Summary
Questo protocollo fornisce un metodo semplice e affidabile per la produzione di fette di fegato tagliate di precisione dai topi. I campioni di tessuto ex vivo possono essere mantenuti in condizioni di coltura dei tessuti di laboratorio per più giorni, fornendo un modello flessibile per esaminare la patobiologia epatica.
Abstract
Comprendere i meccanismi di lesioni epatiche, fibrosi epatica e cirrosi che sono alla base di malattie epatiche croniche (cioè epatite virale, malattia epatica grassa non alcolica, malattia metabolica del fegato e cancro al fegato) richiede la manipolazione sperimentale di modelli animali e colture in vitro cellulari. Entrambe le tecniche hanno limitazioni, come il requisito di un gran numero di animali per la manipolazione in vivo. Tuttavia, le colture cellulari in vitro non riproducono la struttura e la funzione dell'ambiente epatico multicellulare. L'uso di fette di fegato tagliate con precisione è una tecnica in cui fette uniformi di fegato di topo vitale vengono mantenute nella coltura dei tessuti di laboratorio per la manipolazione sperimentale. Questa tecnica occupa una nicchia sperimentale che esiste tra gli studi sugli animali e i metodi di coltura delle cellule in vitro. Il protocollo presentato descrive un metodo semplice e affidabile per isolare e coltura le fette di fegato tagliate con precisione dai topi. Come applicazione di questa tecnica, le fette di fegato ex vivo vengono trattate con acidi biliari per simulare lesioni epatiche colestatiche e, infine, valutare i meccanismi della fibrogenesi epatica.
Introduction
La patogenesi della maggior parte delle malattie epatiche croniche (cioè l'epatite virale, la steatoepatite analcolica, la lesione epatica colestatica e il cancro al fegato) comporta complesse interazioni tra più diversi tipi di cellule epatiche che guidano infiammazione, fibrogenesi e sviluppo del cancro1,2. Per comprendere i meccanismi molecolari alla base di queste malattie croniche a base di fegato, è necessario studiare le interazioni tra più tipi di cellule epatiche. Mentre più linee cellulari epatiche (e più recentemente, organoidi) possono essere coltivate in vitro, questi modelli non emulano con precisione la struttura complessa, la funzione e la diversità cellulare del microambiente epatico3. Inoltre, le cellule epatiche coltivate (in particolare, linee cellulari trasformate) possono discostarsi dalla loro biologia originale. I modelli animali vengono utilizzati sperimentalmente per studiare le interazioni tra più tipi di cellule epatiche. Tuttavia, possono diventare significativamente ridotti nel margine di manipolazione sperimentale, a causa di significativi effetti fuori bersaglio negli organi extraepatici (ad esempio, durante il test di potenziali terapie).
L'uso di fette di fegato tagliate con precisione (PCLS) nella coltura tissutale è una tecnica sperimentale utilizzata per la prima volta negli studi di metabolismo e tossicità dei farmaci, e comporta il taglio di fette di fegato vitali e ultrasottili (circa 100-250 m di spessore). Questo permette la manipolazione sperimentale diretta del tessuto epatico ex vivo4. La tecnica colma un divario sperimentale tra gli studi sugli animali in vivo e i metodi di coltura delle cellule in vitro, superando molti inconvenienti di entrambi i metodi (cioè limiti pratici sulla gamma di esperimenti che possono essere eseguiti in animali interi, nonché la perdita di struttura/funzione e diversità cellulare con metodi di coltura in vitro cell).
Inoltre, il PCLS aumenta notevolmente la capacità sperimentale rispetto agli studi sugli animali interi. Come un topo può produrre più di 48 fette di fegato, questo facilita anche l'uso di entrambi i gruppi di controllo e di trattamento dallo stesso fegato. Inoltre, la tecnica separa fisicamente il tessuto epatico da altri sistemi di organi; pertanto, rimuove i potenziali effetti fuori bersaglio che possono verificarsi in animali interi durante il test degli effetti degli stimoli esogeni.
