Summary
Ce protocole fournit une méthode simple et fiable pour la production de tranches de foie de précision viables de souris. Les échantillons de tissu ex vivo peuvent être maintenus dans des conditions de culture tissulaire de laboratoire pendant plusieurs jours, fournissant un modèle flexible pour examiner la pathobiologie de foie.
Abstract
Comprendre les mécanismes des lésions hépatiques, de la fibrose hépatique et de la cirrhose qui sous-tendent les maladies chroniques du foie (c.-à-d. l’hépatite virale, l’affection hépatique non alcoolique, l’affection hépatique métabolique et le cancer du foie) nécessite une manipulation expérimentale de modèles animaux et les cultures cellulaires in vitro. Les deux techniques ont des limites, telles que l’exigence d’un grand nombre d’animaux pour la manipulation in vivo. Cependant, les cultures cellulaires in vitro ne reproduisent pas la structure et la fonction de l’environnement hépatique multicellulaire. L’utilisation de tranches de foie coupées avec précision est une technique dans laquelle des tranches uniformes de foie de souris viable sont maintenues dans la culture tissulaire de laboratoire pour la manipulation expérimentale. Cette technique occupe une niche expérimentale qui existe entre les études animales et les méthodes de culture cellulaire in vitro. Le protocole présenté décrit une méthode simple et fiable pour isoler et culture des tranches de foie de précision-coupé de souris. Comme application de cette technique, les tranches de foie ex vivo sont traitées avec des acides biliaires pour simuler des lésions hépatiques cholestatiques et finalement évaluer les mécanismes de la fibrogenèse hépatique.
Introduction
La pathogénie de la plupart des maladies chroniques du foie (c.-à-d. l’hépatite virale, la stéatohépatite non alcoolique, les lésions hépatiques cholestatiques et le cancer du foie) implique des interactions complexes entre plusieurs types de cellules hépatiques différentes qui conduisent l’inflammation, la fibrogenèse, et le développement du cancer1,2. Pour comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces maladies chroniques à base de foie, les interactions entre les multiples types de cellules hépatiques doivent être étudiées. Bien que les lignées cellulaires hépatiques multiples (et plus récemment, les organoïdes) peuvent être cultivées in vitro, ces modèles n’imitent pas exactement la structure complexe, la fonction et la diversité cellulaire du microenvironnement hépatique3. En outre, les cellules hépatiques cultivées (en particulier, les lignées cellulaires transformées) peuvent s’écarter de leur biologie source originale. Les modèles animaux sont utilisés expérimentalement pour étudier les interactions entre les multiples types de cellules hépatiques. Cependant, ils peuvent devenir considérablement réduits dans la portée pour la manipulation expérimentale, en raison d’effets hors cible significatifs dans les organes extrahépatiques (par exemple, lors de l’essai thérapeutiques potentielles).
L’utilisation de tranches de foie découpées de précision (PCLS) dans la culture tissulaire est une technique expérimentale utilisée pour la première fois dans les études sur le métabolisme des médicaments et la toxicité, et elle implique la coupe de tranches de foie viables, ultrathines (environ 100 à 250 m d’épaisseur). Cela permet la manipulation expérimentale directe du tissu hépatique ex vivo4. La technique comble un fossé expérimental entre les études animales in vivo et les méthodes de culture cellulaire in vitro, surmontant de nombreux inconvénients des deux méthodes (c.-à-d. des limites pratiques sur la gamme d’expériences qui peuvent être effectuées chez des animaux entiers ainsi que la perte de structure/fonction et de diversité cellulaire avec des méthodes de culture cellulaire in vitro).
En outre, pcLS augmente considérablement la capacité expérimentale par rapport aux études animales entières. Comme une souris peut produire plus de 48 tranches de foie, cela facilite également l’utilisation de groupes de contrôle et de traitement à partir du même foie. En outre, la technique sépare physiquement le tissu hépatique des autres systèmes d’organes ; par conséquent, il élimine les effets potentiels hors cible qui peuvent se produire chez les animaux entiers lors de l’essai des effets des stimuli exogènes.
