Summary
Denne protokollen gir en enkel og pålitelig metode for produksjon av levedyktige presisjonskuttede leverskiver fra mus. Ex vivo vevsprøvene kan opprettholdes under laboratorievevskulturforhold i flere dager, noe som gir en fleksibel modell for å undersøke leverens patolog.
Abstract
Forstå mekanismene for leverskade, leverfibrose, og skrumplever som ligger til grunn for kroniske leversykdommer (dvs. viral hepatitt, alkoholfri fettleversykdom, metabolsk leversykdom, og leverkreft) krever eksperimentell manipulering av dyremodeller og in vitro cellekulturer. Begge teknikkene har begrensninger, for eksempel kravet om et stort antall dyr for in vivo manipulasjon. Imidlertid gjengir ikke in vitro cellekulturer strukturen og funksjonen til det flercellulære levermiljøet. Bruken av presisjonskuttede leverskiver er en teknikk der ensartede skiver av levedyktig muselever opprettholdes i laboratorievevskulturen for eksperimentell manipulasjon. Denne teknikken opptar en eksperimentell nisje som eksisterer mellom dyrestudier og in vitro cellekulturmetoder. Den presenterte protokollen beskriver en enkel og pålitelig metode for å isolere og kultur presisjonskuttede leverskiver fra mus. Som en anvendelse av denne teknikken behandles ex vivo leverskiver med gallesyrer for å simulere kolestatisk leverskade og til slutt vurdere mekanismene for leverfibrogenese.
Introduction
Patogenesen av de fleste kroniske leversykdommer (dvs. viral hepatitt, alkoholfri steatohepatitt, kolestatisk leverskade og leverkreft) innebærer komplekse interaksjoner mellom flere forskjellige levercelletyper som driver betennelse, fibrogenese og kreftutvikling1,2. For å forstå de molekylære mekanismene som ligger til grunn for disse kroniske leverbaserte sykdommene, må interaksjonene mellom flere levercelletyper undersøkes. Mens flere levercellelinjer (og mer nylig, organoider) kan dyrkes in vitro, etterligner disse modellene ikke nøyaktig den komplekse strukturen, funksjonen og cellulær mangfoldet i det hepatiske mikromiljøet3. Videre kan kultiverte leverceller (spesielt transformerte cellelinjer) avvike fra deres opprinnelige kildebiologi. Dyremodeller brukes eksperimentelt for å undersøke interaksjonene mellom flere levercelletyper. Imidlertid kan de bli betydelig redusert i omfang for eksperimentell manipulasjon, på grunn av betydelige off-target effekter i ekstrahepatiske organer (f.eks når du tester potensielle terapeutiske midler).
Bruken av presisjonskuttede leverskiver (PCLS) i vevskultur er en eksperimentell teknikk som først brukes i stoffskifte- og toksisitetsstudier, og det innebærer kutting av levedyktige, ultratynne (rundt 100–250 μm tykke) leverskiver. Dette tillater direkte eksperimentell manipulering av levervev ex vivo4. Teknikken bygger bro over et eksperimentelt gap mellom in vivo dyrestudier og in vitro cellekulturmetoder, overvinne mange ulemper med begge metodene (dvs. praktiske grenser på utvalget av eksperimenter som kan utføres i hele dyr, samt tap av struktur / funksjon og cellulært mangfold med in vitro cellekulturmetoder).
Videre øker PCLS i stor grad eksperimentell kapasitet sammenlignet med hele dyrestudier. Som en mus kan produsere mer enn 48 leverskiver, Dette letter også bruk av både kontroll og behandlingsgrupper fra samme lever. I tillegg skiller teknikken fysisk levervevet fra andre organsystemer; derfor fjerner det potensielle off-target effekter som kan oppstå hos hele dyr når du tester effekten av eksogene stimuli.
I denne protokollen genereres PCLS ved hjelp av en vibratome med et lateralt vibrerende blad. Andre studier har med hell brukt en Krumdieck vev slicer, som beskrevet i Olinga og Schuppan5. I vibratomen forhindrer sidevibrasjon av bladet å rive ultratynt vev forårsaket av skjærstress, da bladet skyves inn i vevet. Både vibratome og Krumdieck vev slicer fungerer effektivt uten strukturell innebygging av levervev, som effektiviserer kutting prosedyren. Denne teknikken kan også brukes til å lage PCLS fra syke lever, inkludert de fra musemodeller av fibrose / skrumplever6 og hepatisk steatose7.
