Summary
이 프로토콜은 마우스에서 가능한 정밀 절단 간 조각의 생산을위한 간단하고 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. ex vivo 조직 샘플은 여러 날 동안 실험실 조직 배양 조건 하에서 유지될 수 있으며, 간 병리학을 검사하는 유연한 모델을 제공합니다.
Abstract
만성 간 질환 (즉, 바이러스 성 간염, 비 알코올 성 지방 간 질환, 대사 간 질환, 간암)의 기초가되는 간 손상, 간 섬유증 및 간경변의 메커니즘을 이해하려면 실험적 조작이 필요합니다. 동물 모델 및 시험관 내 세포 배양. 두 기술 모두 생체 내 조작을 위한 많은 수의 동물의 요구 사항과 같은 제한사항이 있다. 그러나, 시험관내 세포 배양은 다세포간 환경의 구조 및 기능을 재생하지 않는다. 정밀 절단 간 조각의 사용은 실험 조작을 위한 실험실 조직 문화에서 실행 가능한 마우스 간의 균일한 조각이 유지되는 기술입니다. 이 기술은 동물 연구와 시험관 내 세포 배양 방법 사이에 존재하는 실험 틈새 시장을 차지합니다. 제시된 프로토콜은 마우스로부터 정밀 절단된 간 조각을 분리하고 배양하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 이 기술의 응용 프로그램으로, ex vivo 간 조각 담 즙 산으로 처리 됩니다 담 즙 간 손상을 시뮬레이션 하 고 궁극적으로 간 섬유 발생의 메커니즘을 평가.
Introduction
대부분의 만성 간 질환의 병인 (즉, 바이러스 성 간염, 비 알코올 성 지방 간염, 담즙 성 간 손상 및 간암)은 염증, 섬유 발생 및 암발달을유도하는 여러 가지 간 세포 유형 간의 복잡한 상호 작용을 수반합니다1,2. 이 만성 간 기지를 둔 질병의 밑에 분자 기계장치를 이해하기 위하여는, 다중 간 세포 모형 사이 상호 작용을 조사되어야 합니다. 다중 간 세포주(그리고 최근에는 오르가노이드)가 시험관 내에서 배양될 수 있지만, 이들 모델은 간 미세환경의 복잡한 구조, 기능 및 세포 다양성을 정확하게 에뮬레이트하지 않는다3. 더욱이, 배양된 간 세포 (특히, 형질전환된 세포주)는 그들의 본래 근원 생물학에서 이탈할 수 있다. 동물 모델은 여러 간 세포 유형 간의 상호 작용을 조사하기 위해 실험적으로 사용됩니다. 그러나, 그(것)들은 실험적인 조작을 위한 범위에서 현저하게 감소될 수 있습니다, 때문에 간 외 기관에 있는 중요한 오프 표적 효력 (예를 들면, 잠재적인 치료제를 시험할 때).
조직 배양에서 정밀 절단 간 조각 (PCLS)의 사용은 약물 대사 및 독성 연구에 처음 사용되는 실험 기술이며, 실행 가능한 초박형 (약 100-250 μm 두께) 간 조각을 절단하는 것을 포함합니다. 이것은 간 조직 ex vivo4의직접적인 실험적인 조작을 허용합니다. 이 기술은 생체 내 동물 연구와 시험관 내 세포 배양 방법 사이의 실험 적 격차를 해소하여 두 방법의 많은 단점을 극복합니다 (즉, 전체 동물에서 수행 할 수있는 실험 의 범위에 대한 실질적인 한계뿐만 아니라 체외 세포 배양 방법으로 구조 / 기능 및 세포 다양성의 손실).
또한, PCLS는 전체 동물 연구에 비해 실험 능력을 크게 증가시킵니다. 한 마우스보다 더 생산할 수 있습니다 48 간 조각, 이것은 또한 같은 간에서 제어 및 치료 그룹의 사용을 용이하. 또한,이 기술은 다른 장기 시스템에서 간 조직을 물리적으로 분리합니다. 따라서, 그것은 외 인 자극의 효과 테스트 할 때 전체 동물에서 발생할 수있는 잠재적 인 오프 타겟 효과를 제거합니다.
