig ut av bukhulen, og ved foten av fliken slips en 8-10 cm lang nylon tråd (størrelse 4 – 0) knute som nevnt tidligere. Bind to ekstra knop på den andre siden. Forsiktig avgiftsdirektoratet og fjerne bundet median flik tar alle forholdsregler nevnt.
- Etter fjerning av fliker, Sutur peritoneum ved hjelp av en absorberbare chromic 4-0 Sutur med kontinuerlige sting etterfulgt av huden suturing med en avbrutt Sutur.
- Påfør povidon jod på huden rundt sting for å hindre smitte.
- Fjern papiret og fjern dyret fra operasjonsbordet.
4. postoperativ behandling hos dyr
- Intraperitonealt injisere dyret med en dose på 12 mg cefotaksim antibiotika i 1 mL 5% glukoseoppløsning med en 1 mL sprøyte for å beskytte den mot risikoen for postoperativ infeksjon.
- Administrere en subkutan injeksjon av smertestillende meloksikam (1 mg/kg kroppsvekt) for smertelindring etter kirurgi og følge den opp av to flere doser, holde diett som en dose per dag.
- Huset de opererte dyrene under standard forhold på 12 h lys/mørk syklus og overvåke med jevne mellomrom.
5. injeksjon av narkotika i delvis hepatectomized dyr å indusere leversvikt
- Etter 24 h postsurgery, når dyrene har med hell utvinnes fra 70% PHx, måle kroppsvekten av dyret etterfulgt av injeksjoner.
- Injiser 750 mg/kg kroppsvekt av APAP intraperitonealt i delvis hepatectomized dyr 24 timer etter 70% PHx etter dyrenes vellykkede utvinning fra kirurgisk prosedyre. Gjenta dosen igjen etter 24 timer.
Merk: to doser av APAP administreres intraperitonealt til dyret (dvs. 24 timer og 48 h post den 70% PHx prosedyre, henholdsvis). - På hvert tidspunkt etter injeksjonen av APAP, måle kroppsvekten av utvinne dyret.
Merk: APAP (biocetamol) injiseres i dyr som en 150 mg/mL oppløsning i 2% benzylalkohol alkohol.
6. transplantasjon av sunne hepatocytter i ALF dyremodeller
NOTE å studere Reversibilitet av ALF inne rotter, transplantasjon rask syngeneic rotten hepatocytter intrasplenically inne det ALF-indusert dyrene jevnsides med det 1St dose av Apap. I dagens studie, for å gi god tid til de transplanterte cellene for homing og engraftment, ble transplantasjon gjort like etter å gi den 1St dose av Apap. Rat hepatocytter er isolert av en protokoll først utgitt av Berry og venner et al.28 og senere tilpasset i flere andre studier29,30,31 med noen modifikasjoner. For intrasplenic transplantasjon av celler i ALF dyremodell, følg trinnene som er nevnt nedenfor.
- Plasser rotta i en Poly (metyl akrylat) kammer for induksjon av anestesi med 4% isoflurane og 4 L/min oksygen flyt for en rotte på 250 – 350 g kroppsvekt. Sjekk for dybden av anestesi ved mangelen på pedal reflekser når klype tåen på dyret.
- Plasser anesteserte rotte på kirurgisk bord slik at den venstre laterale delen vender opp. Oppretthold anestesi ved 2 – 3% isoflurane inhalasjon gjennom et egnet munnstykke.
- Barbere huden på venstre lateral region og sterilisere den ved povidon jod løsning.
- Lag en tverrgående snitt på den barberte regionen i huden.
- Lag en 1-2 cm skåret i bukhulen for å avdekke milten.
- Forsiktig ta ut milten av bukhulen og løft den opp ved hjelp av to fuktet bomull tips.
- Hold cellene (vanligvis 107 per dyr) for å bli transplantert suspendert i 50 μL IMDM medium i en 1 ml insulinsprøyte med en 29 G nål.
- Forsiktig Pierce nålen inn i milten cortex og slipp celle suspensjonen inn i milten innen 2-3 min.