I tillegg til å demonstrere teknikkene som kreves for forberedelse og vevkultur av PCLS, undersøker denne rapporten også levedyktigheten til disse ex vivo vev ved å måle adenosin trifosfat (ATP) nivåer og undersøke vev histologi for å vurdere nekrose og fibrose. Som en representativ eksperimentell prosedyre behandles PCLS med patofysiologiske konsentrasjoner av tre forskjellige gallesyrer (glycocholic, taurocholic, and cholic acids) for å simulere kolestatisk leverskade. I sammenheng med kolestatisk leverskade har taurocholic syre spesielt vist seg å være betydelig økt i både serum og galle av barn med cystisk fibrose-assosiert leversykdom8.
Leverstamceller har også blitt behandlet in vitro med taurocholic syre for å simulere forhøyede taurocholic syre nivåer observert hos pasienter, og denne behandlingen forårsaket økt spredning og differensiering av leverstamceller mot en galiær (cholangiocyte) fenotype9. Deretter ble PCLS behandlet ex vivo med forhøyede nivåer av taurocholic syre, og økt cholangiocyte markører ble observert. Dette støtter in vitro observasjon at taurocholic syre driver biliær spredning og / eller differensiering i sammenheng med pediatrisk cystisk fibrose-assosiert leversykdom9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med den australske koden for omsorg og bruk av dyr til vitenskapelige formål ved QIMR Berghofer Medical Research Institute med godkjenning fra instituttets dyreetikkkomité. Hann C57BL/6 mus (15–20 uker gammel) ble hentet fra Animal Resources Centre, WA, Australia.
MERK: Alle løsninger, medier, instrumenter, maskinvare og rør som kontakter prøvene må steriliseres eller desinfiseres grundig med en 70% etanolløsning og håndteres ved hjelp av sterile teknikker for å minimere risikoen for kulturforurensning.
1. Oppsett av vibratome
- Forbered steril krebs-henseleit bufferløsning med 2 g/l glukose (Materialtabellen). Kontroller at pH-en på bufferen er 7,4. Hvis pH er høyere, mette bufferen med karboogen (95% O2 + 5% CO2) eller inkubere innenfor en 5% CO2 vev kultur inkubator for å korrigere bikarbonat bufring system. Oppbevar den forseglede sterile bufferoppløsningen ved 4 °C.
- Sett vibratomebladet inn i skjærearmen. Pass på at bladet er godt festet til skjærearmen, da vibrasjoner kan føre til at bladet løsner.
- Desinfiser bladet og skjærearmen med en 70% etanolløsning.
FORSIKTIG: Unngå kontakt med bladet. - Desinfiser bufferbrettet med en 70% etanolløsning og tørk det med et sterilt vev.
- Sett bufferskuffen inn i vibratomen og stram monteringsmekanismen.
- Sett skjærearmen til maksimal tilgjengelig høyde.
- Sett bladvinkelen til 10° under horisontal, skrånende nedover til prøven. Kontroller at bladvinkelen er godt festet.
MERK: Den optimale bladvinkelen kan variere avhengig av vibratomemodellen og vevsegenskapene. - Desinfiser prøveholderen med en 70% etanolløsning.
- Koble kjølevannet til peltier termoelektrisk kjøler som ligger under bufferskuffen.
MERK: Noen vibratome modeller bruker et isbad for kjøling i stedet. - Fest vann-ut røret til et avløp og slå på vannet. Sett kjøleren til 4 °C. Kjør kjølevann med en hastighet på >400 ml/min.
- Fyll bufferbrettet nesten til toppen med steril iskald Krebs-Henseleit buffer (med 2 g/l glukose). La ekstra Krebs-Henseleit bufferløsning på isen.
2. Leverfjerning og forberedelse
- Steriliser eller desinfisere alle kirurgiske instrumenter, inkludert buede tang, flate firkantede tang, pinsett, kirurgiske klemmer og saks ved hjelp av autoklaving.
- Før leverfjerning, dypt bedøve mus ved hjelp av en intraperitoneal injeksjon på 100 mg/ kg ketamin og 12,5 mg / kg xylazine.
MERK: Andre bedøvelsesmiddel kan brukes, eller mus kan euthanized av CO2 kvelning / cervical dislokasjon hvis leveren raskt fjernes for å forhindre hypoksi-indusert skade. - Desinfiser hudflater på mus ved å fukte med en 70% etanolløsning. Sikre mus på ryggen med alle ekstremiteter festet til et dissekerebrett.