이 프로토콜에서 PCLS는 측면 진동 블레이드가 있는 진동체를 사용하여 생성됩니다. 다른 연구는 성공적으로 크룸디크 조직 슬라이서를 사용, Olinga와 Schuppan에 설명 된 대로5. 비브라토임에서 블레이드의 측면 진동은 블레이드가 조직으로 밀려나기 때문에 전단 스트레스로 인한 초박형 조직의 찢어짐을 방지합니다. 진동과 Krumdieck 조직 슬라이서 모두 간 조직의 구조적 포함없이 효과적으로 작동, 이는 슬라이스 절차를 간소화. 이 기술은 또한 섬유증/간경변6 및 간 steatosis7의마우스 모형에서 그(것)들을 포함하여 병들한 간에서 PCLS를 만들기 위하여 이용될 수 있습니다.
PCLS의 준비 그리고 조직 문화에 필요한 기술을 보여주는 것 이외에, 이 보고는 또한 아데노신 삼인산 (ATP) 수준을 측정하고 괴사 및 섬유증을 평가하기 위하여 조직 조직학을 검토해서 이 생체 내 조직의 생존가능성을 검토합니다. 대표적인 실험 절차로서, PCLS는 세 가지 다른 담즙산 (글리코콜릭, 타우로콜릭 및 콜린산)의 병리생리학적 농도로 처리되어 담즙이 있는 간 손상을 시뮬레이션합니다. 담즙성 간 손상의 맥락에서, 타우로콜산은 특히 낭포성 섬유증 관련 간 질환을 가진 어린이의 혈청 및 담즙 모두에서 유의하게 증가하는 것으로 나타났다8.
간 전구 세포는 또한 환자에서 관찰된 높은 타우로콜산 수준을 시뮬레이션하기 위해 타우로콜산으로 시험관내에서 처리되었으며, 이러한 치료는 담즙(cholangiocyte) 표현형9를향한 간 전구 세포의 증식 및 분화를 증가시켰다. 이어서, PCLS는 타우로콜산의 높은 수준으로 생체 내 생체 내 를 처리하였고, 증가된 담관시종 마커가 관찰되었다. 이는 타우로콜산이 소아 낭포성 섬유증 관련 간 질환의 맥락에서 담즙 증식 및/또는 분화를 유도한다는 시험관내 관찰을 뒷받침한다9.
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Protocol
모든 동물 실험은 QIMR Berghofer 의학 연구소에서 과학적인 목적을 위해 동물의 관리 및 사용을 위한 호주 코드에 따라 수행되었으며, 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 수컷 C57BL/6 마우스(15-20주 령)는 호주 워싱턴 주 동물자원센터에서 수득하였다.
참고: 시료에 접촉하는 모든 솔루션, 미디어, 기기, 하드웨어 및 튜브는 70% 에탄올 용액으로 멸균 또는 철저히 소독하고 멸균 기술을 사용하여 처리하여 배양 오염의 위험을 최소화해야 합니다.
1. 진동의 설정
- 2 g/L 포도당(재료 표)으로멸균 크렙스 헨셀레이트 완충액을 준비합니다. 버퍼의 pH가 7.4인지 확인합니다. pH가 높은 경우, 카보겐(95%O2 + 5%CO2)으로완충액을 포화하거나 5%CO2 조직 배양 인큐베이터 내에서 배양하여 중탄산염 완충시스템을 교정한다. 밀봉된 멸균 완충액을 4°C에서 냉장 보관하십시오.
- 비브라토임 블레이드를 절단 암에 삽입합니다. 진동으로 인해 블레이드가 느슨해질 수 있으므로 블레이드가 절단 암에 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오.
- 70% 에탄올 용액으로 블레이드와 절단 암을 소독합니다.
주의: 블레이드와의 접촉을 피하십시오. - 완충트레이를 70% 에탄올 용액으로 소독하고 멸균 조직으로 닦으소.
- 버퍼 트레이를 진동에 넣고 장착 메커니즘을 조입니다.
- 커팅 암을 사용 가능한 최대 높이로 설정합니다.
- 블레이드 각도를 수평 아래 10°로 설정하고 시료로 아래쪽으로 기울어짐. 블레이드 각도가 단단히 고정되어 있는지 확인합니다.
