Summary
このプロトコルは、マウスから実行可能な精密カット肝スライスを製造するための簡単で信頼性の高い方法を提供します。このエクスビボ組織サンプルは、ラボ組織培養条件下で複数回維持することができ、肝臓病理生物学を調べる柔軟なモデルを提供する。
Abstract
慢性肝疾患(ウイルス性肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患、代謝性肝疾患、肝臓がんなど)の根源となる肝障害、肝線維症、肝硬変のメカニズムを理解するには、実験的な操作が必要です。動物モデルとインビトロ細胞培養.両方の技術には、生体内操作のための多数の動物の要件などの制限があります。しかし、インビトロ細胞培養は多細胞性肝環境の構造や機能を再現しない。精密カット肝スライスの使用は、実験操作のために実験室組織培養で生き生きとしているマウス肝臓の均一なスライスを維持する技術である。この技術は、動物実験とインビトロ細胞培養法の間に存在する実験的ニッチを占めています。提示されたプロトコルは、マウスから精密カットされた肝臓スライスを分離し、培養するための簡単で信頼性の高い方法を記述しています。この技術の応用として、ex vivo肝スライスは胆汁酸で処理され、胆汁性肝損傷をシミュレートし、最終的には肝線維形成のメカニズムを評価する。
Introduction
ほとんどの慢性肝疾患の病因(すなわち、ウイルス性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、胆管内肝障害および肝臓癌)は、炎症、線維形成、および癌の発症を促進する複数の異なる肝細胞タイプ間の複雑な相互作用を伴う1、2。2これらの慢性肝系疾患の根底にある分子メカニズムを理解するためには、複数の肝細胞タイプ間の相互作用を調べる必要があります。複数の肝細胞株(そして最近ではオルガノイド)はインビトロで培養することができるが、これらのモデルは肝微小環境3の複雑な構造、機能、および細胞多様性を正確にエミュレートしない。さらに、培養した肝細胞(特に形質転換細胞株)は、元の発生源生物学から逸脱する可能性がある。動物モデルは、複数の肝細胞タイプ間の相互作用を調べる実験に使用される。しかし、それらは、肝外器官(例えば、潜在的な治療薬をテストするとき)の有意なオフターゲット効果のために、実験的操作の範囲が有意に減少する可能性がある。
組織培養における精密カット肝スライス(PCLS)の使用は、薬物代謝および毒性研究で最初に使用される実験的技術であり、生き生きと超薄(厚さ約100〜250μm)の肝臓スライスの切断を含む。これは、肝臓組織ex vivo4の直接実験的操作を可能にする。この技術は、生体内動物実験とインビトロ細胞培養法との間の実験的なギャップを埋め、両方の方法の多くの欠点(すなわち、全動物で行うことができる実験の範囲の実用的な限界、ならびにインビトロ細胞培養法による構造/機能および細胞多様性の喪失)を克服する。
さらに、PCLSは、動物実験全体に比べて実験能力を大幅に増加させます。1つのマウスは48以上の肝臓スライスを産生することができるので、これはまた同じ肝臓からの対照群および処置群の両方の使用を促進する。さらに, この技術は、物理的に他の臓器系から肝臓組織を分離します;;したがって、外因性刺激の影響をテストする際に動物全体で起こり得る潜在的なオフターゲット効果を除去する。
このプロトコルでは、PCLSは横振動ブレードを備えたビブラートメを使用して生成されます。他の研究は、正常にクリンガとシュパン5に記載されているように、クルミエック組織スライサーを使用しています。ビブラートメでは、ブレードの横振動は、ブレードが組織に押し込まれるように、せん断応力によって引き起こされる超薄組織の引き裂きを防ぎます。ビブラートームとクルミエック組織スライサーの両方が肝臓組織の構造的な埋め込みなしで効果的に働き、スライス手順を合理化する。この技術はまた、疾患を有する肝臓からPCLSを作成するために使用することができる、 線維症/肝硬変6および肝性ステアトーシス7のマウスモデルからのものを含む。