- Lag et vertikalt midtlinjesnitt i huden fra bunnen av bukhulen til like over membranen.
MERK: Snitt mot ekstremitetene er laget for å lette tilbaketrekkingen av huden. - Trekk huden tilbake mens du kutter bindevev mellom huden og bukhulen. Forhindre at håret overføres til bukhulen så mye som mulig. Pin eller klemme huden bort fra bukhulen.
- Ved hjelp av rene tang og saks, åpne bukhulen og nedre thorax hulrom.
- Fjerne leveren raskt uten å skade flikene
- Ved hjelp av stumpe verktøy (f.eks. flate firkantede tang), før øvre leverfliker nedover mot magen. Klipp bindevevet rundt øvre leverfliker ved hjelp av saks.
- Før leverflippene oppover mot membranen. Hold den sentrale vaskulære bunten av leveren med tang.
MERK: Det vil ikke påvirke prosedyren hvis den sentrale vaskulære bunten er skadet. - Trekk den sentrale vaskulære bunten bort fra musen og kutt det gjenværende bindevevet, blodkarene, etc. for å fjerne leveren. Pass på at du ikke er 1) skade leverflippene og 2) skåret i mage-tarmkanalen, da dette kan forurense leveren med mikroorganismer.
- Legg den fjernede leveren i en steril 10 cm vevskulturrett halvfylt med iskald Krebs-Henseleit bufferløsning. Bruk et sløvt instrument for å lede flikene, kutt midten av leveren for å dele den inn i separate fliker.
- Velg en leverlapp (bruk den største først), og legg den flatt ned på en ny steril 10 cm tallerken. Oppbevar alle andre leverfliker i fatet med Krebs-Henseleit bufferoppløsning lagret på is for senere bruk.
- Trim rundt 10% av materialet fra den høyeste kanten av leveren flike mens du ligger flatt.
MERK: Trimming er viktig, da denne vevskanten vil kontakte skjærebladet først; Derfor vil en vevskant som er relativt vinkelrett på skjærebladet forhindre vevskompresjon som kan oppstå på grunn av grunne vinkler i de ukuttede leverflikene. - Trim de tre andre vevskantene.
MERK: Dette fjerner noen av den fibrøse Glissons kapsel og vil gjøre separasjon av vevsskivene lettere. - Montering av leverlappen på prøveholderen
- Legg et tynt lag med cyanoakrylat lim (superlim eller medisinsk / veterinær klasse cyanoakrylat lim) på prøveholderen mot forsiden, størrelse litt større enn trimmet leverflike.
MERK: Kontroller at cyanoakrylatlimet ikke inneholder ikke-cyanoakrylattilsetningsstoffer. - Plukk forsiktig opp leverflippen med sterile tang ved hjelp av et hjørne vekk fra cutting edge, og klapp deretter tørr eventuelle gjenværende buffer fra den flate siden av leveren lobe ved hjelp av sterilt absorberende materiale.
- Plasser den store flate siden av leverflippen på cyanoakrylatlimlappen med den største kanten mot fronten. La den kurere i luften i 1-2 min.
MERK: Cyanoakrylatlim kurerer raskt (~ 2 min) som svar på gjenværende fuktighet og vevsproteiner, og de vil feste vevet godt til prøveholderen.
- Legg et tynt lag med cyanoakrylat lim (superlim eller medisinsk / veterinær klasse cyanoakrylat lim) på prøveholderen mot forsiden, størrelse litt større enn trimmet leverflike.
3. Produksjon av leverskiver
- Plasser prøveholderen med den vedlagte leverflippen i vibratomebufferskuffen. Pass på at leverflippen er fullstendig dekket av buffer.
MERK: Fyll om nødvendig opp nivået av iskald Krebs-Henseleit bufferløsning. Hvis buffernivået skjuler kutteprosessen, øker eller reduserer du nivået. - Still inn skjærehastigheten.
MERK: Dette må kanskje bestemmes empirisk avhengig av vibratome-modellen og bladegenskapene. Som startveiledning bruker du en hastighet på 57 Hz/3420 o/min. Vibratomehastigheten kan måles ved hjelp av et lydspektrumanalysatorprogram på en smarttelefon. - Senk skjærebladet til det er plassert like over leverflippen ved hjelp av høydeskiven. Kjør den vibrerende skjærearmen over prøven.