참고: 최적의 블레이드 각도는 진동 모델 및 조직 특성에 따라 다를 수 있습니다. - 70% 에탄올 용액으로 시편 홀더를 소독합니다.
- 완충트레이 아래에 위치한 펠티에 열전 냉각기의 냉각수를 연결합니다.
참고: 일부 진동 모델은 냉각을 위해 얼음 욕조를 사용합니다. - 배수관을 배수구에 고정하고 물을 켭니다. 쿨러를 4°C로 설정합니다. >400 mL/min의 속도로 냉각수를 가동하십시오.
- 멸균 된 얼음 차가운 Krebs-Henseleit 버퍼 (2g / L 포도당)로 버퍼 트레이를 거의 상단에 채웁니다. 크레브스-헨셀리트 완충액을 얼음 위에 추가로 남겨두십시오.
2. 간 제거 및 준비
- 곡면 집게, 평평한 사각형 끝 집게, 핀셋, 수술 용 클램프 및 오토클레이브를 사용하여 가위를 포함한 모든 수술 기구를 살균하거나 소독하십시오.
- 간 제거 전에, 깊이 복 강 주사를 사용 하 여 마우스를 마 사 100 mg/kg 케 타 민과 12.5 mg/kg 자일라진.
참고: 다른 마취제를 사용할 수도 있고, 저산소증으로 인한 손상을 방지하기 위해 간을 신속하게 제거하는 경우CO2 질식/자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사시킬 수 있습니다. - 70% 에탄올 용액으로 젖어 마우스의 피부 표면을 소독합니다. 해부 보드에 고정 된 모든 사지로 등에 마우스를 고정하십시오.
- 복강 기저부에서 다이어프램 바로 위까지 수직 중간선을 피부로 절개합니다.
참고 : 사지쪽으로 절개는 피부의 후퇴를 용이하게하기 위해 만들어집니다. - 피부와 복강 사이의 결합 조직을 절단하는 동안 피부를 다시 당깁니다. 모발이 가능한 한 복강으로 옮겨지는 것을 방지하십시오. 피부를 복강에서 멀리 고정하거나 고정합니다.
- 깨끗한 집게와 가위를 사용하여 복강을 열고 흉강 하부 구멍을 엽니다.
- 로브를 손상시키지 않고 신속하게 간을 제거
- 무딘 도구 (예 : 평평한 사각형 끝 집게)를 사용하여 위 간 엽을 복부쪽으로 아래쪽으로 안내하십시오. 가위를 사용하여 상부 간 엽을 둘러싼 결합 조직을 잘라냅니다.
- 간 엽을 횡격막쪽으로 위쪽으로 안내합니다. 집게와 간 중앙 혈관 번들을 개최.
참고: 중앙 혈관 번들이 손상된 경우에는 절차에 영향을 미치지 않습니다. - 마우스에서 중앙 혈관 번들을 당기고 나머지 결합 조직, 혈관 등을 잘라 간을 제거합니다. 1) 간 엽을 손상시키지 않도록주의하고 2) 위장관으로 자르면 미생물로 간이 오염 될 수 있습니다.
- 제거된 간을 멸균 된 10cm 조직 배양 접시에 얼음 차가운 크렙스 - 헨셀레이트 완충액으로 반 채웠습니다. 무딘 악기를 사용하여 로브를 안내하고 간 중심을 잘라 별도의 로브로 나눕니다.
- 간엽 1개를 선택하고(가장 먼저 사용) 평평한 면을 새로운 멸균 10cm 접시에 놓습니다. 이후 사용을 위해 얼음에 저장된 크렙스-헨셀리트 완충액의 접시에 다른 모든 간 엽을 보관하십시오.
- 평평하게 누워있는 동안 간 엽의 가장 높은 가장자리에서 재료의 약 10 %를 다듬습니다.
참고 : 이 조직 가장자리가 먼저 절단 블레이드에 접촉하기 때문에 트리밍이 중요합니다. 따라서 절단 블레이드에 상대적으로 수직인 조직 가장자리는 절단되지 않은 간 엽의 얕은 각도로 인해 발생할 수있는 조직 압축을 방지 할 수 있습니다. - 다른 세 개의 티슈 가장자리를 다듬습니다.