In questo protocollo, PCLS vengono generati utilizzando un vibratome con una lama vibrante lateralmente. Altri studi hanno usato con successo un affettatrice di tessuto Krumdieck, come descritto in Olinga e Schuppan5. Nel vibratome, la vibrazione laterale della lama impedisce lo strappo del tessuto ultrasottile causato dallo stress di taglio, poiché la lama viene spinta nel tessuto. Sia il vibratome che l'affettatrice di tessuto Krumdieck funzionano in modo efficace senza l'incorporamento strutturale del tessuto epatico, che semplifica la procedura di affettatura. Questa tecnica può essere utilizzata anche per creare PCLS da fegati malati, compresi quelli da modelli murini di fibrosi/cirrosi6 e steatosi epatica7.
Oltre a dimostrare le tecniche necessarie per la preparazione e la coltura tissutale di PCLS, questo rapporto esamina anche la fattibilità di questi tessuti ex vivo misurando i livelli di triposfato di adenosina (ATP) ed esaminando l'istologia dei tessuti per valutare la necrosi e la fibrosi. Come procedura sperimentale rappresentativa, pcLS sono trattati con concentrazioni patofisiologiche di tre diversi acidi biliari (glicocolilici, taurocolilici e colici) per simulare lesioni epatiche colestatiche. Nel contesto della lesione epatica colestatica, l'acido taurocholico in particolare ha dimostrato di essere significativamente aumentato sia nel siero che nella bile dei bambini con malattia epatica associata alla fibrosi cistica8.
Le cellule progenitrici del fegato sono state trattate anche in vitro con acido taurocolilico per simulare i livelli elevati di acido taurocolilico osservati nei pazienti, e questo trattamento ha causato una maggiore proliferazione e differenziazione delle cellule progenitrici epatiche verso un fenotipo biliare (cholangiocyte)9. Successivamente, PCLS sono stati trattati ex vivo con elevati livelli di acido taurocolilico, e sono stati osservati marcatori di colgaliociti aumentati. Ciò supporta l'osservazione in vitro che l'acido taurocholico guida la proliferazione biliare e/o la differenziazione nel contesto della malattia epatica associata alla fibrosi cistica pediatrica9.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati in conformità con il codice australiano per la cura e l'uso degli animali per scopi scientifici presso il QIMR Berghofer Medical Research Institute con l'approvazione del comitato per l'etica animale dell'istituto. I topi maschi C57BL/6 (15-20 settimane) furono ottenuti dall'Animal Resources Centre, WA, Australia.
NOTA: tutte le soluzioni, i supporti, gli strumenti, l'hardware e i tubi che contattano i campioni devono essere sterilizzati o accuratamente disinfettati con una soluzione di etanolo del 70% e gestiti utilizzando tecniche sterili per ridurre al minimo il rischio di contaminazione della coltura.
1. Configurazione del vibratome
- Preparare sterile Krebs-Henseleit soluzione tampone con 2 g/L di glucosio (Tabella dei materiali). Verificare che il pH del buffer sia 7.4. Se il pH è più alto, saturare il buffer con carbogen (95% O2 , 5% CO2) o incubare all'interno di un incubatore di coltura di tessuto CO2 5% per correggere il sistema di buffering del bicarbonato. Conservare in frigorifero la soluzione di tampone sterile sigillata a 4 gradi centigradi.
- Inserire la lama vibratoma nel braccio di taglio. Assicurarsi che la lama sia strettamente fissata al braccio di taglio, poiché le vibrazioni possono causare l'allentarsi della lama.
- Disinfettare la lama e tagliare il braccio con una soluzione di etanolo del 70%.
AVVISO: Evitare il contatto con la lama. - Disinfettare il vassoio tampone con una soluzione di etanolo del 70% e pulirlo con un tessuto sterile.
- Inserire il vassoio del buffer nel vibratoma e stringere il meccanismo di montaggio.
- Impostare il braccio di taglio all'altezza massima disponibile.
- Impostare l'angolo della lama a 10 gradi sotto l'orizzontale, inclinandosi verso il basso rispetto al campione. Assicurarsi che l'angolo della lama sia ben fissato.