- Etter at cellen transplantasjon er fullført, forsiktig ta ut nålen og DAB området av nålen punktering med en fuktet bomull spissen for å unngå lekkasje av cellen suspensjon fra området.
- Lukk peritoneum og huden med en 4 – 0 absorberbare Sutur med kontinuerlig og usammenhengende suturing hhv.
- Påfør povidon jod løsning på huden på stedet av sting for å hindre smitte på det opererte området.
- Intraperitonealt injisere 1 mL volum 12 mg/mL antibiotika (f.eks. cefotaksim) oppløsning og subkutant sprøyte smertestillende (f.eks. meloksikam) 1 mg/kg kroppsvekt til dyret som en del av postoperativ behandling. Flytte dyret til en varm utvinne buret.
- Hold operert dyret isolert under normale forhold på 12 h lys/mørk syklus til kirurgiske sår er fullstendig helbredet. Dette kan ta 3 – 4 dager.
7. karakterisering av ALF utvikling
- Euthanize dyrene ved overdosering av ketamin-xylazine løsning 2 timer etter 2nd dose Apap behandling og samle blod og vevsprøver.
- Samle serum fra blod for biokjemiske studier32.
- Prosess lever vevsprøver for histologiske og gen uttrykks studier33,34,35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overlevelse prosent i dyremodeller av ALF
Den optimale dosen av APAP for å forårsake ALF i kombinasjon med 70% PHx ble standardisert som 750 mg/kg kroppsvekt. Behandlingen regime startet 24 h etter 70% PHx, da dyrene hadde helt utvinnes fra kirurgi, og besto av to APAP doser på 24 h intervaller. Dødelighet ble observert på frekvensen av 80% etter administrering av den andre dosen av APAP, 48 h post-kirurgi. Overlevelses prosenten ble analysert og plottet via Kaplan-Meier-metoden (figur 1). Den reproduserbarhet i tid med død og tidsperiode gitt av denne modellen gjør det til en passende kandidat for å studere en terapeutisk intervensjon mot ALF.
Fire grupper av dyr ble vurdert for studien: gruppe 1 (kontrollgruppe, bare saltvann behandling), gruppe 2 (bare APAP på 750 mg/kg kroppsvekt), gruppe 3 (saltvanns behandling med 70% PHx) og gruppe 4 (APAP ved 750 mg/kg kroppsvekt med 70% PHx). Tre dyr hver ble inkludert i alle gruppene og to representative bilder er inkludert fra hver gruppe. Dyr fra alle fire gruppene ble euthanized 2 h etter administrering av 2nd dose av de respektive behandling. Leverprøver tatt fra alle fire gruppene viste distinkte morfologi fra hverandre. Gruppe 1 viste rødlig-brune morfologi av en sunn gnager leveren. Leverprøver av gruppe 2 viste ingen åpenbare tegn på skade på morfologiske nivå og viste lignende utseende til sunne lever i gruppe 1. Leverprøver tatt fra gruppe 3 og 4 vises ikke sunt og hadde misfarging og et usammenhengende utseende. Den misfarging tilsvarer skaden i leveren vev og var mer tydelig i gruppe 4. Representative data presenteres i figur 2.
Omfanget av leverskade ble bestemt ved å kontrollere serum nivåer av alt, ast, og Alp enzymer36,37,38. Nivåene av ALAT, AST og ALP viste markerte forskjeller mellom de fire gruppene som svarer til omfanget av leverskader. Gruppe 4 viste en betydelig økning i AST og ALP nivåer i forhold til gruppe 1 (Figur 3).
For å sammenligne genuttrykk profilen i kontroll og Alf-indusert grupper, q-PCR analyse av gener involvert i celle død (Bax2, Caspase3, FAS) i leveren vev prøvene ble utført35,39. Disse ble funnet å være upregulated i gruppe 3 i forhold til kontrollgruppe 1, mens ingen forskjell ble sett i gruppe 2 og gruppe 4. Gener som er kjent for å være overexpressed som svar på leverskade (Mcp1 og Mmp2)33,40 ble funnet å være upregulated i alle tre gruppene i forhold til kontrollgruppe 1. Mmp9 ble Upregulated i grupper 3 og 4, mens gruppe 2 ikke viste noen markert forskjell fra kontrollgruppe 1. Uttrykket nivåer av Timp1 og Timp234 ble funnet å være høyere i gruppe 3, men viste ingen markert overuttrykte i gruppe 4 (Figur 4).