PCLSの調製および組織培養に必要な技術を実証することに加えて、この報告書は、アデノシン三リン酸(ATP)レベルを測定し、壊死および線維症を評価するために組織組織組織を調べることによって、これらの生体組織の生存率を調べる。代表的な実験手順として、PCLSは、胆汁性肝損傷をシミュレートするために、3つの異なる胆汁酸(グリコリック、タウロコリック、および胆汁酸)の病態生理学的濃度で処理される。胆汁性肝障害の文脈において、特にタウロコリン酸は、嚢胞性線維症関連肝疾患8を有する小児の血清および胆汁の両方において有意に増加することが示されている。
肝臓前駆細胞は、患者において観察されたタウロチョル酸レベルの上昇をシミュレートするためにタウロチョル酸でインビトロで治療されており、この治療は胆管(胆管支面)表現型9に対する肝前駆細胞の増殖および分化の増加を引き起こした。続いて、PCLSは、タウロチョル酸の上昇したレベルでex vivoを処理し、コリンギオサイトマーカーの増加が観察された。これは、タウロチョル酸が小児嚢胞性線維症関連肝疾患の文脈における胆道増殖および/または分化を駆動するというインビトロ観察を支持する9。
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Protocol
すべての動物実験は、機関動物倫理委員会の承認を得て、QIMRベルクホーファー医学研究所で科学的目的のための動物のケアと使用のためのオーストラリアのコードに従って行われました。雄のC57BL/6マウス(生後15~20週齢)は、オーストラリアのワシントン州動物資源センターから得られた。
注:サンプルに接触するすべてのソリューション、メディア、器具、ハードウェア、チューブは、70%エタノール溶液で滅菌または徹底的に消毒し、培養汚染のリスクを最小限に抑えるために滅菌技術を使用して処理する必要があります。
1. ビブラートのセットアップ
- 2 g/L グルコース (材料表) で滅菌クレブス-ヘンセレイト バッファー溶液を準備します。バッファーの pH が 7.4 であることを確認します。pHが高い場合は、カルボーゲン(95%O2+5%CO2)で緩衝液2を飽和させるか、5%CO2組織培養2インキュベーター内でインキュベートして重炭酸塩緩衝システムを補正する。2密閉された滅菌緩衝液を4°Cで冷蔵する。
- ビブラートメブレードを切断アームに挿入します。振動によってブレードが緩む可能性がありますので、ブレードが切断アームにしっかりと固定されていることを確認してください。
- 刃と切断アームを70%エタノール溶液で消毒します。
注意: ブレードとの接触を避けてください。 - 70%エタノール溶液でバッファートレイを消毒し、滅菌組織で拭きます。
- ビブラートメにバッファトレイを挿入し、取り付け機構を締めます。
- 切断アームを最大の高さに設定します。
- ブレードの角度を水平方向の 10° 下に設定し、下方に傾斜してサンプルに傾斜します。ブレードの角度がしっかりと固定されていることを確認します。
メモ:最適なブレードの角度は、ビブラートメモデルや組織特性によって異なる場合があります。 - 70%エタノール溶液で検体ホルダーを消毒します。
- バッファートレイの下にあるペルチェ熱電冷却器の冷却水を接続します。
注:一部のビブラートメモデルは、代わりに冷却のために氷浴を使用します。 - 水抜きチューブを排水管に固定し、水をオンにします。クーラーを4°Cに設定します。冷却水を>400 mL/minの速度で実行します。
- バッファートレイを滅菌氷冷クレブス-ヘンセリートバッファー(2 g/L グルコース)でほぼ上部に充填します。追加のクレブス-ヘンセレイトバッファー溶液を氷の上に残します。
2. 肝臓の除去と準備
- 曲面鉗子、平らな四角先端鉗子、ピンセット、外科用クランプおよびオートクレーブを使用してはさみを含むすべての外科器具を殺菌または消毒する。
- 肝臓除去の前に、100mg/kgケタミンおよび12.5mg/kgキシラジンの腹腔内注射を使用してマウスを深く麻酔する。