NOTA: L'angolo ottimale della lama può variare a seconda del modello vibratoma e delle caratteristiche dei tessuti. - Disinfettare il supporto del campione con una soluzione di etanolo del 70%.
- Collegare l'acqua di raffreddamento per il dispositivo di raffreddamento termoelettrico Peltier situato sotto il vassoio tampone.
NOTA: Alcuni modelli di vibratomi utilizzano invece un bagno di ghiaccio per il raffreddamento. - Fissare il tubo di uscita dell'acqua per uno scarico e accendere l'acqua. Impostare il dispositivo di raffreddamento a 4 gradi centigradi. Eseguire l'acqua di raffreddamento ad una velocità di >400 mL/min.
- Riempire il vassoio del tampone quasi verso l'alto con sterile tampone Krebs-Henseleit ghiacciato (con 2 g/L di glucosio). Lasciare su ghiaccio un'ulteriore soluzione tampone Krebs-Henseleit.
2. Rimozione e preparazione del fegato
- Sterilizzare o disinfettare tutti gli strumenti chirurgici, tra cui pinze curve, pinze a punta quadrata piatta, pinzette, morsetti chirurgici e forbici con autoclaving.
- Prima della rimozione del fegato, anestesizzare profondamente i topi utilizzando un'iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di ketamina e 12,5 mg/kg di xilosina.
NOTA: Possono essere utilizzati altri anestetici, o i topi possono essere eutanasiati da CO2 asfissia / dislocazione cervicale se il fegato viene rapidamente rimosso per prevenire danni causati dall'ipossia. - Disinfettare le superfici cutanee sui topi bagnando con una soluzione di etanolo del 70%. Topi sicuri sulla schiena con tutte le estremità appuntate a una tavola di dissezione.
- Fare un'incisione verticale media nella pelle dalla base della cavità addominale appena sopra il diaframma.
NOTA: Le incisioni verso le estremità sono fatte per facilitare la ritrazione della pelle. - Tirare la pelle indietro mentre si taglia qualsiasi tessuto connettivo tra la pelle e la cavità addominale. Impedire che i capelli vengano trasferiti nella cavità addominale il più possibile. Pin o bloccare la pelle lontano dalla cavità addominale.
- Utilizzando pinze e forbici pulite, aprire la cavità addominale e la cavità toracica inferiore.
- Rimuovere rapidamente il fegato senza danneggiare i lobi
- Utilizzando strumenti smussati (ad esempio, pinze piatte a punta quadrata), guidare i lobi superiori del fegato verso il basso verso l'addome. Tagliare il tessuto connettivo che circonda i lobi epatici superiori utilizzando le forbici.
- Guidare i lobi epatici verso l'alto verso il diaframma. Tenere il fascio vascolare centrale del fegato con pinze.
NOTA: Non influenzerà la procedura se il fascio vascolare centrale è danneggiato. - Togliere il fascio vascolare centrale dal mouse e tagliare il tessuto connettivo rimanente, i vasi sanguigni, ecc. per rimuovere il fegato. Fare attenzione a 1) danneggiare i lobi del fegato e 2) tagliare nel tratto gastrointestinale, in quanto questo può contaminare il fegato con microrganismi.
- Mettere il fegato rimosso in un piatto sterile di coltura dei tessuti di 10 cm mezzo pieno di soluzione tampone Krebs-Henseleit ghiacciata. Utilizzando uno strumento smussato per guidare i lobi, tagliare il centro del fegato per dividerlo in lobi separati.
- Selezionare un lobo epatico (utilizzare il più grande primo), e posizionarlo lato piatto verso il basso su un nuovo piatto sterile 10 cm. Conservare tutti gli altri lobi epatici nel piatto di Krebs-Henseleit soluzione tampone conservati sul ghiaccio per un uso successivo.
- Tagliare circa il 10% del materiale dal bordo più alto del lobo del fegato mentre si è sdraiati.
