Summary
Il modello animale acuto di insufficienza epatica sviluppato nell'attuale studio presenta un'alternativa fattibile per lo studio di potenziali terapie. L'attuale modello utilizza l'effetto combinato di lesioni epatiche fisiche e farmacologiche e fornisce una finestra temporale adatta per studiare il potenziale di nuove terapie.
Abstract
L'insufficienza epatica acuta (ALF) è una condizione clinica causata da varie eziologie con conseguente perdita di funzioni metaboliche, biochimiche, sintetizzanti e disintossicanti del fegato. Nella maggior parte dei casi di danni al fegato irreversibili, trapianto di fegato ortotropico (OLT) rimane l'unico trattamento disponibile. Per studiare il potenziale terapeutico di un trattamento per ALF, è essenziale il suo test precedente in un modello animale di ALF. Nello studio attuale, è stato sviluppato un modello ALF nei ratti combinando il 70% di epatectomia parziale (PHx) e iniezioni di acetaminofene (APAP) che fornisce una finestra terapeutica di 48 h. I lobi laterali mediani e lasciati del fegato sono stati rimossi per accise 70% della massa epatica e APAP è stato dato 24 h postchirurgico per 2 giorni. La sopravvivenza negli animali indotti da ALF è risultata essere gravemente diminuita. Lo sviluppo di ALF è stato confermato da livelli alterati di siero degli enzimi alanine aminoasi (ALT), aminoatomomomomomosoe aspartato (AST), fosfatosi alcalina (ALP); cambiamenti nel tempo protrombina (PT); e valutazione del rapporto internazionale normalizzato (INR). Lo studio del profilo di espressione genica da parte di qPCR ha rivelato un aumento dei livelli di espressione dei geni coinvolti nell'apoptosi, nell'infiammazione e nella progressione della lesione epatica. La degenerazione diffusa degli epatociti e l'infiltrazione delle cellule immunitarie è stata osservata mediante valutazione istologica. La reversibilità di ALF è stata confermata dal ripristino dei livelli di sopravvivenza e siero di ALT, AST e ALP dopo il trapianto intrasplenico di epatociti di ratti sani sinosgenici. Questo modello presenta un'alternativa affidabile ai modelli animali ALF disponibili per studiare la fisiofisiologia di ALF e per valutare il potenziale di una nuova terapia per ALF. L'uso di due approcci diversi consente inoltre di studiare l'effetto combinato delle lesioni epatiche fisiche e indotte da farmaci. La riproducibilità e la fattibilità della procedura corrente è un ulteriore vantaggio del modello.
Introduction
L'insufficienza epatica acuta (ALF) è definita dall'Associazione Americana per lo Studio delle Malattie del Fegato come rapido sviluppo di lesioni epatiche acute senza segni previi di danno ed è caratterizzata da una grave compromissione delle funzioni sintetiche, metaboliche e disintossicanti del fegato1. ALF si differenzia dall'insufficienza epatica cronica in cui l'insufficienza si verifica a causa di lesioni epatiche causate per un lungo periodo di tempo e da insufficienza epatica cronica acuta (ACLF), dove si verificano danni epatici bruschi a causa di malattie epatiche croniche2,3,4. L'unica cura disponibile per ALF è il trapianto di fegato ortotopico (OLT), o la morte può verificarsi. A causa della carenza di donatori di fegato, il tasso di mortalità nei pazienti affetti da ALF è molto alto.