注:他の麻酔薬を使用することも、低酸素症による損傷を防ぐために肝臓を迅速に除去すると、マウスはCO2窒息/子宮頸部脱臼によって安楽死させることができます。 - 70%エタノール溶液で濡らしてマウスの皮膚表面を消毒する。すべての四肢を解剖板に固定して、背中にマウスを固定します。
- 腹腔の基部から横隔膜のすぐ上まで、皮膚に垂直中線切開を行います。
注:四肢に向かって切開すると、皮膚の引き込みを容易にします。 - 皮膚と腹腔の間の結合組織を切断しながら、皮膚を引き戻します。毛髪が腹腔にできるだけ転移しないようにします。腹腔から皮膚を固定またはクランプします。
- 清潔な鉗子とはさみを使用して、腹腔および下部胸腔を開く。
- 葉を傷つけることなく、迅速に肝臓を除去
- 鈍いツール(例えば、平らな四角先端鉗子)を使用して、上部の肝臓葉を腹部に向かって下向きに導く。はさみを使用して上の肝臓の葉を囲む結合組織を切断します。
- 肝臓の葉を横隔膜に向かって上向きに導く。鉗子で肝臓の中央の血管束を保持します。
注:中央の血管束が損傷している場合、それは手順に影響を与えない。 - マウスから中央の血管束を引き離し、残りの結合組織、血管などを切断して肝臓を取り除きます。1)肝臓の葉を損傷しないように注意し、2)胃腸管に切り込み、これは微生物で肝臓を汚染する可能性があります。
- 取り出した肝臓を、氷冷クレブス-ヘンセレイト緩衝液で半分充填された無菌10cm組織培養皿に入れます。鈍い器具を使って葉を導き、肝臓の中心を切って別々の葉に分ける。
- 1つの肝臓葉を選択し(最初に最大のものを使用してください)、新しい無菌10cm皿の上に平らな側面を置きます。その後の使用のために氷の上に保存クレブス-ヘンセレイトバッファー溶液の皿に他のすべての肝臓の葉を保ちます.
- 平らに横たわっている間、肝臓葉の最も高い縁から材料の約10%をトリミングします。
注:このティッシュエッジは最初に切断刃に接触するので、トリミングは重要です。したがって、切断刃に比較的垂直な組織エッジは、切断されていない肝臓葉の浅い角度のために起こり得る組織の圧縮を防ぐ。 - 他の3つの組織エッジをトリミングします。
注:これは繊維状グリッソンのカプセルの一部を除去し、組織スライスの分離を容易にします。 - 肝臓葉を検体ホルダーに取り付ける
- シアノアクリレート接着剤(スーパーグルーまたは医療グレードシアノアクリレート接着剤)の薄い層を、トリミングされた肝臓の葉よりもわずかに大きいサイズの前部に向かって標本ホルダーに置きます。
注:シアノクリレート接着剤にシアンノクリレート以外の添加物が含まれていないことを確認してください。 - 切断端から離れた隅を使用して無菌鉗子で肝臓葉をそっと拾い、無菌吸収物質を使用して肝臓ローブの平らな側から残留バッファーを軽く乾燥させます。
- 肝ローブの大きな平らな側をシアノアクリル酸接着剤パッチの上に置き、最大の端を前面に向かせます。空気中で1〜2分間硬化します。
注:シアノアクリル酸接着剤は、残留水分や組織タンパク質に反応してすぐに(〜2分)硬化し、組織を検体ホルダーにしっかりと取り付けます。
- シアノアクリレート接着剤(スーパーグルーまたは医療グレードシアノアクリレート接着剤)の薄い層を、トリミングされた肝臓の葉よりもわずかに大きいサイズの前部に向かって標本ホルダーに置きます。
3. 肝臓スライスの製造
- 付属の肝臓ローブを持つ検体ホルダーをビブラートメバッファートレイに入れます。肝臓の葉が完全に緩衝液で覆われていることを確認してください。
注:必要に応じて、氷冷クレブス-ヘンセレイトバッファーソリューションのレベルを上げなさい。バッファレベルが切断プロセスを覆い隠す場合は、レベルを増減します。 - 切削速度を設定します。
メモ:ビブラートメモデルやブレードの特性に応じて、経験的に決定する必要があります。開始ガイドとして、57 Hz/3,420 rpm の速度を使用してください。ビブラートの速度は、スマートフォン上のオーディオスペクトラムアナライザアプリケーションを使用して測定することができます。 - 高さのダイヤルを使用して肝臓の葉のすぐ上に位置するまで、切断ブレードを下げます。振動する切断アームをサンプルの上に実行します。
