Summary
ספיקת כבד חריפה מודל בעלי חיים שפותחה במחקר הנוכחי מציג חלופה אפשרית למחקר של טיפולים פוטנציאליים. המודל הנוכחי מעסיק את ההשפעה המשולבת של פציעה פיזית ומושרה בתרופות בכבד ומספק חלון זמן מתאים כדי ללמוד את הפוטנציאל של טיפולים חדשניים.
Abstract
אי ספיקת כבד חריפה (אלף) היא מחלה קלינית הנגרמת על ידי חבלות שונות וכתוצאה מכך אובדן מטבולית, ביוכימית, סינתזה, ו הרעלים פונקציות של הכבד. במקרים של נזק בלתי הפיך ביותר בכבד, השתלת כבד אורתוטרופי (OLT) נשאר הטיפול היחיד הזמין. כדי ללמוד את הפוטנציאל התרפויטי של טיפול באלף, הבדיקה המוקדמת במודל החי של אלף היא חיונית. במחקר הנוכחי, מודל אלף בחולדות פותחה על ידי שילוב 70% כריתת hepatectomy חלקית (PHx) וזריקות של פרצטמול (APAP) המספק חלון טיפולי של 48 h. חציון ואת האונות לרוחב השמאלי של הכבד הוסרו לבלו 70% ממסת הכבד APAP ניתנה 24 שעות בניתוח עבור 2 ימים. הישרדות בבעלי חיים באלף המושרה נמצאה בירידה חמורה. ההתפתחות של אלף אושרה על ידי שינוי רמות הסרום של האנזימים אלטין העברת אמינו (ALT), אספרטט העברת אמינו (AST), פוספטאז אלקליין (ALP); שינויים בזמן הפרותרומבין (PT); והערכה של היחס המנורמל הבינלאומי (INR). המחקר של הפרופיל ביטוי הגן על ידי qPCR חשף עלייה ברמות הביטוי של גנים המעורבים אפופטוזיס, דלקת, ובהתקדמות של פציעה בכבד. התנוונות מניוון של hepatocytes וחדירה של תאים חיסוניים נצפתה על ידי הערכה היסטולוגית. הסבירות של אלף אושרה על ידי שיקום של רמות ההישרדות והסרום של ALT, AST, ו-ALP לאחר השתלת הטחול של החולדה בריאה syngeneic. מודל זה מציג חלופה אמינה למודלים הזמינים בעלי חיים כדי ללמוד את הפתופסולוגיה של אלף, כמו גם להעריך את הפוטנציאל של טיפול הרומן של אלף. השימוש בשתי גישות שונות מאפשר גם לבחון את ההשפעה המשולבת של פגיעה בכבד ובתרופות הנובעות מסמים. השגות והכדאיות של ההליך הנוכחי הוא יתרון נוסף של המודל.
Introduction
אי ספיקת כבד חריפה (אלף) מוגדר על ידי האגודה האמריקנית לחקר מחלות כבד כהתפתחות מהירה של פגיעה בכבד חריפה ללא סימנים קודמים של נזק מאופיין ליקוי חמור של סינתטי, מטבולית, ו הרעלים פונקציות של הכבד1. אלף שונה מכשל כבד כרוני שבו הכישלון מתרחש כתוצאה של פגיעה בכבד הנגרמת על פני תקופה ארוכה של זמן מ ספיקת כבד כרונית חריפה (aclf), שבו נזק לכבד פתאומי מתרחש כתוצאה של מחלות כבד כרונית2,3,4. התרופה הזמינה היחידה עבור אלף היא השתלת כבד אורתוטופית (OLT), או מוות עלול להתרחש. בשל המחסור של תורמי הכבד, שיעור התמותה בחולים הסובלים מאלף הוא גבוה מאוד.
כדי ללמוד את הפוטנציאל של גישות טיפוליות חלופיות ולהבין טוב יותר את הפתופסיולוגיה של אלף, מודלים בעלי חיים שיכולים לשקף את אלף המתרחשים בבני האדם הם זקוקים. רבים מדגמי החיות הזמינים שכבר הינם בעלי מספר חסרונות. ההשפעות של פרצטמול (APAP) קשות להתרבות, אך יש להן את הדמיון הקרוב ביותר במונחים של הערכים הטמפורלית, הקליניים, הביוכימיים והפתולוגיים. Apap מודלים בעלי חיים המושרה לעתים קרובות בעיות בשל נוכחותם של טהמוגלובינמיה נגרמת על ידי חמצון של המוגלובין על ידי apap ו intermediates שלה5,6,7. בעיה נוספת היא חוסר ביכולת התגובה המשתקף על ידי תגובות מינון בלתי צפויות ואת זמן המוות. אלף מודלים בעלי חיים המיוצרים באמצעות פחמן טטרהכלוריד(ccl4) יש שיקול העוני המסכן8,9,10,11. קונקבלנה (קון a) וליפוסכריד (lps)-המושרה אלף בעלי חיים מודלים לא משקפים את הדפוס הקליני של המחלה האנושית, למרות שיש להם יתרונות במחקר של מנגנונים סלולריים המעורבים מחלות בכבד אוטואימוניות במחקר של אלח דם בהתאמה12,13,14,15. באופן דומה, thioacetamide (TAA) גם דורש ביוטרנספורמציה כדי מטבוליזם פעיל thioacetamide סולפוקסיד ומראה וריאציה מינים16,17,18,19. ד-גלטוסמיטין (d-Gal) מייצרת מספר שינויים ביוכימיים, מטבוליים ופיסיולוגיים הדומים לאלף, אך אינו מסוגל לשקף את כל המצב הפתולוגי של אלף20,21,22,23. היו מעט מאוד נסיונות לשלב שתיים או יותר מהשיטות האלה כדי לפתח דגם אלף שמסוגל לשקף את תסמונת אלף בצורה טובה יותר13. לכן, מחקרים נוספים נדרשים לפתח מודל שיכול לשקף את הפרמטרים של המחלה, יש התפתחות טובה יותר, ומספק מספיק זמן כדי ללמוד את ההשפעות של התערבות טיפולית.