Dans ce protocole, les PCLS sont générés à l’aide d’un vibratome avec une lame qui vibre latéralement. D’autres études ont utilisé avec succès un trancheur de tissu Krumdieck, tel que décrit dans Olinga et Schuppan5. Dans le vibratome, la vibration latérale de la lame empêche la déchirure du tissu ultrathin causé par le stress de cisaillement, comme la lame est poussée dans le tissu. Le vibratome et le trancheur de tissu de Krumdieck fonctionnent efficacement sans l’intégration structurelle du tissu de foie, qui simplifie la procédure de tranchement. Cette technique peut également être utilisée pour créer des PCLS à partir de foies malades, y compris ceux des modèles murins de la fibrose/cirrhose6 et la stéatose hépatique7.
En plus de démontrer les techniques requises pour la préparation et la culture tissulaire de PCLS, ce rapport examine également la viabilité de ces tissus ex vivo en mesurant les niveaux de triphosphate d’adénosine (ATP) et en examinant l’histologie de tissu pour évaluer la nécrose et la fibrose. En tant que procédure expérimentale représentative, les PCLS sont traités avec des concentrations pathophysiologiques de trois acides biliaires différents (acides glycocholiques, taurochiques et choliques) pour simuler des lésions hépatiques cholestatiques. Dans le contexte des lésions hépatiques cholestatiques, l’acide taurocholic en particulier s’est avéré être sensiblement augmenté dans le sérum et la bile des enfants atteints de fibrose kystique-associée à la maladie du foie8.
Les cellules progénitrices de foie ont également été traitées in vitro avec l’acide taurocholic pour simuler les niveaux élevés d’acide taurocholic observés dans les patients, et ce traitement a causé la prolifération accrue et la différenciation des cellules progénitrices de foie vers un phénotype biliaire (cholangiocyte)9. Par la suite, les PCLS ont été traités ex vivo avec des niveaux élevés d’acide taurocholic, et des marqueurs cholangiocytes accrus ont été observés. Ceci soutient l’observation in vitro que l’acide taurocholic conduit la prolifération biliaire et/ou la différenciation dans le contexte de la maladie hépatique kystique-associée pédiatrique9.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément au code australien pour les soins et l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques au QIMR Berghofer Medical Research Institute avec l’approbation du comité d’éthique animale de l’institut. Des souris mâles C57BL/6 (15-20 semaines) ont été obtenues auprès du Animal Resources Centre, WA, Australie.
REMARQUE : Toutes les solutions, médias, instruments, matériels et tubes qui contactent les échantillons doivent être stérilisés ou complètement désinfectés avec une solution d’éthanol de 70 % et manipulés à l’aide de techniques stériles pour minimiser le risque de contamination de la culture.
1. Configuration du vibratome
- Préparer la solution tampon stérile Krebs-Henseleit avec 2 g/L de glucose(tableau des matériaux). Vérifiez que le pH du tampon est de 7,4. Si le pH est plus élevé, saturer le tampon avec du carbogène (95 % O2 et 5 % de CO2) ou incuber dans un incubateur de culture tissulaire de 5 % de CO2 pour corriger le système de mémoire tampon du bicarbonate. Réfrigérer la solution tampon stérile scellée à 4 oC.
- Insérez la lame vibratome dans le bras de coupe. Assurez-vous que la lame est bien fixée au bras de coupe, car les vibrations peuvent faire en sorte que la lame se détache.
- Désinfecter la lame et couper le bras avec une solution d’éthanol à 70 %.
AVERTISSEMENT : Évitez tout contact avec la lame. - Désinfecter le plateau tampon avec une solution d’éthanol de 70 % et essuyez-le avec un tissu stérile.
- Insérez le plateau tampon dans le vibratome et resserrez le mécanisme de montage.
- Réglez le bras de coupe à la hauteur maximale disponible.
- Placez l’angle de la lame à 10 degrés au-dessous de l’horizontale, en pente vers le bas vers l’échantillon. Assurez-vous que l’angle de la lame est bien fixé.