- Sett bladet tilbake med krankarmen i revers. Aktiver vibrasjonene mens du returnerer bladet. Etter at bladet er returnert og ikke er over prøven, senker du bladhøyden med 250 μm.
- Gjenta kutteprosessen til toppen av vevet er fjernet. Kast de første en eller to skiver, da disse vil inneholde Glissons kapsel og derfor ikke inneholde mye funksjonelt levervev sammenlignet med andre skiver.
- For å kutte leverskiver, sakte fremme vibrerende bladet inn i vevet ved å snu håndtaket. Bruk en liten pensel (desinfisert med en 70% etanolløsning) for å forsiktig lede vevet under kutteprosessen.
- Bruk penselen til å løfte de kuttede vevsskivene og legg vevsskiven i et sterilt rør av iskalde Krebs-Henseleit buffer. Når det ikke er i bruk, hold dette røret på is mellom skiver.
MERK: Noen ganger rives vevet under kutteprosessen, men for de fleste formål er vevet fortsatt brukbart. - Gjenta kutteprosessen til bunnen av leverflippen er nådd. Kast eventuelle leverskiver som har synlig herdet lim.
MERK: Det herdede limet er synlig som hvite områder på vevsskivene. En typisk leverflike vil bare ha en brukbar tykkelse på rundt 2 mm. Derfor produseres bare rundt åtte 250 μm leverskiver fra hver flike. - Skjær vevet skiver til nær cyanoakrylat lim. Ikke kutt i limet.
- Gjenta hele prosessen med andre leverfliker til det nødvendige antallvevsskiver oppnås.
- For å rengjøre det herdede cyanoakrylatlimet og vevet fra prøveholderen, bruk enten et blad til å skrape den herdede lim-/vevblandingen av, eller myke opp og rengjøre blandingen med aceton eller dimetylsulfoksid.
4. Vevkultur
MERK: Alt vevskulturarbeid må utføres i en steril lamiarstrømningshette.
- I en vevkultur lamiar flyt hette, pipette 1 ml av William's E medium som inneholder 2,0 g / L glukose, 10% føtal storfe serum (FBS), 2 mM L-glutamin supplement, 100 U / ml penicillin, og 100 μg / ml streptomycin i 12 brønnvev kultur plater.
MERK: Andre antibiotika og antifungale midler kan også legges til. Noen studier har brukt tilsetningsstoffer i vevinkubasjonsmediet (dvs. deksametason og insulin10),men disse kan forstyrre cellesignalering. - Plasser røret som inneholder leverskiver fra is inn i vevskulturen. For å fjerne vevsskivene, virvle blandingen forsiktig og forsiktig tippe inn i en steril 10 cm tallerken mens virvlende.
- Ved hjelp av sterile skarpe spisstang og en skalpell, kutt vevsskivene i omtrent ensartede størrelser (f.eks. 15 mm2).
MERK: Dette trinnet utføres for å sikre et konsekvent overflateareal. Fordi museleverfliker er signifikant forskjellige i størrelse og noen vevskiver vil rive, vil dette produsere en rekke PCLS med varierende overflateområder. De endelige overflateareastørrelsene til PCLS avhenger av hvor mye materiale som trengs i etterfølgende analyseapplikasjoner og hvor mange replikater som trengs. Kutte store PCLS i mindre flere biter av samme omtrentlig størrelse vil medfødt tillate et økt antall eksperimentelle replikerer. - Ved hjelp av sterile tang eller en liten pensel, overfør kuttvevskiver til brønnene på en 12 brønnplate som inneholder 1 ml medium.
MERK: Pass på å bekrefte konsistensen av tykkelse og form av vevskiver. Seksjoner som er mørkere enn gjennomsnittet tyder på at vevtykkelsen er større og må kastes. Lettere skiver tyder på tilstedeværelse av herdet cyanoakrylat lim og må kastes. - Inkuber leverskivene ved 37 °C og 5 % CO2 under 95 % fuktighet.
MERK: Andre grupper har brukt metoder for å forbedre oksygentilførselen til PCLS, som ser ut til å forlenge overlevelsestiden for vev6,,10,,11,,12,13 (se diskusjonsseksjon). - På følgende dag, endre kulturmediet ved hjelp av en manuell pipette (i stedet for suging) for å hindre tap av vev gjennom sugefeil. Deretter endrer du mediet på PCLS daglig. PCLS er nå klar for eksperimentell bruk.