במחקר הנוכחי, המודל האלטרנטיבי של אלף בחולדות נוצר על ידי שילוב ההשפעות של כריתת hepatectomy (PHx) ומינונים נמוכים יותר של מגיב hepatoרעילים. Apap יש תפקיד מבוסס היטב גרימת פציעה בכבד5,24,25. זהו כאבים בשימוש נרחב הוא רעיל לכבד במינון supratherapeutic על ידי יצירת מטבוליטים רעילים. APAP הוא הגורם למותם של רבים במדינות מפותחות. פגיעה גופנית נגרמת על ידי כריתת hepatectomy יוזם הפעלה של תהליכים שונים המעורבים דלקת, כמו גם התחדשות הכבד. הזרקה של הסוכן hepatotoxic APAP גורם לסביבה עוינת בכבד, מניעת התפשטות של hepatציטים. זה מפחית את תקופת הלחץ על בעל החיים, אשר כאשר בשילוב עם מינונים קטנים יותר של hepatotoxin, מוביל לשגות טוב יותר של ההליך. לכן, באמצעות מודל זה, השפעה שוללת של שני סוגים של פציעות בכבד נחקרו. כדי לאפיין את דגם אלף החי המפותח, הפרמטרים הפיזיולוגיים והביוכימיים נחקרו. ההיבישה המוצלחת של אלף אושרה על ידי השתלת החולדה בריאה syngeneic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ההליך המתואר להלן אושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים המוסדי של המכון הלאומי לאימונולוגיה, ניו דלהי. מספר האסמכתא הטורית של האישור מהווה המשך 355/14.
1. הכנה
- היכונו להליך הכירורגי כמתואר קודם על ידי Das B et al.26.
- השתמש 6 – 8-שבוע בן המטבעי חולדות Wistar עם משקל הגוף של 200 – 250 g.
- בית בעלי החיים תחת תנאים סטנדרטיים טיפול בבעלי חיים ולהאכיל אותם עם החולדה העכבר libitum לפני ואחרי ההליך.
- בעת ביצוע 70% PHx, להשתמש בשילוב קוקטייל סטנדרטי של קטמין הידרוכלוריד (100 מ"ג/ק"ג משקל הגוף) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג משקל הגוף), אשר מוזרק intraperitoneally.
הערה: סוג ההרדמה שבשימוש יכול להיות השפעות פוסט-אופרטיביות על התמותה והתחלואה. - במהלך השתלת התא, השתמשו בהרדמה ממסים נדיפים (2-כלורט-2-(difluoromethoxy)-1, 1, 1-trifluoro-ethane) כדי להקטין את זמן ההחלמה של בעל החיים לאחר ניתוח ההשתלה.
- לגרום ולתחזק את ההרדמה הבין-משתמשים במערכת הרדמה אישית. שמור על זרימת החמצן ב-4 ליטר/דקות. לשימוש האינדוקציה isofלאנה ב 4% לשימוש תחזוקה 2 – 3% במהלך הניתוח.
2. הליכים מוקדמים
- הintraperitoneally את החולדה על ידי הזרקת התערובת הקטמין-xylazine שתוארה בשלב 3.1. לאשר את ההרדמה המלאה על ידי צובט את הבוהן של החיה. הליכים נוספים מתבצעים רק כאשר אין רפלקס דוושה.
- על מנת למנוע התייבשות, יש למרוח לשתי העיניים שטיפת מתיל מבוססת-תאית.
- רסן את בעל החיים ההרדמה. ללוח כירורגי באמצעות קלטת לבנה מניחים את בעל החיים עם צד הבטן הפונה כלפי מעלה, ומבטיחים שהפה הוא בצד המרוחק מהאדם המבצע את המבצע.
- להסיר את השיער מאזור כירורגי הימנית העליונה באמצעות קוצץ חשמלי.
- לחטא את האתר כירורגי על ידי שלושה חלוקים לסירוגין של povidone יוד ו 70% אתנול באמצעות רפידות כותנה מעוקר בתנועה מעגלית.
3. כריתת הלוע חלקית (PHx) כדי להסיר 70% ממסת הכבד
הערה: בצע את ההליך הכירורגי כולו תחת סביבה סטרילית במכסה זרימה למינארי. השתמש רק כלי ניתוח סטרילי כדי למזער את הסיכון של זיהום בניתוח. הסרת 70% של מסת הכבד, המכונה 70% כריתת hepatectomy (70% PHx), בוצעה כמתואר על ידי ג ' מיטשל ו-H. וילאנביא, 200827.
- לפני תחילת הניתוח, לאשר את ההרדמה המלאה של החיה על ידי צובט את הבוהן שלה. הליכים נוספים מתבצעים רק כאשר אין רפלקס דוושה.
- סמן את העור להיות נחתך ממש מתחת עצם החזה, בניצב xiphoid, ובמקביל לחזה.
- מניחים סדין סטרילי נקי שיש לו פתח של כ 3 ס"מ x 1 ס מ מעל העור המסומן.
- בצע חתך רוחבי של סביב 2 – 3 ס מ לאורך הקו המסומן עם אזמל. . השתמש בלהב כירורגי מס ' 22 הסירו בעדינות את ההחזקה של העור לשכבת השריר הבסיסית בקרבת האזור המעוקר תוך שימוש בתיאורי כותנה עקרים.