Gener involvert i betennelse i leveren (Tnfa, IL1a, Tgfbr1, og IL1b)41,42,43,44 ble funnet å være overexpressed i gruppe 3 i forhold til kontrollgruppe 1, men deres uttrykks nivå ble redusert i gruppe 4. ALR er overexpressed i leveren vev etter induksjon av leverskade. Den nedstrøms kaskader av dette genet hjelp i leveren gjenfødelse. RIP1 protein er nødvendig i APAP-indusert toksisitet. ALR og RIP1 ble funnet å være upregulated i grupper 2 og 3 i sammenligning for å kontrollere gruppe 1, mens deres nivåer forblir tilsvarende eller lavere i gruppe 4. Alpha glatt muskel utgangen (aSMA), en markør for overdreven ECM deponering som ytterligere fører til fibrose, ble funnet å være Upregulated i gruppe 3 og 4 i forhold til kontrollgruppe 1 (Figur 4). Gene Expression data tyder på at de ovenfor nevnte biomarkører av betennelser og celle død som er kjent for å være overexpressed under leverskade er upregulated i leveren vev prøver av dyr der ALF var-indusert av foreslåtte metoden, og dermed bekrefter forekomsten av leverskade på molekylnivå.
Hematoksylin og eosin (H & E) farging
Hematoksylin og eosin (H & E) farging ble gjort for å vurdere alvorlighetsgraden av leverskade ved å observere omfanget av hepatocytter degenerasjon. Leveren vev seksjoner beiset med H & E ble utsatt for blinde analyse av en tredjepart. I 70% delvis hepatectomy gruppe flytande Fatty degenerasjon ble observert og i Paracetamol gruppen periportal betennelser og nekrose ble sett sammen med milde sinusformet dilatasjon. Flytande Fatty degenerasjon ble observert hovedsakelig i ALF gruppen (figur 5).
Internasjonalt normalisert ratio og blodsukkernivå
Internasjonalt normalisert ratio (PT) er en parameter som avhenger av aktiviteten i leveren-syntetisert vev tromboplastintid og brukes til å karakterisere effekten av blodpropp mekanismen45. Generelt, en økning i PT er observert i forhold til lever-relaterte sykdommer. PT ble funnet å være betydelig høyere i ALF-indusert gruppen i forhold til kontrollgruppen. Den internasjonale normalisert ratio (INR)45 ble også funnet å være høyere, som representerer en defekt i mekanismen av blodpropp som følge av ineffektiv lever fysiologi (figur 6).
Evaluering av overlevelse etter celle sunt syngeneic rotte hepatocytter transplantasjon
Et viktig kriterium for en ALF-modell er Reversibilitet av leversvikt i nærvær av en terapeutisk intervensjon. I dagens studie, 10 000 000 sunn syngeneic rotte hepatocytter ble transplantert instrasplenically å observere effekten av celle transplantasjon terapi på leversvikt. Det riktige antall celler som skal transplantert ble bestemt ved å observere Reversibilitet av leversvikt etter transplantasjon av ulike celle tall (data ikke vist). Celler ble transplantert etter administrering av 1St dose av Apap, og overlevelse ble funnet å være restaurert i dyr etter transplantasjon av celler (figur 7). Serumnivåene av enzymer ALAT, AST, og ALP ble funnet å bli normalisert etter 10 dager med celle transplantasjon (Figur 8).