NOTA: Il taglio è importante, in quanto questo bordo del tessuto contatterà prima la lama di taglio; pertanto, un bordo di tessuto relativamente perpendicolare alla lama di taglio impedirà la compressione dei tessuti che può verificarsi a causa di angoli superficiali nei lobi epatici non tagliati. - Tagliare gli altri tre bordi del tessuto.
NOTA: Questo rimuove parte della capsula fibrosa di Glisson e renderà più facile la separazione delle fette di tessuto. - Montaggio del lobo epatico sul supporto del campione
- Posizionare un sottile strato di colla cianoacrilata (supercolla o colla di cianoacrilata di grado medico/veterinario) sul supporto dell'esemplare verso la parte anteriore, dimensionata leggermente più grande del lobo di fegato tagliato.
NOTA: Verificare che la colla cianoacrlate non contenga additivi non cianoacristi. - Raccogliere delicatamente il lobo del fegato con pinze sterili utilizzando un angolo lontano dal tagliente, quindi asciugare qualsiasi tampone residuo dal lato piatto del lobo del fegato utilizzando materiale assorbente sterile.
- Posizionare il grande lato piatto del lobo del fegato sul cerotto di colla cianoacrita con il bordo più grande rivolto verso la parte anteriore. Lascia che si guarisca nell'aria per 1/2 min.
NOTA: Gli adesivi cianoacrilati curano rapidamente (2 min) in risposta all'umidità residua e alle proteine dei tessuti, e attaccheranno saldamente il tessuto al supporto del campione.
- Posizionare un sottile strato di colla cianoacrilata (supercolla o colla di cianoacrilata di grado medico/veterinario) sul supporto dell'esemplare verso la parte anteriore, dimensionata leggermente più grande del lobo di fegato tagliato.
3. Produzione di fette di fegato
- Posizionare il supporto del provino con il lobo del fegato collegato nel vassoio del tampone del vibratoma. Assicurarsi che il lobo del fegato sia completamente coperto da tampone.
NOTA: Se necessario, ricaricare il livello di soluzione tampone Krebs-Henseleit ghiacciata. Se il livello di buffer oscura il processo di taglio, aumentare o diminuire il livello. - Impostare la velocità di taglio.
NOTA: potrebbe essere necessario determinare empiricamente a seconda del modello vibratoma e delle caratteristiche della lama. Come guida di partenza, utilizzare una velocità di 57 Hz/3.420 rpm. La velocità del vibratoma può essere misurata utilizzando un'applicazione di analisi dello spettro audio su uno smartphone. - Abbassare la lama di taglio fino a quando non si trova appena sopra il lobo del fegato utilizzando il quadrante di altezza. Eseguire il braccio di taglio vibrante sopra il campione.
- Riportare la lama utilizzando la maniglia a manovella in senso inverso. Attivare le vibrazioni durante la restituzione della lama. Dopo che la lama è tornata e non è al di sopra del campione, abbassare l'altezza della lama di 250 m.
- Ripetere il processo di taglio fino a rimuovere la parte superiore del tessuto. Scartare le prime una o due fette, in quanto queste conterranno la capsula di Glisson e quindi non contengono molto tessuto epatico funzionale rispetto ad altre fette.
- Per tagliare le fette di fegato, far avanzare lentamente la lama vibrante nel tessuto ruotando la maniglia. Utilizzare un piccolo pennello (disinfettato con una soluzione di etanolo del 70%) per guidare delicatamente il tessuto durante il processo di taglio.
- Utilizzare il pennello per sollevare le fette di tessuto tagliato e posizionare la fetta di tessuto in un tubo sterile di tampone Krebs-Henseleit ghiacciato. Quando non è in uso, tenere questo tubo sul ghiaccio tra le fette.
NOTA: A volte, il tessuto strappa durante il processo di taglio, ma per la maggior parte degli scopi il tessuto è ancora utilizzabile. - Ripetere il processo di taglio fino a raggiungere la base del lobo epatico. Scartare eventuali fette di fegato che hanno visibile colla curata.