- לאחר מכן, בצע חתך רוחבי דרך שכבת הצפק בדיוק מתחת לתהליך xiphoid.
- בעזרת שני טיפים מלוחים להתשחת כותנה, לחשוף את האונה השמאלית של הכבד על ידי הפעלת לחץ עדין על החזה. מניחים קצה כותנה אחד על האזור הסרמטי של החלק המבוקר וקצה הכותנה השני מתחת לאזור המגורש כדי להרים את אונה הכבד.
- להחליק 8 – 10 ס מ לולאה לאורך חוט ניילון סטרילי (גודל 4 – 0, 0.15 מ"מ קוטר) סביב אונה הכבד חשוף. קח את הלולאה לבסיס של האונה קרוב hilum בעזרת מלקחיים מיקרובתר או ניצנים לחלח כותנה.
- בעזרת מחזיק המחט יקרוסקופיים מיקרו מלקחיים, לקשור את שני הקצוות של הלולאה, הצבת הקשר קרוב לבסיס של האונה ככל האפשר כדי לצמצם את כלי הדם ולהפחית את הדימום לאחר האונה הכבד מוסר. . קשור שני קשרים נוספים בצד השני
- נקוט זהירות לא לקשור את הקשר קרוב מדי לכלי הדם הסמוכים, אשר עלול אחרת לגרום חסימה בורידים (היצרות).
- השימוש מספריים יקרוסקופיים לחתוך את האונה הקשורה ממש מעל הקשר, אשר משאיר מסה דהוי של רקמה הנקרא גדם האיסכמי במקום האונה.
הערה: כבד חולדה, כמו אלה של עכברים, מחולק לארבע אונות נפרדות: האונה החציוני, האונה הימנית לרוחב, שמאל האונה השמאלית, ואת האונה מזונבת, אשר מייצגים כ 40%, 20%, 30%, ו 7% ממסת הכבד הכולל, בהתאמה. כל שילוב של האונות האלה ניתן להסיר לבלו 70% הכבד מסה. במחקר הנוכחי, האונה החציוני ואת האונות הצדדיים השמאלית הוסרו. - אתר בקפידה את האונה החציוני מבלי לפגוע בגדם הנותר של האונה הצדדית השמאלית. בעדינות למשוך את זה מתוך חלל הבטן, ובבסיס של עניבה האונה 8-10 ס מ החוט ניילון ארוך (גודל 4-0) הקשר כפי שהוזכר קודם לכן. . קשור שני קשרים נוספים בצד השני בסדר בזהירות ולהסיר את האונה החציוני קשור לקחת את כל אמצעי הזהירות שהוזכרו.
- לאחר הסרת האונות, תפר את הצפק באמצעות כרוממית 4-0 תפר עם תפרים מתמשך ואחריו העור בתפירה עם תפר קטוע.
- החל povidone יוד על העור המקיף את התפרים כדי למנוע זיהום.
- הסר את הסדין העטוף והוצא את בעל החיים מלוח הניתוח.
4. טיפול פוסט-פעיל בבעלי חיים
- Intraperitoneally להזריק את בעל החיים עם מנה של 12 mg cefo, 1 מ ל של 5% גלוקוז פתרון עם מזרק 1 mL כדי להגן עליו מפני הסיכון של זיהום לאחר הניתוח.
- ניהול הזרקה תת עורית של מלוקסיאם כאבים (1 מ"ג/ק"ג משקל הגוף) להקלה על הכאב לאחר הניתוח ולעקוב אחר זה על ידי שתי מינונים יותר, שמירה על משטר כמנה אחת ליום.
- הבית בעלי החיים המופעלים תחת תנאים סטנדרטיים של 12 h מחזור אור/כהה וניטור במרווחי זמן קבועים.
5. הזרקת סם בעלי חיים בעלי מערכת חלקית כדי לגרום לכשל בכבד
- לאחר 24 שעות הניתוח, כאשר בעלי החיים התאושש בהצלחה מ 70% PHx, למדוד את משקל הגוף של בעל החיים ואחריו הזריקות.
- הכנס 750 מ"ג/ק"ג משקל הגוף של APAP intraperitoneally בחיות hepatectomized תוייזציה באופן חלקי 24 שעות לאחר 70% PHx בעקבות בעלי החיים ' התאוששות מוצלחת מההליך כירורגי. חזור על המינון שוב לאחר 24 שעות.
הערה: שתי מינונים של APAP מנוהלים intraperitoneally לבעל החיים (כלומר, 24 h ו 48 h לפרסם את ההליך 70% PHx, בהתאמה). - בכל פעם לאחר ההזרקה של APAP, למדוד את משקל הגוף של החיה להתאושש.
הערה: APAP (biocetamol) הוא מוזרק בעלי חיים כפתרון 150 mg/mL ב 2% אלכוהול בנזיל.
6. השתלת הפציטים בריאות בדגמי אלף בעלי חיים
הערה: כדי ללמוד את הסבירות של אלף בחולדות, השתלת מלשין בריא לעכברושים בעלי חיים בתוך הבשר המושרה ביחד עםמנה אחת של apap. במחקר הנוכחי, כדי לספק זמן רב לתאים המושתלים עבור ביות ו העפילו, ההשתלה נעשתה רק לאחר לתת אתהמינון 1 של apap. החולדה הפטציטים מבודדת על ידי פרוטוקול שפורסם לראשונה על ידי ברי וחברים ואח '28 ומאוחר יותר הותאם במחקרים שונים29,30,31 עם כמה שינויים. עבור השתלת הטחול של תאים בדגם אלף בעלי חיים, בצע את השלבים שהוזכרו להלן.