Figur 1: overlevelses prosenten i den Alf-induserte gruppen. Kaplan-Meier Survival Curve som viser overlevelse prosentandel av dyr etter induksjon av ALF med kombinasjonen av 70% PHx og APAP dose (750 mg/kg kroppsvekt). Tid 0 h betegner tidspunktet for 70% PHx. 1m og 2nd doser av Apap ble administrert 24 og 48 h postsurgically (n = 12, totalt dyr). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representative bilder av leveren morfologi i de fire ulike gruppene som inngår i studien. Bilde paneler A-D viser morfologi av lever av ulike grupper etter å ha blitt euthanized 2 h etter 2nd dose av de respektive behandling. (A) leveren morfologi av kontrollgruppe 1 der bare saltvann ble gitt. (B) leveren morfologi av gruppe 2 der bare Apap ble gitt på dosen av 750 mg/kg kroppsvekt. (C) leveren morfologi av gruppe 3 der saltvann ble gitt etter 70% PHx. (D) leveren morfologi i gruppe 4 der APAP ble gitt etter 70% PHx på dosen som ligner på gruppe 3 (n = 3 dyr per gruppe). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: en sammenligning av den biokjemiske profilen av serum i de ulike gruppene. Bar grafer representerer gjennomsnittet verdien av ALAT, AST, og ALP i serumprøver av de fire gruppene som inngår i studien. Serum ble samlet inn 2 timer etter 2nd dosen av den respektive behandlingen. Feilfelt = S. E. M; = p < 0,001; * = p < 0,05; n = 3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Gene Expression profil av leveren vev prøver. Bar grafer representerer den relative kvantifisering av mRNA uttrykk av ulike gener involvert i betennelse og celle død i de fire gruppene utsettes for ulike behandlinger. Alle gener ble normalisert mot uttrykket av kontroll Gapdh. Feil linjen = standard feil gjennomsnittet av de tre forskjellige prøvene (n = 3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: histologiske studie av lever vevsprøver. Representative hematoksylin og eosin fargebilder av leveren vevsprøver fra de fire gruppene som inngår i studien, som observert under 200x forstørrelse i lyse felt mikroskopi. Det var for det meste normale hepatocytter i kontrollgruppe 1 med mild periportal infiltrasjon (grønne piler). I gruppe 3 (70% delvis hepatectomy) flytande Fatty degenerasjon ble observert (hvite piler) og i Paracetamol gruppe 2 periportal betennelse (røde piler) og nekrose ble sett sammen med milde sinusformet dilatasjon (gule piler). Macrovesicular Fatty degenerasjon ble mest observert i ALF gruppe 4 (oransje piler). Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: sammenligning av internasjonalt normalisert ratio (PT) og internasjonal balansegang (INR). (A) sammenligning av PT mellom kontrollgruppe 1 (saltvann injeksjon innlegg 70% PHx) og Alf-indusert gruppe 4 (Apap injeksjon post 70% PHx). Blood ble samlet inn 2 timer etter 2nd dose av de respektive behandling og tid (i sekunder) som kreves for fibrin Clot formasjon vises på Y-aksen (* * * * = p < 0,0001, n = 5). (B) INR i Alf-indusert gruppe 4 i forhold til kontrollgruppe 1. Gjennomsnittsverdien av INR i gruppe 4 ble funnet å være 2,28, som faller i warfarin-indusert anti coagulating effekt (n = 5). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: overlevelses prosenten i Alf-indusert gruppe etter celle transplantasjon. Kaplan-Meier overlevelse kurve som viser overlevelse prosent Etter sunn hepatocytter transplantasjon i ALF-indusert gruppe 4 i forhold til kontrollgruppe 1 (n = 5). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: serum biokjemiske profil av Alf-indusert dyr etter celle transplantasjon. Serum nivåer av enzymer ALAT, AST, og ALP 10 dager etter celle transplantasjon i sammenligning med serum nivåer av ALF-indusert dyr euthanized etter en 2nd dose Apap administrasjon. Feil linje = standard feil av gjennomsnittet av fem forskjellige prøver; = p < 0,0001; * * = p > 0,01; n = 5. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utviklingen av en passende dyremodell for ALF er avgjørende for bedre forståelse av patogenesen og progresjon av ALF. En godt preget ALF dyremodell gir også mulighet for utvikling og utprøving av nye terapeutiske tilnærminger mot ALF. Det er gjort mange forsøk på å utvikle en klinisk relevant modell av Alf6,12,21,23,46,47,48. De fleste av disse studiene enten bruke kirurgiske prosedyrer eller indusere leverskade av hepatotoxic kjemikalier.