REMARQUE : L’angle optimal de la lame peut différer selon le modèle vibratome et les caractéristiques tissulaires. - Désinfecter le porte-échantillons avec une solution d’éthanol de 70 %.
- Connectez l’eau de refroidissement pour la glacière thermoélectrique Peltier située sous le plateau tampon.
REMARQUE : Certains modèles de vibratome utilisent plutôt un bain de glace pour se rafraîchir. - Fixer le tube d’eau à un drain et allumer l’eau. Réglez la glacière à 4 oC. Exécuter l’eau de refroidissement à un taux de 400 mL/min.
- Remplissez le plateau tampon presque vers le haut avec le tampon sterile de glace-froid Krebs-Henseleit (avec 2 g/L de glucose). Laissez une solution tampon Krebs-Henseleit supplémentaire sur la glace.
2. Enlèvement et préparation du foie
- Stérilisez ou désinfectez tous les instruments chirurgicaux, y compris les forceps incurvés, les forceps plats à pointe carrée, les pincettes, les pinces chirurgicales et les ciseaux à l’aide d’autoclaving.
- Avant l’ablation du foie, anesthésiez profondément les souris à l’aide d’une injection intrapétonéale de 100 mg/kg de kétamine et de 12,5 mg/kg de xylazine.
REMARQUE : D’autres anesthésiques peuvent être utilisés, ou les souris peuvent être euthanasiées par asphyxie de CO2/dislocation cervicale si le foie est rapidement enlevé pour prévenir les dommages induits par l’hypoxie. - Désinfectez les surfaces cutanées sur les souris en mouillant avec une solution d’éthanol de 70 %. Sécurisez les souris sur le dos avec toutes les extrémités épinglées sur une planche de dissection.
- Faire une incision verticale de ligne médiane dans la peau de la base de la cavité abdominale à juste au-dessus du diaphragme.
REMARQUE : Des incisions vers les extrémités sont faites pour faciliter la rétraction de la peau. - Retirez la peau tout en coupant tout tissu conjonctif entre la peau et la cavité abdominale. Empêcher les cheveux d’être transférés à la cavité abdominale autant que possible. Épinglez ou serrez la peau loin de la cavité abdominale.
- À l’aide de forceps et de ciseaux propres, ouvrez la cavité abdominale et la cavité thoracique inférieure.
- Enlever le foie rapidement sans endommager les lobes
- À l’aide d’outils émoussés (p. ex., forceps plats à pointe carrée), guidez les lobes supérieurs du foie vers le bas vers l’abdomen. Couper le tissu conjonctif entourant les lobes du foie supérieur à l’aide de ciseaux.
- Guidez les lobes de foie vers le haut vers le diaphragme. Tenez le faisceau vasculaire central du foie avec des forceps.
REMARQUE : Il n’affectera pas la procédure si le faisceau vasculaire central est endommagé. - Éloignez le faisceau vasculaire central de la souris et coupez le tissu conjonctif restant, les vaisseaux sanguins, etc. pour enlever le foie. Prenez soin de ne pas endommager les lobes du foie et 2) coupés dans le tractus gastro-intestinal, car cela peut contaminer le foie avec des micro-organismes.
- Placer le foie enlevé dans un plat stérile de culture tissulaire de 10 cm à moitié rempli de solution tampon Krebs-Henseleit glacée. À l’aide d’un instrument contondant pour guider les lobes, couper le centre du foie pour le diviser en lobes séparés.
- Sélectionnez un lobe de foie (utiliser le plus grand premier), et placez-le côté plat vers le bas sur un nouveau plat stérile de 10 cm. Conservez tous les autres lobes hépatiques dans le plat de la solution tampon Krebs-Henseleit stockée sur la glace pour une utilisation ultérieure.
- Couper environ 10% du matériel du bord le plus haut du lobe du foie tout en se trouvant à plat.
REMARQUE : Le rognage est important, car ce bord tissulaire communiquera d’abord avec la lame de coupe ; par conséquent, un bord de tissu qui est relativement perpendiculaire à la lame de coupe empêchera la compression de tissu qui peut se produire en raison des angles peu profonds dans les lobes de foie non coupés. - Couper les trois autres bords de tissu.