- מניחים את העכברוש לתוך תא פולי (מתיל מתיונין) עבור אינדוקציה של הרדמה עם 4% isof, ו 4 זרימת חמצן L/min עבור חולדה של 250 – 350 גרם משקל הגוף. בדוק את עומק ההרדמה על ידי חוסר רפלקסים פדלים כאשר צובט את הבוהן של החיה.
- הניחו את העכברוש הרדימים על הלוח הכירורגי, כך שהחלק השמאלי שלו פונה כלפי מעלה. שמרו על הרדמה בשעה 2-3% משאיפת האינהלציה באמצעות דובר מתאים.
- לגלח את העור על האזור לרוחב שמאל לעקר אותו על ידי הפתרון יוד povidone.
- לעשות חתך רוחבי על האזור מגולח של העור.
- בצע חתך של 1 – 2 ס מ בשכבת הצפק כדי לחשוף את הטחול.
- הסירו בעדינות את הטחול של חלל הצפק והרימו אותו בעזרת שתי עצות לגבי כותנה.
- שמור את התאים (בדרך כלל 107 לכל בעל חיים) להיות מושתלים מושעה 50 ΜL imdm מדיה במזרק 1 מ"ל אינסולין עם מחט של 29 G.
- בעדינות לנקב את המחט לתוך קליפת הטחול ולשחרר את ההשעיה התא לתוך הטחול בתוך 2 – 3 דקות.
- לאחר השתלת התא הושלמה, בזהירות להוציא את המחט ולחלק את האזור של ניקוב המחט עם קצה כותנה לחלח כדי למנוע דליפה של ההשעיה התא מהאתר.
- סגרו את הצפק והעור באמצעות תפר של 4-0 שנספג באופן רציף ובלתי פוסק בהתאמה.
- החל povidone פתרון יוד על העור במקום התפרים כדי למנוע זיהום באתר המופעל.
- Intraperitoneally להזריק 1 מ"ל נפח של 12 מ"ג/mL של אנטיביוטיקה (למשל, cefoסעה) פתרון ותת-עורי להזריק כאבים (g., מלוקסיעם) 1 מ"ג/ק"ג משקל הגוף לחיה כחלק טיפול פוסט-פעיל. הזיזו את החיה לכלוב חם ומתאושש.
- לשמור על החיה המופעלת בבידוד בתנאים נורמליים של 12 h מחזור אור/כהה עד הפצעים המנתחים החלימו לחלוטין. הדבר עשוי להימשך שלושה – ארבעה ימים.
7. אפיון ההתפתחות של אלף
- המתת חסד בעלי חיים על ידי מנת יתר של פתרון קטמין-xylazine 2 h לאחרהמינון 2 של apap טיפול ולאסוף דגימות דם ורקמות.
- איסוף סרום מדם למחקרים ביוכימיים32.
- עיבוד דוגמיות של רקמת הכבד עבור לימודי היסטולוגית וגנים ביטויים33,34,35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אחוז ההישרדות במודלים של בעלי חיים של אלף
המינון האופטימלי של APAP לגרום אלף בשילוב עם 70% PHx היה מתוקננת כמו 750 מ"ג/ק"ג משקל הגוף. משטר הטיפול החל 24 שעות לאחר 70% PHx, כאשר בעלי החיים התאושש לחלוטין מהניתוח, וכללה שתי מנות APAP במרווחי זמן 24 h. התמותה נצפתה בשיעור של 80% לאחר הממשל של המינון השני של APAP, 48 h לאחר הניתוח. אחוז ההישרדות נותח והותווה דרך שיטת קפלן-מאייר (איור 1). השגות בזמן המוות ותקופת הזמן המסופקים על ידי מודל זה הופכת אותו למועמד מתאים לחקר התערבות טיפולית נגד אלף.
ארבע קבוצות של בעלי חיים נחשבו למחקר: קבוצה 1 (קבוצת בקרה, רק טיפול מלוחים), קבוצה 2 (רק APAP ב 750 מ"ג/ק"ג משקל גוף), קבוצה 3 (טיפול מלוחים עם 70% PHx) ו קבוצה 4 (APAP ב 750 מ"ג/ק"ג משקל הגוף עם 70% PHx). שלוש בעלי חיים כלולים בכל הקבוצות ושתי דמויות מייצגות כלולות בכל קבוצה. בעלי חיים מכל ארבעת הקבוצות הורדמים 2 שעות לאחר האדמיניסטרציה שלהמינון השני של הטיפול המתאים. דגימות כבד שנלקחו מכל ארבע הקבוצות הראו מורפולוגיה ברורה אחד מהשני. קבוצה 1 הראתה את המבנה החום-אדמדם של כבד מכרסם בריא. דגימות כבד של קבוצה 2 לא הראו סימנים גלויים של נזק ברמה מורפולוגית והראו הופעה דומה לכבדים בריאים של קבוצה 1. דגימות כבד שנלקחו מקבוצות 3 ו-4 לא הופיעו בריאים היו שינויי צבע ומראה לא סדיר. שינוי צבע מתאים לנזק ברקמת הכבד היה ברור יותר בקבוצה 4. נתונים מייצגים מוצגים באיור 2.
היקף פגיעת הכבד נקבע על ידי בדיקת רמות הסרום של ALT, AST, ו-ALP אנזימים36,37,38. רמות ALT, AST, ו-ALP הראו הבדלים מסומנים בין ארבע קבוצות המתאימות למידת הנזק לכבד. קבוצה 4 הראה עלייה משמעותית ברמות AST ו ALP לעומת קבוצה 1 (איור 3).