Per studiare il potenziale di approcci terapeutici alternativi e per comprendere meglio la fisiofisiologia dell'ALF, sono necessari modelli animali che possano riflettere l'ALF che si verifica negli esseri umani. Molti dei modelli animali ALF già disponibili presentano diverse carenze. Gli effetti dell'acetaminofene (APAP) sono difficili da riprodurre, ma hanno le somiglianze più vicine in termini di parametri temporali, clinici, biochimici e patologici. I modelli animali indotti da APAP- incontrano spesso problemi dovuti alla presenza di methemoglobinemia causata dall'ossidazione dell'emoglobina da parte dell'APAP e dei suoi intermedi5,6,7. Un altro problema è la mancanza di riproducibilità riflessa da risposte imprevedibili alla dose e l'ora della morte. I modelli animali ALF prodotti con tetra cloruro di tetra di carbonio (CCl4) hanno scarsa riproducibilità8,9,10,11. I modelli animali ALF indotti da Concavalin A (Con A) e lipoplysaccharide (LPS) non riflettono il modello clinico della malattia umana, anche se hanno vantaggi nello studio dei meccanismi cellulari coinvolti nelle malattie epatiche autoimmuni e nello studio della sepsi rispettivamente12,13,14,15. Allo stesso modo, la tioacetamide (TAA) richiede anche la biotrasformazione in un metabolita attivo di tioacetamide e mostra la variazione delle specie16,17,18,19. D-galactosamine (D-Gal) produce alcuni cambiamenti biochimici, metabolici e fisiologici simili a ALF ma non è in grado di riflettere l'intera condizione patologica ALF20,21,22,23. Ci sono stati pochissimi tentativi di combinare due o più di questi metodi per sviluppare un modello ALF che è in grado di riflettere la sindrome ALF in modo migliore13. Pertanto, sono necessari ulteriori studi per sviluppare un modello in grado di riflettere i parametri della malattia, ha una migliore riproducibilità e fornisce abbastanza tempo per studiare gli effetti di un intervento terapeutico.
Nello studio attuale, è stato creato un modello alternativo ALF nei ratti combinando gli effetti dell'epatectomia parziale (PHx) e le dosi più basse di un reagente epatotossico. APAP ha un ruolo ben consolidato nel causare lesioni epatiche5,24,25. È un analgesico ampiamente usato ed è tossico per il fegato a dosi sopraterapeutiche formando metaboliti tossici. L'APAP è la causa di molti decessi nei paesi sviluppati. La lesione fisica causata dall'epatectomia parziale avvia l'attivazione di vari processi coinvolti nell'infiammazione e nella rigenerazione del fegato. L'iniezione dell'agente epatotossico APAP provoca un ambiente ostile nel fegato, impedendo la proliferazione di epatociti. Questo riduce il periodo di stress sull'animale, che quando combinato con piccole dosi di epatotossina, porta a una migliore riproducibilità della procedura. Pertanto, utilizzando questo modello, è stato studiato un effetto combinatorio di due tipi di lesioni epatiche. Per caratterizzare il modello animale ALF sviluppato, sono stati studiati i parametri fisiologici e biochimici. Una corretta reversibilità di ALF è stata confermata dal trapianto di epatociti di ratto sano singenico.
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Protocol
La procedura descritta di seguito è stata approvata dal Comitato Etico Istituzionale degli Animali dell'Istituto Nazionale di Immunologia, Nuova Delhi. Il numero di riferimento seriale dell'omologazione è IAEC-355/14.
1. Preparazione
- Preparare la procedura chirurgica come descritto in precedenza da Das B et al.26.
- Usa ratti Wistar inbred di 6-8 settimane con un peso corporeo di 200-250 g.
- Alloggiare gli animali in condizioni standard di cura degli animali e dar loro da mangiare con chow ratto e libitum prima e dopo la procedura.
- Quando si esegue il 70% di PHx, utilizzare un mix cocktail standard di cloridrato di chetamina (100 mg/kg di peso corporeo) e xylazina (10 mg/kg peso corporeo), che viene iniettato intraperitonealmente.
NOTA: Il tipo di anestetico utilizzato può avere effetti postoperatori sulla mortalità e la morbilità. - Durante il trapianto di cellule, utilizzare l'anestesia inalante Isoflurane (2-cloro-2-(difluoromethoxy)-1,1-trifluoro-etano) per ridurre il tempo di recupero dell'animale dopo l'intervento di trapianto.
- Indurre e mantenere l'anestesia inalazionale utilizzando un sistema di anestesia personalizzato. Mantenere il flusso di ossigeno a 4 L/min. Per l'uso a induzione èoflurane al 4% e per l'uso di manutenzione 2-3% durante la procedura chirurgica.
2. Procedure di preoperatoria
- Anestesizzare il ratto iniettando la miscela di chetamina-xilazina descritta al punto 3.1 intraperitonealmente. Confermare l'anestesizzazione completa pizzicando la dita dell'animale. Ulteriori procedure vengono eseguite solo quando non c'è riflesso del pedale.
- Per evitare la disidratazione corneale, applicare un carboxy methyl-cellulosa a base di occhio su entrambi gli occhi.