NOTA: La colla curata è visibile come aree bianche sulle fette di tessuto. Un tipico lobo epatico avrà solo uno spessore utilizzabile di circa 2 mm. Pertanto, solo otto fette di fegato da 250 m sono prodotte da ogni lobo. - Tagliare le fette di tessuto fino a vicino alla colla cianoacrilata. Non tagliare nella colla.
- Ripetere l'intero processo con altri lobi epatici fino a ottenere il numero richiesto di fette di tessuto.
- Per pulire la colla e il tessuto di cianocrita curati dal supporto del campione, utilizzare una lama per raschiare la miscela di colla/tessuto stagionato, oppure ammorbidire e pulire la miscela con acetone o zolfo dimetilico.
4. Cultura dei tessuti
NOTA: Tutto il lavoro di coltura dei tessuti deve essere eseguito in una cappa sterile a flusso laminare.
- In una cappa di flusso laminare di coltura tissutale, pipetta 1 mL del mezzo E di William contenente 2,0 g/l di glucosio, 10% di siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 u/mL di penicillina e 100 streptomici in 12 piastre di coltura dei tessuti.
NOTA: possono essere aggiunti anche altri antibiotici e agenti antifungini. Alcuni studi hanno utilizzato additivi nel mezzo di incubazione dei tessuti (ad esempio, dexamethasone e insulina10), ma questi possono interferire con la segnalazione cellulare. - Posizionare il tubo contenente fette di fegato dal ghiaccio nella cappa di coltura dei tessuti. Per rimuovere le fette di tessuto, ruotare delicatamente il composto e puntarlo delicatamente in un piatto sterile di 10 cm mentre vorticoso.
- Utilizzando pinze sterili a punta affilata e un bisturi, tagliare le fette di tessuto in dimensioni approssimativamente uniformi (ad esempio, 15 mm2).
NOTA: questo passaggio viene eseguito per garantire una superficie coerente. Poiché i lobi del fegato di topo sono di dimensioni significativamente diverse e alcune fette di tessuto si lacerano, questo produrrà una gamma di PCLS con aree di superficie variabili. Le dimensioni finali delle superfici di superficie dei PCLS dipendono dalla quantità di materiale necessaria nelle applicazioni di analisi successive e dal numero di repliche necessarie. Tagliare grandi PCLS in più pezzi più piccoli della stessa dimensione approssimativa permetterà innatamente un aumento del numero di repliche sperimentali. - Utilizzando pinze sterili o un piccolo pennello, trasferire le fette di tessuto tagliato ai pozzetti di un pozzo 12 contenente 1 mL di mezzo.
NOTA: Fare attenzione a confermare la consistenza dello spessore e della forma delle fette di tessuto. Le sezioni più scure della media suggeriscono che lo spessore del tessuto è maggiore e deve essere scartato. Le fette più leggere suggeriscono la presenza di colla cianoacrilata curata e devono essere scartate. - Incubare le fette di fegato a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 sotto il 95% di umidità.
NOTA: Altri gruppi hanno utilizzato metodi per migliorare la consegna di ossigeno a PCLS, che sembrano prolungare il tempo di sopravvivenza dei tessuti6,10,11,12,13 (vedi sezione discussione). - Il giorno successivo, cambiare il mezzo di coltura utilizzando una pipetta manuale (piuttosto che aspirazione) per prevenire la perdita di tessuto attraverso errori di aspirazione. Successivamente, cambiare il supporto sul PCLS ogni giorno. I PCLS sono ora pronti per l'uso sperimentale.
5. Esempio di applicazione di PCLS
- A 16 ore dopo la generazione, trattare pcLS con tre diversi acidi biliari: acido glicococolilico (GCA), acido taurocolilico (TCA), e acido collezioso (CA) (come sali di sodio, il tutto ad una concentrazione di 150 m) per 2 giorni.
- Dopo 2 giorni di trattamento dell'acido biliare, estrarre l'mRNA inserendo fette di tessuto nel tampone di lisi di RNA ghiacciato e omogeneizzare rapidamente utilizzando perline con un omogeneizzatore di perline (Tabella dei materiali).