REMARQUE : Cela élimine une partie de la capsule fibreuse Glisson et facilitera la séparation des tranches de tissu. - Montage du lobe du foie sur le support du spécimen
- Placez une fine couche de colle cyanoacrylate (superglue ou colle cyanoacrylate de qualité médicale/vétérinaire) sur le support du spécimen vers l’avant, de taille légèrement plus grande que le lobe de foie paré.
REMARQUE : Vérifiez que la colle cyanoacrylate ne contient pas d’additifs non cyanoacrylate. - Ramassez doucement le lobe de foie avec des forceps stériles utilisant un coin loin du bord d’avant, puis tapotez n’importe quel tampon résiduel du côté plat du lobe de foie utilisant le matériel absorbant stérile.
- Placez le grand côté plat du lobe du foie sur le patch de colle cyanoacrylate avec le plus grand bord orienté vers l’avant. Laisser chauffer dans l’air pendant 1 à 2 minutes.
REMARQUE : Les adhésifs cyanoacrylate guérissent rapidement (2 min) en réponse à l’humidité résiduelle et aux protéines tissulaires, et ils attacheront fermement le tissu au support du spécimen.
- Placez une fine couche de colle cyanoacrylate (superglue ou colle cyanoacrylate de qualité médicale/vétérinaire) sur le support du spécimen vers l’avant, de taille légèrement plus grande que le lobe de foie paré.
3. Production de tranches de foie
- Placez le support du spécimen avec le lobe de foie attaché dans le plateau tampon vibratome. Assurez-vous que le lobe du foie est entièrement recouvert de tampon.
REMARQUE : Si nécessaire, rechargez le niveau de solution tampon Krebs-Henseleit glacée. Si le niveau tampon obscurcit le processus de coupe, augmentez ou diminuez le niveau. - Réglez la vitesse de coupe.
REMARQUE : Cela peut devoir être déterminé empiriquement en fonction du modèle vibratome et des caractéristiques de la lame. En tant que guide de départ, utilisez une vitesse de 57 Hz/3 420 tr/min. La vitesse vibratome peut être mesurée à l’aide d’une application d’analyseur de spectre audio sur un smartphone. - Abaissez la lame de coupe jusqu’à ce qu’elle soit située juste au-dessus du lobe du foie à l’aide du cadran de hauteur. Exécuter le bras vibrant de coupe sur l’échantillon.
- Remettre la lame en arrière à l’aide de la poignée de manivelle à l’envers. Activer les vibrations tout en retournant la lame. Une fois la lame retournée et n’est pas au-dessus de l’échantillon, abaissez la hauteur de la lame de 250 m.
- Répétez le processus de coupe jusqu’à ce que le dessus du tissu soit enlevé. Jetez les premières tranches, car celles-ci contiendront la capsule de Glisson et ne contiennent donc pas beaucoup de tissu hépatique fonctionnel par rapport à d’autres tranches.
- Pour couper les tranches de foie, faites avancer lentement la lame vibrante dans le tissu en tournant la poignée. Utilisez un petit pinceau (désinfecté avec une solution d’éthanol à 70 %) pour guider doucement le tissu pendant le processus de coupe.
- Utilisez le pinceau pour soulever les tranches de tissu coupé et placer la tranche de tissu dans un tube stérile de tampon Krebs-Henseleit glacé. Lorsqu’il n’est pas utilisé, gardez ce tube sur la glace entre les tranches.
REMARQUE: Parfois, le tissu ne se déchire pendant le processus de coupe, mais pour la plupart des fins le tissu est encore utilisable. - Répétez le processus de coupe jusqu’à ce que la base du lobe du foie soit atteinte. Jetez les tranches de foie qui ont de la colle visible guérie.