- Restringere l'animale anestesizzato a una scheda chirurgica utilizzando nastro bianco. Posizionare l'animale con il lato addominale rivolto verso l'alto, assicurandosi che la bocca sia sul lato disfatto dalla persona che esegue l'operazione.
- Rimuovere i capelli dall'area chirurgica addominale in alto a destra utilizzando un clipper elettrico.
- Disinfettare il sito chirurgico con tre scrub alternati di iodio povidone e 70% di etanolo utilizzando batuffoli di cotone sterilizzati in movimento circolare.
3. Epatectomia parziale (PHx) per rimuovere il 70% della massa del fegato
NOTA: Eseguire l'intera procedura chirurgica in un ambiente sterile in una cappa a flusso laminare. Utilizzare solo strumenti chirurgici sterili per ridurre al minimo il rischio di infezione postchirurgica. La rimozione del 70% della massa epatica, chiamata 70% epatectomia parziale (70% PHx), è stata eseguita come descritto da C. Mitchell e H. Willenbring, 200827.
- Prima dell'inizio dell'intervento, confermare l'anestesizzazione completa dell'animale pizzicando il dito del dito del dito. Ulteriori procedure vengono eseguite solo quando non c'è riflesso del pedale.
- Contrassegnare la pelle da tagliare appena sotto lo sterno, perpendicolare allo xifoide e parallelamente alla gabbia toracica.
- Posizionare un foglio di drappo sterile con un'apertura di circa 3 cm x 1 cm sulla pelle marcata.
- Eseguire un'incisione trasversale di circa 2-3 cm lungo la linea marcata con un bisturi. Utilizzare la lama chirurgica n. 22. Rimuovere delicatamente l'attaccamento della pelle allo strato muscolare sottostante in prossimità dell'area incisa utilizzando punte sterili di cotone inumidito.
- Successivamente, fare un'incisione trasversale attraverso lo strato peritoneale appena sotto il processo xifoideo.
- Con l'aiuto di due punte di cotone inumidite salina, esporre il lobo sinistro del fegato applicando una leggera pressione sul torace. Posizionare una punta di cotone sulla regione diaframmatica della porzione incisa e l'altra punta di cotone sotto la regione incisa per sollevare il lobo del fegato.
- Scivolare un anello di filo di nylon sterile lungo 8-10 cm (dimensioni 4-0, diametro di 0,15 mm) intorno al lobo epatico esposto. Prendere l'anello alla base del lobo vicino all'hilum con l'aiuto di pinze microdissecting o cotton fioc inumiditi.
- Con l'aiuto del supporto dell'ago di microchirurgia e delle microforza, legare le due estremità del loop, ponendo il nodo il più vicino possibile alla base del lobo per restringere il vaso sanguigno e ridurre il sanguinamento dopo la rimozione del lobo epatico. Legare due nodi aggiuntivi sull'altro lato.
- Prendere precauzione di non legare il nodo troppo vicino ai vasi sanguigni vicini, che altrimenti possono causare ostruzione venosa (stenosi).
- Utilizzare forbici microchirurgiche per tagliare il lobo legato appena sopra il nodo, che lascia una massa scolorita di tessuto chiamata un ceppo ischemico al posto del lobo.
NOTA: Il fegato di ratto, come quelli dei topi, è diviso in quattro lobi distinti: il lobo mediano, il lobo laterale destro, il lobo laterale sinistro e il lobo caudato, che rappresentano rispettivamente circa il 40%, il 20%, il 30% e il 7% della massa epatica totale. Qualsiasi combinazione di questi lobi può essere rimosso per accise 70% massa epatica. Nello studio attuale, il lobo mediano e i lobi laterali sinistri sono stati rimossi. - Individuare con attenzione il lobo mediano senza danneggiare il resto ceppo del lobo laterale sinistro. Estrarlo delicatamente dalla cavità addominale, e alla base del lobo legare un filo di nylon lungo 8-10 cm (dimensioni 4-0) nodo come accennato in precedenza. Legare due nodi aggiuntivi sull'altro lato. Accisa con attenzione e rimuovere il lobo mediano legato prendendo tutte le precauzioni menzionate.
- Dopo aver rimosso i lobi, suturare il peritoneo utilizzando una sutura cromatica assorbibile 4-0 con punti continui seguiti da sutura della pelle con una sutura interrotta.