- Purificare l'RNA utilizzando un kit di isolamento rna (Tabella dei materiali) e creare cDNA dall'RNA purificata.
- Eseguire la reazione quantitativa della catena di polimerasi (Tabella dei materiali) utilizzando primer specifici ( Tabella1) sul cDNA per esaminare l'espressione genica.
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Representative Results
Per determinare la vitalità cellulare dei PCLS nel tempo, sono stati misurati i livelli di ATP dei tessuti. I livelli ATP sono in genere proporzionali alla redditività. I PCLS (circa 15 mm2 nell'area) sono stati coltivati nel normale mezzo E di William con il 10% di FBS, quindi in tempi specifici, le fette di fegato sono state rimosse dalla coltura dei tessuti e omogeneizzate con concentrazioni atP e proteine (per la normalizzazione) (Tabella dei materiali) misurate ( Figura1A). Per saggi biochimici come questo, la normalizzazione è importante, in quanto le fette di fegato tagliate non sono necessariamente identiche nelle dimensioni. I livelli di ATP (rispetto alle proteine) sono stati soppressi immediatamente dopo l'isolamento e dopo 1 h (Figura 1A), suggerendo lo stress metabolico a breve termine dalle procedure di raffreddamento e taglio. Tuttavia, i livelli di ATP recuperati di 3 h. I livelli di ATP sono rimasti elevati fino a 5 giorni di coltura tissutale, indicando nessuna diminuzione significativa della redditività. La colorazione dell'ematossia e dell'eosina (H&E) delle fette di fegato suggerì che la necrosi tissutale limitata (caratterizzata dal pleomorfismo nucleare) si verificasse nella coltura intorno ai giorni 2 e 3. I livelli di necrosi dei tessuti progredirono a gravi entro il giorno 5 (Figura 1B). Considerando questi dati morfologici, presi insieme ai risultati ATP, si consiglia di utilizzare questo modello di tessuto sperimentale per un massimo di 3 giorni.
PCLS ha anche mostrato l'aumento dell'accumulo di collagene in tempi dicolturasuccessivi, come dimostrato dall'ispessimento delle fibre di collagene rosso Picro-sirius al giorno 5 ( Figura 2 ). Questo ispessimento di fibre di collagene suggerisce che i processi fibrogenici spontanei sono attivi in PCLS ottenuti utilizzando questo metodo. Questo processo appare indipendente dalla metodologia di isolamento PCLS con l'ispessimento delle fibre di collagene6 e l'espressione genica profibrona14 che si verificano sia da affettatrici di vibratomi che di tessuto Dirumdieck, rispettivamente nel tempo. Lo sviluppo di questi processi fibrogenici spontanei deve essere preso in considerazione nell'interpretazione della biologia PCLS, in particolare con esperimenti associati a processi fibrotici.
Abbiamo già mostrato la significativa induzione del gene colangiocite specifico connexin 43 (Cx43) e la secrezione della proteina transpeptidase glutamyl (Ggt1) da Parte di TCA in PCLS9. L'espressione dei geni specifici del colmariocito rispetto ai controlli delle pulizie (dehydrogenasi a 3 fosfati di glicerofidina 3 -fosfato [Gapdh] e ipoxanthine fossphoriboyltransferase 1 [Hprt1]) in PCLS trattati con TCA, GCA o CA sono stati esaminati da qPCR utilizzando parte primaria specifici. Coerentemente con una relazione precedente, un'induzione significativa nell'espressione dei geni specifici del colcancio cytokeratin 19 (CK19; Figura 3A) e connexin 43 (Cx43; La gcAe la TCA hanno osservato la cifra 3B). Espressione Ggt1 è stata aumentata da entrambi gli acidi biliari; anche se, questo non ha raggiunto la significatività statistica, forse a causa di variazioni sperimentali (Figura 3C). L'espressione di CA non è stata influenzata da alcun acido biliare. L'induzione di geni specifici del colcano suggerisce che la GCA può anche essere coinvolta in lesioni epatiche colestatiche, come precedentemente riportato per TCA8,9.