כדי להשוות את הפרופיל ביטוי הגן בשליטה וקבוצות אלף המושרה, ניתוח q-PCR של גנים המעורבים במוות תאים (Bax2, Caspase3,מהר) בדגימות רקמת הכבד בוצעה35,39. אלה נמצאו בקבוצה 3 בהשוואה לבקרת קבוצה 1, ואילו לא נראה הבדל בקבוצה 2 ובקבוצה 4. גנים אשר ידועים להיות מבוטא בתגובה לפגיעה בכבד (Mcp1 ו Mmp2)33,40 נמצאו upregulated בכל שלוש הקבוצות בהשוואה לקבוצה בקרת 1. Mmp9 היה upregulated בקבוצות 3 ו 4 ואילו קבוצה 2 לא הראה הבדל מסומן מתוך שליטה קבוצה 1. רמות הביטוי של Timp1 ו- Timp234 נמצאו גבוה יותר בקבוצה 3 אך הראה לא מסומן ביטוי יתר בקבוצה 4 (איור 4).
גנים מעורבים דלקת הכבד (tnfa, IL1a, Tgfbr1, ו IL1b)41,42,43,44 נמצאו להיות מבוטא בקבוצה 3 בהשוואה לקבוצה בקרה 1 אבל רמת הביטוי שלהם הצטמצמה בקבוצה 4. ALR הוא מבוטא יתר על רקמת הכבד לאחר אינדוקציה של פציעה בכבד. מפלי הזרם של הגנים. מסייעים בחידוש הכבד חלבון RIP1 הוא הכרחי ברעילות APAP הנגרמת. Alr ו RIP1 נמצאו להיות Upregulated בקבוצות 2 ו 3 בהשוואה לשלוט בקבוצה 1, ואילו הרמות שלהם נשארים דומים או נמוך בקבוצה 4. השריר החלק אלפא אקטין (לאזמה), סמן של ההצהרה ecm מוגזמת כי נוסף מוביל פיברוזיס, נמצא upregulated בקבוצה 3 ו 4 בהשוואה לשלוט בקבוצה 1 (איור 4). ביטוי גנים הנתונים עולה כי הסמנים הנ ל של דלקת ומוות תאים אשר ידועים להיות מבוטא במהלך הפגיעה בכבד הם upregulated בדגימות רקמת הכבד של בעלי חיים בהם אלף היה-המושרה על ידי השיטה המוצעת, ובכך מאשרת את התרחשות של פציעה בכבד ברמה המולקולרית.
המטאוקסילין והאאוזין (H & E) מכתים
המטאוקסילין ואאוזין (H & E) כתמים נעשה כדי להעריך את חומרת הפגיעה בכבד על ידי התבוננות בהיקף של ניוון hepatocyte. מקטעי רקמת הכבד המוכתמת עם H & E היו חשופים לניתוח עיוור על ידי צד שלישי. ב 70% הקבוצה הניתוח הפפאטומיה ניוון שומן היתה נצפתה ובקבוצה פרצטמול periportal דלקת ונמק נראו יחד עם sinusoidal dilatation מתון. ניוון שומן וסיקולריות נצפתה בעיקר בקבוצת אלף (איור 5).
שעון הפרותרומבין ורמות הגלוקוז בדם
זמן הפרותרומבין (PT) הוא פרמטר התלוי בפעילות הthromboplastin של רקמת הכבד מסונתז ומשמש לאפיון היעילות של מנגנון קרישת הדם45. בדרך כלל, עלייה ב-PT הוא נצפתה בתנאים של מחלות הקשורות לכבד. הקבוצה הייתה גבוהה באופן משמעותי בקבוצת אלף המושרה בהשוואה לקבוצת הביקורת. היחס המנורמל הבינלאומי (INR)45 נמצא גם הוא גבוה יותר, המייצג פגם במנגנון של קרישת הדם כתוצאה של פיזיולוגיה הכבד יעיל (איור 6).
הערכה של הישרדות לאחר השתלת העכבר התחבירי בריא בתאים
קריטריון חשוב במודל אלף הוא הסבירות לכשל בכבד בנוכחות התערבות טיפולית. במחקר הנוכחי, 10,000,000 חולדה בריאה החרופציטים עכברוש היו מושתלים לבחון את ההשפעה של טיפול השתלת תאים על אי ספיקת כבד. המספר המתאים של תאים להיות מושתלים נקבע על ידי התבוננות הסבירות של אי ספיקת כבד לאחר השתלת מספרי תאים שונים (נתונים לא מוצגים). תאים היו מושתלים לאחר הממשל שלמינון 1 של apap, והישרדות נמצאה לשחזר בעלי חיים לאחר השתלת תאים (איור 7). רמות הסרום של אנזימים ALT, AST, ו-ALP נמצאו להיות מנורמל לאחר 10 ימים של השתלת תא (איור 8).