- Applicare iodio povidone sulla pelle che circonda le suture per prevenire l'infezione.
- Rimuovere il foglio di drappo e rimuovere l'animale dalla scheda chirurgica.
4. Cura postoperatoria negli animali
- Intraperitonealmente iniettare l'animale con una dose di 12 mg cefotaxime antibiotico in 1 mL di 5% soluzione di glucosio con una siringa da 1 mL per proteggerlo dal rischio di infezione postoperatoria.
- Somministrare un'iniezione sottocutanea di meloxicam analgesica (1 mg/kg di peso corporeo) per alleviare il dolore dopo l'intervento chirurgico e seguirlo da altre due dosi, mantenendo il regime come una dose al giorno.
- Casa gli animali operati in condizioni standard di 12 h ciclo di luce / buio e monitorare a intervalli regolari.
5. Iniezione di droga in animali parzialmente epatici per indurre l'insufficienza epatica
- Dopo 24 ore di postchirurgia, quando gli animali si sono ripresi con successo dal 70% di PHx, misurare il peso corporeo dell'animale seguito dalle iniezioni.
- Iniettare 750 mg/kg di peso corporeo di APAP per via intraperitoneamente in animali parzialmente epatici 24 h dopo il 70% di PHx dopo il recupero riuscito degli animali dalla procedura chirurgica. Ripetere di nuovo la dose dopo 24 h.
NOTA: Due dosi di APAP vengono somministrate intraperitonealmente all'animale (rispettivamente 24 h e 48 h post della procedura PHx del 70%). - Ad ogni momento dopo l'iniezione di APAP, misurare il peso corporeo dell'animale in recupero.
NOTA: L'APAP (biocetamolo) viene iniettato negli animali come soluzione da 150 mg/mL nel 2% di alcool benzile.
6. Trapianto di epatociti sani in modelli animali ALF
NOTA: Per studiare la reversibilità di ALF nei ratti, trapiantare epatociti di ratti sinugenici sani intrasplenically negli animali indotti da ALF insieme alladose di APAP. Nello studio attuale, per fornire ampio tempo alle cellule trapiantate per l'homing e l'innesto, il trapianto è stato fatto subito dopo aver dato ladose di APAP. Gli epatociti rattociti sono isolati da un protocollo pubblicato prima da Berry and Friends et al.28 e successivamente adattati in vari altri studi29,30,31 con alcune modifiche. Per il trapianto intrasplenico di cellule nel modello animale ALF, seguire i passaggi indicati di seguito.
- Mettere il ratto in una camera poli (methacritillato metilico) per l'induzione dell'anestesia con 4% di isoflurane e 4 L/min flusso di ossigeno per un ratto di 250-350 g di peso corporeo. Controllare la profondità dell'anestesia per la mancanza di riflessi del pedale quando si pizzica la punta dell'animale.
- Posizionare il ratto anatizzato sulla scheda chirurgica in modo che la sua parte laterale sinistra sia rivolta verso l'alto. Mantenere l'anestesia al 2-3% di inalazione isoflurane attraverso un boccaglio adatto.
- Rasare la pelle sulla regione laterale sinistra e sterilizzarla con soluzione di iodio povidone.
- Fare un'incisione trasversale sulla regione rasata della pelle.
- Fate un taglio di 1-2 cm nello strato peritoneale per esporre la milza.
- Estrarre delicatamente la milza della cavità peritoneale e sollevarla con l'aiuto di due punte di cotone inumidite.
- Mantenere le cellule (tipicamente 107 per animale) da trapiantare sospese in supporti IMDM da 50 anni in una siringa di insulina da 1 mL con un ago da 29 G.
- Forare delicatamente l'ago nella corteccia della milza e rilasciare la sospensione cellulare nella milza entro 2-3 min.
- Dopo aver completato il trapianto di cellule, estrarre con attenzione l'ago e tamponare l'area della puntura dell'ago con una punta di cotone inumidita per evitare perdite della sospensione cellulare dal sito.
- Chiudere il peritoneo e la pelle con una sutura assorbibile 4-0 con sutura continua e discontinua rispettivamente.
- Applicare la soluzione di iodio povidone sulla pelle sul posto delle suture per prevenire l'infezione sul sito azionato.