Det er vanskelig å lage en ALF modell av PHx alene fordi PHx ikke ville gjenspeile patologi av ALF på grunn av fravær av betennelse forårsaket av nekrotisk og apoptotisk vev. Ved terapeutiske doser metaboliseres APAP fullstendig av prosessene i glucoronidation og sulfering. Ved høyere doser, når disse banene er mettet, APAP metaboliseres ved cytokrom p450 enzymer som er primært syntetisert av hepatocytter, noe som resulterer i dannelsen av en giftig mellomliggende, NAPQI (N-acetyl-p-benzoquinone iminfunksjon). Under normale forhold NAPQI er nøytralisert av glutation (GSH) reserver av celler, mens ved supratherapeutic doser det forårsaker oksidativt stress i hepatocytter, noe som resulterer i hepatocytter død4,24,25,46. Derfor, ved å kombinere de fysiologiske effektene av 70% PHx og APAP-indusert leverskade, en ALF rotte modell ble opprettet i den aktuelle studien. Et mindre terapeutisk vindu reduserer stress perioden på dyret. Når det kombineres med mindre doser av APAP, fører dette til bedre reproduserbarhet for prosedyren.
Dosen av APAP ble valgt for å gi et egnet terapeutisk vindu der en terapeutisk intervensjon kan gis til dyret (dvs. innen 48 h av 1St dose og 24 h av 2nd dose). Innen 24 timer etter 2nd dose av APAP, 100% dødelighet ble observert. Men tidspunktet for dødsfallet i denne perioden var variabel for hvert dyr. Derfor, for å studere utviklingen av ALF, dyrene ble euthanized på en standard tid punkt på 2 h etter 2nd dose Apap.
Tidspunktet for terapeutisk intervensjon kan avgjøres avhengig av den enkelte studien og den type terapi som blir studert, som i dagens studie ble transplantasjon av syngeneic rotte hepatocytter like etter 1St dose av Apap, slik at cellene nok tid til å hjem og engraft. I dagens modell, transplantasjon av minst 10 000 000 celler er nødvendig for en vellykket redning fra ALF.
For å sikre suksess for den kirurgiske prosedyren, bør noen viktige punkter vurderes. Det anbefales å bruke ulike typer anestesi i ulike kirurgiske prosedyrer. For å utføre delvis hepatectomy, en cocktail av ketamin-xylazine bør brukes i de anbefalte doser fordi det gir god tid til å fullføre den kirurgiske prosedyren. Under celle transplantasjon, bør inhalerbar anestesi isoflurane brukes fordi det reduserer fysisk stress på ALF-indusert dyr.
Som konklusjon, på grunn av en ensartet dødelighet og et praktisk terapeutisk vindu, ble en APAP og 70% PHx kombinert modell brukt til å studere Reversibilitet av ALF ved celle transplantasjon. Å vurdere Reversibilitet av ALF, 10 000 000 sunne syngeneic rotte hepatocytter ble transplantert intrasplenically i ALF-indusert dyr. Etter transplantasjon ble overlevelses prosenten funnet å være økt i ALF-indusert dyr. Forbedring i serum nivåer av ALAT, AST, og ALP ble også observert hos dyr etter celle transplantasjon, noe som tyder på restaurering av leveren metabolisme. Dette ALF dyr modell presenterer et alternativ til å evaluere terapeutisk potensialet i cellene bygge bro mellom akutt leversvikt og lever transplantasjon. Det gir også mulighet til å studere leverskader forårsaket av fysisk skade og hepatotoxic middel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av kjernen stipend mottatt fra Institutt for bioteknologi, regjeringen i India til National Institute of immunologi, New Delhi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet (Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Cefotaxime (Taxim®) | AlKem; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma; US | 6522 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet®) | Reckitt Benckiser, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD; US | REF 303060 | |
| Isoflurane (Forane®) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax®) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex®) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll® | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin®) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
References
- Polson, J., Lee, W. M. AASLD position paper: the management of acute liver failure. Hepatology. 41, 1179-1197 (2005).