- 逆にクランクハンドルを使用してブレードを戻します。ブレードを戻しながら振動を作動させます。ブレードが戻ってきてサンプルを上回らない場合は、ブレードの高さを250μm下げます。
- 組織の上部が取り除かれるまで切断プロセスを繰り返します。これらはグリソンのカプセルを含むので、他のスライスと比較して多くの機能的な肝臓組織を含んでいないので、最初の1つまたは2つのスライスを捨てます。
- 肝臓のスライスを切断するには、ハンドルを回すことによってゆっくりと振動ブレードを組織に進めます。小さな絵筆(70%エタノール溶液で解毒)を使用して、切断プロセス中に組織を穏やかに導きます。
- ペイントブラシを使用して切断されたティッシュのスライスを持ち上げ、氷冷クレブス-ヘンセレイトバッファーの無菌チューブにティッシュスライスを置く。使用しない場合は、スライスの間に氷の上にこのチューブを保管してください。
注:切断プロセス中に組織が裂ける場合がありますが、ほとんどの目的で組織はまだ使用できます。 - 肝臓葉の基部に到達するまで切断プロセスを繰り返します.目に見える硬化した接着剤を持つ肝臓スライスを破棄します。
注:硬化した接着剤は、組織スライス上の白い領域として表示されます。典型的な肝臓の葉は約2mmの使用可能な厚さしか持たない。したがって、各ローブから約8つの250μmの肝スライスのみが生成されます。 - シアノクリレート接着剤の近くまで組織スライスを切ります。接着剤に切り込みないでください。
- 必要な数の組織スライスが得られるまで、他の肝臓葉で全体のプロセスを繰り返します。
- 硬化したシアノアクリレート接着剤と組織を標本ホルダーから洗浄するには、ブレードを使用して硬化した接着剤/組織混合物を削り取るか、アセトンまたはジメチルスルホキシドで混合物を柔らかくして洗浄します。
4. 組織培養
注:すべての組織培養作業は、滅菌層流れフードで行う必要があります。
- 組織培養層流フードでは、2.0 g/Lグルコース、10%ウシ胎児血清(FBS)、2 mM L-グルタミンサプリメント、100 U/mLペニシリン、100μg/mLレンサプマイシンを含むウィリアムのE培地のピペット1mLを12ウェル組織培養プレートに入れる。
注:他の抗生物質および抗真菌剤も添加することができる。いくつかの研究は、組織インキュベーション培地(すなわち、デキサメタゾンおよびインスリン10)に添加剤を使用しているが、これらは細胞シグナル伝達を妨げる可能性がある。 - 肝臓のスライスを含むチューブを氷から組織培養フードに入れる。組織スライスを取り除くために、混合物をそっと渦巻き、渦巻きながら滅菌10cm皿にそっとチップします。
- 滅菌された鋭利な鉗子とメスを使用して、組織スライスをほぼ均一なサイズ(例えば、15mm2)に切2る。
注: この手順は、一貫した表面積を確保するために実行されます。マウスの肝臓葉はサイズが大きく異なり、一部の組織スライスが裂けるため、これは様々な表面積を持つPCLSの範囲を生成します。PCLS の最終的な表面積サイズは、後続の解析アプリケーションで必要な材料の量と必要な反復の数によって異なります。大きなPCLSを同じおおよその大きさのより小さい複数の部分に切り分けると、自然に実験反復の数が増える。 - 滅菌鉗子または小さい絵筆を使用して、切断されたティッシュスライスを1mLの媒体を含む12の井戸の版の井戸に移す。
注:ティッシュスライスの厚さと形状の一貫性を確認するように注意してください。平均よりも暗いセクションは、組織の厚さが大きく、廃棄する必要があることを示唆しています。軽いスライスは、硬化シアノクリレート接着剤の存在を示唆し、廃棄する必要があります。 - 肝臓スライスを湿度95%以下で37°C、5%CO2でインキュベートします。2
,注:他のグループは、組織の生存時間,6、10、11、12、1310,11を延長するように見えるPCLSへの酸素供給を強化する方法を使用しています(説明セクションを参照)。61213 - 翌日、吸引誤差による組織の損失を防ぐために、手動ピペット(吸引ではなく)を使用して培養培地を変更します。続いて、PCLS上の媒体を毎日変更します。PCLS は、実験用に準備が整いました。