5. Eksempel på bruk av PCLS
- Ved 16 timer etter generasjonen, behandle PCLS med tre forskjellige gallesyrer: glycocholic acid (GCA), taurocholic acid (TCA), og kolsyre (CA) (som natriumsalter, alt med en konsentrasjon på 150 μM) i 2 dager.
- Etter 2 dager med gallesyrebehandling, trekk ut mRNA ved å plassere vevsskiver i iskald RNA-lysisbuffer og raskt homogenisere ved hjelp av perler med en perlehomogenisator (Table of Materials).
- Rense RNA ved hjelp av et RNA-isolasjonssett(Materialtabell) og lag cDNA fra renset RNA.
- Utfør kvantitativ polymerasekjedereaksjon (Materialtabell) ved hjelp av spesifikke primere (Tabell 1) på cDNA for å undersøke genuttrykk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å bestemme cellelevedyktigheten til PCLS over tid, ble vevATP-nivåer målt. ATP-nivåer er vanligvis proporsjonale med levedyktighet. PCLS (rundt 15 mm2 i området) ble dyrket i normalt Williams E-medium med 10 % FBS, deretter ved bestemte tidspunkter ble leverskiver fjernet fra vevskultur og homogenisert med både ATP- og proteinkonsentrasjoner (for normalisering)(Materialbord) målt (figur 1A). For biokjemiske analyser som dette er normalisering viktig, da de kuttede leverskivene ikke nødvendigvis er identiske i dimensjoner. ATP nivåer (i forhold til protein) ble undertrykt umiddelbart etter isolasjon og etter 1 t (Figur 1A), noe som tyder på kortsiktig metabolsk stress fra kjøling og kutte prosedyrer. Atp-nivåene ble imidlertid gjenopprettet med 3 h. ATP-nivåer forble forhøyet ved opptil 5 dager med vevskultur, noe som indikerer ingen signifikant reduksjon i levedyktighet. Hematoksylin og eosin (H&E) farging av leverskiver antydet at begrenset vevnekrose (preget av kjernefysisk pleomorphism) skjedde i kultur fra rundt dag 2 og 3. Vevsnekrosenivået utviklet seg til alvorlige etter dag 5 (figur 1B). Tatt i betraktning disse morfologiske dataene, tatt sammen med ATP-resultatene, anbefales det å bruke denne eksperimentelle vevsmodellen i opptil 3 dager.
PCLS viste også økende kollagenakkumulering ved senere kulturtidspunkter, som vist ved fortykning av Picro-sirius rødfargede kollagenfibre på dag 5 (Figur 2). Denne fortykningen av kollagenfibre tyder på at spontane fibrogene prosesser er aktive i PCLS oppnådd ved hjelp av denne metoden. Denne prosessen vises uavhengig av PCLS isolasjonsmetodikk med fortykning av kollagenfibre6 og profibrogenic genuttrykk14 som forekommer fra både vibratome og Krumdieck vevskiver, henholdsvis over tid. Utviklingen av disse spontane fibrogene prosessene må tas i betraktning ved tolkning av PCLS biologi, spesielt med eksperimenter forbundet med fibrotiske prosesser.
Vi har tidligere vist signifikant induksjon av cholangiocyte-spesifikt gen connexin 43 (Cx43) og sekresjon av glutamyl transpeptidase (Ggt1) protein av TCA i PCLS9. Uttrykket av cholangiocyte-spesifikke gener i forhold til rengjøringskontroller (glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase [Gapdh] og hypokseninfosforførelse 1 [Hprt1]) i PCLS behandlet med TCA, GCA eller CA ble undersøkt av qPCR ved hjelp av spesifikke primere. I samsvar med en tidligere rapport, en betydelig induksjon i uttrykket av cholangiocyte-spesifikke gener cytokeratin 19 (CK19; Figur 3A) og connexin 43 (Cx43; Figur 3B) ble observert av både GCA og TCA. Ggt1-uttrykket ble økt med begge gallesyrer; selv om dette ikke nådde statistisk signifikans, muligens på grunn av eksperimentell variasjon (figur 3C). Uttrykket av CA var upåvirket av gallesyre. Induksjonen av kolangiocytterspesifikke gener tyder på at GCA også kan være involvert i kolestatisk leverskade, som tidligere rapportert for TCA8,9.