참고 : 이것은 섬유 질 글리슨의 캡슐의 일부를 제거하고 조직 조각의 분리를 쉽게 만들 것입니다. - 시편 홀더에 간 엽 장착
- 시편 홀더에 시아노아크릴레이트 접착제(수퍼글루 또는 의료/수의학 등급의 시아노아크릴레이트 접착제)를 얇게 놓고, 손질된 간엽보다 약간 큰 크기의 시편 홀더를 향하게 합니다.
참고 : 시아노 아크릴 산 접착제가 비 시아노 아크릴레이트 첨가제를 포함하지 않는지 확인하십시오. - 절삭날에서 멀리 떨어진 모서리를 사용하여 멸균 포셉으로 간 엽을 부드럽게 집어 들고 멸균 흡수 재료를 사용하여 간 엽의 평평한 면에서 잔류 완충액을 두드려 두드려 건조시면 됩니다.
- 사이아노아크릴레이트 접착제 패치에 간엽의 큰 평평한 면을 놓고 가장 큰 가장자리가 앞쪽을 향하게 합니다. 1-2 분 동안 공중에서 치료할 수 있습니다.
참고 : 시아노 아크릴 접착제는 잔류 수분 및 조직 단백질에 대한 응답으로 신속하게 (~ 2 분) 치료하고, 그들은 단단히 시편 홀더에 조직을 부착합니다.
- 시편 홀더에 시아노아크릴레이트 접착제(수퍼글루 또는 의료/수의학 등급의 시아노아크릴레이트 접착제)를 얇게 놓고, 손질된 간엽보다 약간 큰 크기의 시편 홀더를 향하게 합니다.
3. 간 슬라이스 의 생산
- 부착된 간엽이 있는 시편 홀더를 진동 완충트레이에 넣습니다. 간 엽이 완충제에 의해 완전히 덮여 있는지 확인하십시오.
참고: 필요한 경우, 얼음으로 차가운 크렙스-헨셀리트 완충액의 수준을 높입니다. 버퍼 레벨이 절삭 공정을 가리는 경우 레벨을 늘리거나 줄입니다. - 절삭 속도를 설정합니다.
참고: 진동 모델과 블레이드 특성에 따라 경험적으로 결정해야 할 수도 있습니다. 시작 가이드로 57Hz/3,420rpm의 속도를 사용합니다. 진동 속도는 스마트폰의 오디오 스펙트럼 분석기 애플리케이션을 사용하여 측정할 수 있습니다. - 높이 다이얼을 사용하여 간 엽 바로 위에 위치할 때까지 절단 블레이드를 낮춥습니다. 샘플 위에 진동 절단 팔을 실행합니다.
- 반대로 크랭크 핸들을 사용하여 블레이드를 다시 반환합니다. 블레이드를 되돌리는 동안 진동을 활성화합니다. 블레이드가 반환되고 시료 위에 있지 않은 후에는 블레이드 높이를 250 μm 낮춥시됩니다.
- 조직의 상단이 제거 될 때까지 절단 과정을 반복합니다. 첫 번째 하나 또는 두 개의 조각을 폐기, 이들은 Glisson의 캡슐을 포함 하 고 따라서 다른 조각에 비해 많은 기능성 간 조직을 포함 하지 않습니다.
- 간 조각을 자르려면 손잡이를 돌려 진동하는 블레이드를 조직으로 천천히 진행합니다. 작은 페인트 브러시 (70 % 에탄올 용액으로 소독)를 사용하여 절단 과정에서 조직을 부드럽게 안내하십시오.
- 페인트 브러시를 사용하여 잘라낸 티슈 슬라이스를 들어 올리고 티슈 슬라이스를 얼음으로 차가운 크렙스-헨셀레이트 완충제의 멸균 튜브에 넣습니다. 사용하지 않을 때는 이 튜브를 슬라이스 사이에 얼음 위에 두십시오.
참고 : 때로는 조직이 절단 과정에서 찢어지지만 대부분의 경우 조직은 여전히 사용할 수 있습니다. - 간엽의 기저부가 도달할 때까지 절단 과정을 반복합니다. 눈에 보이는 경화 접착제가 있는 간 조각을 버리십시오.