REMARQUE : La colle guérie est visible sous forme de zones blanches sur les tranches de tissu. Un lobe typique du foie n’aura qu’une épaisseur utilisable d’environ 2 mm. Par conséquent, seulement environ huit tranches de foie de 250 m sont produites à partir de chaque lobe. - Couper les tranches de tissu jusqu’à ce que près de la colle cyanoacrylate. Ne pas couper dans la colle.
- Répétez le processus entier avec d’autres lobes de foie jusqu’à ce que le nombre requis de tranches de tissu soit obtenu.
- Pour nettoyer la colle et le tissu de cyanoacrylate guéris du support de spécimen, soit utilisez une lame pour gratter le mélange de colle/tissu guéri, soit ramollissez et nettoyez le mélange avec de l’acétone ou du sulfure de diméthyle.
4. Culture tissulaire
REMARQUE : Tous les travaux de culture tissulaire doivent être exécutés dans un capot de flux laminar stérile.
- Dans un capot de flux laminaire de culture tissulaire, pipette 1 ml de médium E de William contenant 2,0 g/L de glucose, 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM L-glutamine supplément, 100 U/mL pénicilline, et 100 'g/mL streptomycine en 12 plaques de culture de tissu bien.
REMARQUE : D’autres antibiotiques et agents antifongiques peuvent également être ajoutés. Certaines études ont utilisé des additifs dans le milieu d’incubation des tissus (c.-à-d. la dexaméthasone et l’insuline10),mais ceux-ci peuvent interférer avec la signalisation cellulaire. - Placez le tube contenant des tranches de foie de la glace dans le capot de la culture tissulaire. Pour enlever les tranches de tissu, faire tourbillonner doucement le mélange et verser délicatement dans un plat stérile de 10 cm tout en tourbillonnant.
- À l’aide de forceps stériles à pointes pointues et d’un scalpel, coupez les tranches de tissu en tailles à peu près uniformes (p. ex., 15 mm2).
REMARQUE : Cette étape est effectuée pour assurer une surface uniforme. Puisque les lobes de foie de souris sont sensiblement différents dans la taille et quelques tranches de tissu se déchireront, ceci produira une gamme de PCLS avec des secteurs variables de surface. La taille finale de la surface du PCLS dépend de la quantité de matière nécessaire dans les applications d’analyse ultérieures et du nombre de répliques nécessaires. Couper de gros PCLS en petits morceaux multiples de la même taille approximative permettra innée un nombre accru de répliques expérimentales. - À l’aide de forceps stériles ou d’un petit pinceau, transférer les tranches de tissu coupé dans les puits d’une plaque de 12 puits contenant 1 ml de milieu.
REMARQUE : Prenez soin de confirmer la consistance de l’épaisseur et de la forme des tranches de tissu. Les sections plus foncées que la moyenne suggèrent que l’épaisseur du tissu est plus grande et doit être jetée. Des tranches plus légères suggèrent la présence de colle cyanoacrylate guérie et doivent être jetées. - Incuber les tranches de foie à 37 oC et 5% de CO2 sous 95% d’humidité.
REMARQUE : D’autres groupes ont utilisé des méthodes pour améliorer la livraison d’oxygène aux PCLS, qui semblent prolonger le temps de survie des tissus6,10,11,12,13 (voir la section de discussion). - Le lendemain, changer le milieu de la culture à l’aide d’une pipette manuelle (plutôt que d’aspiration) pour prévenir la perte de tissu par des erreurs d’aspiration. Par la suite, changez le support sur le PCLS tous les jours. Les PCLS sont maintenant prêts pour une utilisation expérimentale.
5. Exemple d’application de PCLS
- À 16 h après la génération, traiter les PCLS avec trois acides biliaires différents : l’acide glycocholique (GCA), l’acide taurocholic (TCA) et l’acide cholique (CA) (comme sels de sodium, le tout à une concentration de 150 m) pendant 2 jours.
- Après 2 jours de traitement à l’acide biliaire, extraire l’ARNm en plaçant des tranches de tissu dans un tampon de lyse à ARN glacé et homogénéiser rapidement à l’aide de perles avec un homogénéisateur de perles(Tableau des matériaux).