איור 1: אחוז ההישרדות בקבוצה אלף המושרה. הישרדות קפלן מאייר עקומת מראה את אחוז ההישרדות של בעלי חיים לאחר אינדוקציה של אלף עם השילוב של 70% PHx ו APAP מינון (750 מ"ג/ק"ג משקל הגוף). Time 0 h מציין את השעה של 70% PHx. 1 ומינונים 2של apap היו מנוהלים 24 ו 48 h בניתוח (n = 12, סך כל החיות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות מייצגות של מורפולוגיה של הכבד בארבע הקבוצות השונות הכלולות במחקר. לוחות תמונה A – D להראות את המבנה של הכבדים של קבוצות שונות לאחר המתת2 h לאחר המינון 2 של הטיפול המתאים. (א) מורפולוגיה של הכבד של קבוצת שליטה 1 שבה רק מלוחים ניתנה. (ב) מורפולוגיה של הכבד של קבוצה 2 שבה רק apap ניתנה במינון של 750 מ"ג/ק"ג משקל הגוף. (ג) המבנה של הכבד של קבוצה 3 שבו מלוחים ניתנה בעקבות 70% phx. (ד) מורפולוגיה הכבד בקבוצה 4 שבו apap ניתנה בעקבות 70% phx במינון דומה לקבוצה 3 (n = 3 בעלי חיים לכל קבוצה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השוואה בין הפרופיל הביוכימי של הסרום בקבוצות השונות. תרשימי עמודות מייצגים את הערך הממוצע של ALT, AST ו-ALP בדגימות סרום של ארבע הקבוצות הכלולות במחקר. סרום נאסף 2 h לאחרהמינון 2 של הטיפול המתאים. קווי שגיאה = S. E. M; = p < 0.001; * = p < 0.05; n = 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: פרופיל ביטוי גנים של דגימות רקמת הכבד. תרשימי עמודות מייצגים את הקוונפיקציה היחסית של ביטוי mRNA של גנים שונים המעורבים בדלקת ומוות תאים בארבע הקבוצות החשופים לטיפולים שונים. כל הגנים הנורמו כנגד הביטוי של שליטה שוטפת. שגיאה בשורת השגיאה = ממוצע שגיאות סטנדרטי של שלוש דגימות שונות (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מחקר היסטולוגית של דגימות רקמת הכבד. המטאוקסילין ואאוזין צביעת תמונות של דגימות של רקמת הכבד מארבע הקבוצות הכלולות במחקר, כפי שנצפה תחת הגדלת 200x במיקרוסקופ שדה בהיר. היו בעיקר הפטוציטים נורמלי בשליטה קבוצה 1 עם הסתננות הפרישער מתון (חיצים ירוקים). ב קבוצה 3 (70% כריתת hepatectomy חלקית) ניוון שומן ושומני נצפתה (חיצים לבנים) ו פרצטמול קבוצה 2 דלקת הפורטל (חיצים אדומים) ו נמק נראו יחד עם sinusoidal רחבה מתון (חיצים צהובים). ניוון שומן macrovesicular נצפתה בעיקר בקבוצת אלף 4 (חיצים כתומים). סרגל בקנה מידה = 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: השוואת זמן הפרותרומבין (PT) ויחס מנורמל בינלאומי (INR). (א) השוואה של PT בין בקרת קבוצה 1 (הזרקה מלוחים לכתוב 70% PHx) ו אלף המושרה קבוצה 4 (הזרקתapap 70% phx). בלאד נאסף 2 h לאחרהמינון 2 של הטיפול והזמן בהתאמה (בשניות) הנדרש עבור היווצרות קריש קרישי דם מוצג על ציר Y (* * * * = p < 0.0001, n = 5). (ב) INR בקבוצה אלף המושרה 4 בהשוואה לשליטה בקבוצה 1. הערך הממוצע של INR בקבוצה 4 נמצא 2.28, הנופל על האפקט וורפרין המושרה נגד קרוש (n = 5). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: אחוז ההישרדות בקבוצה אלף המושרה לאחר השתלת תאים. עקומת ההישרדות קפלן-מאייר מראה את אחוז ההישרדות לאחר השתלת hepatocyte בריא בקבוצה אלף המושרה 4 לעומת בקרת קבוצה 1 (n = 5). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: סרום בפרופיל ביוכימיים של בעלי חיים מושרה אלף לאחר השתלת תאים. סרום רמות של אנזימים ALT, AST, ו-ALP 10 ימים לאחר השתלת תא בהשוואה לרמות הסרום של בעלי חיים המושרה אלף לאחרהמינון 2 של המינהל apap. שגיאה בשורת השגיאה = שגיאת תקן של משמעות של חמש דגימות שונות; = p < 0.0001; * * = p > 0.01; n = 5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התפתחותו של דגם בעלי חיים מתאים לאלף היא החשובה ביותר להבנת הפתוגנזה וההתקדמות של אלף. מודל מאופיין היטב של אלף בעלי חיים גם מספק את ההזדמנות לפיתוח ולניסוי של גישות טיפוליות חדשות נגד אלף. ניסיונות רבים נעשו לפתח מודל רלוונטי קלינית של אלף6,12,21,23,46,47,48. רוב מחקרים אלה או לנצל הליכים כירורגיים או לגרום לפציעה בכבד על ידי כימיקלים hepatotoxic.
קשה ליצור מודל אלף על ידי PHx לבד בגלל PHx לא ישקף את הפתולוגיה של אלף בשל העדר דלקת הנגרמת על ידי הרקמות נקרוטיק ו האפוטוטיק. במינון הטיפולי, APAP הוא מטבוליזם לחלוטין על ידי התהליכים של הגלואפיפיקציה ו sulphation. במינונים גבוהים יותר, כאשר מסלולים אלה הם רוויים, APAP הוא מטבוליזם על ידי האנזימים p450 ציטוכרום אשר מסונתז בעיקר על ידי hepatocytes, וכתוצאה מכך היווצרות של ביניים רעילים, NAPQI (N-מרחקסיל-p-בנזוקניום imine). בתנאים רגילים napqi מנוטרל על ידי שמורות הגלוטתיון (gsh) של תאים, ואילו במינון supraתרפויטי זה גורם ללחץ חמצוני בתוך הפטציטים, והתוצאה היא מוות hepatocytes4,24,25,46. מכאן, על ידי שילוב ההשפעות הפיזיולוגיות של 70% PHx ו APAP פציעה בכבד הנגרמת, מודל החולדה אלף נוצר במחקר הנוכחי. חלון תרפויטי קטן יותר מפחית את תקופת הלחץ על החיה. בשילוב עם מינונים קטנים יותר של APAP, זה מוביל לשגות טוב יותר של ההליך.