참고 : 경화 접착제는 조직 조각에 흰색 영역으로 볼 수 있습니다. 일반적인 간 엽은 약 2 mm의 사용 가능한 두께를 가질 것입니다. 따라서 각 엽에서 약 8 개의 250 μm 간 조각만 생산됩니다. - 티슈 슬라이스를 시아노아크릴레이트 접착제 근처까지 자른다. 접착제로 자르지 마십시오.
- 필요한 수의 조직 조각이 얻어질 때까지 다른 간 엽과 함께 전체 과정을 반복하십시오.
- 시편 홀더에서 경화 된 시아노 아크릴레이트 접착제와 조직을 청소하려면 블레이드를 사용하여 경화 된 접착제 / 조직 혼합물을 긁거나 아세톤 또는 디메틸 황산화물로 혼합물을 부드럽게하고 청소하십시오.
4. 조직 배양
참고 : 모든 조직 배양 작업은 멸균 층류 흐름 후드에서 수행되어야합니다.
- 조직 배양 층류 후드에서, 2.0 g/L 포도당을 함유하는 윌리엄의 E 배지의 피펫 1 mL, 10% 태아 소 혈청 (FBS), 2 mM L-글루타민 보충제, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신을 12개의 잘 조직 배양 플레이트에 담는다.
참고: 그밖 항생제 및 항진균제는 또한 추가될 수 있습니다. 몇몇 연구 결과는 조직 배양 매체에 있는 첨가제를 사용했습니다 (즉, 덱사메타손 및 인슐린10),그러나 이들은 세포 신호질을 방해할 수 있습니다. - 얼음에서 간 조각을 포함하는 튜브를 조직 배양 후드에 넣습니다. 티슈 슬라이스를 제거하려면 혼합물을 부드럽게 소용돌이치면서 멸균 된 10cm 접시에 부드럽게 팁을 넣습니다.
- 멸균 된 날카로운 점집과 메스를 사용하여 조직 조각을 대략 균일 한 크기 (예 : 15mm2)로자른다.
참고: 이 단계는 일관된 표면적을 보장하기 위해 수행됩니다. 마우스 간 엽은 크기가 크게 다르고 일부 조직 조각이 찢어지기 때문에 다양한 표면면적을 가진 다양한 PCLS를 생성합니다. PCLS의 최종 표면적 크기는 후속 분석 응용 분야에서 필요한 재료의 양과 필요한 복제수에 따라 달라집니다. 큰 PCLS를 동일한 대략적인 크기의 더 작은 여러 조각으로 절단하면 본질적으로 실험 복제수가 증가합니다. - 멸균 집게 또는 작은 페인트 브러시를 사용하여 절단 된 조직 조각을 중간 크기의 1 mL을 포함하는 12 개의 웰 플레이트의 우물로 옮김을 옮김.
참고 : 조직 조각의 두께와 모양의 일관성을 확인하십시오. 평균보다 어두운 섹션은 조직 두께가 더 크고 폐기해야 한다는 것을 시사합니다. 가벼운 슬라이스는 경화 된 시아노 아크릴레이트 접착제의 존재를 제안하고 폐기해야합니다. - 95% 습도에서 37°C 및 5%CO2에서 간 슬라이스를 배양합니다.
참고 : 다른 그룹은 조직 생존 시간을 연장하는 것으로 나타나는 PCLS에 산소 전달을 향상시키는 방법을사용했습니다 6,,10,,11,,12,,13 (토론 섹션 참조). - 다음 날, 흡입 오류를 통해 조직의 손실을 방지하기 위해 수동 파이펫 (오히려 흡입)을 사용하여 배양 매체를 변경합니다. 그 후, 매일 PCLS에 매체를 변경합니다. 이제 PCLS를 실험용으로 사용할 수 있습니다.
5. PCLS의 예시 응용 프로그램
- 16 시간 후 생성에서, 세 가지 다른 담즙 산으로 PCLS를 치료: 글리코콜산 (GCA), 타우로콜산 (TCA), 그리고 콜린산 (CA) (나트륨 염으로, 모두 150 μM의 농도에서) 2 일 동안.
- 담즙산 처리 2일 후, 조직 조각을 얼음-차가운 RNA 용해 완충액에 배치하여 추출하고 비드 균질화제(표)로 비드를 사용하여 신속하게 균질화한다.Table of Materials
- RNA 분리키트(재료 표)를사용하여 RNA를 정화하고 정제된 RNA로부터 cDNA를 생성합니다.