- Purifier l’ARN à l’aide d’un kit d’isolationde l’ARN( Tableau des matériaux ) et créer l’ADNC à partir de l’ARN purifié.
- Effectuez une réaction quantitative en chaîne de polymérase(Tableau des matériaux) à l’aided’amorces spécifiques(tableau 1) sur l’ADNC pour examiner l’expression des gènes.
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Representative Results
Pour déterminer la viabilité cellulaire des PCLS au fil du temps, les niveaux d’ATP tissu ont été mesurés. Les niveaux d’ATP sont généralement proportionnels à la viabilité. PCLS (environ 15 mm2 dans la région) ont été cultivés dans le milieu normal de William E avec 10% FBS, puis à des points de temps spécifiques, les tranches de foie ont été enlevées de la culture tissulaire et homogénéisées avec des concentrations d’ATP et de protéines (pour la normalisation)(tableau des matériaux) étant mesurées (figure 1A). Pour les essais biochimiques comme celui-ci, la normalisation est importante, car les tranches de foie coupées ne sont pas nécessairement identiques en dimensions. Les niveaux d’ATP (par rapport aux protéines) ont été supprimés immédiatement après l’isolement et après 1 h(figure 1A), suggérant le stress métabolique à court terme des procédures de refroidissement et de coupe. Cependant, les niveaux d’ATP récupérés par 3 h. niveaux d’ATP sont restés élevés jusqu’à 5 jours de culture tissulaire, indiquant aucune diminution significative de la viabilité. La coloration d’hématoxyline et d’éosine (H et E) des tranches de foie a suggéré que la nécrose limitée de tissu (caractérisée par le pléomorphism nucléaire) ait eu lieu dans la culture d’environ les jours 2 et 3. Les niveaux de nécrose tissulaire ont progressé à sévère au jour 5(figure 1B). Compte tenu de ces données morphologiques, prises avec les résultats de l’ATP, il est recommandé d’utiliser ce modèle de tissu expérimental pour un jusqu’à 3 jours.
PCLS a également affiché l’accumulation croissante de collagène aux points de temps de culture postérieurs, comme le montre l’épaississement des fibres de collagène teintées de rouge Picro-sirius au jour 5(figure 2). Cet épaississement des fibres de collagène suggère que les processus fibrogéniques spontanés sont actifs dans pcLS obtenus en utilisant cette méthode. Ce processus semble indépendant de la méthodologie d’isolement de PCLS avec l’épaississement des fibres de collagène6 et expression profibrogenic de gène14 se produisant des trancheurs de vibratome et de tissu de Krumdieck, respectivement, au fil du temps. Le développement de ces processus fibrogéniques spontanés doit être pris en compte lors de l’interprétation de la biologie du PCLS, en particulier avec des expériences associées à des processus fibrotiques.
Nous avons déjà montré l’induction significative de cholangiocyte-spécifique gène connexin 43 (Cx43) et la sécrétion de transpeptidase glutamyl (Ggt1) protéine par TCA dans PCLS9. L’expression de gènes spécifiques au cholangiocyte par rapport aux contrôles d’entretien ménager (glycérydéhyde 3-phosphate déshydrogenase [Gapdh] et hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 [Hprt1]) dans PCLS traités avec TCA, GCA, ou CA ont été examinés par qPCR à l’aide d’amorces spécifiques. Conformément à un rapport précédent, une induction significative dans l’expression des gènes cholangiocytes-spécifiques cytokeratine 19 (CK19; Figure 3A) et connexin 43 (Cx43; La figure 3B) a été observée par GCA et TCA. L’expression de Ggt1 a été augmentée par les deux acides biliaires ; bien que, cela n’a pas atteint une signification statistique, peut-être en raison de la variation expérimentale(figure 3C). L’expression de CA n’a pas été affectée par n’importe quel acide biliaire. L’induction des gènes cholangiocytes-spécifiques suggère que GCA peut également être impliqué dans des dommages cholestatiques de foie, comme précédemment rapporté pour TCA8,9.