- Intraperitonemente iniettare 1 mL di 12 mg/mL di soluzione antibiotica (ad esempio cefotaxime) soluzione e sottocutaneamente iniettare analgesico (ad esempio, meloxicam) 1 peso corporeo di 1 mg/kg per l'animale come parte delle cure postoperatorie. Spostare l'animale in una gabbia calda di recupero.
- Mantenere l'animale operato in isolamento in condizioni normali di 12 h ciclo leggero / scuro fino a quando le ferite chirurgiche sono completamente guarite. L'operazione potrebbe richiedere da 3 a 4 giorni.
7. Caratterizzazione dello sviluppo ALF
- Eutanasia gli animali per sovradosaggio di chetamina-xylazina soluzione 2 h dopo la dose 2nd di trattamento APAP e raccogliere campioni di sangue e tessuti.
- Raccogliere il siero dal sangue per studi biochimici32.
- Elaborare campioni di tessuto epatico per studi istologici e di espressione genica33,34,35.
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Representative Results
Percentuale di sopravvivenza nei modelli animali di ALF
La dose ottimale di APAP per causare ALF in combinazione con 70% PHx è stato standardizzato come 750 mg/kg peso corporeo. Il regime di trattamento è iniziato 24 h dopo 70% PHx, quando gli animali si erano completamente ripresi dall'intervento chirurgico, e consisteva di due dosi di APAP a intervalli di 24 h. La mortalità è stata osservata al tasso dell'80% dopo la somministrazione della seconda dose di APAP, 48 h post-intervento chirurgico. La percentuale di sopravvivenza è stata analizzata e tracciata tramite il metodo Kaplan-Meier (Figura 1). La riproducibilità in tempo di decesso e periodo di tempo fornito da questo modello lo rende un candidato adatto per studiare un intervento terapeutico contro ALF.
Quattro gruppi di animali sono stati presi in considerazione per lo studio: Gruppo 1 (gruppo di controllo, solo trattamento salina), Gruppo 2 (solo APAP a 750 mg/kg peso corporeo), Gruppo 3 (trattamento salina con 70% PHx) e Gruppo 4 (APAP a 750 mg/kg peso corporeo con 70% PHx). Tre animali ciascuno sono stati inclusi in tutti i gruppi e due immagini rappresentative sono incluse da ogni gruppo. Gli animali di tutti e quattro i gruppi sono stati eutanasia 2 h dopo la somministrazione della dose di 2nd del rispettivo trattamento. I campioni di fegato prelevati da tutti e quattro i gruppi mostravano una morfologia distinta l'una dall'altra. Il gruppo 1 ha mostrato la morfologia bruno-rossastro di un epatico sano dei roditori. I campioni di fegato del Gruppo 2 non mostravano segni apparenti di danni a livello morfologico e mostravano un aspetto simile aquello dei fegati sani del Gruppo 1. I campioni di fegato prelevati dai gruppi 3 e 4 non sembravano sani e avevano scolorimento e un aspetto irregolare. Lo scolorimento corrisponde al danno nel tessuto epatico ed era più evidente nel gruppo 4. I dati dei rappresentanti sono presentati nella Figura 2.
L'entità della lesione epatica è stata determinata controllando i livelli di siero degli enzimi ALT, AST e ALP36,37,38. I livelli di ALT, AST e ALP hanno mostrato marcate differenze tra i quattro gruppi corrispondenti all'entità dei danni al fegato. Il gruppo 4 ha mostrato un aumento significativo dei livelli AST e ALP rispetto al Gruppo 1(Figura 3).
Per confrontare il profilo di espressione genica nei gruppi di controllo e indotti da ALF, è stata eseguita l'analisi q-PCR dei geni coinvolti nella morte cellulare (Bax2, Caspase3, Fas) in campioni di tessuto epatico35,39. Questi dati sono stati aggiornati nel gruppo 3 rispetto al gruppo di controllo 1, mentre nel gruppo 2 e nel gruppo 4 non si è osservata alcuna differenza. I geni che sono noti per essere sovraespressi in risposta a lesioni epatiche (Mcp1 e Mmp2)33,40 sono stati trovati ad essere upregulated in tutti e tre i gruppi rispetto al controllo del gruppo 1. Mmp9 è stato aggiornato nei gruppi 3 e 4, mentre il gruppo 2 non ha mostrato differenze marcate rispetto al gruppo di controllo 1. I livelli di espressione di Timp1 e Timp234 sono stati trovati essere più elevati nel Gruppo 3, ma non hanno mostrato alcuna sovraespressione marcata nel Gruppo 4 (Figura 4).