- cDNA상에서 특정 프라이머(표1)를이용하여 정량적 중합효소 연쇄 반응(Tableof Materials)을수행하여 유전자 발현을 검사한다.
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Representative Results
시간이 지남에 따라 PCLS의 세포 생존 가능성을 결정하기 위해 조직 ATP 수준을 측정했습니다. ATP 수준은 일반적으로 생존 가능성에 비례합니다. PCLS(면적 에서 약 15mm2)를 10% FBS로 정상 윌리엄의 E 배지에서 배양한 다음, 특정 시점에서, 간 조각을 조직 배양으로부터 제거하고 ATP 및 단백질(정상화를 위한)농도(물질표)로균질화하였다(도1A). 이와 같은 생화학 적 분석의 경우 절단 간 조각이 반드시 크기가 동일하지 않기 때문에 정상화가 중요합니다. ATP 수준(단백질에 상대적)은 즉시 격리 후 및 1시간후(그림 1A)냉각 및 절단 절차로부터 단기 대사 스트레스를 시사하는 억제되었다. 그러나, ATP 수준에 의해 복구 3 시간. ATP 수준까지 상승 남아 5 조직 배양의 일, 생존에 상당한 감소를 나타내는. 헤마톡신과 에오신(H&E) 간슬라이스의 염색은 제한된 조직 괴사(핵 다형성을 특징으로 함)가 2일과 3일 경부터 배양물에서 발생했다고 제안했다. 조직 괴사 수준은 5일째까지 심각하게 진행되었다(도1B). 이러한 형태학적 데이터를 고려하여 ATP 결과와 함께 찍은 이 실험 조직 모델을 최대 3일 동안 사용하는 것이 좋습니다.
PCLS는 또한 5일째에 피크로 시리우스 붉은 얼룩진 콜라겐 섬유를 두껍게 하여 나타난 바와 같이, 후기 배양 시점에서 콜라겐 축적을 증가시키는 것으로나타났다(그림 2). 콜라겐 섬유의 이 두껍게 하는 것은 자발적인 섬유원 프로세스가 이 방법을 사용하여 얻은 PCLS에서 활성화된다는 것을 건의합니다. 이러한 과정은 시간이 지남에 따라 각각 비브라토메 및 크룸디크 조직 슬라이서모두에서 발생하는 콜라겐 섬유6 및 자생 유전자발현(14)의 농축과 함께 PCLS 격리 방법론과 독립적으로 나타난다. 이러한 자발적인 섬유발생 과정의 개발은 PCLS 생물학을 해석할 때, 특히 섬유성 과정과 관련된 실험과 관련이 있습니다.
우리는 이전에 PCLS9에서TCA에 의한 글루타밀 트랜스펩티다아제(Ggt1) 단백질의 콜린옥시테 특이적Ggt1유전자 코넥신 43(Cx43)의 유의한 유도를 보여주었다.Cx43 하우스키핑 대조군(글리세랄데히드 3-인산염 탈수소효소[Gapdh]및 저산소산틴 인산화효소 1[Hprt1])에비해 콜린옥시비체 특이적 유전자의 발현은 TCA, GCA, 또는 CA로 처리된 PCLS에서 특정 프라이머를 사용하여 qPCR에 의해 조사되었다. 이전 보고서와 일치, 담관옥시오종 특이적 유전자의 발현에서 유의한 유도 시토케라틴 19(CK19; 도 3A)및 코넥신 43(Cx43;Cx43 도 3B)는GCA 및 TCA 둘 다에서 관찰하였다. Ggt1 발현은 두 담즙산모두에 의해 증가되었다; 비록, 이것은 통계적 유의에 도달하지 못했지만, 아마도 실험적 변화로 인한것(도 3C). CA의 발현은 어떤 담즙산에 의해영향을 받지 않았습니다. 담관옥시제 특이적 유전자의 유도는 GCA가 또한 TCA8,,9를위해 이전에 보고된 것과 같이 담홀성 간 손상에 관여할 수 있다는 것을 건의합니다.