המינון של APAP נבחר כדי לספק חלון תרפויטי מתאים במהלכו התערבות טיפולית ניתן להעניק לבעל החיים (כלומר, בתוך 48 h של המינון 1 ו 24 h שלמינון 2 ). בתוך 24 שעות לאחרהמינון 2 של apap, 100% התמותה נצפתה. עם זאת, זמן המוות בתקופה זו היה משתנה לכל חיה. מכאן, לצורך לימוד התפתחות אלף, בעלי החיים הורדמים בנקודת זמן סטנדרטית של 2 h לאחרהמינון 2 של apap.
הזמן של התערבות טיפולית יכול להיות החליט בהתאם למחקר הפרט וסוג של טיפול ללמוד, אשר במחקר הנוכחי היה השתלת החולדה המרופאית של העכבר בדיוק לאחרהמינון 1 של apap, המאפשר את התאים מספיק זמן לבית, חרט. במודל הנוכחי, השתלת לפחות 10,000,000 תאים נדרש להצלה מוצלחת של אלף.
כדי להבטיח את הצלחת ההליך הכירורגי, יש לשקול מספר נקודות חשובות. מומלץ להשתמש בסוגים שונים של הרדמה בניתוחים שונים. כדי לבצע ניתוח hepatectomy קוקטייל של קטמין-xylazine יש להשתמש במינון המומלץ, כי זה נותן הרבה זמן כדי להשלים את ההליך הכירורגי. במהלך השתלת תאים, יש להשתמש בהרדמה מלאה של הרדמה משום שהיא מקטינה את הלחץ הפיזי על בעלי חיים המושרה על ידי אלף.
לסיכום, בשל שיעור תמותה אחיד וחלון טיפולי נוח, APAP ו 70% PHx מודל משולב שימש כדי ללמוד את הסבירות של אלף על ידי השתלת תאים. על מנת להעריך את הסבירות של אלף, 10,000,000 חולדה בריאה החרופציטים המושתלים בתוך בעלי חיים המושרה אלף. לאחר ההשתלה, התגלה אחוז ההישרדות שגדל בבעלי חיים המושרה אלף. שיפור ברמות הסרום של ALT, AST, ו-ALP נצפתה גם בבעלי חיים לאחר השתלת תאים, הרומז על שיקום חילוף החומרים בכבד. מודל זה לחיות אלף מציג אלטרנטיבה להעריך את הפוטנציאל התרפויטי של תאים המגשרים את הפער בין אי ספיקת כבד חריפה השתלת כבד. זה גם מספק את ההזדמנות ללמוד נזק לכבד הנגרמת על ידי פציעה פיזית סוכן hepatotoxic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענק הליבה שהתקבל מהמחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו למכון הלאומי לאימונולוגיה, ניו דלהי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet (Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Cefotaxime (Taxim®) | AlKem; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma; US | 6522 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet®) | Reckitt Benckiser, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD; US | REF 303060 | |
| Isoflurane (Forane®) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax®) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex®) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll® | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin®) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
References
- Polson, J., Lee, W. M. AASLD position paper: the management of acute liver failure. Hepatology. 41, 1179-1197 (2005).
- Chung, R. T., et al. Pathogenesis of liver injury in acute liver failure. Gastroenterology. 143, 1-7 (2012).
- Fyfe, B., Zaldana, F., Liu, C. The Pathology of Acute Liver Failure. Clinical Liver Disease. 22, 257-268 (2018).
- Lefkowitch, J. H. The Pathology of Acute Liver Failure. Advances in Anatomic Pathology. 23, 144-158 (2016).
- Mitchell, J. R., et al. Acetaminophen-induced hepatic necrosis. I. Role of drug metabolism. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187, 185-194 (1973).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 81, 145-157 (2000).
- Rahman, T. M., Selden, A. C., Hodgson, H. J. A novel model of acetaminophen-induced acute hepatic failure in rabbits. Journal of Surgical Research. 106, 264-272 (2002).
- Dashti, H., et al. Thioacetamide- and carbon tetrachloride-induced liver cirrhosis. European Surgical Research. 21, 83-91 (1989).
- Demirdag, K., et al. Role of L-carnitine in the prevention of acute liver damage-induced by carbon tetrachloride in rats. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 19, 333-338 (2004).
- Sheweita, S. A., Abd El-Gabar, M., Bastawy, M. Carbon tetrachloride-induced changes in the activity of phase II drug-metabolizing enzyme in the liver of male rats: role of antioxidants. Toxicology. 165, 217-224 (2001).
- Sinicrope, R. A., Gordon, J. A., Little, J. R., Schoolwerth, A. C. Carbon tetrachloride nephrotoxicity: a reassessment of pathophysiology based upon the urinary diagnostic indices. American Journal of Kidney Diseases. 3, 362-365 (1984).
- Takada, Y., Ishiguro, S., Fukunaga, K. Large-animal models of fulminant hepatic failure. Journal of Artificial Organs. 6, 9-13 (2003).
- Takada, Y., et al. Increased intracranial pressure in a porcine model of fulminant hepatic failure using amatoxin and endotoxin. Journal of Hepatology. 34, 825-831 (2001).
- Leist, M., Wendel, A. A novel mechanism of murine hepatocyte death inducible by concanavalin A. Journal of Hepatology. 25, 948-959 (1996).
- Mizuhara, H., et al. Strain difference in the induction of T-cell activation-associated, interferon gamma-dependent hepatic injury in mice. Hepatology. 27, 513-519 (1998).