I geni coinvolti nell'infiammazione del fegato (Tnfa, IL1a, Tgfbr1 e IL1b)41,42,43,44 sono risultati sovraespressi nel Gruppo 3 rispetto al gruppo di controllo 1, ma il loro livello di espressione è diminuito nel Gruppo 4. ALR è sovraespresso nel tessuto epatico dopo l'induzione della lesione epatica. Le cascate a valle di questo aiuto genetico nella rigenerazione del fegato. La proteina RIP1 è necessaria nella tossicità indotta da APAP. Nel gruppo 2 e 3, alR e RIP1, i gruppi 2 e 3 sono risultati in aumento rispetto ai gruppi di controllo 1, mentre i loro livelli rimangono simili o inferiori nel gruppo 4. Alfa liscia actina muscolare (aSMA), un marcatore di eccessiva deposizione ECM che porta ulteriormente alla fibrosi, è stato trovato per essere upregulated nel gruppo 3 e 4 rispetto al gruppo di controllo 1 (Figura 4). I dati sull'espressione genica suggeriscono che i suddetti biomarcatori dell'infiammazione e della morte cellulare che sono noti per essere sovraespressi durante le lesioni epatiche sono upregulated in campioni di tessuto epatico di animali in cui ALF è stato indotto con il metodo proposto, confermando così l'insorgenza di lesioni epatiche a livello molecolare.
Colorazione ematossilia e eosina (H&E)
La colorazione ematossina ed eosina (H&E) è stata fatta per valutare la gravità della lesione epatica osservando l'entità della degenerazione epatocita. Le sezioni di tessuto epatico macchiate di H&E sono state sottoposte ad analisi cieca da parte di terzi. Nel 70% parziale del gruppo di epatectomia è stata osservata la degenerazione visicolare del grasso e nel gruppo degli acetaminofene è stata osservata un'infiammazione periportaliva e necrosi insieme a lievi dilatazioni sinusoidi. La degenerazione grassa vescicolare è stata osservata principalmente nel gruppo ALF (Figura 5).
Tempo di protromboina e livelli di glucosio nel sangue
Il Tempo Prothromina (PT) è un parametro che dipende dall'attività della tromboplastica del tessuto sintetizzato per il fegato e viene utilizzato per caratterizzare l'efficienza del meccanismo di coagulazione del sangue45. Generalmente, un aumento di PT è osservato nelle condizioni di malattie correlate al fegato. Il PT è risultato significativamente più alto nel gruppo indotto da ALF rispetto al gruppo di controllo. Anche il rapporto internazionale normalizzato (INR)45 è risultato essere più alto, rappresentando un difetto nel meccanismo di coagulazione del sangue a causa di una fisiologia epatica inefficiente (Figura 6).
Valutazione della sopravvivenza dopo il trapianto di ratti epatociti sani e cellule
Un criterio importante di un modello ALF è la reversibilità dell'insufficienza epatica in presenza di un intervento terapeutico. Nello studio attuale, 10 milioni di epotociti di ratto sintetico sani sono stati trapiantati instrasplenically per osservare l'effetto della terapia trapiantata cellulare sull'insufficienza epatica. Il numero appropriato di cellule da trapiantare è stato determinato osservando la reversibilità dell'insufficienza epatica dopo il trapianto di diversi numeri di cellule (dati non mostrati). Le cellule sono state trapiantate dopo la somministrazione della dose 1st di APAP, e la sopravvivenza è stata trovata ripristinata negli animali dopo il trapianto di cellule (Figura 7). I livelli di siero degli enzimi ALT, AST e ALP sono stati trovati normalizzati dopo 10 giorni di trapianto di cellule (Figura 8).