그림 1: 정밀 절단 간 슬라이스 (PCLS)의 조직 생존 가능성. (A)ATP 및 PCLS의 단백질 수준을 즉시 측정하였다(T+ 0) 및 1시간, 3시간, 6시간, 및 1-5일 후 격리. (b)세포 형태를 검사하기 위해, PCLS를 고정, 파라핀 내장, 단면화, H&E로 즉시 염색(0일째) 및 1, 2 및 5일 후 격리하였다. 던의 다중 비교 시험을 가진 Kruskal-Wallis 시험은 T + 0에 비해 수행되었습니다. 모든 데이터는 평균 ± SEM (n = 2−3 마우스)으로 *p < 0.05로 표현됩니다. 축척 막대는 100 μm을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: PCLS에서의 콜라겐 침착 평가. PCLS는 0일, 1일, 2일 및 5일 후 격리시 콜라겐 섬유를 시각화하기 위해 Picro-Sirius Red로 고정, 파라핀 내장, 단면화 및 염색되었습니다. 축척 막대는 200 μm을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 담즙산은 담관옥시제 특이적 유전자 발현을 유도한다. 16 시간 후 격리에서, PCLS에 배지가 변경되었고, 새로운 배지가 150 μM 글리코콜릭 (GCA), 타우로콜릭 (TCA) 또는 콜린 (CA) 산 (나트륨 염)과 함께 첨가되었습니다. PCLS는 2일 후에 수확되었고, 시토케라틴(19)(CK19; A),코넥신 43(Cx43; B),및 γ-글루타밀 트랜스펩티다아제1(Ggt1; C)는 Gapdh 및 Hprt1의기하학적 평균을 기준으로 조사하였다. Dunnett의 다중 비교 시험은 치료되지 않은 대조군 조직 슬라이스(n=15)에 대해 수행되었다. 모든 데이터는 평균 ± SEM (n = 4 마우스, 삼중 분할 조각; *p < 0.05, **p < 0.01)으로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: qPCR 프라이머.
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Discussion
이 프로토콜은 뮤린 PCLS 격리 및 조직 배양의 적용을 입증하고, 절차는 생화학 분석, 조직학 및 qPCR를 사용하여 간 병리학의 외인성 중재자의 영향을 검사할 뿐만 아니라 생존력과 유용성을 모두 평가하기 위해 고안되었습니다. 설치류와 인간에서 PCLS 조직 배양의 실험 적 유용성은 microRNA15/RNA9/단백질 발현16,대사17,바이러스 감염 역학10,,18,감염 신호19,종양 침입12,독성 연구4,,13,,15,,20,DNA 손상에 대한 실험 조사를 포함하여 광범위한 응용 분야에서 입증되었습니다. 연구21,세포 생물학14,분비 연구9.
ATP 수준은 배양에서 최대 5일까지 PCLS에서 세포 생존능력을 나타내지만, H&E 염색은 배양에서 5일까지 심한 괴사가 발생했다는 것을 시사합니다. PCLS의 생존을 제한하는 것으로 보이는 주요 요인은 산소 가용성6,,11입니다. 여러 연구는 향상 된 산소 가용성을 포함 하 고 결과적으로 조직 배양에 PCLS의 생존 시간을 증가. 산소 가용성을 높이기 위해 사용되는 방법은 산소가 풍부한 분위기에서 조직의 인큐베이션을 포함10,,11,산소 캐리어 관류 perfluorodecalin 의 사용12,배양 시 배양 을 흔들고 롤링6,,10,,13,및 산소를 최대화하도록 설계된 조직 배양 판6.
최근, 혁신적인 공기-액체 계면 조직 배양 시스템은 배양14에서7일 이상에 명시된 기능적 유틸리티로 설명되고 있다. 이 프로토콜은 정상 조직 배양 인큐베이터에서 대기 산소를 사용합니다. 이 방법을 사용하면 산소 전달을 안전하게 향상시키기 위해 고도로 전문화된 맞춤형 장비가 없는 실험실에서 PCLS에 액세스할 수 있습니다. 그러나, 산소 전달을 향상시키는 이러한 방법이 이용 가능한 경우, 그들은 배양에서 장기적인 PCLS 생존능력을 향상시킬 수 있다.