Figure 1 : Viabilité tissulaire des tranches de foie découpées de précision (PCLS). (A) Les niveaux d’ATP et de protéines dans les PCLS ont été mesurés immédiatement (T et 0) et à 1 h, 3 h, 6 h et 1 à 5 jours après l’isolement. (B) Pour examiner la morphologie cellulaire, les PCLS étaient fixes, paraffin-embedded, sectionnés, et tachés avec H et E immédiatement (jour 0) et à 1, 2, et 5 jours après l’isolement. Un test Kruskal-Wallis avec le test de comparaisons multiples de Dunn a été effectué par rapport à T 0. Toutes les données sont représentées comme moyennes ' SEM (n '2'3 souris) avec 'p 'lt; 0.05. Les barres d’échelle représentent 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Évaluation des dépôts de collagène dans le PCLS. Les PCLS étaient fixes, paraffin-embedded, sectionnés, et tachés avec Picro-Sirius Red pour visualiser les fibres de collagène aux jours 0, 1, 2, et 5 post-isolation. Les barres d’échelle représentent 200 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Les acides biliaires induisent l’expression de gène cholangiocyte-spécifique. À 16 h après l’isolement, le milieu sur pcLS a été changé, et le nouveau milieu a été ajouté avec 150 acides glycocholiques (GCA), taurocholic (TCA), ou acides cholic (CA) (sels de sodium). LES PCLS ont été récoltés après 2 jours, et l’expression de la cytokeratine 19 (CK19; A), connexin 43 (Cx43; B), et transpeptidase de glutamyl 1 (Ggt1; C) a été examiné par rapport à la moyenne géométrique de Gapdh et Hprt1. Le test de comparaisons multiples de Dunnett a été effectué par rapport aux tranches de tissu de contrôle non traitées (n - 15). Toutes les données sont représentées comme moyennes seM (n - 4 souris, tranches triplicate; p 'lt; 0,05, 'p 'lt; 0.01). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Tableau 1 : amorce qPCR.
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Discussion
Le protocole démontre l’application de l’isolement murine de PCLS et de la culture de tissu, et les procédures sont conçues pour évaluer la viabilité et l’utilité aussi bien que pour examiner des impacts des médiateurs exogènes de pathobiologie de foie utilisant des essais biochimiques, l’histologie, et qPCR. L’utilité expérimentale de la culture tissulaire PCLS chez les rongeurs et les humains a été démontrée dans un large éventail d’applications, y compris des investigations expérimentales dans microRNA15/RNA9/protein expression16, métabolisme17, dynamique d’infection virale10,18, infection signalant19, invasion de tumeur12, études de toxicité4,13,15,20, dommages d’ADN études21, biologie cellulaire14, et études de sécrétion9.
Tandis que les niveaux d’ATP indiquent la viabilité cellulaire dans PCLS jusqu’à 5 jours dans la culture, la coloration de H et E suggèrent que la nécrose grave se produisait par 5 jours dans la culture. Le principal facteur qui semble limiter la viabilité de PCLS est la disponibilité de l’oxygène6,11. Plusieurs études ont inclus une meilleure disponibilité en oxygène et, par conséquent, augmenté le temps de viabilité du PCLS dans la culture tissulaire. Les méthodes utilisées pour augmenter la disponibilité de l’oxygène comprennent l’incubation des tissus dans les atmosphères riches en oxygène10,11, l’utilisation de la perfusion perfluorodecalin12du porteur d’oxygène, secouant/roulant la culture pendant l’incubation6,10,13, et les plaques de culture tissulaire conçues pour maximiser l’oxygénation6.
Récemment, un système novateur de culture de tissu d’interface air-liquide a été décrit avec l’utilité fonctionnelle déclarée à plus de 7 jours dans la culture14. Ce protocole utilise l’oxygène atmosphérique ambiant dans un incubateur normal de culture tissulaire. La méthode permet aux PCLS d’être accessibles aux laboratoires qui n’ont pas d’équipement hautement spécialisé et personnalisé pour améliorer en toute sécurité la livraison d’oxygène. Cependant, si de telles méthodes pour améliorer la livraison d’oxygène sont disponibles, elles peuvent améliorer la viabilité à long terme de PCLS dans la culture.