Figura 1: Percentuale di sopravvivenza nel gruppo indotto da ALF. Curva di sopravvivenza Kaplan-Meier che mostra la percentuale di sopravvivenza degli animali dopo l'induzione di ALF con la combinazione della dose di 70% PHx e APAP (750 mg/kg di peso corporeo). Time 0 h indica il tempo del 70% di PHx. Le dosi 1st e 2nd di APAP sono state somministrate 24 e 48 h postchirurgica (n - 12, animali totali). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini rappresentative della morfologia epatica nei quattro diversi gruppi inclusi nello studio. I pannelli immagine A–D mostrano la morfologia dei fegati di gruppi diversi dopo essere stati eutanasia 2 h dopo la dose di 2nd del rispettivo trattamento. (A) La morfologia epatica del gruppo di controllo 1 in cui è stata data solo la salina. (B) La morfologia epatica del gruppo 2 in cui solo l'APAP è stato somministrato alla dose di 750 mg/kg di peso corporeo. (C) La morfologia epatica del gruppo 3 in cui la salina è stata data dopo il 70% di PHx. (D) La morfologia del fegato nel gruppo 4 in cui l'APAP è stata somministrata dopo il 70% di PHx alla dose simile al Gruppo 3 (n - 3 animali per gruppo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Un confronto del profilo biochimico del siero nei diversi gruppi. I grafici a barre rappresentano il valore medio di ALT, AST e ALP nei campioni di siero dei quattro gruppi inclusi nello studio. Il siero è stato raccolto 2 h dopo la dose 2nd del rispettivo trattamento. Barre di errore: S.E.M; p < 0.001; p < 0,05; n - 3 . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Profilo dell'espressione genica dei campioni di tessuto epatico. I grafici a barre rappresentano la quantificazione relativa dell'espressione mRNA di vari geni coinvolti nell'infiammazione e nella morte cellulare nei quattro gruppi sottoposti a diversi trattamenti. Tutti i geni sono stati normalizzati contro l'espressione di controllo Gapdh. Barra di errore: media di errore standard dei tre campioni diversi (n - 3). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Studio istologico di campioni di tessuto epatico. Rappresentative di ematossina e macchie di eosina immagini di campioni di tessuto epatico dei quattro gruppi inclusi nello studio, come osservato sotto l'ingrandimento 200x nella microscopia da campo luminoso. C'erano per lo più epatociti normali nel controllo del gruppo 1 con lieve infiltrazione periportali (frecce verdi). Nel gruppo 3 (70% di epatectomia parziale) è stata osservata la degenerazione del grasso vescicolare (frecce bianche) e nell'acetaminofene Gruppo 2 l'infiammazione periportale (frecce rosse) e la necrosi sono state osservate insieme a lievi dilatazioni sinusoidali (frecce gialle). La degenerazione grassa macrovelare è stata osservata per lo più nel gruppo 4 ALF (frecce arancioni). Barra di scala : 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Confronto tra il tempo protrombinato (PT) e il rapporto internazionale normalizzato (INR). (A) Confronto tra PT del gruppo 1 (iniezione salina post 70% PHx) e del gruppo 4 indotto dall'ALF (iniezione APAP post 70% PHx). Il sangue è stato raccolto 2 h dopo la dose di 2nd del rispettivo trattamento e il tempo (in secondi) richiesto per la formazione di coaguli di fibrina è mostrato sull'asse Y (sezione < p < 0.0001, n - 5). (B) L'INR del gruppo 4 indotto dall'ALF rispetto al gruppo di controllo 1. Il valore medio di INR nel gruppo 4 è risultato essere 2,28, che rientra nell'effetto anti coagulante indotto da Warfarin (n . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Percentuale di sopravvivenza nel gruppo indotto da ALF dopo il trapianto di cellule. Curva di sopravvivenza Kaplan-Meier che mostra la percentuale di sopravvivenza dopo un trapianto di epatociti sano nel gruppo 4 indotto da ALF rispetto al gruppo di controllo 1 (n . 5). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Profilo biochimico del siero degli animali indotti da ALF dopo il trapianto di cellule. Livelli di siero di enzimi ALT, AST e ALP 10 giorni dopo il trapianto di cellule rispetto ai livelli di siero degli animali indotti da ALF eutanasia dopo una dose di 2nd di somministrazione APAP. Barra di errore: errore standard della media di cinque campioni diversi; p < 0.0001; p > 0,01; n n - 5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Lo sviluppo di un modello animale appropriato per ALF è fondamentale per una migliore comprensione della patogenesi e della progressione di ALF. Un modello animale ALF ben caratterizzato offre anche l'opportunità per lo sviluppo e la sperimentazione di nuovi approcci terapeutici contro ALF. Sono stati fatti molti tentativi per sviluppare un modello clinicamente rilevante di ALF6,12,21,23,46,47,48. La maggior parte di questi studi o utilizzare procedure chirurgiche o indurre lesioni epatiche da sostanze chimiche epatossiche.