Figur 1: Vevslevedyktighet av presisjonskuttede leverskiver (PCLS). (A) ATP og proteinnivåer i PCLS ble målt umiddelbart (T + 0) og ved 1 t, 3 t, 6 h og 1−5 dager etter isolasjon. (B) For å undersøke cellemorfologi, pcls ble løst, parafin-innebygd, seksjonert, og farget med H & E umiddelbart (dag 0) og på 1, 2, og 5 dager etter isolasjon. En Kruskal-Wallis test med Dunns flere sammenligninger test ble utført i forhold til T + 0. Alle data er representert som gjennomsnitt ± SEM (n = 2-3 mus) med *p < 0,05. Skalalinjene representerer 100 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vurdering av kollagenavsetning i PCLS. PCLS ble fikset, parafininnebygd, seksjonert og farget med Picro-Sirius Red for å visualisere kollagenfibre på dag 0, 1, 2 og 5 etter isolasjon. Skalalinjene representerer 200 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Gallesyrer induserer kolangiocytterspesifikt genuttrykk. Ved 16 h post-isolasjon, medium på PCLS ble endret, og nytt medium ble lagt sammen med 150 μM glycocholic (GCA), taurocholic (TCA), eller kolsyre (CA) syrer (natriumsalter). PCLS ble høstet etter 2 dager, og uttrykket av cytokeratin 19 (CK19; A),connexin 43 (Cx43; B)og γ-glutamyl transpeptidase 1 (Ggt1; C) ble undersøkt i forhold til det geometriske gjennomsnittet av Gapdh og Hprt1. Dunnetts flere sammenligninger test ble utført i forhold til ubehandlet kontroll vev skiver (n = 15). Alle data er representert som gjennomsnitt ± SEM (n = 4 mus, triplicate skiver; *p < 0,05, **p < 0,01). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: qPCR-primere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen demonstrerer anvendelsen av murine PCLS isolasjon og vevkultur, og prosedyrene er utformet for å vurdere både levedyktighet og nytte samt undersøke virkningene av eksogene meklere av leverpatologi ved hjelp av biokjemiske analyser, histologi og qPCR. Eksperimentell nytte av PCLS vev kultur hos gnagere og mennesker har blitt demonstrert i et bredt spekter av applikasjoner, inkludert eksperimentelle undersøkelser i microRNA15/RNA9/protein uttrykk16, metabolisme17, virusinfeksjon dynamikk10,18, infeksjon signalisering19, tumor invasjon12, toksisitetsstudier4,13,15,20, DNA skade studier21, cellebiologi14, og sekresjon studier9.
Mens ATP-nivåer indikerer cellulær levedyktighet i PCLS opptil 5 dager i kulturen, antyder H&E-farging at alvorlig nekrose skjedde med 5 dager i kulturen. Den viktigste faktoren som ser ut til å begrense levedyktigheten til PCLS er oksygentilgjengelighet6,11. Flere studier har inkludert forbedret oksygentilgjengelighet og dermed økt levedyktighetstiden til PCLS i vevskultur. Metoder som brukes til å øke oksygentilgjengeligheten inkluderer inkubasjon av vev i oksygenrike atmosfærer10,11, bruk av oksygenbærerperfusjon perfluorodecalin12, risting / rullende kulturen under inkubasjon6,10,13, og vev kultur plater designet for å maksimere oksygenering6.
Nylig har et innovativt luftflytende grensesnitt vevkultursystem blitt beskrevet med funksjonelt verktøy oppgitt på mer enn 7 dager i kultur14. Denne protokollen bruker atmosfærisk oksygen i en normal vevskulturinkubator. Metoden gjør det mulig for PCLS å være tilgjengelig for laboratorier som ikke har høyt spesialisert, tilpasset utstyr for å trygt forbedre oksygenleveringen. Men hvis slike metoder for å forbedre oksygenlevering er tilgjengelige, kan de forbedre langsiktig PCLS levedyktighet i kultur.