- Chung, R. T., et al. Pathogenesis of liver injury in acute liver failure. Gastroenterology. 143, 1-7 (2012).
- Fyfe, B., Zaldana, F., Liu, C. The Pathology of Acute Liver Failure. Clinical Liver Disease. 22, 257-268 (2018).
- Lefkowitch, J. H. The Pathology of Acute Liver Failure. Advances in Anatomic Pathology. 23, 144-158 (2016).
- Mitchell, J. R., et al. Acetaminophen-induced hepatic necrosis. I. Role of drug metabolism. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187, 185-194 (1973).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 81, 145-157 (2000).
- Rahman, T. M., Selden, A. C., Hodgson, H. J. A novel model of acetaminophen-induced acute hepatic failure in rabbits. Journal of Surgical Research. 106, 264-272 (2002).
- Dashti, H., et al. Thioacetamide- and carbon tetrachloride-induced liver cirrhosis. European Surgical Research. 21, 83-91 (1989).
- Demirdag, K., et al. Role of L-carnitine in the prevention of acute liver damage-induced by carbon tetrachloride in rats. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 19, 333-338 (2004).
- Sheweita, S. A., Abd El-Gabar, M., Bastawy, M. Carbon tetrachloride-induced changes in the activity of phase II drug-metabolizing enzyme in the liver of male rats: role of antioxidants. Toxicology. 165, 217-224 (2001).
- Sinicrope, R. A., Gordon, J. A., Little, J. R., Schoolwerth, A. C. Carbon tetrachloride nephrotoxicity: a reassessment of pathophysiology based upon the urinary diagnostic indices. American Journal of Kidney Diseases. 3, 362-365 (1984).
- Takada, Y., Ishiguro, S., Fukunaga, K. Large-animal models of fulminant hepatic failure. Journal of Artificial Organs. 6, 9-13 (2003).
- Takada, Y., et al. Increased intracranial pressure in a porcine model of fulminant hepatic failure using amatoxin and endotoxin. Journal of Hepatology. 34, 825-831 (2001).
- Leist, M., Wendel, A. A novel mechanism of murine hepatocyte death inducible by concanavalin A. Journal of Hepatology. 25, 948-959 (1996).
- Mizuhara, H., et al. Strain difference in the induction of T-cell activation-associated, interferon gamma-dependent hepatic injury in mice. Hepatology. 27, 513-519 (1998).
- Bruck, R., et al. Hypothyroidism minimizes liver damage and improves survival in rats with thioacetamide-induced fulminant hepatic failure. Hepatology. 27, 1013-1020 (1998).
- Chieli, E., Malvaldi, G. Role of the microsomal FAD-containing monooxygenase in the liver toxicity of thioacetamide S-oxide. Toxicology. 31, 41-52 (1984).
- Fontana, L., et al. Serum amino acid changes in rats with thioacetamide-induced liver cirrhosis. Toxicology. 106, 197-206 (1996).
- Peeling, J., et al. Cerebral metabolic and histological effects of thioacetamide-induced liver failure. American Journal of Physiology. 265, 572-578 (1993).
- Blitzer, B. L., et al. A model of fulminant hepatic failure in the rabbit. Gastroenterology. 74, 664-671 (1978).
- Diaz-Buxo, J. A., Blumenthal, S., Hayes, D., Gores, P., Gordon, B. Galactosamine-induced fulminant hepatic necrosis in unanesthetized canines. Hepatology. 25, 950-957 (1997).
- Maezono, K., Mawatari, K., Kajiwara, K., Shinkai, A., Maki, T. Effect of alanine on D-galactosamine-induced acute liver failure in rats. Hepatology. 24, 1211-1216 (1996).
- Patzer, J. F., et al. D-galactosamine based canine acute liver failure model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 1, 354-367 (2002).
- Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: a critical evaluation. Liver Transplantation. 6, 21-31 (2000).