È difficile creare un modello ALF da PHx da solo perché PHx non rifletterebbe la patologia di ALF a causa dell'assenza di infiammazione causata dai tessuti necrotici e apoptotici. A dosi terapeutiche, L'APAP viene metabolizzato completamente dai processi di glucoronizzazione e solfogia. A dosi più elevate, quando queste vie sono sature, APAP è metabolizzato da enzimi citocromatici p450 che sono principalmente sintetizzati da epatociti, con conseguente formazione di un intermedio tossico, NAPQI (N-acetyl-p-benzoquie imine). In condizioni normali NAPQI è neutralizzato dalle riserve glutathione (GSH) delle cellule, mentre a dosi sopraterapeutiche provoca stress ossidativo negli epatociti, con conseguente morte epatocite4,24,25,46. Quindi, combinando gli effetti fisiologici del 70% di PHx e lesioni epatiche indotte da APAP, è stato creato un modello di ratto ALF nello studio attuale. Una finestra terapeutica più piccola riduce il periodo di stress sull'animale. Quando combinato con piccole dosi di APAP, Questo porta a una migliore riproducibilità della procedura.
La dose di APAP è stata selezionata per fornire una finestra terapeutica adeguata durante la quale è possibile soppartire un intervento terapeutico all'animale (cioè entro 48 h della dose 1st e 24 h di 2nd dose). Entro 24 h dopo la dose di 2nd di APAP, 100% mortalità è stato osservato. Tuttavia, l'ora del decesso all'interno di questo periodo era variabile per ogni animale. Quindi, allo scopo di studiare lo sviluppo di ALF, gli animali sono stati eutanasia in un punto temporale standard di 2 h dopo la dose 2nd di APAP.
Il tempo di intervento terapeutico può essere deciso a seconda dello studio individuale e del tipo di terapia in fase di studio, che nello studio attuale è stato il trapianto di epatociti di ratto singenici subito dopo la dose di 1st di APAP, consentendo alle cellule abbastanza tempo per casa e innesto. Nel modello attuale, il trapianto di almeno 10 milioni di cellule è necessario per un salvataggio riuscito da ALF.
Per garantire il successo della procedura chirurgica, è necessario considerare alcuni punti importanti. Si raccomanda di utilizzare diversi tipi di anestetici in diverse procedure chirurgiche. Per eseguire l'epatectomia parziale, un cocktail di ketamina-xilosina deve essere utilizzato nelle dosi raccomandate perché dà ampio tempo per completare la procedura chirurgica. Durante il trapianto di cellule, l'anestesia inalabile isoflurane deve essere utilizzata perché riduce lo stress fisico sugli animali indotti da ALF.
In conclusione, a causa di un tasso di mortalità uniforme e di una comoda finestra terapeutica, è stato utilizzato un modello combinato APAP e 70% PHx per studiare la reversibilità dell'ALF mediante trapianto di cellule. Per valutare la reversibilità di ALF, 10 milioni di epotociti di ratto sintetici sani sono stati trapiantati intrasplenalmente negli animali indotti dall'ALF. Dopo il trapianto, la percentuale di sopravvivenza è stata aumentata negli animali indotti da ALF. Miglioramento nei livelli di siero di ALT, AST, e ALP è stato osservato anche negli animali dopo trapianto di cellule, suggerendo il ripristino del metabolismo del fegato. Questo modello animale ALF rappresenta un'alternativa per valutare il potenziale terapeutico delle cellule che colmano il divario tra insufficienza epatica acuta e trapianto di fegato. Fornisce anche l'opportunità di studiare i danni al fegato causati da lesioni fisiche e agente epatotossico.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione di base ricevuta dal Dipartimento di Biotecnologia, Governo dell'India all'Istituto Nazionale di Immunologia, Nuova Delhi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet (Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Cefotaxime (Taxim®) | AlKem; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma; US | 6522 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet®) | Reckitt Benckiser, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD; US | REF 303060 | |
| Isoflurane (Forane®) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax®) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex®) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll® | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin®) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
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