3일째 후 PCLS에 콜라겐이 축적된 것은 자연적인 섬유발생 과정이 이 모델 내에서 활성화되었음을 시사한다. 자발적 섬유증은 또한 PCLS6,,14,,22,,23,,24에서 이전에 관찰되었으며 절단 과정 또는 조직 괴사에 의해 방출된 손상 관련 분자 패턴(DAMPs)에 의해 매개될 가능성이 있다. DAMPs는 이후에 프로-섬유성 신호 통로25,,26를활성화하는 신호 분자로 작용한다. 더욱이, PCLS에 있는 자발적인 섬유증은 stellate 세포 및/또는 Kupffer 세포의 활성화에서 풀어 놓인 케모카인에 의해 중재될 수 있었다 (즉, 성장 인자 베타를 형질전환 [TGF-β]). 이러한 맥락에서, Bigaeva et al.24에 의한 최근 논문은 TGF-β 억제제 갈룬니세르티브를 통한 PCLS의 배양으로 인해 PCLS의 인큐베이션이 자발적인 간 섬유증과 관련된 유전자 발현 변화를 억제함에 따라, PCLS에서의 자발적섬유증이 부분적으로 TGF-β 신호에 의해 매개된다는 것을 시사한다. 또 다른 가능한 메커니즘은 슬라이싱 절차가 처음에 세포 증식 신호 경로 및 세포 주기내의 간세포의 진입을 유도한다는 것입니다. 그러나,이 메커니즘실패 하 고 중간 G1 단계에서 세포 주기 체포 결과27. 세포주기 체포는 간 재생이 아닌 간섬유증(28)과연관된다.
대표적인 실험 절차에서, PCLS는 담즙성 간 손상을 시뮬레이션하기 위해 2일 동안 3개의 상이한 담즙산(GCA, TCA 및 CA)으로 치료됩니다. 담즙산(GCA 및 TCA)의 2개는 담관기능과 관련된 유전자인 CK19 및 Cx43의유의한 발현을 유도한다. 이것은 이러한 담즙산으로 처리된 PCLS에서 담관계 계보를 향한 세포의 확장 또는 분화를 시사한다. 이는 PCLS에서 TCA9를 사용하여 유사한 효과를 보여주는 이전 작업과 일치합니다. 더욱이, 또한 쥐에게 타우로콜레이트 먹이를 주는 것을 보여주는 생체내 관찰과 일치하여 담관종수(29)가증가한다. 담즙산으로 간 조직 슬라이스의 치료는 간 담즙 정체를 시뮬레이션하고, 담관 기능과 관련된 유전자의 발현의 증가는 담즙 분비를 증가시키기 위해 추가 담즙 덕트를 만드는 간 조직에 의해 시도되는 것으로 추측된다. 이들 유전자의 특이적 유도는 공액담산(GCA 및 TCA)에 의해 생성되지만 비공액CA에 의해 생성되는 것을 감안할 때, 이러한 효과는 스핑고신-1-인산 수용체 2, 접합담담즙산(30)에의한 우대 활성화를 갖는 세포 표면 수용체에 의해 매개되는 것으로 의심된다.
PCLS 적용의 한 가지 주요 제한 사항은 개별 복제 가변성입니다. 간은 균질하지 않고 생산에 가변성이 있기 때문에, 간 조각은 세포 배양 실험보다 더 큰 생물학적 변이를 가지는 경향이 있다. 위에서 설명한 대표적인 절차와 같은 몇 가지 변수가 있는 실험 연구에서는 증가된 복제 수를 사용하여 이를 극복합니다. 그러나, 이것은 더 큰 검열 연구 결과를 위한 문제점이 될 수 있습니다. 요약하면, 기재된 프로토콜은 생체내 간 병리학의 양상을 연구하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법이며, 진동을 제외한 거의 전문화된 장비가 필요하지 않습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 호주의 국립 건강 및 의학 연구 위원회 (NHMRC)에서 연구 보조금에 의해 지원되었다 (그랜트 번호. APP1048740 및 APP1142394에서 G.A.R.까지; APP1160323에서 J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.)에. 그랜트 A. 램은 호주의 NHMRC에서 수석 연구 펠로우십에 의해 지원됩니다 (그랜트 번호. APP1061332). 마누엘 페르난데스-로조는 스페인 마드리드의 TALENTO 프로그램(T1-BIO-1854)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
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