L’accumulation de collagène dans pcLS après jour 3 dans la culture suggère que les processus fibrogéniques spontanés sont actifs dans ce modèle. La fibrose spontanée a également été observée précédemment dans PCLS6,14,22,23,24 et est probablement médiée par des modèles moléculaires endommagés (DAMP) libérés par le processus de coupe ou la nécrose tissulaire. DamP agissent comme des molécules de signalisation qui activent par la suite des voies de signalisation pro-fibrotiques25,26. En outre, la fibrose spontanée dans le PCLS pourrait être médiée par les chimiothérapeuines libérées de l’activation des cellules stellates et/ou des cellules Kupffer (c.-à-d. transformer le facteur de croissance bêta [TGF-MD]). Dans ce contexte, un article récent de Bigaeva et coll.24 suggère que la fibrose spontanée dans le PCLS est en partie médiatisée par la signalisation TGF-MD, comme incubation de PCLS avec l’inhibiteur de TGF Galunisertib inhibé les changements d’expression de gène associés à la fibrose hépatique spontanée. Un autre mécanisme possible est que la procédure de tranchage induit initialement des voies de signalisation de prolifération cellulaire et l’entrée des hépatocytes dans le cycle cellulaire ; cependant, ce mécanisme échoue et entraîne l’arrêt du cycle cellulaire dans la phase27mi-G1 . L’arrêt de cycle cellulaire est associé à la fibrose hépatique plutôt qu’à la régénération hépatique28.
Dans la procédure expérimentale représentative, les PCLS sont traités avec trois acides biliaires différents (GCA, TCA et CA) pendant 2 jours pour simuler des lésions hépatiques cholestatiques. Deux des acides biliaires (GCA et TCA) induisent l’expression significative de CK19 et Cx43, qui sont des gènes associés à la fonction de cholangiocyte. Ceci suggère l’expansion ou la différenciation des cellules vers une lignée de cholangiocyte dans PCLS traitées avec ces acides biliaires. Ceci est compatible avec notre travail précédent montrant un effet similaire utilisant TCA9 sur PCLS. En outre, il est également compatible avec les observations in vivo qui montrent l’alimentation taurocholate aux rats augmente les nombres de cholangiocyte29. Le traitement des tranches de tissu de foie avec des acides biliaires simule la cholestasis hépatique, et il est spéculé que l’augmentation de l’expression des gènes associés à la fonction de cholangiocyte est une tentative par le tissu de foie pour créer des ductules biliaires supplémentaires pour augmenter la sécrétion de bile. Étant donné l’induction spécifique de ces gènes est produite par les acides biliaires conjugués (GCA et TCA) mais pas le CA non soumis, on soupçonne que ces effets sont médiés par le récepteur de sphingosine-1-phosphate 2, un récepteur de surface cellulaire avec activation préférentielle par les acides biliaires conjugués30.
L’une des principales limites de l’application des PCLS est la variabilité individuelle de la reproduction. Puisque le foie n’est pas homogène et qu’il y a une variabilité dans la production, les tranches de foie ont tendance à avoir une plus grande variation biologique que l’expérimentation de culture cellulaire. Dans les études expérimentales avec peu de variables, telles que la procédure représentative démontrée ci-dessus, ceci est surmonté en utilisant un nombre accru de répliques. Cependant, cela peut devenir un problème pour les études de dépistage de plus grande envergure. En résumé, le protocole décrit est une méthode simple et fiable pour étudier les aspects de la pathobiologie hépatique ex vivo, nécessitant peu d’équipement spécialisé, sauf pour le vibratome.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par des subventions de recherche du National Health and Medical Research Council (NHMRC) d’Australie (Grant No. APP1048740 et APP1142394 à G.A.R.; APP1160323 à J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm est soutenu par une bourse de recherche senior du NHMRC d’Australie (Grant No. APP1061332). Manuel Fernandez-Rojo a été soutenu par le programme TALENTO de Madrid, Espagne (T1-BIO-1854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
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