5. PCLSの応用例
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Representative Results
時間の経過に関するPCLSの細胞生存率を決定するために、組織ATPレベルを測定した。ATP レベルは、通常、実行可能性に比例します。PCLS(面積約15mm2)を10%FBSで通常のウィリアムのE培地で培養し、次いで特定の時点で、肝臓スライスを組織培養から除去し、ATPおよびタンパク質(正規化用)濃度(材料表)の両方を測定して均質化した(図1A)。このような生化学的アッセイの場合、カットされた肝臓スライスは必ずしも寸法が同一ではないため、正規化が重要です。ATPレベル(タンパク質に対して)は、単離後に直ちに抑制され、1時間後(図1A)、冷却および切断手順からの短期的な代謝ストレスを示唆した。しかし、ATPレベルは3h.ATPレベルで回復し、組織培養の最大5日間で上昇したままであり、生存率の有意な減少を示さなかった。肝臓の断片のヘマトキシリンとエオシン(H&E)染色は、2日目と3日目頃の培養で限られた組織壊死(核多形を特徴とする)が生じたことを示唆した。組織壊死レベルは5日目までに重症に進行した(図1B)。これらの形態学的データを考慮すると、ATPの結果と一緒に、この実験組織モデルを最大3日間使用することが推奨される。
PCLSはまた、5日目にピクロシリウス赤染色コラーゲン線維の増粘によって示されるように、後の培養時にコラーゲン蓄積の増加を示した(図2)。このコラーゲン線維の肥厚は、この方法を用いて得られたPCLSにおいて自発的な線維形成過程が活発であることを示唆している。このプロセスは、経時的に、ビブラードームおよびクルミディエック組織スライサーの両方から生じるコラーゲン線維6およびプロ線維原性遺伝子発現14の肥厚を伴うPCLS単離方法論とは無関係に現れる。これらの自発的な線維形成過程の開発は、特に線維化プロセスに関連する実験でPCLS生物学を解釈する際に考慮される必要がある。
我々は、以前に、コネキシン43(Cx43)およびPCLS9におけるTCAによるグルタミルトランスペプチダーゼ(Ggt1)タンパク質の分泌の有意な誘導を示した。TCA、GCA、またはCAで処理したPCLSにおけるハウスキーピングコントロール(グリセアルデヒド3リン酸脱水素酵素[Gapdh]およびヒポキサンチンリン酸化酵素1[Hprt1])に対するコリンギオサイト特異的遺伝子の発現を、特定のプライマーを用いてqPCRにより検討した。以前の報告と一致して、コランギオサイト特異的遺伝子サイトケラチン19(CK19;図 3A) とコネキシン 43 (Cx43;図3B)はGCAとTCAの両方で観察した。Ggt1発現は両方の胆汁酸によって増加した。しかし、これは、おそらく実験的変動のために統計的有意性に達しなかった(図3C)。CAの発現は胆汁酸の影響を受けなかった。胆管球特異的遺伝子の誘導は、TCA8,,9について以前に報告されたように、GCAが胆管性肝障害にも関与する可能性があることを示唆している。
図1:精密カット肝スライス(PCLS)の組織生存率。(A)PCLSのATPおよびタンパク質レベルを直ちに(T+0)、1時間、3時間、6時間、および1-5日で測定した。A(B)細胞形態を調べるために、PCLSを固定し、パラフィンを埋め込み、切除し、H&Eで直ちに(0日目)、1、2、および5日後に染色した。ダンの多重比較テストを伴うクルスカル・ウォリス検定は、T + 0に対して行われました。すべてのデータは、平均値±SEM(n = 2-3マウス)で、*p<0.05で表されます。スケールバーは100 μmを表します。
図2:PCLSにおけるコラーゲン沈着の評価PCLSを固定し、パラフィンを埋め込み、切除し、ピクロシリウスレッドで染色し、0日目、1日目、2日目、5日目の分離時にコラーゲン線維を可視化した。スケールバーは200 μmを表します。