Figura 1: Vitalità dei tessuti di fette di fegato tagliate con precisione (PCLS). (A) I livelli di ATP e proteine in PCLS sono stati misurati immediatamente (T - 0) e a 1 h, 3 h, 6 h, e 1/5 giorni dopo l'isolamento. (B) Per esaminare la morfologia cellulare, i PCLs sono stati fissati, incorporati in paraffina, sezionati e macchiati con H&E immediatamente (giorno 0) e a 1, 2 e 5 giorni dopo l'isolamento. Un test Kruskal-Wallis con il test di confronto multiplo di Dunn è stato eseguito rispetto a T .0. Tutti i dati sono rappresentati come media (n - 2-3 topi) con il valore di < 0,05. Le barre della scala rappresentano 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Valutazione della deposizione di collagene in PCLS. I PCL s erano fissi, incorporati in paraffina, sezionati e macchiati con Picro-Sirius Red per visualizzare le fibre di collagene nei giorni 0, 1, 2 e 5 post-isolamento. Le barre della scala rappresentano 200 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Gli acidi biliari inducono l'espressione genica specifica del cholangiocyte. A 16 h post-isolamento, il mezzo su PCLS è stato cambiato, e il nuovo mezzo è stato aggiunto insieme a 150 sm glicocolilici (GCA), taurocholic (TCA), o acidi colici (CA) (sali di sodio). PCLS sono stati raccolti dopo 2 giorni, e l'espressione di citokeratina 19 (CK19; A), connexin 43 (Cx43; B), e transpeptidase 1 (Ggt1; C) è stato esaminato in relazione alla media geometrica di Gapdh e Hprt1. Il test di confronto multiplo di Dunnett è stato eseguito in relazione alle fette di tessuto di controllo non trattate (n - 15). Tutti i dati sono rappresentati come media (n - 4 topi, fette triplicati; s < 0,05, s< 0,01). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: primer qPCR.
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Discussion
Il protocollo dimostra l'applicazione dell'isolamento e della coltura dei tessuti del PCLS murino, e le procedure sono progettate per valutare sia la vitalità che l'utilità, nonché per esaminare gli impatti dei mediatori esogeni della patobiologia epatica utilizzando saggi biochimici, istologia e qPCR. L'utilità sperimentale della coltura tissutale PCLS nei roditori e negli esseri umani è stata dimostrata in una vasta gamma di applicazioni, tra cui indagini sperimentali in microRNA15/RNA9/protein espressione16, metabolismo17, dinamica infezione virale10,18, infezione segnalazione19, invasione del tumore12, studi di tossicità4,13,15,20, danno del DNA studi21, biologia cellulare14, e studi di secrezione9.
Mentre i livelli di ATP indicano la vitalità cellulare in PCLS fino a 5 giorni in coltura, la colorazione H&E suggerisce che la necrosi grave si stava verificando da 5 giorni in coltura. Il fattore principale che sembra limitare la vitalità di PCLS è la disponibilità di ossigeno6,11. Diversi studi hanno incluso una maggiore disponibilità di ossigeno e di conseguenza aumentato il tempo di vitalità della PCLS nella coltura dei tessuti. I metodi utilizzati per aumentare la disponibilità di ossigeno includono l'incubazione del tessuto in atmosfere ricche di ossigeno10,11, l'uso del vettore di ossigeno perfusione perfluorodecalin12, scuotendo / rotolando la coltura durante l'incubazione6,10,13, e piastre di coltura dei tessuti progettati per massimizzare l'ossigeno6.
Recentemente, un innovativo sistema di coltura dei tessuti dell'interfaccia aria-liquido è stato descritto con utilità funzionale dichiarato a più di 7 giorni nella coltura14. Questo protocollo utilizza ossigeno atmosferico ambientale in un normale incubatore di coltura tissutale. Il metodo consente di pcLS essere accessibile ai laboratori che non dispongono di attrezzature personalizzate altamente specializzate per migliorare in modo sicuro la consegna di ossigeno. Tuttavia, se tali metodi per migliorare la consegna di ossigeno sono disponibili, essi possono migliorare la vitalità PCLS a lungo termine in coltura.