- Bruck, R., et al. Hypothyroidism minimizes liver damage and improves survival in rats with thioacetamide-induced fulminant hepatic failure. Hepatology. 27, 1013-1020 (1998).
- Chieli, E., Malvaldi, G. Role of the microsomal FAD-containing monooxygenase in the liver toxicity of thioacetamide S-oxide. Toxicology. 31, 41-52 (1984).
- Fontana, L., et al. Serum amino acid changes in rats with thioacetamide-induced liver cirrhosis. Toxicology. 106, 197-206 (1996).
- Peeling, J., et al. Cerebral metabolic and histological effects of thioacetamide-induced liver failure. American Journal of Physiology. 265, 572-578 (1993).
- Blitzer, B. L., et al. A model of fulminant hepatic failure in the rabbit. Gastroenterology. 74, 664-671 (1978).
- Diaz-Buxo, J. A., Blumenthal, S., Hayes, D., Gores, P., Gordon, B. Galactosamine-induced fulminant hepatic necrosis in unanesthetized canines. Hepatology. 25, 950-957 (1997).
- Maezono, K., Mawatari, K., Kajiwara, K., Shinkai, A., Maki, T. Effect of alanine on D-galactosamine-induced acute liver failure in rats. Hepatology. 24, 1211-1216 (1996).
- Patzer, J. F., et al. D-galactosamine based canine acute liver failure model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 1, 354-367 (2002).
- Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: a critical evaluation. Liver Transplantation. 6, 21-31 (2000).
- Yoon, E., Babar, A., Choudhary, M., Kutner, M., Pyrsopoulos, N. Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity: a Comprehensive Update. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 4, 131-142 (2016).
- Das, B., et al. Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3, 1167-1170 (2008).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Fry, J. R., Jones, C. A., Wiebkin, P., Bellemann, P., Bridges, J. W. The enzymic isolation of adult rat hepatocytes in a functional and viable state. Analytical Biochemistry. 71, 341-350 (1976).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell Tissue Bank. 18, 597-604 (2017).
- Ismail, T., et al. Growth of normal human hepatocytes in primary culture: effect of hormones and growth factors on DNA synthesis. Hepatology. 14, 1076-1082 (1991).
- Greenfield, E. A. Sampling and Preparation of Mouse and Rat Serum. Cold Spring Harbor Protocols. 11, (2017).
- Walsh, K. M., Timms, P., Campbell, S., MacSween, R. N., Morris, A. J. Plasma levels of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitors of metalloproteinases -1 and -2 (TIMP-1 and TIMP-2) as noninvasive markers of liver disease in chronic hepatitis C: comparison using ROC analysis. Digestive Diseases and Sciences. 44, 624-630 (1999).
- Thiele, N. D., et al. TIMP-1 is upregulated, but not essential in hepatic fibrogenesis and carcinogenesis in mice. Scientific Reports. 7, 714 (2017).
- Li, C. P., Li, J. H., He, S. Y., Li, P., Zhong, X. L. Roles of Fas/Fasl, Bcl-2/Bax, and Caspase-8 in rat nonalcoholic fatty liver disease pathogenesis. Genetics and Molecular Research. 13, 3991-3999 (2014).
- Kim, W. R., Flamm, S. L., Di Bisceglie, A. M., Bodenheimer, H. C. Serum activity of alanine aminotransferase (ALT) as an indicator of health and disease. Hepatology. 47, 1363-1370 (2008).
- Henry, L. Serum transaminase levels in liver disease. Journal of Clinical Pathology. 12, 131-137 (1959).
- Giannini, E. G., Testa, R., Savarino, V. Liver enzyme alteration: a guide for clinicians. Canadian Medical Association Journal. 172, 367-379 (2005).
- Hammam, O., et al. The role of fas/fas ligand system in the pathogenesis of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Hepatitis Monthly. 12, 6132 (2012).
- Prystupa, A., et al. Activity of MMP-2, MMP-8 and MMP-9 in serum as a marker of progression of alcoholic liver disease in people from Lublin Region, eastern Poland. The Annals of Agricultural and Environmental Medicine. 22, 325-328 (2015).
- Sekiyama, K. D., Yoshiba, M., Thomson, A. W. Circulating proinflammatory cytokines (IL-1 beta, TNF-alpha, and IL-6) and IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) in fulminant hepatic failure and acute hepatitis. Clinical and Experimental Immunology. 98, 71-77 (1994).
- Schwabe, R. F., Brenner, D. A. Mechanisms of Liver Injury. I. TNF-alpha-induced liver injury: role of IKK, JNK, and ROS pathways. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 583-589 (2006).
- Ataseven, H., et al. The levels of ghrelin, leptin, TNF-alpha, and IL-6 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma due to HBV and HDV infection. Mediators of Inflammation. 2006, 78380 (2006).
- Ambrosino, G., et al. Cytokines and liver failure: modification of TNF- and IL-6 in patients with acute on chronic liver decompensation treated with Molecular Adsorbent Recycling System (MARS). Acta Bio Medica Atenei Parmensis. 74, Suppl 2 7-9 (2003).
- Robert, A., Chazouilleres, O. Prothrombin time in liver failure: time, ratio, activity percentage, or international normalized ratio. Hepatology. 24, 1392-1394 (1996).
- Francavilla, A., et al. A dog model for acetaminophen-induced fulminant hepatic failure. Gastroenterology. 96, 470-478 (1989).
- Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36, 770-774 (1991).
- Tunon, M. J., et al. Rabbit hemorrhagic viral disease: characterization of a new animal model of fulminant liver failure. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141, 272-278 (2003).