図3:胆汁酸は、胆管球特異的な遺伝子発現を誘導する。16時間の後分離時に、PCLS上の培地を交換し、新しい培地を150 μMグリココール(GCA)、タウロコリック(TCA)、またはコール(CA)酸(ナトリウム塩)と共に添加した。PCLSは2日後に収穫し、サイトケラチン19(CK19;)A)コネキシン 43 (Cx43;B)、およびγ-グルタミルトランスペプチダーゼ1(Ggt1;C)は、ガプドとHprt1の幾何学的平均に対して調べた。ダネットの多重比較試験は、未処理の対照組織スライス(n=15)に対して行った。すべてのデータは平均値±SEM(n = 4匹のマウス、三重スライス、*p<0.05、**p<0.01)として表されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表1:qPCRプライマー。
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Discussion
このプロトコルは、マウスPCLSの分離および組織培養の適用を実証し、この手順は、生化学的アッセイ、組織学、およびqPCRを使用して、肝病理生物学の外因性メディエーターの影響を評価するとともに、生存率と有用性の両方を評価するように設計されています。齧歯類およびヒトにおけるPCLS組織培養の実験的有用性は、microRNA 15 /RNA9/タンパク発現16、代謝17、ウイルス感染15ダイナミクス10、18、感染シグナル伝達19、腫瘍浸潤,1812、毒性研究104,4、13、15、20、DNA,15,20損傷の実験研究を含む幅広い用途で実証されている研究 21, 細胞生物学14, 分泌研究9.
ATPレベルは培養で5日間までのPCLSにおける細胞の生存率を示すが、H&E染色は培養中に5日までに重度の壊死が起こっていることを示唆している。PCLS の実行可能性を制限するように見える主な要因は酸素の可用性6,,11です。いくつかの研究は、強化された酸素の可用性を含み、その結果、組織培養におけるPCLSの生存率を増加しました.酸素の利用可能性を高めるために使用される方法としては、酸素が豊富な雰囲気中の組織のインキュベーションが挙げられる10,11、,11酸素キャリア灌流灌流パーフルオロデカリン12の使用、培養中の培養物の揺れ/転動6、10、13、10,13および酸素化を最大化するように設計された組織培養プレート6。
近年、革新的な空気液体界面組織培養システムが、培養14において7日以上に記載された機能的有用性を有して説明されている。このプロトコルは、正常な組織培養インキュベーターで周囲の大気酸素を使用します。この方法により、PCLSは、高度に特殊化されたカスタム機器を持たない研究所が安全に酸素供給を強化することができます。しかし、酸素供給を増強するそのような方法が利用可能であれば、それらは培養における長期PCLSの生存率を向上させる可能性がある。
培養3日目以降のPCLSにおけるコラーゲンの蓄積は、このモデル内で自発的な線維形成過程が活発であることを示唆している。自発的線維症は、PCLS6、14、22、23、2414,22,23でも以前に観察されており、24切断プロセスまたは組織壊死によって放出される損傷関連分子パターン(DAMP)によって媒介される可能性がある。6DAMPは、その後、25,26の線維性シグナル伝達経路を25,26活性化するシグナル伝達分子として機能する。さらに、PCLSにおける自発的線維化は、ステレート細胞および/またはクファー細胞の活性化から放出されるケモカイン(すなわち、成長因子β[TGF-β]の変換)によって媒介され得る。この文脈において、ビガエバら24の最近の記事は、PCLSにおける自発的線維化がTGF-βシグナル伝達によって媒介される部分であり、TGF-β阻害剤ガルニサチブによるPCLSのインキュベーションが自発的肝線維症に関連する遺伝子発現変化を阻害したことを示唆している。もう一つの可能なメカニズムは、スライス手順が最初に細胞増殖シグナル伝達経路を誘導し、細胞周期への肝細胞の侵入である。しかし、このメカニズムは失敗し、結果は、中間G1フェーズ27で細胞周期停止を生じる。細胞周期停止は、肝再生ではなく肝線維症に関連する28.