- Yoon, E., Babar, A., Choudhary, M., Kutner, M., Pyrsopoulos, N. Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity: a Comprehensive Update. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 4, 131-142 (2016).
- Das, B., et al. Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3, 1167-1170 (2008).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Fry, J. R., Jones, C. A., Wiebkin, P., Bellemann, P., Bridges, J. W. The enzymic isolation of adult rat hepatocytes in a functional and viable state. Analytical Biochemistry. 71, 341-350 (1976).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell Tissue Bank. 18, 597-604 (2017).
- Ismail, T., et al. Growth of normal human hepatocytes in primary culture: effect of hormones and growth factors on DNA synthesis. Hepatology. 14, 1076-1082 (1991).
- Greenfield, E. A. Sampling and Preparation of Mouse and Rat Serum. Cold Spring Harbor Protocols. 11, (2017).
- Walsh, K. M., Timms, P., Campbell, S., MacSween, R. N., Morris, A. J. Plasma levels of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitors of metalloproteinases -1 and -2 (TIMP-1 and TIMP-2) as noninvasive markers of liver disease in chronic hepatitis C: comparison using ROC analysis. Digestive Diseases and Sciences. 44, 624-630 (1999).
- Thiele, N. D., et al. TIMP-1 is upregulated, but not essential in hepatic fibrogenesis and carcinogenesis in mice. Scientific Reports. 7, 714 (2017).
- Li, C. P., Li, J. H., He, S. Y., Li, P., Zhong, X. L. Roles of Fas/Fasl, Bcl-2/Bax, and Caspase-8 in rat nonalcoholic fatty liver disease pathogenesis. Genetics and Molecular Research. 13, 3991-3999 (2014).
- Kim, W. R., Flamm, S. L., Di Bisceglie, A. M., Bodenheimer, H. C. Serum activity of alanine aminotransferase (ALT) as an indicator of health and disease. Hepatology. 47, 1363-1370 (2008).
- Henry, L. Serum transaminase levels in liver disease. Journal of Clinical Pathology. 12, 131-137 (1959).
- Giannini, E. G., Testa, R., Savarino, V. Liver enzyme alteration: a guide for clinicians. Canadian Medical Association Journal. 172, 367-379 (2005).
- Hammam, O., et al. The role of fas/fas ligand system in the pathogenesis of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Hepatitis Monthly. 12, 6132 (2012).
- Prystupa, A., et al. Activity of MMP-2, MMP-8 and MMP-9 in serum as a marker of progression of alcoholic liver disease in people from Lublin Region, eastern Poland. The Annals of Agricultural and Environmental Medicine. 22, 325-328 (2015).
- Sekiyama, K. D., Yoshiba, M., Thomson, A. W. Circulating proinflammatory cytokines (IL-1 beta, TNF-alpha, and IL-6) and IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) in fulminant hepatic failure and acute hepatitis. Clinical and Experimental Immunology. 98, 71-77 (1994).
- Schwabe, R. F., Brenner, D. A. Mechanisms of Liver Injury. I. TNF-alpha-induced liver injury: role of IKK, JNK, and ROS pathways. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 583-589 (2006).
- Ataseven, H., et al. The levels of ghrelin, leptin, TNF-alpha, and IL-6 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma due to HBV and HDV infection. Mediators of Inflammation. 2006, 78380 (2006).
- Ambrosino, G., et al. Cytokines and liver failure: modification of TNF- and IL-6 in patients with acute on chronic liver decompensation treated with Molecular Adsorbent Recycling System (MARS). Acta Bio Medica Atenei Parmensis. 74, Suppl 2 7-9 (2003).
- Robert, A., Chazouilleres, O. Prothrombin time in liver failure: time, ratio, activity percentage, or international normalized ratio. Hepatology. 24, 1392-1394 (1996).
- Francavilla, A., et al. A dog model for acetaminophen-induced fulminant hepatic failure. Gastroenterology. 96, 470-478 (1989).
- Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36, 770-774 (1991).
- Tunon, M. J., et al. Rabbit hemorrhagic viral disease: characterization of a new animal model of fulminant liver failure. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141, 272-278 (2003).