Akkumuleringen av kollagen i PCLS etter dag 3 i kultur tyder på at spontane fibrogene prosesser er aktive i denne modellen. Spontan fibrose har også blitt observert tidligere i PCLS6,14,22,23,24 og er muligens mediert av skade-assosiertmolekylære mønstre (DAMPs) utgitt av kutteprosessen eller vevnekrose. DAMPs fungerer som signalmolekyler som senere aktiverer pro-fibrotiske signalveier25,26. Videre kan spontan fibrose i PCLS formidles av chemokines utgitt fra aktiveringen av stellateceller og /eller Kupffer-celler (dvs. transformere vekstfaktor beta [TGF-β]). I denne sammenheng, en fersk artikkel av Bigaeva et al.24 antyder at spontan fibrose i PCLS er delvis mediert av TGF-β signalering, som inkubasjon av PCLS med TGF-β hemmer Galunisertib hemmet genuttrykk endringer forbundet med spontan hepatisk fibrose. En annen mulig mekanisme er at kuttingprosedyren i utgangspunktet induserer cellespredningssignalveier og inntrengning av hepatocytter i cellesyklusen; Denne mekanismen mislykkes imidlertid, og resulterer i cellesyklusarrest i midten av G1 fase27. Cell syklus arrest er forbundet med hepatisk fibrose i stedet for leverregenerering28.
I den representative eksperimentelle prosedyren behandles PCLS med tre forskjellige gallesyrer (GCA, TCA og CA) i 2 dager for å simulere kolestatisk leverskade. To av gallesyrer (GCA og TCA) indusere betydelig uttrykk for CK19 og Cx43, som er gener forbundet med cholangiocyte funksjon. Dette antyder utvidelse eller differensiering av celler mot en cholangiocyte avstamning i PCLS behandlet med disse gallesyrer. Dette er i samsvar med vårt tidligere arbeid som viser en lignende effekt ved hjelp av TCA9 på PCLS. Videre er det også i samsvar med in vivo observasjoner som viser fôring taurocholate til rotter øker cholangiocyte tall29. Behandlingen av levervevskiver med gallesyrer simulerer hepatisk kolestase, og det spekuleres i at økningen i uttrykket av gener forbundet med cholangiocyte funksjon er et forsøk fra levervevet for å skape ekstra galleductules for å øke gallesekresjon. Gitt den spesifikke induksjonen av disse genene er produsert av konjugerte gallesyrer (GCA og TCA), men ikke den ukonjugerte CA, er det mistanke om at disse effektene medieres av sphingosin-1-fosfatreseptoren 2, en celleoverflatereseptor med fortrinnsrett aktivering av konjugerte gallesyrer30.
En viktig begrensning av anvendelsen av PCLS er individuell elekter variasjon. Siden leveren ikke er homogen og det er variasjon i produksjonen, leverskiver har en tendens til å ha større biologisk variasjon enn cellekultur eksperimentering. I eksperimentelle studier med få variabler, for eksempel den representative prosedyren demonstrert ovenfor, overvinnes dette ved hjelp av et økt antall replikater. Dette kan imidlertid bli et problem for større screeningstudier. Oppsummert er den beskrevne protokollen en enkel og pålitelig metode for å studere aspekter av leveren pathobiology ex vivo, som krever lite spesialisert utstyr bortsett fra vibratome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av forskningstilskudd fra National Health and Medical Research Council (NHMRC) i Australia (Grant No. APP1048740 og APP1142394 til G.A.R.; APP1160323 til J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm støttes av et seniorstipendiatfellesskap fra NHMRC of Australia (Grant No. I 1999 ble det avlagt en Manuel Fernandez-Rojo ble støttet av TALENTO-programmet i Madrid, Spania (T1-BIO-1854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
- Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).
- Ouchi, R., et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).
- Vickers, A. E., Fisher, R. L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).
- Olinga, P., Schuppan, D. Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo. Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).
- Paish, H. L., et al. A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
- Prins, G. H., et al. A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices. Nutrients. 11 (3), 507 (2019).
- Ramm, G. A., et al. Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment. Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).
- Pozniak, K. N., et al. Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease. The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).
- Clouzeau-Girard, H., et al. Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices. Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).
- Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Granitzny, A., et al. Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound. Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).
- Wu, X., et al. Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform. Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).
- Zarybnicky, T., et al. Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).
- van de Bovenkamp, M., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).
- Buettner, R., et al. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system. Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).
- Lagaye, S., et al. Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model. World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).
- Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).
- Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro. Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).
- Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro. Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).
- Guyot, C., et al. Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices. Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).
- Bigaeva, E., et al. Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices. Biochim Biophys Acta - Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).
- Kiziltas, S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases. World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).
- Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 58 (5), 704-720 (2009).
- Finot, F., et al. Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices. International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).
- Marshall, A., et al. Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).
- Alpini, G., et al. Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes. Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).
- Studer, E., et al. Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes. Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).