代表的な実験手順では、PCLSは、胆汁性肝損傷をシミュレートするために、3つの異なる胆汁酸(GCA、TCA、およびCA)で2日間処理される。胆汁酸(GCAおよびTCA)の2つは、胆管球機能に関連する遺伝子であるCK19およびCx43の有意な発現を誘導する。これは、これらの胆汁酸で処理されたPCLSにおける胆管球系統に対する細胞の拡張または分化を示唆している。これは、PCLS で TCA9を使用して同様の効果を示す以前の作業と一致しています。さらに、ラットへのタウロコレートの供給が29の胆管球数を増加させることを示すインビボ観察とも一致している。胆汁酸による肝組織スライスの治療は肝胆汁質をシミュレートし、胆管機能に関連する遺伝子の発現の増加は、胆汁分泌を増加させる追加の胆管を作り出そうとする肝臓組織の試みであると推測される。これらの遺伝子の特異的誘導は共役胆汁酸(GCAおよびTCA)によって産生されるが、非共役CAでは得られないことを考えると、これらの作用はスフィンゴシン-1-リン酸受容体2によって媒介されることが疑われる、共役胆汁酸30による優等活性化を有する細胞表面受容体である。
PCLSの適用の重要な制限の1つは、個々の複製変動である。肝臓は均質ではなく、生産にばらつきがあるため、肝臓スライスは細胞培養実験よりも生物学的変異が大きくなる傾向がある。上記の代表的な手順など、変数の少ない実験的研究では、反復数の増加を使用することで克服されます。しかし、これはより大きなスクリーニング研究の問題になる可能性があります。要約すると、記載されたプロトコルは、ビブラートを除いてほとんど特殊な装置を必要とせず、肝臓病理生物学ex vivoの側面を研究するための簡単で信頼性の高い方法です。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、オーストラリアの国家保健医療研究評議会(NHMRC)からの研究助成金(グラントNo.)APP1048740およびAPP1142394からG.A.R.へ;APP1160323 から J.E.E.T.、J.K.O.、G.A.R.へ。グラント・A・ラムは、オーストラリアのNHMRC(グラントNo.)のシニア・リサーチ・フェローシップによってサポートされています。APP1061332)。マヌエル・フェルナンデス=ロホは、スペインのマドリード(T1-BIO-1854)のTALENTOプログラムによってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
- Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).
- Ouchi, R., et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).
- Vickers, A. E., Fisher, R. L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).
- Olinga, P., Schuppan, D. Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo. Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).
- Paish, H. L., et al. A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
- Prins, G. H., et al. A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices. Nutrients. 11 (3), 507 (2019).
- Ramm, G. A., et al. Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment. Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).
- Pozniak, K. N., et al. Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease. The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).
- Clouzeau-Girard, H., et al. Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices. Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).
- Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Granitzny, A., et al. Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound. Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).
- Wu, X., et al. Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform. Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).
- Zarybnicky, T., et al. Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).
- van de Bovenkamp, M., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).
- Buettner, R., et al. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system. Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).
- Lagaye, S., et al. Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model. World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).
- Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).
- Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro. Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).
- Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro. Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).
- Guyot, C., et al. Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices. Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).
- Bigaeva, E., et al. Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices. Biochim Biophys Acta - Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).
- Kiziltas, S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases. World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).
- Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 58 (5), 704-720 (2009).
- Finot, F., et al. Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices. International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).
- Marshall, A., et al. Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).
- Alpini, G., et al. Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes. Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).
- Studer, E., et al. Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes. Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).