L'accumulo di collagene in PCLS dopo il giorno 3 in coltura suggerisce che i processi fibrogenici spontanei sono attivi all'interno di questo modello. La fibrosi spontanea è stata osservata anche in precedenza in PCLS6,14,22,23,24 ed è probabilmente mediata da modelli molecolari associati ai danni (DAMP) rilasciati dal processo di taglio o necrosi tissutale. I DAMP agiscono come molecole di segnalazione che successivamente attivano le vie di segnalazione pro-fibrotiche25,26. Inoltre, la fibrosi spontanea nel PCLS potrebbe essere mediata dalle chemiochine rilasciate dall'attivazione delle cellule stellate e/o delle cellule di Kupffer (cioè, trasformando il fattore di crescita beta [TGF-z]). In questo contesto, un recente articolo di Bigaeva et al.24 suggerisce che la fibrosi spontanea nella PCLS è in parte mediata dalla segnalazione TGF-z, come incubazione di PCLS con i cambiamenti di espressione genica inibita di Galunisertib TGF- Un altro possibile meccanismo è che la procedura di affettazione induce inizialmente le vie di segnalazione della proliferazione cellulare e l'ingresso di epatociti nel ciclo cellulare; tuttavia, questo meccanismo fallisce e provoca l'arresto del ciclo cellulare nella fase27del G1 . L'arresto del ciclo cellulare è associato alla fibrosi epatica piuttosto che alla rigenerazione epatica28.
Nella procedura sperimentale rappresentativa, i PCLS vengono trattati con tre diversi acidi biliari (GCA, TCA e CA) per 2 giorni per simulare lesioni epatiche colestatiche. Due degli acidi biliari (GCA e TCA) inducono un'espressione significativa di CK19 e Cx43, che sono geni associati alla funzione cholangiocyte. Ciò suggerisce l'espansione o la differenziazione delle cellule verso un lignaggio di colgaliociti in PCLS trattati con questi acidi biliari. Questo è coerente con il nostro lavoro precedente che mostra un effetto simile utilizzando TCA9 su PCLS. Inoltre, è anche coerente con le osservazioni in vivo che mostrano l'alimentazione taurocholate ai ratti aumenta i numeri di colaniociti29. Il trattamento delle fette di tessuto epatico con acidi biliari simula la colestasi epatica, e si ipotizza che l'aumento dell'espressione dei geni associati alla funzione del colcanocito sia un tentativo da parte del tessuto epatico di creare ulteriori dottli biliari per aumentare la secrezione biliare. Data l'induzione specifica di questi geni è prodotta dagli acidi biliari coniugati (GCA e TCA) ma non dalla CA non congenerata, si sospetta che questi effetti siano mediati dal recettore sphingosina-1-fosfato 2, un recettore della superficie cellulare con attivazione preferenziale mediante acidi biliari coniugati30.
Una limitazione fondamentale dell'applicazione di PCLS è la variabilità di replica individuale. Poiché il fegato non è omogeneo e c'è variabilità nella produzione, le fette di fegato tendono ad avere una variazione biologica maggiore rispetto alla sperimentazione della coltura cellulare. Negli studi sperimentali con poche variabili, come la procedura rappresentativa mostrata in precedenza, questo viene superato utilizzando un numero maggiore di repliche. Tuttavia, questo può diventare un problema per gli studi di screening più grandi. In sintesi, il protocollo descritto è un metodo semplice e affidabile per studiare gli aspetti della patobiologia del fegato ex vivo, che richiedono poche attrezzature specializzate ad eccezione del vibratome.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni di ricerca del National Health and Medical Research Council (NHMRC) dell'Australia (Grant No. DA APP1048740 e da APP1142394 a G.A.R.; DA APP1160323 a J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm è supportato da una Senior Research Fellowship del NHMRC of Australia (Grant No. APP1061332). Manuel Fernandez-Rojo è stato supportato dal programma TALENTO di Madrid, Spagna (T1-BIO-1854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
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